UNIVERSIDADE PAULISTAINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CURSO DE BIOMEDICINA

APS – ATIVIDADE DE PRÁTICA SUPERVISIONADA

DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR

AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL E TÉCNICAS

DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS.

Nome: Beatriz Chagas e Silva Pinto

RA:B2041C-2

Camila Maira Azevedo

B51AGB-5

1

SÃO PAULO

2014

Beatriz Chagas e Camila Maira

AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL E TÉCNICAS DE

BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS.

Trabalho apresentado para

avaliação na disciplina de

Biologia Molecular do curso de

Biomedicina, turno noturno da

Universidade Paulista – UNIP.

Orientador: Profº Carlos

Francischini

2

ntadoparaavaliação nadiscipli

São Paulo

2014

SUMÁRIO

RESUMO........................................................

.............................................................4

INTRODUÇÃO...................................................5

LISTA DE

TABELAS.................................................... . .6

HEMATOLOGIA

LABORATORIAL..................................................

.....................................7

AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA

LABORATORIAL................. .......8

3

DIFERENCIAÇÃO CELULAR OU

CD............................................................

...... .......9

CITOCINAS.....................................................

..............................................................

...13 - 15

BIOLOGIA

MOLECULAR.....................................................

.........................................16 - 17

TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS A ANÁLISES

CLÍNICAS.......17

Southern

blotting......................................................

.........................................................17 -

20

Reação em Cadeia da Polimerase –

PCR...........................................................

...............20 - 25

Hibridização "in situ" por fluorescência –

FISH..........................................................

.....25 - 26

USO DA GENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS NA ELUCIDAÇÃO DE CASOS

INCONCLUSIVOS NA FENOTIPAGEM

ERITROCITÁRIA...............................................27

APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR EM

HEMATOLOGIA ................................28

TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EM HEMOTERAPIA E

BANCO DE

4

SANGUE................................................................................................................28

- 30

CONSIDERAÇÕES

FINAIS........................................................

................................... 31 - 32

REFERÊNCIAS...................................................

............................................................

33 - 34

REFERÊNCIAS

ELETRÔNICAS...................................................

........................................35

RESUMO

Durante as últimas décadas observou-se uma grande evolução

tecnológica na realização de exames, e as técnicas manuais têm

sido substituídas por sistemas automatizados que apresentam maior

5

precisão nos resultados e em um menor intervalo de tempo. Essas

inovações mudaram a rotina dos laboratórios, tornando-os mais

eficientes e ágeis, além de apresentarem uma melhor qualidade nos

resultados. "A automatização assegura a confiabilidade dos testes

hematológicos em todas as fases, pois a padronização garante a

eficiência dos resultados"

A Biologia Molecular, apresenta especial preocupação com o

estudo das características genéticas passadas de geração em

geração. A chamada hereditariedade tem participação de uma série

de fatores como o DNA, os genes, cromossomos e ainda outros

fatores a serem considerados, a Biologia Molecular abre uma série

de possibilidades para tratamentos, fabricação de remédios e

ainda outras soluções para saúde. Estudar como funciona o sistema

de herança genética pode ajudar a descobrir doenças que uma

pessoa recém-nascida ou que ainda vai nascer tem mais

possibilidade de obter ao longo da vida. Sendo assim, essa pessoa

pode receber tratamento antes mesmo que a doença se manifeste ou

que a mesma seja atingida pela tal doença.

A prática das aplicações das técnicas de PCR e suas técnicas

derivadas em diagnósticos moleculares tem se mostrado de grande

efetividade, especialmente no diagnóstico de doenças cujo

diagnóstico precoce é crucial no sucesso do tratamento. A reação

de PCR constitui-se em um instrumento diagnóstico valioso,

notadamente no caso de doenças infecciosas graves, por exemplo,

devido à sua capacidade em detectar agentes infecciosos com maior

sensibilidade e especificidade ,sem necessidade de se encontrarem

parasitas viáveis na amostra biológica. A técnica de PCR

6

possibilita uma nova estratégia na análise dos genes, dispensando

todas as trabalhosas etapas de clonagem gênica. Ainda, há a

possibilidade de adaptações da técnica de PCR a fim de melhorar a

especificidade e a eficiência da reação.

