Correlation between dietary lipid:protein ratios and plasma growth and thyroid hormone levels in...

12
Correlation between dietary lipid:protein ratios and plasma growth and thyroid hormone levels in juvenile Arctic charr, Salvelinus alpinus (Linnaeus) Colin Cameron 1 , Richard Gurure 2 , Konda Reddy 1 , Richard Moccia 2 & John Leatherland 1 1 Department of Biomedical Sciences, University of Guelph, Guelph, ON, Canada 2 Department of Animal and Poultry Science, University of Guelph, Guelph, ON, Canada Correspondence: J F Leatherland, Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada. E-mail: [email protected] Abstract Sexually immature Arctic charr, Salvelinus alpinus (Linnaeus), were fed one of five isoenergetic prac- tical diets of differing lipid:protein ratios (0.98, 0.67, 0.41, 0.26, 0.19) for an 84-day period to examine the influence of diet composition on growth, and growth hormone (GH) and thyroid hormone physiology. All five diets supported growth at ap- proximately the same rate, but the diet with a lipid: protein ratio of 0.98 had the lowest weight gain and highest food conversion ratios. A GH enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA), developed for use with oncorhynchid fishes, was validated for use with Arctic charr. Plasma GH concentrations were significantly higher in fish fed the diet with a lipid:protein ratio of 0.98, and there were significant direct and inverse correlations between plasma GH levels and dietary lipid and protein content re- spectively. There were no significant differences in pre- and post-prandial plasma GH concentrations for any group. There were significant post-prandial elevations of plasma triiodothyronine (T 3 ) and thy- roxine (T 4 ) for fish fed the lower lipid:protein ratio diets, but there were no differences related to the diets. The results are discussed in terms of GH as a factor in the regulation of lipid and protein homeo- stasis in fishes. Keywords: hormone assay validation, dietary lipid: protein ratios, teleost fishes, carcass proximate analysis, growth rates Introduction Growth hormone (GH) has been implicated in the control of several, apparently disparate, physio- logical processes in teleost fishes; these include ionic and/or osmotic regulation, gonadal function, energy homeostasis, protein anabolism, lipolysis, smoltification and immune system function (see reviews by Bjo Èrnsson 1997; Holloway & Leatherland 1998; Pe Ârez-Sa Ânchez 2000). However, the specific roles played by this pleiotropic hormone in these regulatory processes is still not fully under- stood, and the common link, if any, between the actions of GH in many of these different physio- logical events has not yet emerged. This paper focuses on the possible involvement of GH in lipid and protein metabolism in salmonid fishes, for which there is relatively scanty direct, and indirect evidence in the published literature (reviewed by Bjo Èrnsson 1997). With regard to lipid metabolism, a lipolytic action for GH is hypothesized based on GH-stimulating increases in plasma free fatty acid (FFA) levels in vivo, and GH-stimulated release of FFA and gly- cerol from hepatic tissues in vitro in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) (reviewed by Bjo Èrnsson 1997). Support for this hypothesis of a lipolytic action of GH was provided by the observa- tions of a significant correlation between plasma GH and non-esterified fatty acids (NEFA) levels in sexually mature female rainbow trout in which plasma GH levels were elevated (Holloway, Sheridan, Van Der Kraak & Leatherland 1999). Aquaculture Research, 2002, 33, 383±394 ß 2002 Blackwell Science Ltd 383

Transcript of Correlation between dietary lipid:protein ratios and plasma growth and thyroid hormone levels in...

���������� ����� ������ ������������ ������ ��

������ ������ �� �� ���� ������ ������ � �������

������ ������ ��������� ����� ��������

����� ������� �� ��� ������ ����� ������ �� ��� �� ��� � ���� ����������

���������� � � ��� ��� �� ����� � ���� �� � ������� ������� ��� ��������������� � � ��� �� ������ �� ���� � ���� �� � ������� ������� ��� �����

���������� �� ! "���������� ��������� � � ��� ��� �� ����� ���� #���� ��� ����$�� � ���� �� � ������� ������� ��� ���

�%�� �����& '(�� �) *�������+��&�$�����&��

�������

��,����� ������� ���� � ������ ��������� �����

-" ����.� /��� ��� � � � �� ����$�� � ����(

� ��� � ��� � � ���� $ � � �)���� ��� � -0&12� 0&34�

0&5�� 0&�3� 0&�1. �� � 25(��� ��� � � �,�� �

��� ������ � � �� ���� � $�/��� ��

$�/�� ���� -�6. �� ���� � ����

���� �$�& ��� � �� � ��� �������� $�/�� �� ��(

��, ������ ��� ���� ����� 7�� ��� � �� / �� � � � �)

���� ��� � 0&12 ��� ��� �/��� /� $�� $�

�� � $���� �� ����� ��� �& � �6 �8���(

� 9�� �����7�� ����� -'":��.� ��������

�� ��� / �� ������ � � ����� /�� ��� ����� ��

��� / �� ���� � �����& ������ �6 ������� �

/��� � $ � ����� � $��� � �� ��� ��� � �� / �� �

� � �)���� ��� � 0&12� �� ����� /��� � $ � ���

� ���� �� ����� ������� � 7��/�� ������

�6 ������ �� � ����� � � � �� ���� ���� ��(

����� ����& ;���� /��� � $ � ��� � ��������

���( �� ���(���� �� ������ �6 ������� � ��

�� $���& ;���� /��� � $ � ��� ���(���� ��

������ � � ������ �� ����� � -;<. �� ���(

�, � -;5. �� � �� ��� ��� �/�� � � �)���� ���

� ���� 7�� ����� /��� � �������� ������� � ���

� ���& ;�� ������� ��� � ������� ����� � �6 �� �

����� ��� ��$���� � � � � �� ���� ���(

���� � � ����&

�������� ���� ����� ��� ��� � � ����� � � �)

