Biochemical analysis of a caveolae-enriched plasma membrane fraction from rat liver

10
Biochemical analysis of a caveolae-enriched plasma membrane fraction from rat liver We isolated and characterized a subcellular fraction derived from the blood-sinusoidal plasma membrane of hepatocytes enriched in caveolin and containing several of the molecular components described to be present in caveolae isolated from other cell types. A morphological study by electron microscopy revealed that it was composed of caveolae-attached membrane profiles. Immunoelectron microscopy of isolated fraction showed the specific labeling of internal caveolae membranes with anti-caveolin anti- body. Finally, one- and two-dimensional electrophoresis and Western blotting were used for the biochemical analysis of this new rat liver plasma membrane fraction. From the biochemical and the morphological characterization, we conclude that the caveo- lae-enriched plasma membrane fraction is a plasma membrane fraction, which origi- nates from specialized regions of the sinusoidal plasma membrane, enriched in caveo- lae. Keywords: Hepatocyte / Plasma membrane / Endosomes / Rat liver / Caveolin / Membrane trafficking EL 4108 Mario Calvo Carlos Enrich Departament de Biologia Cel.lular, IDIBAPS*, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain 1 Introduction The hepatocyte is a highly polarized cell with a plasma membrane organized in three different morphological and functional domains. The sinusoidal plasma membrane, the basolateral domain, facing the endothelial cells in the Space of Disse, is endowed with most of receptors for growth factors, hormones and metabolites; the lateral plasma membrane containing the junctional complexes such as the desmosomes and the gap junctions and finally the canalicular plasma membrane, apical domain, specialized in the formation and secretion of bile [1, 2]. The origin and maintenance of this functional polarity, with a well-defined distribution of proteins, glycoproteins, and lipids, implies a precisely regulated process of mem- brane trafficking, i.e., exocytosis and endocytosis [3±6]. In epithelial cells, two main types of microdomains at the basolateral plasma membrane have been demonstrated to be involved in the endocytosis: clathrin-coated pits and caveolae [7, 8]. Receptor-mediated endocytosis through clathrin-coated pits and vesicles have been well charac- terized in the hepatocytes; asialoglycoprotein receptor, pIgR, insulin, transferrin, or low-density lipoprotein (LDL) receptors are good examples of endocytic processes initi- ated in clathrin-coated pits at the basolateral plasma membrane [9±11]. Although most of the studied receptors that are involved in endocytosis or transcytosis are located in clathrin-coated pits, alternative ports of entry by nonclathrin-coated pits or the existence of caveolae in dif- ferent hepatocyte cell lines [12, 13] or in the liver [14] have been demonstrated. However, very little information regarding these membrane specializations in the hepato- cyte has been reported and also there is a lack of informa- tion about the importance or the functionality of caveolae in the endocytosis (potocytosis) or in membrane traffick- ing, although caveolae were discovered by Palade and Yamada [15, 16] almost 50 years ago. The presence of caveolin, the only structural membrane protein identified in caveolae, was demonstrated in liver by Northern blot [17] and in homogenates by Western blot [14]; also, studies on the internalization of specific ligands through caveolae have been shown [14, 18, 19]. Caveo- lae are abundant in endothelial cells, smooth muscle cells, or fibroblast but are most likely to be present in all differentiated cells. The liver is composed of parenchy- Correspondence: Dr. Carlos Enrich, Departament de Biologia Cel.lular, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona, Casa- nova 143, 08036 Barcelona, Spain E-mail: [email protected] Fax: +34-93-4021907 Abbreviations: ASGP-R, asialoglycoprotein receptor; CAN, canalicular plasma membrane; CEF, caveolae-enriched plasma membrane fraction; CURL, compartment of uncoupling of recep- tors and ligands; GPI, glycosyl-phosphatidylinositol; LAT, lateral plasma membrane; LDL, low density lipoprotein; LDLR, LDL re- ceptor; LRP, LDL receptor-related protein; MAPK, mitosis asso- ciated protein kinase; MEK, MAPK/ERK kinase; MVB, multive- sicular bodies; PKC, protein kinase C; RRC, receptor-recycling compartment; SIN, sinusoidal plasma protein; SRB-I, scavenger receptor type I 3386 Electrophoresis 2000, 21, 3386±3395 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 2000 0173-0835/00/1616-3386 $17.50+.50/0 * IDIBAPS, Institut d©Investigacions Biomdiques August Pi I Sunyer

Transcript of Biochemical analysis of a caveolae-enriched plasma membrane fraction from rat liver

���������� ������ � � �������������������� ������� ������ ��� ��� ����

�� ������� � ��� ���� ��� � ���������� � ����� � ��� � �� ��� ������������������� ���� �� �� ����������� � ���� � ������� � ������� ���� �� �� ����������� �������� ��� ��� �� �� � ���� � �������� ������� � �� ���� ���������� � �� ���������� ���� �� ����� � ��� ������ ������ ���� �� ��� ������� ������������������ ���� �� � ������� ���������� � ��� ������ �� ������� � ���������� ��� �������� ������� �� ��� �� �������� ���� ��� ���� ����������� �������� ������� ��� � ������������ ����� ���� ���� � ����� ������� �� ���� �� ��� ����������� ������� �� ���� �� �� ���� ������ ���� �� � ������ � ����� ����������� � ��� �� ���������� ��� ���� ������� �� ������ ���� ��� ����������� ���� ������ ���� �� � ����� �� � ������ ���� �� � ������ ����� � �������� � �� ���������� ����� �� ��� �������� ������ ���� ��� � ���� � ����������

��������� ���������� � ����� ���� �� � !������ � "�� ���� � #������ � $��� ��

� �����%�� !& '()*

����� ��������� �����

+��� ����� � ,�������#������� � �+�,� -.��������� � $������/��� ����� � ,� ������,� ������ -���

� ����������

0�� ���������� �� � ������ ���� ��� ���� ���� � ���������� �� � ����� � �� �� ���� �� �� ���������� ��������� ������ 0�� �������� ������ ���� ������ �������� �� ����� ����� ��� ��������� ����� � ���-���� �� +����� �� ���� ���� ���� �� ������ � �� � ���� ����� �� �� ���� � �����������1 ��� ���� �������� ���� �� ������� ��� 2������� ������3������ �� ��� ��������� � ��� ��� 2������ ������� ��� ��������� ������ ���� ��� ������ ��������������� � ��� �� ����� � ��� ���� �� ���� 4(� 56�0�� � ��� � �������� �� ���� �������� ���� �������� � ��������� ��� ������ �� � ������ ������ ������� ������ ������� � � ������� ������� � ����� �� ����� �� � �����%��� ����� �3�������� � ��������� 47896�

� ���������� ������ ��� ��� ����� �� ��� ������ �� ����������� �� ������ ���� �� ���� ��� ����� ����� �� ������ � ��� ���������: ����� ������� ���� ��������� 4;� *6� "������ ������� ��������� �� ��������� ������� ���� � �������� ���� ��� ���� ��� ����� ��� � ��� �����������1 ������������ ���� ������ ����"� ������ � ���� �� � ��������� ����� ���� <&+&= ������ � � � ��� �3������ �� ������� � ������� �������� � ����� ������� ���� �� ��� �������� �� ���������� �� 4>8((6� �������� ���� �� ��� ����� ������ ����� � � ������ � ��������� � � ��������� � ������� � ����� ������� ����� ���� ����� �� �� �� �� � �������� ������� ���� � ��� �3������ �� �������� � ����� �� ���������� ���� ���� 4(5� (76 � � ��� ���� 4('6���� ��� ����� ���� ������ � �� � ������ ��� ����� ��� �� ����� ���� �� �������������� � ��� ����������� ��� ��� ��� �� � ���� ��� � �� � ���% �� ��� ������ ����� ��� ���� ���� � ��� ����������� �� ��������� ��� ��������� <�����������= � � ���� �� � �����%���� �������� �������� �� � ������ � �� ���� �?���� 4(@� (96 ������ @) ��� � ����

0�� � ����� �� �������� ��� ��� �� ���� �� ���� ��� ���� ������� � ��������� ��� ����� ��� � ���� �� A� ��� ���� 4(;6 � � ���������� �� ����� ����4('61 ����� ������ � ��� ��� �������� �� �������� ������� ���� �������� ���� ��� ���� 4('� (*� (>6� #�������� � � ����� � ��������� ������ ������ ������������ � ��� ������ ��� � � ���� ��%��� �� �� � ���� � ������� ������ ������ 0�� ���� �� ������� �� �� �����

������������� + � #� ��� ! ���� +��� ����� � ,�������#������� � �������� � $������ /��� ����� � ,� ������ #������� ('7� )*)79 ,� ������ -��������� � ���B���������������� C7'�>7�')5(>);

������������ !"#�$� ������������ ���� ������ 1 � %���������� ������ ���� ��1 ���� ���������� ���� ���������� �� � �����1 �&$'� ����� ���� �� �������� �� ������� � � �����1 "#�� ���������������������������1 ' (� ���� �������� ���� ��1 ')'� ��� ����� ����� ����1 ')'$� &+& ������� 1 '$#� &+& ������ � ����� � ����1 � #�� ������� ���������� � ���� %����1 ���� $� D�!"D %����1 �*�� �������������� �����1 #��� � ���� %���� #1 $$�� ������ � ������������ ����1 !�%� �������� ������ � ����1 !$���� ������� ������ ���� �

77*9 ������������ 5)))� �� 77*9877>@

E ��&!?�F#� F� ��� G���� 9>'@( �������� 5))) )(;7�)*7@�))�(9(9�77*9 H(;�@)C�@)�)

. �+�,� -� ������� I������������ ,���J�K��� ������ � �-���

���� ����������� � ��� ������� ������ �����D����� � �������� � ��������� ������ &����� �� %������� ��� ������� ��� ������ �� �������� � ���� ������-�������� ���� �������� ���� �� ��� ��� ���� ��� ��� �� ��������� �� ���� �� �������� ����� 45)6 ��� ����� D����� ����� 45(6� /��%� ���� �������� ���� �������������� � �� ���� �� ����� �������� 455� 576� 0��� ���������� ���� ���� �� ������� ������ � ��� ����������� ���� �� ������������

0�� ���% �� %������ ��� �� ��� ���������� ������� ������ �� �� ��� ������� � ������ �� ���� ������������ ��� �������� "������� �� ����� ��� � ������� ������� � ��� ������� ����� ���� 45'6 � ���� ���� ����� ���� �� � ����� ���� �� �� ��� ���� ��� ������� � ���� ���� �� ��� ��� � ��� ����� �� ������� ��� �������� �� � ���������� ���� ������ ����� �� � ����� <#!�= � �� �� ���� � ����� ��� ������������ � �� ���������� ������ ���� �� ��������������� ��� ���� ��� ��� � �� � ����� ��� ��� ����� ���� ����� �� �� ����������� �� �� ������ ������������� ���������� � ���������� #�5C���������� ����� � ��������

+ �������� �� �������

+,� ����

$��� -� �����+����� ��� ������� 5))85@) � �� � %����� � ��� ���� ������� ������� ���� � (5 � � %�� ��� ��� ������ ������ ���� �� � � ������������� ����������� ��������� ��� � ���� �� � ���������� �� ��������

+,+ ��������

0�� �������� ��� � ���� ���� �� �: ���������� ���� ����� ������������ ����� ���� D#�� ����� ����$�%5� ����� ����"���(� � �� 0 ������� &��� ��� ���<&�3����� D?� /-�=1 ����� �������"�� <���5= � ��L����� -����� </������ A?� /-�=1 ����� �������� � � ����� ���������� � �� �#A <#���� $���� #��/-�=1 ����� ����������� � �� -���� <$� �� -���=�$���� ������3� �� <��;= ��� ���� �� + � F��%� G� %� </��� ���� �� $M��� � G� ���=1 ��� ���������� ����� ����� ������3� F� ��� � ��� � � �� ���� ��� �1��� ����� ����G�� ��� ���� �� + � D���� !� $������/��� ���� �� #����� ��� -� � ������� #�� /-�1 ��� ������ ����������� ������ ���� � <����-",��= ��� � ����� �� + � � �� "���� </��� ���� �� ����� ��G� ���=� �� �� ���� �� �3���� <�" =���2���������� � �������� �� � � �� ,���"� <�� ������ #��/-�= � ��� � ���� � ��2����� �� () � ��� ���� �� + � N� -��� </� ���� /��� ����� 0�� A���� ���=�

+,- !������� ���������� � ��� ������������ � ���

�� ��� � ��� ����� �� ����� �� ��� ��� �� ����������� �� �� �� ������� � ������ � �� �� ���� 45@85;6� ���� �� �� ��� �� (;��������� ��� ���� � ��������� ��� ��� �� ���� ��� �3� ����� �� ��� &+& ������� � 45*6� ��� �� � ���������� ���� ������ ��� ����� &+& <@ �� �� � ����= ��� �2���� ��� ��� ���� ������ 0���� �� ���� � ���� � �� � ����� � ���������� � )�5@ $ ��� ��� ���� � ������ ������� �� 0� �������� ������� � ������ �� � ������ ���� ��� ��������� �� � � �� ������ � ����� � � ��� ��� � �����: ������������� ����� <$F,= �� *�5'O � (>�7O������ ���� �� �������� �� ������ � � �����<#/"&= �� (>�7O � 5*�*(O� � ������ � ������� ������ ���� <""#= �� 5*�*(O � 79�7;O ��� ��� ������ � ����� ���� � � ��� �� �� �� ��� ��� ���� �� 79�7;O � '9O�2��� � ��� ������ �� ����� ��� ���� ��� ���� ��������� ��� ���� ���� +�� �� ��� ����� ���� � ������ ��������� ���� � ����� ��� ����� #!�� 0�� �������� �������� ���� �� ���� ������ � ������� � �� ��� �� ������ �� �������� ����� �� ���������� �� � �� ��� �� �� ��� ��� �� ����� � !��� 45>6�

+,. +�) /� �������������� �� 0����������/

�� 5�+ ����� ���� ����� ��� ���� ����� ��� �� ����� ��� � ������ ��� � ����� � ��� ������ ����� ������ �� ������ ���� �� � ������� � ������ 45;�7)6 ��� �� ������ �� ���� ��� � ����� �� #!�� , ��������� LI�� ��� �� ��� 47(6 � ���� � ��� ��� ���� ���������������� ���� � $��� ���� �� 5�+ #!&& � �� ,���"� &��� ��� ���� 0�� �� �� ������ ��� �� �� �� ���!� <7 � �� ;@) F= � 'O ��� ������ ������ ���� �������� 5O �� �� ����������� �� 78() <,���&��� 7�()��������� � �� ,���"� &��� ��� ���=� >�5 $ � ��� 5O������ #��97)� $��� �� � ������ <(@ �� � ����= �� ����������� � >�* $ � ��� 5O ������ #��97)� 5O �� �� ����������� �� ;8> <�������� �� ;�)8>�)1 ��� ���� �� ����� ,������� /������� -���= � ()) �$ +00��!� ���� �� � �K����� ��� <@ �� �� ��� ����� ��� �= �( �& �� �K����� ���� ������� <)�)95@ $ 0 ����#�� �� 9�*�5�7O -+-� ()O ����� ��� ()) �$ +00� )�))5O � ��������� ����=� �!� ���� �� � ��� � �� 8*)�# ���� ������ � ��� �� ��� ������������� �� 0�� (�+ �5�+ -+-� �G! ���� <() � (5O= �� � �� �� ��� ����� ��� �� &������ 4756� ���� ����� ���� ����� ������ � ����� �� ��� ����� �� ,��� �� ��� 4776 � � ����� � ����� ���� �������� �� 9) F �� >) �� �� '�# ����������� � ���� ���� ��� <$������ �� ,��� �$�� /-�= � ������ �� � ������� ���� ���� ��

������������ 5)))� �� 77*9877>@ #��������� ���� ���� ��� � �� �� ���� 77*;

#�����������+�)�

�������� ����� � 0,- ������� )�@O ���� ��%���� ���%� ������ ��� ������ � ���� ��� ���������� ��� !#& ������ <��� ����=�

+,1 ������ ���������� �� ���������/

� �� ���������� ���� �� ��� �� ���� ��������� ����������� � ������ � ��������� ������ ���� �� ����� �� ��� �� ����� � ��� ������� ������ � �� �������� ������ �� � ��3� � 5�@O ����� ������� (O �� ���� ������� � )�( $ ��������� ����� � �� ;�'� � � ���� � �� ����� � ��� ������ 47'6� �� � ������������������ � ��� ������ � ������ �� � ������� �� (@ �� � � !���� � ��� ���� ����� � �������� ��� ������ ����� (:( ���� ��� ,- � ������������ ���� ������� �� � ������� � ������� ������������� ������������( <(:())= � ,- ������� (O,-� �� ( � �� ��� ����� ��� �� #�� �� ������� �� �������� ���� ,-�(O ,-� ���� � ������ �� ������ �� �� ����� �� ��� �������� � ,-� -�������� � ��� ������� ���� � ���� � ��2����� �� @ � () � ��� ����� ���� ,-�(O ,-� <(:>@= �� ( � �� ��� ����� ��� �� ���� ���� �� ������� ������� �� ���3� � (O �� ��� �������� 5�@O ����� ������ �)�( $ ��������� ����� � �� ;�'� �� 7) ��� ���� �� �� ���� � )�( $ ����� ��������� ����� � ��� ������� �� �������3� � (O L�L' � )�( $ ����� ���������� �������������� �� � ����� � -�� <-����=� � �����3�� ������ #!� �� � �� ��������� ���� )�(O ������ �� ��� �������� ���� ��������� ������������( ������� � )�)5@O ����� � �� ��� ������ 45'6�

- $����� �� ���������

-,� ������� � ��� ��� ��� ����

�������� �� ������� �������� � ������� �� ���� ����� ��� � �� ���� �� ���� ����� ����� ���� �: <�= ��� ����� ��� ���� <�� �3����� 0 ��� P�())=� ���� � ���������������� �� ������ �� �3� ��� � �� ���� �� � ������� � �� ����� ���� ��� �������� � ����� � ������� ����� ���� �� � ��� ���� � ���� � �������� 47@87*61 <��= ��������� �� ����� �� ����� ��� �������� ����� ��� ���� �� �������� � ����� � ����� 47>61 <���= � � ��������� ���� � ������� ��� ����� �� ��������� ����������� ������ 4')� '(6� !���������� ����������� �� � ������ �� ��� �������� �� �������� � ����������� ����� � ������ ��� ���� �� ����� �� �������� � ������: <�= ���������������� �� ������ ���� ����� � ������ �� ��� � ����� ��� ��� � ��� � ���� ����� <��= ������� ����� �������� <������� ��� �� �������� ��=� ������ � �� �� ����� � ���� �� ������ ������ �� ��� ���� � 0�� ����� ��� �� ��� ��������� �� ������� �� � � ����� ���� �� � ���������� ��%� �������� �� ������ ���������� �� G���� ��������� ��������� ��������� � ��������� 45'6� 0�������� ���� �� � ����� ��� �������� �� ������������������ �� ����� � ���� ���� ���������� ������ � ���� � @I����������� ���� ��%� �������� ����� ������ �� ���� �� �������� � ������� 45'� '56� �� �����K��� ������� �� ��� ���� �� �� ������ � ����� ������� � �� ���� ���� ��� ��� #!��

� ���� �3�� ������ �� ���� � ��� ��� ����� �� ���������� #!� � ����� ��� ���2���� �� ������������� ���� 0 ���� P�()) � ��� ������� � � ��� ��� � ���� �� ��

77** $� #���� � #� ! ��� ������������ 5)))� �� 77*9877>@

��/��� �, -+-������� ��������� ����� ���� ���� �� �� ���� �� ���� ���������� � �������0�� ����� �� � ���� � �������� ��� (@ ��� -�� �������������� ���� ��1 #�A� ���������� ������ ���� ��1 &�0����� �� ������ ���� ��� #/"&��� ����� ��� �������1 $F,����� �������� 0�� ��� �������� ���� #�������� ������ ��� < ����= ������ ��2� ������������ <.= !������������ � ����� �� ����� ��2� � �������

�� ��� �� &� �� ��� 4'76� -������������ ���� )�(O 0 ��� P�()) �� � >)O �� ������� � ��� �������� ������� ��������� ���� ��� ��� ��� ����������� �� ���������������� ���� �� � ������ ��� ��� 47@6� ������ � ���#!� ��� ���2���� �� ������������� ���� (O 0 ��� P�())�� '�# � ��� ������� � ��� ��� � ����� �� ��� ����� �� ���� � ��������� ����� �� ������� ������ � ����� ����� ����� � ����� <79O ��� ���= ��� ������ �������� <>8('O ��� ���=� � �� ����� ���� ��� ��� �����

�� �������� ������� � ����� ������ ���� ��� ����45'� ''6� 0�� ���� � ���� � ��� � �� � ��� ��� <�� ������ ���� ��� ���� � � ����� ���� ������ ����=��� ���� �� �� �� � ��� ����� � �� ���� �� ����� ��� ����� �1 ��� ���� �� � ���� � ��� #!� ��������� ��� ���� <C (;��������� ��� ���� <!!= C &+&:(>�@ Q ;�)1 � � ������: 55�( Q (5�) �� #!��� ���� <� R;==� 0�� ����� �� ������� � ���� ����� ��� ��� ����<�� ����=�

������������ 5)))� �� 77*9877>@ #��������� ���� ���� ��� � �� �� ���� 77*>

(��� �, #���� ��� �� ������� � ������ ���� �� � ����� � �� �� ����

G ��� ���� #/"& $F, ""# #!� -�A #�A &�0 "��� A���� � ���

� "�� ' CC C CC C 45'6"�� @ CC 8 CCC C 8 8 8 45'� @@6"�� (( CCC C C C 0��� �� %"�� (; CC CC C C 0��� �� %��3� � CC CC C 4@56��3� �� C 8 CCC CC C 8 8 45'� @56��3� �F CC 8 CC 4@56��3� F� C C C C C C C 45'� @56 ')#����� ��� CC CCC 8 8 8 8 45'� @;6���� 8 8 C CCC C CC CC 45'� 7)6 *(0����� C 8 CCC C CC CC CC 47)� @56 ���� ���� � CC C CCC C CC 8 CC 4@5� @96 5������� C 8 CCC C 45'6 5;

�� !G�" C C CC C CC 8 8 4@76G�� CC C CCC C 0��� �� % *@#������� C C CCC CCC CC CC CCC 4@5� @*6 ��� D#� C 8 CC CCC 45'6 7*#������ C 8 CC CCC C 8 C 45'� 9'6 (';�('*"�� 8 C CC CC C C C 4@7� @>6 (@5�(@7"���( C C C CCC 4@76 7'$� D 8 8 CC CCC 4@76$!D5 8 8 C CCC 0��� �� % �� � ����

��� ��� ,()) C CCC 8 8 0��� �� %���� C 8 CC 8 45;6

�F 0�" C CC CC 8 45;6�-G �" CCC C CC 8 CCC 8 C 45'� 9)6���" CC 8 CCC 8 CC C 8 45'� 9(6-",�( 8 8 8 CCC 0��� �� %&" CC C CC 8 CCC 8 8 0��� �� %&+&" CC 8 CC 8 C 8 8 45;6�(����� � CC C CC 8 CCC 8 8 45;� 976

F #�CC��0 ��� C 8 CC CCC 45'6A��D��0 ��� 8 8 CC C C 8 C 45'6@I�A0 CC CC CCC CCC CC CC C 0��� �� %� 45;6��� ����� C CC C 8 CC C C 0��� �� %� 4956

����� � � ��������� � ���� � ����: �� ������� �� %� � � �����%������ � �����1��� ����� � ������� ��������1 ���� �����1 �F� ������ �1 F� ������ � ���� ��� ����� ����� ��� ������ �� �3� ���� �� � ��� � � ������� ������: CCC ����1 C� ���1 8� ��������1 ���% ������ �� ��� ����� � ����� �� ������ � ����� ������A���� � � ��� � ������� ��� �� � ����� ������� �� ��� ���� �� ����� �!G�"� ���� ��� � ���� ����� ������

0�� ��2� ����������� �� #!� <#������������� �������= �� � ����� � ���� ��� ������ ���� �� � ������� ������ � �� ��� �� �� ����������� ����� <������������� �� � ��������� = � ��� � ���� �� �� ��� ������������ �� ����� � !��� 45>6 � ���� ���� ����� �� ������� � ������ <���� (=� �� ��� �� � ���������� � �� ����� ���� ��� �������� �������� ����������� ��� ���� �� ����� ����� <����� ������ ����� �� � ������� ����� ����= 47)� '@6� ��� � �� � ��������� ��� ������ ��� ���������� ����� � �� �������� ������ ���� ���� ������ � ���� �� ��2� � ��������� � ����� � ������: ����� &+& ������ � ����� � ����<&" = ��� ��� � ���� � ��� �������� ������ ����� �� � � ��� ������� � ������� ��3� F� ����� � ����� � ��� ������� � ������ � � #!�1������� ������� � ������ ������ �� �� ������ ��&+& ������ <&+&"= � &+& <���,�())= �� �� ������ ���� � ������ � ��� ����%�� ������������

-��� ���� �� ������ ���� �� � ����� �� � ���� � ��������� � �� ��� ������ ���� �������� � � ������ ���������� ������ ��� ��� ������ �� ��� ������� ������� ��� #!� ��� ��� ������� -�� �������� ������ �������� ���� ��� ������� ����� �� ��� ����� �� ��57O �� ��� ������ ���� �� �� ���� � �� � �� ��')O �� ��� �������� �� ���� � �� 4'96� �� ��� �� ��� �������� ��� ����� ���� �� ����� � ���������� �3���� ����� � ��� ��� �� ��� ������� ����� 4';61 ����� ������ ��� ������ ��� �� ������ ���� �� � �������������� � �� ���� ������ � ������� ����������� 4'*�'>6 ���� �� ������� �� ��� ���� ���� ����� � � � ��������� ���������� ���� ���1 ������� ����������� %� � ���� �� ��� 7) %+� ���������� � ���� ������ � F!����� � <� "!#��( �����= �� � ������ ��� �� �� �� � ���� � ��� ������� ������� � ���� �� � ������ 45'� @)6� 0�� ��� �� ����� ��� ������ ��� ����������� �� � ��� ������� � ��� �� #!� ����� �� �������� ���� ��� ���� ���� �������� � � ����������� ���� �� ���������������

0�� ���������� ���������� �� #!� ��� ������ ����� �� ���� �� ��������1 0���� ( ����� ��� � ����������� � ��� ������� ����� �� ���� � ����� ������� ������� � ���� ������ ���� �� � ������� �� �� ���� � #������ ��� � ���� � ��� ""# � �#!�� ������ � ����� �� ��� ����� ����� �� �������� � ���� <� ��= ����� � � ���� � ����� <$F,� ;7 Q7*1 #/"&� (5) Q *)1 ""#� 75' Q 9;1 #!�� >)@ Q 79*1 �R (5 �3�� �����=� � ��� ������� � ������ �� ��������� #!� <9@O= ��� ��� � ����� ������� ��� ������������ �� ������� ������� �� ""# <77O= � #/"&<5O=� A� ������� ��� ������ � ��� $F, � �������������� ������� ��� ��� �� %� �� #!�� ���� ���������� ����������� �� #!�� ��� ����� � ���� ���

����� � ��� ���� ����� �� ��� ���������� ���������� ��� �� �: ��� ���� � ������ �� ����� ���������� #�5C��0 ���� ������� ��������� � ���� %����<$� D=� $� D�!"D %���� <$!D= � "���(1 ��� ���% �������� ���� ��� ��� ����� �� ����� ������ � ������ ���� ����� ������� ���� <������������ ���� ������

77>) $� #���� � #� ! ��� ������������ 5)))� �� 77*9877>@

��/��� +, !���� � ��� ������ �� ������� ���� ��� ������ � �� �� ���� #!� ������ �������������������� ��� <� ������= � ���� ���� �� �� ����� �� ���� ������� �� ���� �� ��� ������ � ��� � �� ����������� ������ ���� ��� <�=� <�= +������ �� �� ���������� �� ���� �� �� #!�� <= #�������� ������ ����� �� � ����� ������ ��� �� �� ����� �������� ���� �� �������� ���������� ���� �� �� #!�� ,� � ()) ��

��/��� -, ���������������� �� ������� � �������#!�� ���������� � ��� �� ���� �� ��� ���� ������� ��#!� ������ <� �������� �����K��= ���� ��� ���������� ������������ � #!�� �� ��������� ���� )�(O ������� ��� �� ������ �� � ����� ��������� ���� ��������<� ������=� ,� � ()) ��

<�-G �"=� &" � � ���"=� � ��� �������� � ����� ��-",�� <0���� (=� "������� -",�� ��� ���� �� �������� � �������� 4@(6�

-,+ &������������ ����������2���� � ������������������ ������

,� ����� � ��� ������ �� �� �� ���� �� ���� #!� �� ����� �� � ����� ���� ������ � �� �� ���� �� ����������������� ���� �� � ������ <� ������=� 0�� ��� ���� ���� �� ��� ���� ���� ��� ������� ��� ��������� ��� (@)85@) � ���� '@8*@ � ������� �� ������ �� ������� <���� 5=� ���� � 5� ����� � ����� �� ������� ����� ���� �� �� ���� � ��� � #!�� ��� ����������������� ���� �� �� ���� �� 0���� �� ���� �� � �������� �� ����� � �� ��������� ����� ������� �� -�����

�� �� ��� 47@6� 0���� ���� �� ���� �� ������� ����������� ���� � ������ ����� � �� ��� � ��%��� �� ��������� ���� ��� � ��� ������������� � ��� �������� � �� ��� ��������1 ��� ������ ���� �� �� � ���� ��� �������� ��� ��� ��� ��� � ����� ��������������������������� <G �=����� � � �����47@6� � ����� �� ������������� �� ���� ������ @I����������� � ����� ���� ��� <�� ����=� 0�� ����� ��� �� ��� ���� �� � ������ �� �� �� ��� ����������������� ������� � �� ��� � ��������� � ������A� �������� ������� ����� ����� <�� � $F, � #/"&=�� � ���� �� � #!�� 0��� � ����� ���� ������ ������ ���� �� ����� �� ���� ����� ���� ������� ��� ������ ��� ����� ���� ��� � ����� � ���� ��� �������� ���������� �� �� ��� ����������� � ����� � ��� ��������� �� ��� �� ��� ��������� ������ ���� �� 4''6 ��

������������ 5)))� �� 77*9877>@ #��������� ���� ���� ��� � �� �� ���� 77>(

��/��� ., 5�+ ��� ����� ���� ���� �� #!�� ���������� �� ��� 5�+ ��� �� � ��������� �� ����� ������ ����� �� �!�� �� 7�@8*�;1 �G!� 55)8(' %+��

���� <���� 5= �� ����� ��� ���� #!�� 0���� ����� ��� ������� �� � ���������� ��������� �� �������������� ���� � ����� ��� ���������� ���� �� � ��#!�� � � � �� ���� � ���� �� ���� �� ������ � #!��� ����� �� ��������� ���������� � ��� ������������� �� ������� � ������ ��� �� �� �� ���� ������������ ������� � ���� 7 ��� ��� ������� ���� ����� �� ������������ �� ����� �� �� �� ���� ������ ��� ����������� ������ ������������ ������ ��� �������� � ����� ���� ��� ���� ���� ��� � �� ������������� ������ � ��� ����������� �����

-,- +�) ������������ �������������� � ���

0�� � ���� ���� ���� �� ���� ��� ���� �� ���������� ����� �� ��� �� �� ��2� ������ ���� �� ������� ��� ���������� � �� ��� ������� � ������ � ��� ��� �� ��� � ����� �� ��������� ������������������ � ����� ���� ��� 45;� 7)� '@� @56� 0��

��� � � ��� � ��� � ��� ����3� �� ���������� � ��������� � � ������� � � ��������� � �����%��� ���� � '����� � �� ��������� ����� ������ 5�+ ��� �� #!�1 (;)����������� �� � ������ � #!� � ��� �� ��� '�)8*�9� �������� ������ ��� �� (' )))85)) )))� �� �������������� �� � ����� � ��� 5�+ ����� ��� ���� �� ������� � � �� �����: �� �� ����� ������ � ��� ���� �� ����� ����� #������ 5�+ � ����� ���� ������K���� (( � ����� �� � ������� � #!� <���� @ �0���� 5=� ���� � @ ����� �� �� � ��� �� #!� ��� � � ������� ����� ������ � ��� ����� � �������� ������� ������� �� ����� ���� < ���� �����=� � ���� @��� ����� ���� �� ��� ��� �� ���� ��� � "���( � � ����D���� #� < D#�= �� � ��������1 "���( ��� �������� ��� �� � ����� �� <*�@8>�)=� �� ��� ������ �� ��� �!� ����� D#� ��� ���� ������ �� 98;� � ���� @�� $�%5 �������� � �� �� S 9�5� � �� ����� ���� ��� �� ��� �� ���� ������� <5�+ �������: /"&� ��������������%�������������=� G�� ��� ������ � ��� ��� �� �� @89�

77>5 $� #���� � #� ! ��� ������������ 5)))� �� 77*9877>@

��/��� 1, ����������� �� � ����� � #!�� &��� ������ ����� ������ 5�+! �� #!�1 ���� ���������� ��� �� ������ ����� ������ <�= D#� � "���(1 <�= $�%5� G�� � ��3� ��� � <�=������� � �� "���

��3� �� ��� ������� � ��� 5�+ ��� �� ��� ����� ��������� ��� �� ���� �� ���� ��3� ��� � � ����� ��<79�9 � 7;�9 %+�1 �� ;�' � ;�)� �����������=� ����������� @� ����� ��� ����� ����������� ���� �� ������� � "��� 0�� ��������� ������������( ������ � ��2� ����� ����� ��� �� ���� �� ��� ���� ����� ����� � <������� �� �� @�* � 5(�@ %+�= �� ������� <���� ���� ('; � ��� ����� ������ 5�+ ���=� 0�� �������"�������� ��� ��� ����� �� �� "��: ���"��� ��"�� � A�"�� <���� � �� ���� � �� '�@ �� ;�)=1 ��� ��� ���� �������� <���� @�= ��� �� ���� �� ����� ����� ��� � ����@�� �������� <���� (9; � ���� '= ��� ���� ��������� ��� ��� ����� <�� � �������� ����=� � ��� ����� ������ ���� �� � ���� � ����� <0���� (= 4@56�

��� ����� � ���� ������� � ������ <#/"&� $F, � ""#=� �� �� �� ���� �� ����� �������� ��� (�+ �������%� �� � ������ � ��� ��� ��� 5�+ ����� �� #!� �� ����� �� � ��� ��2� ����� �� �� #!� � � <�= ���% �� ������� ����� < ������� �� ��� ����� ����� ���� ���� ����� �� � �������� ����= � <��= � ������ � �����%������� � ����� <����� �� ����� ������ � ����%� ����=���K������ � ������ ���� �� � ��� ������ ���� ���������� � � <���= ��� ��� ���� �� � ����� � ��� ���� �� � ������ �� ��� "�� � ������ � �� ����� ���� � ������� � ��� �� ��� G0 ����� � ������ <��= ��� ���% �� ������ �� � <�= ��� � ������ � ����� � ����������������

������������ 5)))� �� 77*9877>@ #��������� ���� ���� ��� � �� �� ���� 77>7

(��� +, ����� ������� � #!�

�����= $��� ���� ��� �3� �� A���� � $F,�= #/"& ""# #!�<%+�= ���

G�� '@�7 @89 *@ * (9 7' '5 D#� *5 98; 7* �� ' 5) ;9#������ 5( @�(�@�* (';�('* �� 9 9) 7'�� "�� 5( @8; (@5�(@7 5 () '* ')"�� ( ;' *�@8> 7' (' (5 7( '7$!D 5 ';�@ 9�5 �� � ���� �� @ (@ *)��3� �� 7; ;8;�' *>�>) ( 9 ;; (9��3� F� 9* 9 ') 5) 7* 5@ (;���� '7 @�)�@�( *( �� �� 9 >'������� *@ @�@ 5; �� 5 95 79���� � ((* 9�' 5 (@ (' 7> 75