Com relação ao Fish (hibridação in situ com

fluorescência) , essa técnica detecta DNA localizados dentro do

cromossomo, usa laminas de microscopia, cromossomos estão em

metáfase , anáfase e interfase , usa sondas de DNA específicos. E

sobre o Southern blot é uma técnica de biologia molecular

utilizada para conferir se uma determinada sequência de DNA

encontra-se ou não presente em uma amostra de DNA analisada. Isto

é realizado por meio de um realce da eletroforese em gel de

agarose.

INTRODUÇÃO

Os principais avanços científicos e tecnológicos são as

principais causas de mudanças na prática da Imuno-hematologia,

promovendo excepcional desenvolvimento no diagnóstico

laboratorial de diversas doenças hematológicas. O progresso

obtido através de aplicações das técnicas de biologia

molecular se tornam cada vez mais instrumentos laboratoriais

de grande definição no diagnóstico e na prevenção de doenças

hematológicas, notadamente aquelas de origem hereditária. O

crescimento das aplicações tecnológicas que resultaram na

automação dos laboratórios, além de produzir maior grau de

reprodutibilidade dos resultados de exames e rapidez nas suas

determinações, avançou para um grau de especificidade tal que7

deverá exigir dos médicos e dos profissionais de laboratórios

constantes atualizações.

O conhecimento das bases genéticas dos polimorfismos dos

grupos sanguíneos, adquirido nos últimos anos, permitiu o

desenvolvimento de diversos protocolos para deduzir o fenótipo

eritrocitário, usando técnicas de biologia molecular, com

aplicação na prática transfusional. Essas metodologias são

vantajosas, em muitos casos, em relação aos métodos

sorológicos utilizados na fenotipagem eritrocitária.

A determinação do perfil de antígenos eritrocitários em

doadores de sangue e pacientes que recebem transfusão

sanguínea é importante na prevenção de aloimunização.

Pacientes recentemente transfundidos ou com anemia hemolítica

autoimune nem sempre conseguem ser fenotipados, e para estes

casos a genotipagem vem se apresentando como uma ferramenta

auxiliar na tipagem sanguínea.

O uso da genotipagem também mostrou-se útil na identificação de

anticorpos irregulares. Por sua precisão, facilidade de execução e

viabilidade de custo, as técnicas para tipagem de DNA para sistemas

sanguíneos vêm sendo usadas na prática transfusional, contribuindo

para aumento da segurança dos pacientes cronicamente transfundidos

ou com anemia hemolítica autoimune, como, por exemplo, pacientes com

anemia falciforme. Além disso, ela vem permitindo o melhor uso de

unidades de sangue com fenótipos menos frequentes na nossa população

de doadores de sangue.

8

LISTA DE TABELAS

TABELA 1- Relação entre alguns antígenos CD, células e

funções...........................10

TABELA 2- Relação entre determinantes celulares - CD e

subpopulações de células

identificadas.................................................

..............................................................

.11

TABELA 3- Marcadores usados para auxiliar o diagnóstico das

leucemias agudas e

crônicas......................................................

..............................................................

..12

TABELA 4- Síntese e ação das

Interleucinas.................................................

..........14

9

HEMATOLOGIA LABORATORIAL

O Serviço de Hematologia Laboratorial é composto por duas

áreas distintas que se complementam, a área da morfologia

hematológica e a área da citometria de fluxo, cuja missão é a

realização de análises na área Laboratorial, incluídas nos

meios complementares de diagnóstico e terapêutica. Estas

tarefas são efetuadas segundo o estado de arte e em tempo

útil e adequado, tendo como destinatários todos os doentes em

regime de internamento e/ou ambulatório que estão em

tratamento da sua patologia oncológica.( 28)

10

Apesar dos avanços científicos e da sofisticação da

tecnologia laboratorial, o diagnóstico das doenças

hematológicas depende quase exclusivamente da correlação entre

a clínica e os aspectos morfológicos no esfregaço de sangue

periférico.