���� ��� �� ������ � ����� ������� ��, ����

����� �� $�/�� �����

����������

��/�� ���� -�6. ��� 7�� ��� ����� ���

���� � �������� ��������� � �������� ���� (

�$ ��� �������� ������ � ����= ����� �����

� ��>� ��� � ��$���� � $���� ���� �

���$� ������� �� ���� ��7� ��� � ���� ��

���� � ��� �� ���� ������ ����

-��� ��� �/� 7� �*?��� �114= 6��/�� @

"��������� �112= ��A��8(��A���8 �000.& 6/�����

��� ���� � � ���� ������ 7� �� � ��� ��� � ����

����� ��$������ �������� � �� �� � ����� ����(

���� �� ��� ��� � 9� � ��� 7��/�� ���

��� � � �6 ��� � ����� � ������ ���� (

�$ ��� ����� ��� � ��� ����$��& ;� � �����

������ ��� ��� 7�� ������� � �6 � � �

�� ���� ����7� �� ���� � � ����� ��

/� �� ����� � ����� ���� ����� � ����� �� � ����

�� ���� ��� ��7� ���� � �������� -��� �/�� 7�

�*?��� �114.&

% �� ��$��� � � � � ����7� ��� � � ���� � ���

�� �6 � ������� 8�� 7���� �6(�� ����� $

������� ������ ���� ����� �� � -!!�. ������

�� ����� �� �6(�� ������� ������� � !!� �� $��(

���� ��� ����� � � ����� �� ��� � �� 7/ �����

���� ������ ���� -%��7���. -��� �/�� 7�

�*?��� �114.& ������ �� �� � ������� � � �

� ���� � ��� � �6 /�� ��� ��� 7� ��� 7�����(

� � � � � $ � ��� ������� 7��/�� ������

�6 �� (����� � �� ����� �� �� -�'!�. ������

��,����� ������ ������ �� 7/ ����

/� �� ������ �6 ������ /��� �������� -6��/���

���� ��� #� ��� B���9 @ "��������� �111.&

�C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15

� �00� ����9/��� �� ��� "�� <2<

6/����� ������ �6 ������� /��� ��� ���

*��� �� �� 7/ ���� ���/ $ ��� ����� �

�4�(������ � -'�. /� �� ����� /�� � ���9��

������ ���� ������ ���� � � � ���� -���$���

��� � �������� � ����$� .� 7�� ������� 7�(

�/�� ������ �6 �� �'!� ������ �� � $�� 7�

�,������ � � � � � 7� $ �7 � 8�� -F�������

6��/��� ;����� ���� ��� #� ��� B���9 @

"��������� �00�.& : ���� ���� ������ �/�����

������ �6 ������� � �� ������ ���� ������

�� ���� ���� � � � ������� � /��� � $ (

� ����� ���������� ��� 7�� ��$$��� $ ���� ���

������� ������ �6 ���� /�� ������ ��

������ ��� ��� ����� � ��� ������ ������

� � � ������� & ;� � ������� �� ������� � �

�������� 7� ��� �� ���� � ���9���� ��������

������ �6 ������ ���� � � ���� ��� � ��� ��� / ��

� � �(� �� � ��� -F���GA(������� F���GA�8(���7���A�

���A� #��� � �� ��A��8(��A���8 @ B���� 9 �113=

������ �������(� ��� B���� 9 @ ��A��8(��A���8

�111.= �� ����� � ��� ����� � �������7�� � (

������� ��� �� � � � ������ $ ��>� ������(

��� ���$�� ���� ����7� ��&

�� � ��� ���� �� ��� ������ � 9� 7��/�� �6

������ �� � � � ����7� ��� ����� � ��� ��

���� � � ��� � ���� �� ���� �� � ���� ��7� �

��� � �6 -��� �/�� 7� �*?��� �114.&

6/����� ��� � ���� �� ����� ���� �� ��� ���9(

���� ������ ���� ������ � 7���� ������

7�� /� $��� � � �� ��� ������ �6 -�&$& �/�

������ ���� "�$��� @ ��8� �121.� � � �6

$�� ����$� � � ���� -�&$& ���� � �/��� ����9��

�� ����9���� � �9���� F� ����� H���9 � 6�/

�000. ��$��� ���$�� �� � ���� ��7� � ��$���(

��� ��� �� �6&

; ������� �,���� ��� ����� �� ����� �� � 7�(

�/�� �6 �� � � � �� ���� ����7� �� ���(

� � � ����� /� ������ � � � ��� ������� � ����

���� �� ���� � ���� ��� �� �,�� �� ��� ������ �

� ��� � � ������ � � �)���� ��� � �6 ������

7� ��,����� ������� ���� � ������ ��������� �����

-" ����.& ��� �� ���� � ����� /��� ���� 7������

����� ��� ��/ ��7� ���� ���� �� � �6 ���� �$�

������ � � ���� � ����� �� �� $ ��,����� ���(

���� � �� /� �� � ���� ��� ��� 7�� ���� $

������� � ��, ���� �� /� �� ��� � ������ � � �(

����� ������ �6 ������ � ���� -��� �/�� 7�

6��/�� @ "��������� �112.& ;�� � �� /��� ���

����$�� � � ��� � � ������ � � �)���� ��� �� ��

/� ������� 8�� ���� � �6 ��� ���� � ��� � � �

����7� �� ���� � ���� ��� ��� ������� ��� �(

�7 � �� � � $��� 7�� � � � ��� � �� ����� ������

�6 ���� �$�& 6/����� 7������ ����$�� � � ���

� � ������ � � � ���� / �� ��� ��� � ������

������ � ���� ���$�(� ��� $ ��� ��� - �� � ����

���$��� ���� � �� � � ������ �,��� ���7�������.�

/� ��� ��������� ��� ��� 7�� ������� � ��� �� �

���� ��� ��� ��� �6 ������� ��� ���

�����&

: ��� � � ��� ���� �6� /� ��� �,�� ��

��� ������ � � �� ���� � ������ ���� �

���� ������& ;� � /�� ������9� 7������

����� � � ������ ��� �� �� ����� � -;<.

�6 ������ � � �� -!���� (� ����� ����7��$ @

F�� �114.� �� �6 � 9/ � �� ������ ����� �

;< ������ � � �� -��� �/�� 7� "��������� �115.&

;���� � ��������� ���$� �6 ������ � $��

7� ���� ���� / �� ���� � ���� ���$��� ��(

� 7�� ��� � $ � � $�� � ��� ������ � �

;< �� �6 � ��&

��������� �� �������

� ��������� ����!�

��� �� ���� � ����� � ��� "�7���� ���� - � ��

��� 7�� /� $�� �&I3�0&0� $. /��� ���� ���

�����& ;�� � �� /��� �� �� �� ��� 30(� ���

�C��� � ����� �� / �� ������� ������� �� ��(

$ /��� /���� -��/ ���� < " � ��.& ;����������

/�� ������ ����� � ���� �� ��$�� ��� ��(

��, ������ �< �� �� ��� 7�$ $ � ��� �,��� (

��� � 1&I �� �� ��� ����� � ��� �����.� ��

��� � � �� ��������� � $��� /��� ��� � � ���")�� ��

������ �& '��� ��9 /�� ������ � ������ ���

������ � ��� $ ��� � ��& !� ��� ����� � ���

����� ��� � �� /��� ���(��� � ��� ��� ��� �����

� ��� � ���&

�� ��� 7�$ $ � ��� ������ ��� � �� /��� ��(

���� � ��� 7���� � � �� �������� $����� / ��

����� ���� ����� ��� ��������& '��� ��������

���������� � � � �� ����$�� � ����� ��� � ���

-� $��� 7�� ���$� ����, ������ �4 F 9$��. / ��

���� $ � � � -�5&4E�0&2J. �� ����

-�I&<EI2&�J. ���� � ��� �� � ��� / �� ����

� � �)���� ��� � � 0&12� 0&34� 0&5�� 0&�3

�� 0&�1 -;�7�� �.& ���7������� ������ /���

����� ���� ���7��� ��$ $ ��� <0&5J � <2&<J

-;�7�� �.& ;�� ������ � ��� � ��� /��� ���(

������ ��� F��� K� !��� F ��� -'�� ��� ���

�����.� ��� ����� ��� ���� ��� ��� C��� ��

�� ��� � ����� 7� ��� ���� F ���� � �������

D������� !��� ������ �������� ���� �� �

/� �� �� 7� ��� ��� ���/ $ /�7

� ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��& �C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15

<25 � �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15

� ��) ����)>>///&�$�����&��>� ����� � >���� �&

���L! ����� 7�(�������& ;�� � ��� /��� ���������

����� ��������� �� ��(�� �� �� ��� � ���� �� �

������� �� ���� ��� ����� � �������� �� ��(

��� 7�� ���� ���� -������� F�� � @ ��9 �

�11I= ������ �114.& ;�� ����� �� �� �� ��

����� �� 7� ��� � ��� /��� ���������� �� $ � $��� 7��

�� �� � ������ �� ��� ��� �� $��� ��� ��

��� ��� ��� ��C� ������ ��������� �� ����

���� � ���� �� -�D� �11<.&

� ������ � � �� /�� ��9� 7���� 7�$ $ ���

���� $ �� ��� �������� 8�� F���� -��I �$ "��.

�� ��8� �� ������� ����� � �� ����� 7��

���� ���� -������ �� ��& �11I= ������ �114.& ;��

���� $ � �� /��� ��� ��� �,��� ����� � ��� ��

�� /��9�� �� /� �� � �� ��� ��� 7�� /� $�� �

� �� ���� �������� /�� ������ �� 7� 7��9

/� $� $ ���� ��9 -��< �� ���� ��������.&

������� � � �� /��� ��9� �$� ��� ���� �����(

��� $���� ����� 8��� �� ��8� �� �������

��, ���� ����� �&

"���� �������! ��� ������

;�� ������ � 7�� ������� 7�$� 4 ���� �����

��� 25 ��� /� $� $ � �� � ��� ��� ��� 7 � �� �

���$�� ������ ������ ������� � ���� $ �����(

���& �� ��� � ���� ��� � �� �� ��� � 7� ���(���

� ��� ��� ��� ����� � ��� ��� ���& ! �� /���

������� �� �/ � ��� � ��� ���� � � 7���� ��� � ���

���(���� $ � ��� ��� -���(���� �� ������.

