Die immunmodulatorische Aktivität von Gelée Royale(GR) und Human Interferon-Alfa (HuIFN-αN3) in Bezug

auf ihre Induktion von anti-mikrobieller Aktivität in vitro.

Filipič B. 1), Gradišnik L. 2), Pereyra A. 3), Jaklič D. 3),Potokar J. 3)

1) Institut für Mikrobiologie und Immunologie, Medizinische Fakultät, Universität Ljubljana, Zaloška 4, 1105 Ljubljana, Slowenien

2) Medizinische Fakultät, Universität Maribor, Taborska 8, 2000 Maribor, Slowenien

3) MEDEX d.o.o., Linhartova 049a, 1000 Ljubljana, Slowenien

Die Immunmodulatoren sind die Substanzen, die mit demImmunsystem zusammenwirken können, um die spezifischen Aspekteder Gastgeber-Immunantwort nach oben oder unten zu regulieren.Sie umfassen Zytokine, Hefe Produkte, aus Pflanzen gewonnenesMaterial und verschiedene Bienenprodukte wie: Propolis, GeléeRoyale oder verschiedene Arten von Honig. Unter anderem zeigtGR auch die immunmodulatorische Aktivität, verbunden entwedermit Apalbumin-α oder mit 10-HDA. HuIFN-αN3 ist dasmultifunktionelle Protein, das unter anderem auch dieimmunmodulatorische Aktivität zeigt. Seine immunmodulatorischeAktivität wird auch mit der Induktion von antimikrobiellerAktivität in vitro verbunden. Die dargestellten Experimentezielten zur Analyse der immunmodulatorischen Aktivität von GRund HuIFN-αN3 einzeln, sowie deren Kombination in Bezug aufihre antimikrobielle Aktivität in vitro. DieImmunmodulationsexperimente wurden in den Systemen der TL-4menschlichen Makrophagen-Zelllinie und der frischen peripherenmononukleären Blutzellen (PBMC) (106 Zellen/ml) durchgeführt.Nach der Behandlung des Systems mit GR, HuIFN-α und derenKombination für 24 Stunden bei 37 ° C, wurde dieImmunmodulation und antimikrobielle Aktivität in vitrountersucht. Als erstes erhöht sich durch dieMakrophagenaktivierung der NO "Burst", H2O2 und Lysozyme Pegel.

Nach der Bindung an die Makrophagen und die Interaktion mit denPBMC, wurde eine Erhöhung der GM-CSF, TNF -α und IFN-γfestgestellt. Begleitend, die Abnahme der pro - entzündlichenZytokine (IFN- α) und der unterschiedliche Anstieg von IL-1α,IL-2 und IL-4. Die Kombination von GR und HuIFN-αN3 warungefähr 0,5 mal aktiver als GR oder HuIFN-αN3 einzeln. DieKombination von GR und HuIFN-αN3 induziert höhereantimikrobielle Aktivität gegen Gram - positive Bakterien:Staphylococcus aureus, MRSA, Streptokokkus pyogenes, Streptococcus agalactiaeund Hefe Candida albicans, als gegen Gram - negative Bakterien:Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis und AcinetobacterBaumanii.

Stichwörter: Gelée Royale, Human Interferon –AlfaN3,Immunmodulation, Zytokine, antimikrobielle Aktivität.

The immunomodulatory activity of Royal Jelly (RJ)and Human Interferon-Alfa (HuIFN-αN3) in relationto their's induction of antimicrobial activity in

vitro.

Filipič B.1), Gradišnik L.2), Pereyra A.3), Jaklič D.3), PotokarJ.3)

1) Institute for Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Zaloška 4, 1105 Ljubljana, Slovenia

2) Medical Faculty, University of Maribor, Taborska 8, 2000 Maribor, Slovenia.

3) MEDEX D.o.o., Linhartova 049a, 1000 Ljubljana, Slovenia

The immunomodulators are the substances, that can interactswith the immune system to up ordown-regulate the specific aspects of the host response. Teyinclude cytokines, yeast products, plant derived material anddifferent bee prducts like: propolis, Royal Jelly or different