�= ������� �� ����� ��������� � ��� �� ������ � ����� �������= +�������� �� K��������� � �� ������

��/��� 3, #������� � �������� � �����%��� 0�� ����������� ��� �������� ���������� �� ���� ���� ��� ��������������� ������ � ���������� <����� ������� ����� ## =������� ������� ���� <A## =� ��������� #������� ������ ����� ��� ���� � ������������� �� �������� <""#�= �� ���� � �������� ����� ���������� ��� ���� ���� ��� �� ����� ��� �������1 ""#�� � ���������� �������� �� �� � ����� ����� ��� �������1 �""# � ������� ����� ���������� � ��� � ���� � �� ������� � ���% �� ��� ���������� ��� � �� ��� �� ��� ��������1 -�#� ��������� �������� ����� ����1 �2� ����� 2�������

-,. ��� �� ��� �������� ����������

#������ �� � ���� �� ������ ���� �� � ���� ������� G���� � � �������� ����� �� ��� �������� �� ���������� �� <��������=� #������ ������ ������ �������� ���� �� ����� ����� � � ������� ��� ����� ��� ������� ����� ����� -��� �� � ����� ������� ��� ��� �� �� ��������� ���� ������� � ����� � ���� �� ������� � �� ��� ���� �� ���� �� ���� ���� �������� ���������� ������ ��� �� ����� ��� �������� <#/"&= 4@76� �� ���� � ����� ���� �� ���� ��������� � ��� ""# ��� � ������ � ��� ����������������� �� ���� ��� <#!�= <���� 9= ���� ���� �� �� ��� T�������U �� ��� �� ������ �� ������� � ������������������� �� ��� ����� � ������� ������ � � ����� ����� ��� ������� ����� ���� 4@'6� 0��� ��������� �� ���� � ����� �� �� ������� �� !G� 49@6� #����� �� ��� �������� ���������� �� #!�� �� ����� ���������� ���� ���� ��� �� ���� ��� �������� �� �������� ����������� �� �3����� � ����� ���� G ������ � � ������ ������ ��� ��������� �� ������������� ���� ��� ��� �������� ������ ���� �� ������� � ������ ������� � ��� ���������� � �����%���������� ������ �%���

. ������/ �����4� �� ������������

0�� ��� �������� �� ���� ���� �� ���� �� ���� �������� ��� ���� ��� � ����� ���� �� � ����� � ���� ��������� ���� � �� ������� ������ ������� �� ��������������� � �� ��������� ������ ���� � ��� ����� ������� ������� �� ������� ������ �� ���� ���������� % �� � � �� ��� �� ��� �� �������� �� �������� � ��#!�� �� �� ��� � ������ �� ������ �� ���� �� ���������� �� ��� ����������� �� ��2� � ����� �� ��� ����K����� � ����� ������� ������ ��� ����������� ��G0 ����� � ����� <"�� � �����= � ��� �������� ����� �������� ��������

���� ��� ��� ������ �� � ����� ��� ��� ���������� �������!� �� "������ #$ %�&''()*� +� ��� �������� ���� ������� � ��� ,-��.��� "�������� � �/�����, �� ���0��.������ � 1������� �� ��� ������� ������� ������&�����

"������ $� �� 7� 5)))

1 $� ������

4(6 !���� �� ��� 1������ 1����� 2��� (>*)� �'3� 5;89'�

456 !���� �� ��� 4������ (>*(� �� '@58'@;�

476 ,� ����� N� "�� ����� � �� &�� ������ 1������ -��� (>**��)� (*(8(*'�

4'6 $���� � D�� $������ ��� "���� 5��� "��� 1��� (>>'� ��@'@8@@'�

4@6 $������ D� !�� #� ��� $� ��� 1������� (>>@� ���(5>8(7*�

496 V��� �� $� $� �� ���%�� �� +�� 1������ 6� (>>*� ))��5@;859>�

4;6 $������ ��� 2���� 7�.� "��� 8�.� 1��� (>>9� � � @;@895@�

4*6 �� ��� "� G� ��� 2���� 7�.� 1������ (>>*� ���(>>855@�

4>6 #�������� � ��� -���� ��� �� &�� &����� �� ��� "��� �%()�) � ��9 �:�

4()6 G����� �� N�� -���� N� ��� -� ���� G� N� �� $�� &����� �� ���-���� ��� �� &�� "��� (>*7� ) � 5;;85*;�

4((6 G����� �� N�� -���� N� ��� -� ���� G� N� �� $�� ���� � N���� ���� �� D�� ������%� ��� -���� ��� �� &�� "��� (>*'� )��(>@85)'�

4(56 $������� "�� "���� N�� "��� �� ��� L ��� &�� ;����� (>*5� %�� 9@(89@7�

4(76 ������ N� "�� D ���� � !� �� ��� L����� ,� N�� $�A���� $���� 6� "��� 1��� (>>*� �3�� *@8>>�

4('6 $������ &�� -����� -�� -���� ��� A� ��� D� "�� ,� �� 0��,�������� "�� D��� �� G� $�� 6� 1��� "���� (>>@� �'�(@9*98(@9>5�

4(@6 ����� G� !�� 6� 2�� $���� (>@7� 3� ('5'�

4(96 ?����� !�� 6� 1����� 1������ "���� (>@@� �� ''@8'@*�

4(;6 G���� N � N� "�� <�1- =���� (>>5� )�3� '@8'*�

4(*6 N������ $�� ���K���� ��� +����K����� ,�� 6� 1��� "����(>>(� ��� (5*@*8(5*9@�

4(>6 N������ $�� #���� N� �� +����K����� ,�� 1������ 6� (>**� :)� ;7@8;'7�

45)6 0����� ?�� L����� $�� ���� 0�� 2���� 4����� 6�� (>*7� 3��')(8'59�

45(6 L����� $�� ���� 0�� 2���� 4����� 6�� (>*9� 3%� *78()7�

4556 ����� "� !�� ,������ N�� $������ "� ��� ,������� +� $�� 6� "���1��� (>*@� �''� ()78((;�

4576 L�� �� $������� +� �� -������ � N� !�� 6� "��� 1��� (>>*��3�� ()(8(('�

45'6 ��� ��� #����� $�� &�� ��� ! ���� #�� 4������ (>>>� %�(*'*8(*@;�

45@6 ,����� � N� +�� �������� "� &�� , ��� -� !�� �� ��%� #� ���NW�%��� -�� -����� � �� N�� ������ "� N�� $��� ;���� 2����-��� 0-2 (>*;� (3� 9;*@89;*>�

4596 NW�%��� -�� "�K����� !� ��� , ��� -�� �������� "� &�������� "� N�� 6� =�� 7��� (>>(� ) � '*@8'>*�

45;6 ��� ��� L ����� +�� ! ���� #�� 1������ 6� (>>;� ) )�'7@8''7�

45*6 #���� ?� -�� ���� � !� !�� #��� G� #�� ������ "� N��6� 1��� "���� (>;>� :3� ((79)8((799�

45>6 ����� � $� ��� !���� �� ��� 1������ 6� (>;@� �3��7;@87**�

47)6 ! ���� #�� 0����� �� !���� �� ��� 1������ 6� (>>)� ��� (;(8(;*�

47(6 LI�� ���� � V�� G����� �� $�� LI�� ���� � ��� "��� (>;;�� � ((778(('5�

4756 &������� /� D�� ;����� (>;)� �� 9*)89*@�

4776 ,���� ��� ,��� � ��� G ���� ��� ������������ (>*;� (�>78>>�

47'6 �� ��%� #� ��� �������� "� &�� -������� !�� !� �� G� ��������� "� N�� 6� "��� 1��� (>*@� �''� (@@*8(@9>�

77>' $� #���� � #� ! ��� ������������ 5)))� �� 77*9877>@

47@6 -������ � N� !�� $������� +� �� +�� �%� �� $�� &��� N�� L�� �� -������ (>>@� �%� ('7@8('7>�

4796 #���� �� N�� ?��� ?� -�� "����� �� D� G�� ����� � A� $��0� � � �� N�� G�������� �� ��� +� G���� �� N�� $����� -�$�� G����� �� #�� �� ��� "� G�� 6� "��� 1��� (>>'� � ��(5;8(7*�

47;6 &������ $� �� -��� � � � !�� F���� ���� N�� 0��� V�� �� ������%��F����%�� ��� 0�� ?� ��� #��%� "� ��� -� ��������$�� 6� "��� 1��� (>>'� � �� (((8(59�

47*6 &������ $� �� 0��� V�� -��� � � � !�� -� �������� $�� ����� ��>���� (>>@� :'� 9@@899*�

47>6 -�� �� !� N�� ?��� ?� -�� $���� #�� �� ��� "� G�� $���;���� 2���� -��� 0-2 (>>@� % � ()()'8()()*�

4')6 -��� "��F�� "��� ��� �� G�� ������ +�� ����� D�� -������ &� G�������� &�� ����� G� !�� �� 1��� "��� (>>;� (�@>@89)@�

4'(6 L�� �� -������ � N� !�� 6� 1��� "���� (>>>� �3�57(''857(@'�

4'56 ��� ��� ! ���� #�� ������������ (>>;� �(� 5@'*85@@;�

4'76 &�� -�� L%������ 0�� #��� $�� -� �������� $�� #�������N� !�� ����� -� ��� A��������� ��� &������ $� �� 6� 1���"���� (>>@� �'� (@9>78(@;)(�

4''6 -� �������� $�� -���� $�� 0��� V�� &������ $� �� 6� "���1��� (>>7� � � ;*>8*);�

4'@6 !���� �� ��� ! ���� #�� 1������ -�� ������ (>*>� ���9(>8955�

4'96 ,����� ��� ,���� � "� �� ������� !� "�� 6� "��� 1��� (>;;�� � ''(8''@�

4';6 �� ,� %��� 0� N� #�� D���� � N� ��� �: ������ !�� D��%� +� &�<!��=� ?����� "���� ��� 5���� -�������� "����� !������ �A������� ����� �� (>;;� ��� 5>>87)9�

4'*6 ����� � $� ��� !���� �� ��� 1������ 6� (>;;� ��3�'(@8'55�

4'>6 ,������ � N� F�� ������ +�� 6� 1��� "���� (>*9� ���;''@8;'@'�

4@)6 -��� � #� N�� #�� ��� �� "�� 6� 1��� "���� (>;>� :3�''@;8''9(�

4@(6 ,������ N�� 0 ������� ,�� "������� ��� -�� �� !� N�� �� �� "�G�� P�� -�� D ���� � $�� 6� 1��� "���� (>;;� � �(75'58(75'>�

4@56 ��� ��� L ����� +�� ! ���� #�� 1������ 6� (>>;� ) ��;'(8;'9�

4@76 ��� ��� #����� $�� ! ���� !�� <�1- =���� (>>*� 33�� 7'87*�

4@'6 ! ���� #�� ��� ��� #����� $�� ��� $�� NW�%��� -�� 4����&�� (>>>� )'� (((@8((5)�

4@@6 L ����� +�� ��� ��� ,�� �� � $�� NW�%��� -�� ! ���� #��6� "��� -��� (>>*� ���� 59(859>�

4@96 ��������� "�� &�������� � -�� ,����� L�� -� ������ N��,������ � ?�� G�������� �� 1������ 1����� 2��� (>>)��')%� ;78*)�

4@;6 #����� $�� ��� ��� &�� ��� L ����� +�� ��� +�� ,����� N��! ���� #�� 6� 1��� "���� 5)))� �:� ;>()8;>(;�

4@*6 ! ���� #�� ,����� L�� !���� �� ��� 1������ 6� (>**� ::�>>>8())@�

4@>6 ! ���� #�� !���� �� ��� -������� 1������ (>>7� �%�(>@8555�

49)6 ! ���� #�� F� �X�� $�� !���� �� ��� 6� "���� $������ (>>5��:'� 7''87@5�

49(6 ! ���� #�� NW�%��� -�� ������ "� N�� 4������ (>>9� 3�5598575�

4956 ! ���� #�� !���� �� ��� G����� �� #� G�� <�1- =����(>**� (� (7@8(7*�

4976 �2���� #�� �� ��� �� !�� ! ���� #�� N������� -�� 6� "���-��� (>>5� �' � *(@8*5)�

49'6 D� �������� 0� F�� +�� ��� �� � ��� "� G�� D���� � "��F� ��� ��� &��� �� $�� -����� D�� 6� "��� 1���� (>>5� ��(�())78()('�

49@6 ��� ��� #����� $�� &�� ��� ! ���� #�� "��� -����� 5)))�� � ����

������������ 5)))� �� 77*9877>@ #��������� ���� ���� ��� � �� �� ���� 77>@