�� � � ����� ��� � ��� ���(���� $ -���(���� ��

������. � ��� ���& ;�� ����� $ /�� ���� �� ��

��� ������� ����� �� � �� /��� ��9� ��� ����

��9 �� �� �� $ �� ��� � � � 8� ���

��� 7 � �� � ���� ����� $ ������ �������& ;���� �

��� � �� /��� ������ ��� ���� �,��� �����

��9� ����� 8�� F���� -��I �$ "��.� �� 7���

���/ $ ������ ��������& ;�� 7�� /�� ��������

����� 8�� ��� ����� ��7��� ���� ��$�� �� ���

������ /�� �� C���� �� ����� ��8� �� ��0 ��&

��7��C������ ��� ������ ������� /��� ������� ��

�6� ����, � -;5.� ;< �� $����� ������� �&

���������� �� ��� �� ������������� ������� ����

���

�6 ������ /��� �������� �� $ � (����� � ��

�8���(� 9�� �����7�� ����� -'":��. ��(

������ �� $ ����� �6 �� 7� �� �� ���

� �� ������ � ����7 �� ���� �����

���� ������ ���� -%��7���. �6& ;�� ����7 ��

���� ���� �6 /�� 9 ��� ����� 7� �� 6&

B�/���� & ���� �� � ��� ����� �� ��� / �� ��(

���� � ���� �� ���� 7�� ������� ���� ����

-!��7� �$� @ "��������� �11�.& ; ��� ���� ���

����� �� ��� / �� ������ � ���� ��� /� �� �������

����� ���� $ ������ $ � ���� � ����� � ��(

���� ���� � / �� ����� �� 7� �� � �6�

�� � ��� ������ � ���� � ����� � �� ���� $���

��$������ ���� � ����� ������� �� ��� ��� ��

/� �� ���� � ����� � �� ���� $���� ��� 7��

��7���� �� ��� �& !� ����������� � ������

�� � �� ���� ��$���� �6� ��� '":�� ��������

7� !��7� �$� @ "��������� -�11�. /�� ����& !�

#�$�� ���� � � ��� � ��� ���� ��� ����� �,(

������� ��� 7�� � � ��� ������

�����

� � �

���������� ��

������ ���� ���� ���� ���� ���� ����

���� ������ ���� ��� ��� ��� ���� ����

� ��� �������� ���� ���� ���� ���� ����

!�" #��� ���# ���� ��� ��� ��� ���

$� ��� ���� ���� ���� ��� ���

%#��&�# �#�� ���� ���� ���� ���� ����

'������ (����)� ��� ��� ��� ��� ���

*������ (����)+ ��� ��� ��� ��� ���

���(������

�, �� ���� ���� ���� ���� ����

-�, �� ���� ���� ���� ���� ����

-. */ 0���� ���� ���� ���� ���� ����

� 1 �� ���� ���� ���� ���� ����

� ���#�� ����2�

�, �� ���� ���� ���� ���� ����

.����2 */ 0���� ���� ���� ���� ���� ����

3�(�� �� ���� ���� ���� ���� ����

% �� ��� ��� ��� ��� ����

3�(��4�, ����� &��� ��

(��#������ #������

���� ���� ���� ���� ����

�# ��� ���� , -�$ 9$�� � ��� ����� ����/ �� ������.) ���� ��

������ � �� � -<0.� ��� �, � -�0.� � 7���� -4.� �� -�I0.�

�� � �� � -I.� ��� � ���� �� -�000.� �� �� � ������� �� -<.�

7 � -0&�I.� ����7���� -0&0�I.� ���� � �� �� 7 ���(

����� -�0.� � �� -500.� ����7 � �� � -500.� �"(�(��������

������� -<0.� �������� ���� -�500 :�.� ��� � ������� -�I00 :�.&

MF ���� ���� , -�$ 9$��.) ���� -<000.� ����5 I6�� -�I.� !��(

�5 46�� -2<.� F��5 6�� -23.� N��5 6�� -�55.� B: -2.� ��

-0&�I.& �77��� �� �) �6�) ���7�������= ��) ����� ���� =

���) � $��� 7�� ����� ���� � �') � $��� 7�� ���$�& � ����� ��(

�� � /�� ���������� ��� 7�� � � ��� �� ���� � � �����

$��� ���� �,���� �� �6� -J. /� �� /�� ��� ����� ��� ����(

��� ����� � ���� �� ���/�) �00� -��� " � �����O&

�C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15 � ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��&

� �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15 <2I

����������� � �6 �������� �� ��� �� ��� '":�� ��

�� � �� 7� 6��/�� @ "��������� -�1147.�

����� $ � ������� �6 �� 7�� �� ��� � ���

���$�� �� � ����� �6 �� 7�� �� ��� ����

���$� � ��� '":��� /�� ����&

: ��� ������ �� � �� ���� ���� �� ��� �� (

���� ���� ����� �� 7� �� /��� ��� �

����(����� ���� � ����� / �� ��� � �� ���� ����(

���� � *��� �� �� ����� ���� � ����� -! $& �.=

���� � �� ���� ���� ���� /�� ������ ��& :

��� � � �������� � ��� ������ /��� 7�� �� ��

������� � �� ���� ��$���� �� � �� ���� ��7�(

� ��� �� -! $& �.& ;�9� �$������ ��� ����(

�� $ ��������� �� �� � ��� �� 7� �� ���� ���

������ �� ��� � ��� ������ � � �� ���� ��$�(

���� ������ �� � �� ���� ��7�� ��� �� ��(

� �� ��� ��� � ��� �6 '":�� �� ��� ������ �

���� ��& ���� �� � ��� ������ $ ������ ��

� ��� ����� ��������� ���� �� ��� ��� ��� ���

�� ���/�&

��������������� � ������

� �� ���� $���� /��� ������ ��� *��� �� ��

��,����� ������ ���� � ����� �� � ,�� �� K�

��� �& ����� �������� � $����� ��� �� � ������

��� $���� /��� ��7����� ������ �� ���� ��

�� I��& ;�� #������� ��� �� � (7 � ���(

� ������ ��������/������ -#���� "�7���� ���

���� $���� ��� ���. / �� ������� ����� �� (

7� �� � ���� ���� �6 �� � � ��� � �)�000&

���� �� � ��� ���� ������ ���� ���� 7��

��� ��� ����/���� -!��7� �$�� F�����( ���

F�"��� "/��� '����� @ "��������� �110.= ���(

� ������ ��� ����� /��� ���� �� �� �� ����(

����� 7� �� ��� @ '�� � -�120.&

!������ � ����"�����# ���������� ������ ��� ����

��������

!�8� � �� ���� $���� � ������ -��000 $ 7��

/� $��. �� ������� -<00E<I0 $ 7�� /� $��.

���� � ����� /��� ���������� ��$� 8�� � �"

� 0&�� ��������(7������� ��� � -���.� ���� (

��$�� -�000 ". �� �I � �� 5 ��� �� ��7��C�����

� ����� ��� ���� ��� �� �6 �����&

� �� ���� $���� � ������� ���� � ����� -��(

��, ������ <I0 $ 7�� /� $��. /��� ��� � ���(

���� � ���� �� ��� ��7���� �� 3 � �� ��� �

� �" � ������K� ��� �� �� �0 ��� � ������

����7��� �� ��� ����� / �� 6�9�K 7������ ����

���� -6���. ��� �� �� �I �" ��� -����� $����

��� ��� ��� ����. ����� $ � ��� ������

����� 7�� 7� 6��/�� @ "��������� -�1147.& !�

RPD

NIL0.1 mm

%�!�� ���� � ��� � �� ����

$��� � � ��,����� ������� ���� �

������ ��������� ����� -" ����.