types of honeys. Among other activities, RJ shows also theimmunomodulatory activity, being connected with eitherApalbumin-α or 10-HDA. HuIFN-αN3 is the multifunctional proteinshowing among other also the immunomodulatory activity. Itsimmunomodula – tory activity is also connected with theinduction of antimicrobial activity in vitro. The presentedexperiments were aimed to analyse the immunomodulatory activityof RJ and HuIFN-αN3 alone, as well as their's combination inrelation to their's antimicrobial activity in vitro. Theimmunomodulation experiments were performed in the system ofTL-4 Human macrophage cell line and fresh Peri – pheral bloodmononuclear cells (PBMC) (106 cells/ml). After the systemtreatment with RJ, HuIFN-α and combination between them for 24hours at 37o C, the immunomodulation and antimicrobial activityin vitro was analysed.At first the macrophage activation by theNO »burst«, H2O2 and lysozime level increase. After the bindingto the macrophages and interaction with the PBMC, the increaseof GM-CSF, TNF – α and IFN – γ was found. Concomitantly, thedecrease of pro – inflamatory cytokines (IFN-α) and thedifferent increase of IL-1α, IL-2 and IL-4. The combination ofRJ and HuIFN-αN3 was approximately half more active than RJ orHuIFN-αN3 alone. The combination of RJ and HuIFN-αN3 inducehigher antimicrobial activity against Gram – positive bacteria:Staphylococcus aureus, MRSA, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiaeand yeast Candida albicans, than against Gram – negative bacteria:Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis and AcinetobacterBaumanii.

Keywords: Royal Jelly, Human Interferon – AlfaN3, Immunomodulation, cytokins, antimicrobial activity.

EINLEITUNG

Die Immunmodulatoren sind die Substanzen, die mit demImmunsystem zusammenwirken können, um die spezifischen Aspekteder Gastgeber-Immunantwort nach oben oder unten zu regulieren.Sie umfassen Zytokine, Hefe Produkte, aus Pflanzen gewonnenesMaterial und verschiedene Bienenprodukte wie: Propolis, GeléeRoyale oder verschiedene Arten von Honig (Bild 1). Unteranderem zeigt GR auch die immunmodulatorische Aktivität,verbunden entweder mit Apalbumin-α oder mit 10-HDA (1,2,3). Dasgesamte GR ist auf dem Gebiet der Immunomodulation ein bisschenanders als 10-HDA. GR erhöht NO und H2O2 während 10-HDA, NO aufder Kontrollebene lässt, und H2O2 verringert.

Bild 1. Die Makrophagen-Aktivierung in vivo (6)

Es gibt auch Unterschiede zwischen den GR 10-HDA im Bezug aufTNF -α und IFN-γ. GR erhöht beide, während 10-HDA TNF -αverringert und IFN-γ auf der Kontrollebene lässt. HuIFN-αN3 istdas multifunktionelle Protein, das unter anderem auch dieimmunmodulatorische Aktivität zeigt. Während derimmunmodulatorischen Aktivität erhöht HuIFN-αN3 das Niveau vonNO, senkt das Niveau von H2O2, und erhöht das Niveau derLysozime. Des Weiteren lässt es IL-1α auf der Kontrollebene,erhöht IL-2 und lässt IL-4 auf der Kontrollebene. Seineimmunmodulatorische Aktivität is auch mit der Induktion derantimikrobiellen Aktivität in vitro verbunden, vor allem gegendie Gram "+" Bakterien und Candida albicans.

Die dargestellten Experimente zielten zur Analyse derimmunmodulatorischen Aktivität von GR und HuIFN-αN3 einzeln,sowie deren Kombination in Bezug auf ihre antimikrobielleAktivität in vitro.

MATERIAL UND METHODEN

MATERIAL

Bei den Experimenten verwendeten wir: frischen Gelée Royale(Mižigoj) (GR-F (M), 10-HDA und Human-Leukozyten-Interferon -αN3 und verschiedene Kombinationen zwischen ihnen (1:1, 1:2 und2:1).

METHODEN

Die immunmodulatorischen Experimente wurden durchgeführt in demSystem von: TL-4 (der menschliche Makrophagen-Zelllinie und derfrischen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) (106

Zellen/ml)) (Bild 2).

Nach der Behandlung des Systems mit GR(4), HuIFN-αN3 (5) undderen verschiedenen Kombinationen (1:1, 1:2 und 2:1), wurde dieImmunmodulation und antimikrobielle Aktivität in vitrountersucht.

Bild 2. Das schema des experiments.

Im ersten Teil das Niveau des NO, H2O2 und der Lysozime und imzweiten Teil das Niveau des GM-CSF, TNF –α, IFN-γ und IFN-α.Zur Konrolle des HuIFN-αN3 Niveaus haben wir eine RP-HPLC-Analyse der verschiedenen IFNs-α durchgeführt. Im zweiten TeilIL-1α, IL-2 und IL-4 und im dritten Teil die antimikrobielleAktivität gegen Gram - positive Bakterien: Staphylococcus aureus,MRSA, Streptokokkus pyogenes, Streptococcus agalactiae und Hefe Candidaalbicans, so wie gegen Gram - negative Bakterien: Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis und Acinetobacter sp.