������ �� / �� � � ���

����� �� 7� �� � $�/��

���� -�6. ���� /��� ���� ���

�6 '":��& ��� ��� �������� �

��� ��, ��� ���� � ���� � ��/ �� (

���� � ����(����� � �� / �� ���

�� 7��& D��� ������ ���� � ���� �=

�:"� ���( ������ ��� �7�&

� ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��& �C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15

<23 � �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15

7�� ��� ���� � �� ��� ��� ���� ��� ��� �������

��� �� /�� ����� ��8� �� ��0 �� �� � � /��

��� ���� � ����� ��� �� ������� �� �6 ���(

���� &

��� ���/ ��� ��� ������ ������� � ����(

���� 8�� ������� -<00E<I0 $ 7�� /� $��. ��

������ -��000 $ 7�� /� $��. ���� � ����� /��

�������� ����� 8�� ��7��� ���� ��$�� �� ���

������ ��������� �� ������� ��������& ;�� ������

/�� ��8� �� C��� �� ��0 ��� �� ������� ���/��

�� C��� /��� � ����� ��� ���� ���&

!���� ��� �$��� %&'(# � �������� ����� %&)( ���

"����� ������� �����

������ ;5 �� ;< ������� � /��� ��������

�� $ ��� ������, �� � ����� ��� ��������

9 �� - �� @ �� �� ��� � �$�� ���

F��9���� ��� ���. ���� ���� ����� 7�� ��

��� ����� �� ��� / �� ��� �� ���� � ���� ��� (

���� $ 7�9 ������ ��������� ��������� -" ����.

-����(;����� �������� @ "��������� �11�.&

!� ��� ���� � ������ � ����� �����(

���� ��C� � $ IE�0 �" � ������ /��� ��������

�� �������� �� ����� 7�� ���� ���� -"����������

6 �� ���� F���� @ ����� �110.& ������ $�����

������� /�� �������� �� $ � ����� ������

�� ��� � $�� �8���� � ����� -� $�� ���� ���

�&� ��& "� �� F�� ���. ����� 7�� ���� ���� -D����

@ "��������� �115.&

&������� �

���� �� $�/��/��� ������� ���� �� ����� �� $ �(

/�� ����� � � ��� ���= /���� *(������ � �����

� $ � ����� ���� /��� ������� �� $ ����K�

���� ���(��$� ����& ���� �� ������� ��, ����

0.110

100

1 10

LOG GH concentration (ng mL−1)

LOG

A/A

100

100 1000

(c)

0.1

10

100

1 10

LOG GH concentration (ng mL−1)

LOG

A/A

100

100

(d)

0.1

10

100

1

(a)

10

LOG GH concentration (ng mL−1)

LOG

A/A

100

100 1000

(b)

0.1

10

100

1 10

LOG GH concentration (ng mL−1)

LOG

A/A

100

100

%�!�� � � ��� ������ �� ���� � ����� -�. ������ - ������� �� ������.� -7. � �� ���� ��$������ �� ��7��

��� �� /� �� � �� ���� $���� ��� ������� �� ������ ���� � ����� ��� 7�� ��7���� � ���� -�. � ���� -���� �.

������� � -�. � ��� ��� ������� ������& '��� 7��� � ���� ������� ���� � ��� ��� �� 7�� ������� ����� -��

�� �� ����. �� ������ � ��� � -�� ���� ����.& �7��7��� ������ ������� 8�� �� �>��00 � ������ �7��7��� ��

5I0�>�00 $�"�� ������� �7��7��� �� 5I0 �&

�C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15 � ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��&

� �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15 <24

���� � /��� � � ����� ������� �� $ �(/��

������ �� 7������ ��� � �� ��� /� $��� �� ����

�������� /��� ����� ���� � � ��� -��$�) �5&5E

<0&2 $. ������ /�� �������� �� �� �������

� � 8� 7�� ���� � & ;�� ���� �� ����

������ ��������� /��� ���������� ��7*����� �

�(/�� ����� � � ��� ���= /���� ��������

���� /��� �$(��������� 7���� ����� � � �����

/��� � $ � ����� � ������ ��� ���� ��$ �����(

����& %���� *(������ � ����� � $ � ����

-!�0&0I.� ��� ���� /��� ������� �� $ ;�9��K�

������ � $ � ����� � ������ ����= !�0&0I /��

�������� �� � ��� $ � $ � ��� � ��������& ����(

�K� ������� ����� � /�� ���� � ���� ����� (

�� �� 7��/�� ��� ��� �7��� ��������&

�������

����� ��� �� ����� ����������

;�� $�/�� ���� ��/ ���� ��� � �� � ��� ��������

$�/�� �� ����, ������ ��� ���� ������ / �� ���

�,���� ���� �� � �� ��� � �� � -� � �)���� ���

0&12. ��� /� $�� $� /�� �/�� ��� �� � �� ���

� ��� < �� 5 -� � �)���� ��� � 0&5� �� 0&�3

������� ����.& ;�� � �� ��� � �� � ��� ��� � � $ � (

����� �/�� ���� $� ������� / �� � �� ��� ���

���� � ��� -;�7�� �.& : ��� � � ���� ��9�� ����

��� � ��� ��� -�'D. �� ���� ����� ��� � ���

-!�'. /��� � $��� � �� ��� ��� � $��� � � �)����

��� � ��� -;�7�� �.&

;���� /�� � $����� �������� ������� � � � �(

���� ��� ��� � $���� ����� � �� ��� � �� �

-�5&31J � ����� � � �.� � ��� �/��� �������

� � � ����� � �� ��� � �� I -�0&44J � ����� � � �.

-;�7�� �.& ;� � ������ /�� ��� ��������� ��� � � �

$� � � �� ��� ��� � ������ � ���� / �� � $ � �����

� $��� � � � $� � � �� ��� � ��� �E< ��� � �� ���

� ��� 5 �� I -;�7�� �.& �����$� ��� ���7�������

���� � ��� � ��� ��$�� ��� ����, ������ <0J

� <2J� ��� ������� ���7������� ���� ���

$���� /�� �$� $ 7��� �������7�� ��� ���� �

��� �/ � $��� 7 � �� � ���� � ��� � ����� ���7��(

������ �� ��� ����� � ���� ��$��� ���� /���

#�$�� � ! �� 7�� /� $��� ��� /� $�� $� � �� ��, ���� ���� � � ���� � ������ ��������� ����� -" ����. ���

��� �,��� ����� � ��� �� 25 ����

�����

� � �

5��"� (��������

$���� &��2 "��� � �� ����� �����& ����&# ����&# �����&#

*��� "��� � ���� �� ���� ����� ���� �����& ���� ����&# ���� ����&# ���� �����&#

���#� (��)����� ����2�

� "�� "��� ��

*������ ���� ����� ���� ����� ���� ����& ���� ����# ���� �����

,������ ���� ����� ���� ����& ���� �����& ���� ����& ���� �����&

3�(�� ���� ����� ���� ����&# ���� ����# ��� ����� ��� �����

% ��� ����� ��� ����� ��� ����� ��� ����� ��� �����

$��� ����0� ��� (������ ���

��(�� ���� � (�� 6� �

$��� ����0� ���� ����� ���� ����� ���� ����� ���� ����& ���� ����&

,������ ���� ��� ����� ��� ����& ��� ����& ��� ����& ��� ����&

3�(�� ���� ��� ����� ��� ����� ��� ����� ��� ����& ��� ����&

$��� �66�#���#��

,.! ��� ������ ��� �����& ��� �����# ��� ������ ��� ������

$�! ��� ������ ��� �����& ��� �����# ��� �����# ��� �����#

��� /� $��� /��� ������ �� 7� 7��9 /� $� $ � �� ��� ���� ��9 � ������ � � ��9 ��� 7�� /� $�� �� ���� � ����� ��9� ���

��������� �� �������� $ ��� �������� ��� ��� ����� ����� ������ P��� ���� ������� ���� � ��� -�'F. /�� �&�O& ;�� � ��

��� ��� 7�� /� $�� -$. -�'F. -���I. /�� �&I3 -0&0�.& ���� ����/� $�� $� � ������� ��, ���� ���� � � ���� ��9�� ����

�� � � � $� � �� ���� ��� � �� �� ��� ��/ �� ��� -�'F. � ����� ���� �����= ��� ������ / �� � � ��� �������� ��� ��� � � $ � �����

� ������ ��� � �����& : � �� ��� -�'F. ������� ���� � ) � ����� 42&4 -0&3.� ���� �<&3 -0&I.� � � � I&� -0&�.� ��� �&4 -0&�.&

�77��� �� �) !�D) ���� ����� ��� -$ ���� ��9� ��� $ /� $�� $� .= �'D) ���� ��� � ��� ��� -$ /� $�� $� ��� $ ���� ��9�.&

� ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��& �C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15

<22 � �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15

� $����� �� �7��7�� � � � �& ;���� /�� ��� �

����� -�3&IJ ����. $����� ������ �������

� ����� ���� ��� ��� �/��� ������ � �� ���

� �� � � ��� � $���� ������ � �� ��� � �� I -;�7�� �.&

������� ���� �� ��� ���� ��/�� �������

������� � � �� ���� � -;�7�� �.&

'����� ������ ��� !�� ��� �� ���������

;���� /��� � $ � ��� � �������� ��� ���( ��

���(���� �� ������ ������ � �6 �� ��������

-� ��. $��� -;�7�� <.& ;���� /�� � � $ � ���

-!�0&0�. ����� � ��� ������� 7��/�� � ��(

��� ����� ���� ���� �� ������ �6 ���(

���� � -;�7��� < �� 5.� �� � � $ � ��� � ����

������� 7��/�� � ����� � � � ���� ��

������ �6 ������� � -;�7��� < �� 5.& 6/(

����� ����� �������� � 7� �/ ������ � ���

������ / �� �6 ������ ��� � �� ��� � ��� <EI -� � �)

���� ��� � � 0&5�� 0&�3 �� 0&�1 ������� ����.

��/ $ � �������� ������ �6 ������� ��

7�� / �� � $� ������ �6 ������ 7� $ ������ ���

����� ��� � ��� � �� � /� �� ��� �� � $��� � � �)

���� ��� � -0&12 �� 0&34 ������� ����.&

: ��� ���(���� �� �������� ��� ������ �6

������ ��� ����� ��� � �� � -� � �) ���� ���

0&12. /��� � $ � ����� � $��� ��� ��� ����

���(���� �� �������� $���� -;�7�� <.& : ���

���(���� �� �������� ��� ������ �6 ������ ���

����� ��� � �� � -� � �)���� ��� 0&12. /��� � $(

� ����� � $��� ��� ����� ��� � ��� < � 5 -� � �)

���� ��� � 0&5� �� 0&�3 ������� ����. -;�7�� <.&

;���� /��� � $ � ��� ������� � � ����� � � �)

���� ��� � ���( � ���(���� �� ������ ;5 �

;< ������� � -;�7�� <.� � /�� ����� � � $ � (

��� ������� 7��/�� � ����� � � � �� ������ ;5

� ;< ������ -;�7�� 5.& 6/����� ����� /��� � $ � (

��� ���(���� �� ������� ������ ;5 ������

����� ��� � ��� <EI �� ������ ;< ������ �����

��� � ��� �EI -;�7�� <.&

;�� ������ $����� ������� � ��$�� ���

�34 � 2I �$ �"�� �� ��� �������� $����� ��

����� /��� � $ � ��� � �������� ���( ��

���(���� �� ������ $����� ������� � ��

�� $��� -;�7�� <.& :� ��� ���� ���� ��� /���

������� ���� �� ������ ����� /�� � $ � ���

������� - �0&I4= !�0&0I. 7��/�� � �����

���7������� ���� -;�7�� �. �� ������ $�����

������� -;�7�� <.& 6/����� � ��� ���� ���

� �� � /��� �,������ ��� ��� ����� �� ����� /�� �

���� � $ � ��� - �0&25= !�0&00I. � ��� �����(

�� 7��/�� ��� �/ ��� �7���& ;� � � ��(�� ��

������ ������ $����� ������� � ��� ��7(

�7�� ����� � ��� ������� � $ � ��� � ��� �����(

�� � 7��/�� ������ $����� �� ������ �6

������� � �� � ����� � � � �� ���� ����

-;�7�� 5.&

#�$�� � '����� � � �� ���( �� ���(���� �� ������ $�/�� ����� ����, �� �� ����� � �� $����� ���(

���� � ���� � �����

�����

� � �

5��"� ������ ���3���,��7(������� ���� ����� ���� ����& ��� ����# ���� ����& ��� ����&#

,��7(������� ���� ����� ���� �����& ��� ����& ��� ����&# ���� �����&

8 2��)��� �*�

,��7(������� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ��� ���� ���� ����

,��7(������� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ���� ����

8������� 2������ �*�

,��7(������� ��� ����� ��� ����� ��� �����& ��� �����& ��� ����&

,��7(������� ��� �����& ��� ����� ��� ����� ��� ����� ��� ����&

5��#�� ���3���,��7(������� ��� ���� ��� ��& ��� ��&# �� ��# �� ���

,��7(������� ��� ��� ��� ��� ��� ��& ��� ��& ��� ��&

���� ��� ��/ �� ��� -������� ���� � ���.� ���0= ���� / �� � � ��� �������� ��� ��$ � � � ��� � � $ � ����� � ������ ���

� �����&

�C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15 � ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��&

� �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15 <21

��������

� ��*� � � $ � �� � ����� /�� ��� ���9����

�������� ������ �6 ������ ���� � ����� ��� ���

��� � � �(� �� � ��� -� �� �. -;�7�� <.& ;����

� � $� ��� ����� / �� ���� � F���GA(������

�� ��& -�113. �� ����� �� ��& -�111. /�

��/�� � � � ��� ������ ������ �6 ������ -��

������� ������� � � � ����. $ ������ ���

7����� �� � �� ��� -" ����. ��� � ��� ��� / ��

� � �(� �� � ���& 6/����� 7������ ��� �,��� �����

� ��� ���� ��� ������ ����� /��� ��������� �

��� � � ��� ������ � $��� ���$�� ��� ����

�� � � � ���� /��� ����, ������ ������� ��(

������ �� �������� �� � �������� ������ �6

������ ������� � � �� ���� �C����� 7� ������ 7�

���$�� ��� � ����� � � � � ��� � ����� ����

����& ���C������ 7�� ��� 7 � � �� ��� �(

� ����� ��� ���/ $ � ����� &

�� � ������� ��� :������ � � ���� � ��� �

� �6 ���� 7�� ����� 7�� ��� ���� � ���� ��&

6/����� ��� ������� � ��� ������ ����� -;�7�� �.

�� � � ��� ���� �� /� �� ���� � ���� �� /��� ���

� � �(� �� � ��� -F���GA(������ �� ��& �113= �����

�� ��& �111= ��� �/�� 7� ��A��8(��A���8 �000. ���

� ��$�� �$� �� ���� ������� �� 7������ ���� �� ���

�������� ������ �6 ������ ��� � �� ��� ��� � � �(

� �� � ���� ����� /�� ��� � ������� �� �� �� �

����� � �� � ��� �� � � � � ��� � ��� � ������ ���

�7 � 8�� & ����� �� ��& -�111. �� ��A��8(

��A���8 -�000. ��$��� ���� �� $ ������ ��� 7����

��7*����� � � $� � � � ��� $� ��� � ���� � ��� �

� �6 � $�� ����� � � 7 � � � � ���� � �

� ����� ���� ��� ������� � � � �������& ;���� �6 ���

���� � � ����(������ �� ���& ����� ��� 7 � �� �

���� ��� � $� ������ �6 ������ � �� ��� � � �(� ��

� ��� ��� ������ � �������� ������ �� � ����

� � �� �� ���� �6 � ����� ��� ���������

����7� �� 7��$�� �7�� 7� � $� � � � ��� $&

���� ����� � ���� � ��� ���� ��� ����

���� ��� � �� � ����� � � ���� � ��� ��

���� ���� � ��� � �� � ����7� 8� �,���� � � ��&

:� ���� ��� � � $�� ��� 7� �� �����& !�

�,������ ������ �������� -�D:!. ������ ������

� 7� ������� ��������� / �� ������ �6 ������

���� � � ���� -6��/�� �� ��& �111= F������ �� ��&

�00�= #���� B���� B �� �� @ ���� �� �00�.�

�� 7������ �D:! ��� 7�� ��� � ���� � � ���� �

��� ��� � ���� -���� �� �115.� ��� � $�

������ �6 ������ ��� ����� � �������� �D:! �������

���� ����� $ � � � ������� ��� � �����&

: ��� �7�� � ����� � � ������� ���� ��� � $�

�6 ������ � �� ��� ��� � � �(� �� � ��� ��� ��������

��� ���� � ��� � �� ��� ��� �/�� � � �)���� ���

� ���& � �� ��� � $� � � � ������ � ��� � / �� ���� �

������ � � $�� �C����� 7� ��$��� ���� ��� �6 ������

��� � �� ��� ��� � � �(� �� � ��� ��� Q����K ��

��� ������ ��� � �� ��� ��� �/�� � � �)���� ���

� ��� ��� ���������& : �� � ����� � ��� ������

�6 � $�� 7� � �/�� �� � � � � ���� $ ������ �

� � 8� � � � �7 � 8�� �� �� � 8�� &

�� ������ ���� ��� ��� ��� 7 � �� ���� ��� � ��(

������� � �������� ������ �6 ��� ��� � � ����(

���� � ����� ���� ����� ������ ��� � � � �

���� ��� 7� � ������& #�� �� � ���

� 8� � ��� ���� ��� � �� � ����� ���� ����

���� ���9�� ������� ������ �6 ������� �

�� �6 ���� �$� � ���� -�������� "� �� ��

#�$�� ( ������� ����� � � ��� ��� �7��� �������� ��� �����= ���( �� ���(���� �� ������ /��� ������ ���

����� �

-�����2 (������

-�����2 ��(��

������ ��� ����� �� 5��"�

�� ���� �� ���� ������

�� ���� �� ���� �� ���� 8 2��)���

9:- 9:- 9:-

�� ���� �� ���� �� ���� �� ���� 8������;

9:- 9:- 9:- 9:- � 2������

���� � ��� ������ �� ���� �� �� ���� �� ���� 5��#��

�� ���� �� ���� �� ���� 9:- 9:-

������� ���� � �� ������� � �� ��7�7 � �� ������� !� ��� ��/= � $ � ��� ������� � ��� ��/ 7��= : �� � � ���� ����� ��

� ���� ������� � ������� ����&

� ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��& �C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15