RESULTATE

1. Bestimmung von NO, H2O und LysozimenIn dem Fall von NO wurde eine Freisetzungsverbesserungfestgestellt (6.86 µM/ml), als die Kombination (GR-F (M):HuIFN-αN3) verwendet wurde. Das Niveau des H2O2 und der

Lysozime wurde mit der Verwendung der Kombination (1.52 µM und0.748 µg) erhöht. Lysozime sind der Indikator derantimikrobiellen Aktivität Induktion (Bild 3).

Bild 3. Bestimmung von NO, H2O und Lysozimen.

2. Aktivität von GM-CSF und TNF-αGM-CSF als Proliferator verschiedener Tumorzellen in vitro und invivo wurde entweder durch IFN oder GR gesperrt, oder durch derenKombination. Der Opponent TNF-α wurde erhöht, als dieKombination verwendet wurde (Bild 4).

Bild 4. Aktivität von GM-CSF und TNF-α.

3. Aktivität von IFN-γ und IFN-α Als das Niveau der beiden IFNs untersucht wurde, wurden diefolgenden Daten bestätigt: Zunahme von IFN-γ und die Abnahmedes pro-entzündliche IFN- α (Bild 5).

Bild 5. Aktivität von IFN-γ und IFN-α.

4. Aktivität von IL-1α, IL-2 und IL-4Es erhöht sich das Niveau des IL-1α, des Cytokins, das den"programmierten Zelltod" (Apoptose) von meist unterschiedlichenTumorzellen induziert, ähnlich wie IL-2 und IL-4 (Bild 6).

Bild 6. Aktivität von IL-1α, IL-2 und IL-4

ZUSAMMENFASSUNG UND DISKUSSION

Als erstes erhöht sich durch die Makrophagenaktivierung der NO"Burst", H2O2 und Lysozyme Pegel. Nach der Bindung an dieMakrophagen und der Interaktion mit den PBMC, wurde eineSenkung von GM-CSF, und eine Erhöhung von TNF -α und IFN-γ

festgestellt. Begleitend, die Abnahme der pro - entzündlichenZytokine (IFN- α) und der unterschiedliche Anstieg von IL-1α,IL-2 und IL-4. Die Kombination von GR und HuIFN-αN3 warungefähr 0,5 mal aktiver als GR oder HuIFN-αN3 einzeln. DieKombination von GR und HuIFN-αN3 induziert höhereantimikrobielle Aktivität gegen Gram - positive Bakterien:Staphylococcus aureus, MRSA, Streptokokkus pyogenes, Streptococcus agalactiaeund Hefe Candida albicans, als gegen Gram - negative Bakterien:Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis und Acinetobacter sp.

Es ist auch wichtig, diese Daten , verbunden mit derMakrophagenaktivierung in vitro, mit der früheren Studie zuverbinden, als wir die Wirkung der Kombination von GR-F (M)analysierten: HuIFN-αN3 auf Gluthation-Ebene undLipidperoxidation, wobei wir festgestellt haben, dass dieKombination die Gluthathion Ebene senkt und dieLipidperoxidation erhöht. Wir haben so ein klareres Bild vonder antiproliferativen und möglichen Antitumor-Aktivität derKombination von RJ-F (M): HuIFN-αN3 gekriegt.

VERWENDETE LITERATUR

1. Stanilova SA, Dobreva ZG, Slavov ES et al. C3 binding glycoprotein from cuscuta europea induced different cytokine profiles from human pbmc compared to other plant and bacterial immunomodulators. International immunopharmacology 2005; 5: 723-734.

2. Utoh-Nedos AU, Akah PA, Okoye TC et al. Evaluation of the toxic effects of dihydroartemisinin on the vital organs ofwistar albino rats. American Journal of Pharmacology and Toxicology 2009; 4: 169-173.

3. Tzianabos AO Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: Structural aspects and biologic function. Clinicalmicrobiology reviews 2000; 13: 523-533.

4. Gasic S, Vucevic D, Vasiljic S, Antunovic M, Chinou J, ColicM Evaluation of the mmu- nomodulatory activities of royal jelly components in vitro. Immunopharmacol

Immunotoxicol 2007 ;29:521-536.

5.Bassard LD, Grace MJ, Bordens RW Interferon-αas an immunotherapeutic protein. Journal of Leukocyte Biology 2002; 71: 565-569.

6.Modifizierte und von Immunopaedia.org angepasst.

Bild 1. Die Makrophagen-Aktivierung in vivo (6)

Bild 2. Das schema des experiments.

Bild 3. Bestimmung von NO, H2O und Lysozimen

Bild 4. Aktivität von GM-CSF und TNF-α.

Bild 5. Aktivität von IFN-γ und IFN-α.

Bild 6. Aktivität von IL-1α, IL-2 und IL-4