<10 � �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15

� �9�� $� ��� $�� @ �����$��� �11�= !��7� �$� @

"��������� �11�= !��7� �$�� !���� @ "���������

�11�= D�$���� 6���� @ ���� �11�= ��A��8(

��A���8� F���GA(������ @ B���� 9 �11I= F���GA(

������ �� ��& �113= ����� �� ��& �111.& ;����

� ����� ���� ��� ��7 � �� � $�� 7� � ��*� �����

��� �6 ������� ��� ��� ������ �����& ;����

/�� ����� � �/��� � ������� ��� ��� ���

� $��� 7�� ���� ���� � ��� � ��� -�<&�EII&�J=

;�7�� �.� �� ��� � $��� ������ �6 ������ /���

��� ����� ��� � ��� ���� ��� ��� �/�� ��$�

� � $��� 7�� ���� & ;�� ����� ��� � �� ��������

$���� ��� ����������� � � � ��� ����� �

������� ���� -;�7�� �. ���� �� ��� ��� �� �

� ����� ���� ����� ��$$��� $ ���� ��� $����

��� �������� � ������ ���� ��� � ��� ������&

;���� ������� /��� � 9�� � ������� � ����

��9� �� ������ �'D / �� ����� $ � �����

� � �)���� ��� � -;�7�� �.� �� ��$$��� � ��� �

���� ������� �& ����� �6 ��� ����� �

� ��� �� �6 $�� ����7 �� � �� / �� � $�

������ �6 ������� ���� ������ � ������

-��� :������ �� ���������.& ;���� � � $�� 7�

��$��� ���� ��� � $��� ������ �6 ������ ����� ���

� $� � � �)���� ��� � ��� � $�� ��� � �����

���� ��7� ��� ������ 7� $ $ �7�� ����

���� $& ;�� �/ ���� $� �� �������� ���� $

���� � � �� $ �� � �� � ��7�7�� ������� ��� �/��

��� �� ��� ���� ���� � �� � � ��� /� �� �

/��� 7��/ ��� <4E5�J ����� ���� ������ ����

/��� ������ �� � 7� �� ��� �� ���� $�/��

� ���� � ����� -������ �� ��& �11I.&

!��� ����� ��� � � ���� � ������� ���� �

����� � ���� ���$� � �� ��� � ��� / �� � $�

� � �)���� ��� �& ;� � ������� ���� �����

��� 7� ���� ���� / �� ������� ���� ��9��

��7 �� / �� �/ � ����� ���� ����&

6/����� ��� ��$���� �� ������ �'D ���� ����

/ �� ��� ����� $ � ����� � � � ���� � ����� �

������ ��� � ��� � ��� ��7�� � ����� ���� �

��� 7�� 7� �� $ � � � ����7� �� � ������ ���

��*� ����7� � ���$� ����� �� ����� $ ��(

�� �������� �� � ���� $�/��&

"/ ���� � ��� ��� ����� ���� ���� / ��

�/���� ����� � �6 ��� ����� -��� � �6 ��������.�

�/���� ��� (� 9� $�/�� �����(: -:�!(:. �����(

� �� �� � $� ������ �6 ������ ���� � � ����

-��A��8(��A���8 �� ��& �11I= F���GA(������ �� ��&

�113= ����� �� ��& �111= ��A��8(��A���8 �000.&

������� :�!(: ������� � � 7 � �6 ������� ���� �

�� ���� � ���� �� -��A��8(��A���8� %� � @ "� �� �

�11�= ��� ��� %� � @ "� �� � �11I.� � � ��������

��� 7�� ���� ��� � $� ������ �6 ������ ���

�������� $���� ��� ������ ����� ��� ��� ������

� �/���� :�!(: ������ �� �� ���� � ���� ��(

����� � ������� ���� ��� ��7 � ��&

;�� 7������ �������� ������ �6 ������ ��� ���

7� � ������ � ���$ $ ������ � ��� �� ������

��� ���& !� �,������ �� ��� � �6 ������� ���

� ��� � -� ���� ��� �������� ������. � �� ����

$���� � �� ������� 7� $������ �� � 7 ��� 7�

����� �� �� �� �� -D�$��� �� ��& �11�.& ;��

�/ ������ �� �� � ������ ���� � ����� ���

��� � $� � � �)���� ��� � ��� -7������ � ���

�/ � ����� ���� ��9�.� ��� 7�� ������ / ��

��� � $� ������ $����� ������ 7������ �����

$����� ��� ���� ��� 7���� � ��� � $� ������

������ � �6 ����$� ������� ������ � ��� � ��(

���� �������� � �����& �����$� ����� �� ��� �

���� �� ��� �� �� ���� � � �����(������ �������

��� � ���� ��� ��� �����, �� ���� � ���� �

���� ������ �� �����$� ������� ����� �� �� ������

� 7� �������� ���� ��� � ������� �� 7� �����(������

�����& � ���� � � � ��� ������� �������

7��/�� ������ �6 �� $����� ������� �

��� ��� ������ ����� /� �� ���� �C����� 7�

������� � ��� ����� � �������� � ����� ���7��(

�����&�� � �����$����/����,��� ����������

������� � 7��/�� ������ $����� ������� �

�� � ����� ���� �� � � � ���� -;�7�� 5.&

: ��� ������ ������ ����� /�� ������� ��(

����� 7��/�� � ����� � � �)���� ��� � �� ���

������� � � ���� ;5 � ;< -;�7�� 5.& ;����

� � $� *��� �� ���� � ����� ��� �� ����

/ �� ���� �� *��� �� �� 7/ ���� /� ��

������ ������ � ;< �� ;5 � � � ���$� � $ � (

����� /�� ��� ����$�� � ����� ��� � ��� / ��

� ���� ���� $ � � � �� ���� ���� -'�����

F��"������ 6 $$� @ ���*� �11�. � ����(

$�� �> � ��$��� � ��� / �� � ������ �� �� �

��� ��� -D ���� 6 $$�� ���*� @ '���� �11<.&

%� �� ������ ;< �� ;5 ������ � 7� ����� ����

��� � �� � ���$�� � �� ���� � � ����� �

IA(��� � ��� -IA(F��. ��� � �� ������� �

���� � $ � ����� / �� 7�� ��� C��� �� �� C��� ��

� ���� 7�� �� ����$� ��� � ��� �� ���� ���

7� � ��� ��� � �� � ���� � ������ ���� �

������ ���� ���� �� � � -'���� �� ��& �11�=

D ��� �� ��& �11<.& 6/����� ��� ���$��

IA(F�� ��� � �� ������� ��������� �������

���� ��� � ���� ��� �� ����� � ���� � ����

������� � ���� ������� ����7� � � ���� �� ��

�� ����� ��� � ��� �� � � $�� � ��� ��� 7��

���-�. � ;<&

�C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15 � ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��&

� �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15 <1�

;���� 7������ � �� 7� ���/ ��� ��� ������

���� � ���� ������� ��� ������ �����&

! ���� ��� ���(���� �� ������ � 7�� ������ ;5

�� ;< ������ /��� ��� ��� $���� ��� ��� �/��

� � �)���� ��� � ��� -;�7�� <. /� �� � ����� �

� ��(������� ���$� ���� � ���� ����� ��(

��� � ������ � ���(���� �� ������ ��� ��

������& ����� 7������ ������� ���� �� ���� ��/

������ ;< ������ -�� ����� � IA(F�� ��� � ��. � 7�

���� ����� �� � ���$�� ��� ������� ��� (

� �� ����� � ���� � � ���� -!��7� �$� �� ��&

�11�= !��7� �$� @ "��������� �11�= "���������

@ !��7� �$� �11�= �/��� $ @ '���� �11�.� ���

����� ���� ����� ������ ������ � 7�� ;5 �� ;<

���� � ����� ��� � ������ �������� $���� ��$(

$���� ���� ��� � ���� ���� ��� ������ �����

/��� � �������� ��� � ���� ������$�� -���� ��

��� �� ���� � ������� ���� ��� � ��� � ��

��� � �� �.& ;� ��� ��� ���$�� ������ �6 ���(

���� ��� ������� ��� ������ ;< ������

���� �� ��� �� ���� � � �� ������� ��� � �6

����� � ;< ������ ������� �������� ���� ��

-��� �/�� 7� "��������� �115= #� ��� ������

F�� ��������� B�?� @ ������ �112.& ;����

������� ���� � ����� ���� ��� ������ ������

����� ��� � ������ � 7� � �����(������ ����� (

�� � 7��/�� ��� ������ � �6 �� ���� �

�����&

��!����������

;�� ������ / �� � ���9 F�� "��� " �� ���

�,������ ���� ��� ��� ����� �� ��� � ��� ����� ��

��� ���� �C��������� D������� ���� & ;�� /�9

/�� �������� 7� � ��'D� $���( (� � � ��������

� !" �� � �F�!D� �/��� � D�F&

"��� ����� � ����#

� ����� ��7� ��� -�������� �&� ���� � �&� @

B���� 9� �& -�00�. 6 $� � ����� � � �� ���� � ���

$�����(3(���������� �,����� �� 7/ ����

-���� ����������.& +�� ��� ��,�� �������� �<4E

�5�&. ��� ����� 7�� � ������ �� ������ $�����

������ � 7� �������� �� 7/ ���� ��� � � � � ��

� ��� -�3J ��& ��J.� ���� �� / �� � � $ � ���

������ ����� � $�����(3(���������� �D��

�,����� &

��#������

�*?��� �&;�& -�114. ;�� 7 �$� � ���� $�/��

����) ��� ���� $�� � �� ���& *�� !������"�

��� -�������� � )� 1E�5&

��� �� �&� %� � �& @ "� �� � �&(H& -�11I. D�� � :�!(: ���

���� � �6 ������ �� 7/ ���� -���� ������

����.& � �.�� ��"������� *� �5�E�I0&

�� ��� �&#& @ '�� � �&�& -�120. � �� � C�� � ��� ��� (

7�� � ������, ���� ������� ���� � ��

�������� $ � � �� ���� ���� ���� � �� ����������

7� �� ������ ���� �� � $�������� ��� ������

�� ��$��� �D6 �� ;D6& ������������ +�� ���

�� 50IE5�2&

����� D&� �������(� �� &�&� B���� 9 �& @ ��A��8(

��A���8 & -�111. ��/�� ��������� �� �� �� ��

$ ������ ��� 7���� -�� � �� ���.) � �9� �� 7��� ��

� � $� ���$� � ���& ��������� � )� �41E�1�&

���� D&6&� �/�� �&� ����9� %&�&� �� ����9��� '&�

� �9��� %&%&� F� ���� �&� H���9 ;&H& @ 6�/ �&("&

-�000. ���/���� ������7 � �� �� ���� ������

$�/��(������ ����$� � �� �����

���� ������ ������& ��������� � +� <34E<2I&

�/ �&'&� ����� '&F&� ��� 6&F&� "�$��� B&'& @

��8� "&F& -�121. D���7 �� 7� � �������

��� ��� ��7��� ��� $�/�� ���� � �� ����

-���� ������ ������. ���� ����� � ���/���� �� ��(

7 �� /���� �� � �& ��������� � ,-� �5�E�II&

'���� &�&� F��"����� �&"&� 6 $$� �&�& @ ���*� �&�&

-�11�. ;�� ������ � � ����� ���� �� ���� �

���� ���� � ���� �� ����� � ����, � IA(

��� � ��� ��� � �� �� 7/ ����� ���� ������

����& �������� +�� ��� �� /����"� ).� �I�3E�I<I&

!��7� �$� B& &� !���� �&�& @ "��������� &!& -�11�.

;������ ������� � ����� ���� � �� �� ���������

������� � ����� ��9� ���� � ���� � ������

$�/�� ���� ������ �� � ���� � � � �������� �

�� 7/ ����� ���� ������ ����& ��������� � .(�

�I4E�45&

!��7� �$� B& & @ "��������� &!& -�11�. ;�� ���������

� � ����� � �� �8���(� 9�� �����7��

����� �� ������ � $�/�� ���� �� $ �(

���� �� 7� ��& ���� �� ��� ���� ����� 0���� �����"�

-�� 4E�&

!��7� �$� B& & @ "��������� &!& -�11�. ;������ ���$��

������ ���� � ����� $�/�� ���� �� ����

����� �� � ������� �� �� ����� � IA(��� � (

��� ��� � � ��� � � � �� ���� ���� ��� $ ��� �

���� $ �� ��(���� $ �� 7/ ���� -���� ������

����.& *�� !������"� ��� -�������� � .� �5IE�I4&

!��7� �$� B& &� F�����( �� �&� F�"�� �&"&� "/��

�& &� '����� D& & @ "��������� &!& -�110. ;�� ������(

��� � ����� �� 7� �� �$� �� ����

-���� ������ ������ �� �1 ����. � �� ���� �����

� ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��& �C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15

<1� � �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15

�� ��� � ���� ������ ��� ��� � ��� & ���� ��

��� ���� ����� 0���� �����"� )+� <3�E<45&

!���� (� ���� �&� ����7��$ 6& @ F�� �& -�114.

;����� �� �� ��$���� � � �� $�/�� ����

$��& *�� !������"� ��� -�������� � )� �<4E�53&

������ D&F& -�114. ��� $ ��� ���� �� �� �� �

��C� ������ � ���� � ����� �� $ �� ���� �� ����� $

���� C���& ��� ;��� �& � ���� �� � ������� �������

��� �����&

������ D&F&� F�� � D&�& @ ��9 � &"& -�11I. ��� ���

���� ��C� ������ � ��$ ���� � ����� -���������

�����. ��� ����� ��� � ���& ��������� � ,�� ����� �

��4E�<5&

6��/�� �&�& @ "��������� &!& -�114�. '����� � $����

���� � ����� ������ $�/�� ���� �(

������ � ��,����� ������� �� 7/ �����

���� ������ ����& ���� �� ��� ���� �����

0���� �����"� .*� �53E�I5&

6��/�� �&�& @ "��������� &!& -�1147. ;�� ������� �

,(������(���(��������� �� $����� (������ $

���� �� ��� � $�/�� ���� ������� ���� �(

�� ��� ������� �� 7/ ����� ���� ������ ����&

���� �� ��� ���� ����� 0���� �����"� .)� <�E5<&

6��/�� �&�& @ "��������� &!& -�112. �������� �

��$���� � $�/�� ���� ������ ������ � ����

/ �� ������ � ��� ������� � $���� ��, ����(

��& �����. �� *�� -����"� ��� *��� �� -� 501E5�1&

6��/�� �&�&� ���� �� F&�&� #� ��� B���9 �& @

"��������� &!& -�111. ������� � � ������ $�/��

���� / �� �������� � $���� ���� � �����

�� ���� � ����� �� 7/ ���� ��� $ ��,���

������������& ���� ����� -�������� � ��� !������"�

��"� �I�E�30&

"��������� &!& -�115. D������ � ��� ���� ��$� �

� ����) ��� �������� � ����9 �& ����� ��������"�

�����. �� �E34&

"��������� &!& @ !��7� �$� B& & -�11�. ��� � ���� $

������� ��� ������ � ��� ���� � � $�/�� ����

�� ;�6� �� ������ ��� $�/�� ����(�������

���$�� ����� � I(��� � ��� ��� � �� �� (

7/ ����� ���� ������ ����& ���� �� ��� ���� �����

0���� �����"� -)� <5�E<I<&

"��������� &!&� 6 �� ��� D&%&� F���� �& & @ ����� :&�&

-�110. ���$�� ����� ����, � �� �� �����(

� ������� � ��� $ ��������� � � ���

������ 6�� ������ ������� ���� �� ��� ���� �� ���

������ � ������� ���� �� �� ����� � �� �� �(

����� ����������� ����� ���� � ���� ���(

���� � ��������& *�� !������"� ��� -�������� �

-� �34E�44&

F���GA(������ 6&� F���GA�8(���7���A &�&� ���A �&�

#��� � � F&F&� ��A��8(& ��A���8 & @ B���� 9 �& -�113.

��/�� ���� �� � ���� � �$� �� � ����� ��(

�� ) ���$� ��� � ��� � ������� ��� $ ������ ���

7���� -�� � �� ���.& � �.�� ��"������� ,� �I<E�I1&

F������ !&� 6��/�� �&�&� ;���� �&D&� ���� �� F&�&�

#� ��� B���9 �& @ "��������� &!& -�00�. :������ �

������ � � � ���$�� ������ � �4�(������ �

�� ����� ������ $�/�� ����� �������� �

�� ���� � ���� ������ ������� �� 7/ ����&

+�� ��� �� *�� -����"� *+� 30IE3�I&

�D� -��� �� D������� ��� �. -�11<. ,�� ����

����� ����� �� *���1 ���� �� D�C� ����� �

����� � � ��� ��� ��& ��� �� ������� � �� ����

%��� $�� ��&

��A��8(��A���8 & -�000. ;�� ������� � $�/�� ��(

�� $�/�� ��$���� � ���$� ������� � ��

���� ���� ��� $ ������ ��� 7���� -�� � �� �

���.) � ���� ��� �/& *�� !������"� ��� -�������� � ���

�<IE�55&

��A��8(��A���8 &� F���GA(������ 6& @ B���� 9 �& & -�11I.

D�� � 8� �� ���� ��9� ������ � ������ $ $�/��

���� ������� � ����� � $�/�� ���� 7 �(

$ �� ��� (� 9� $�/�� �����(: �������� � ��

� ��� � ������� ��� $ ������ ��� 7���� -�� � �� ���.&

+�� ��� �� ,�� ����� �*� I53EII�&

��A��8(��A���8 &� %� � �& @ "� �� � �&(H& -�11�. '������ �

���� ��� (� 9� $�/�� �����(: ������� � $�/��

���� 7� �� 7/ ���� -���� ������ ����.

� �� ���� �����& +�� ��� �� 0$� ������� /����"� �,��

�24E�10&

D���� �&B& @ "��������� &!& -�115. ��� ��� � �� �

���� $ ������ ��� � ���� ������� � ������ ����

�� $����� ������� � �� ����� � $���$� �(

��� � �� 7/ ����R *�� !������"� ��� -�������� �

�� �<<E�50&

D ��� %&%& �� 6 $$� �&�&� ���*� �&�& @ '���� &�& -�11<.

:������ � � ����� �� �� � ���� � ���� �

���� � *��� �� �� 7/ ����� ���� ������ ����&

��������� � �� �I<E�31&

D�$��� �&�&� 6���� "&F&6& @ ���� '&�& -�11�. '������ �

���� $� ��� �� $������ �� �� �� � ������� �

������ �� $�/�� ���� �������� �� ��� �# ���

��� � �� ���� � ��� � ��� � � ���� ��� ��������&

���� �� ��� ���� ����� 0���� �����"� -,� <55E<I�&

����(;���� �&�&!&� �������� &�& @ "��������� &!&

-�11�. :������ �� ������� � � $� ���9 $ ��� �� ��

�� ����� �(��� ����� ������� � ��� �� ����

������ ��� ����7� �� �� �� ��� � ����� � ������ �

��������� � �� ������� � ���� �� �����

7�9 ������ ��������� ���������& +�� ��� �� 0$� �������

/����"� �,�� 32E2�&

���� �� F&�& -�115. D�$���� � � � � ����7� ��

� 9 ������ � �����7�����& ���� ����� -�������� � ���

!������"� .)"� 51IEI02&

������� &�&� "� �� � �&(H&� � �9�� $ �&�&� ��� $�� ;&�& @

�����$��� &!& -�11�. ;�� ������ � ������� $�/��

�� ������ $�/�� ���� ������� � � �� 7/

����� ���� ������ ����& ���� �� ��� ���� �����

0���� �����"� -�� 15E�0�&

�C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15 � ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��&

� �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15 <1<

�/��� $ D&F& @ '���� &�& -�11�. ;�� ������� � ���� $ ��

���� $ ����� � ����, � IA(��� � ��� ��� � ��

��� �� 7/ ����� ���� ������ ����& ��������

+�� ��� �� /����"� ).� �I�3E�I�I&

#� ��� ����� �&� F� B&�&� �������� %&� B�?� '&D& @

������#&F& -�112. ���$�� ������ ;< ��� $ ���� $>

������ $ � ��� � -� ���� �����������. ����� ����$�(

����� ����$� ���$�� ����� � ���� :: ����� �

�� � ���& *�� !������"� ��� -�������� � +�

�<IE�5<&

#��� �&F&� B��� �&� B �� �� &�& @ ���� �� F&�&

-�00�. �������� � 7 �� $�/�� � �� 7/ ����&

+�� ��� �� *�� -����"� *+� �I4E�3I&

<15 � �00� ����9/��� �� ��� "��� ��������� � ���� ��� ��� <2<E<15

� ����� � � �) ���� �� ������ ����� � ���� �� �� ��& �C��������� D�������� �00�� ��� <2<E<15