Na Unidade de Hematologia Laboratorial é efectuada a

análise qualitativa e quantitativa dos elementos figurados do

sangue (hemograma e medulograma), velocidade de sedimentação

eritrocitária, o estudo de populações linfocitárias e a

pesquisa e identificação de Malária (citometria e métodos

imunológicos) bem como de outras parasitoses do sangue e

medula, através da aplicação e desenvolvimento da tecnologia

disponível.

Todos os pedidos são, obrigatoriamente, acompanhados de

informação clínica que é correlacionada com os parâmetros

hematológicos, sendo a sua execução técnica e interpretação

efetuada por pessoal com formação específica e experiente.

Os estudos morfológicos das amostras de medula óssea são

efetuados pelo Hematologista responsável pelo doente.( 29)

11

AVANÇOS TECNOLÓGICOS EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL

Os principais avanços científicos e tecnológicos são as

principais causas de mudanças na prática da moderna

hematologia, influindo especialmente no diagnóstico

laboratorial e nos procedimentos terapêuticos de algumas

patologias com destaques para anemia falciforme, hemofilias e

leucemias. O progresso obtido pela imunologia tem alavancado o

desenvolvimento do diagnóstico laboratorial de diversas

doenças hematológicas mielo e linfoproliferativas, bem como

determinando especificidades da fisiologia leucocitária diante

das toxicidades de proveniências bacterianas e virais. Essas

conquistas ultrapassaram as fronteiras das aplicações

laboratoriais e forneceram conhecimentos importantes nos

procedimentos terapêuticos (1, 5, 8).

O crescimento das aplicações tecnológicas que resultaram

na automação dos laboratórios, além de produzir maior grau de

reprodutibilidade dos resultados de exames e rapidez nas suas

determinações, avançou para um grau de especificidade tal que

deverá exigir dos médicos e dos profissionais de laboratórios

constantes atualizações. Os exemplos mais recentes se baseiam

na moderna imunohematologia direcionada à diferenciação das

células, em especial dos leucócitos, por meio da identificação

12

de seus antígenos conhecidos por "cluster of differentiation"

ou CD, bem como da caracterização funcional das citocinas. Por

outro lado, a biologia molecular se torna cada vez mais um

instrumento laboratorial de grande definição (9).

DIFERENCIAÇÃO CELULAR OU CD

Todas as células possuem em suas composições estruturais

de membranas proteínas específicas capazes de serem

reconhecidas por anticorpos sintetizados em laboratórios –

os anticorpos monoclonais. Para os anticorpos monoclonais as

proteínas de membrana de células blásticas, linfócitos,

monócitos, entre outras, são identificadas como "antígenos

celulares". Porém, observou-se que grupos de diferentes

anticorpos monoclonais reconheciam o mesmo antígeno celular

presente em mais de uma célula, quer fossem normais, malignas

13

ou células de linhagens evolutivas. Esses antígenos de

diferenciação celular reconhecidos por grupos de anticorpos

monoclonais foram denominados por grupo de diferenciação

celular ou CD (6, 7). Foram reconhecidos em experimentação

laboratorial perto de 170 diferentes tipos de CD, conhecidos

por CD1, CD2, CD3, CD4, etc., cujas relações entre as células

identificadas e suas funções específicas também foram

relacionadas. A tabela 1mostra a relação entre alguns

antígenos CD selecionados com distribuição celular e funções

específicas. Um dos exemplos mais conhecidos da aplicação de

marcadores CD se refere à avaliação laboratorial da

resistência imunológica em pacientes com AIDS por meio da

determinação dos linfócitos CD4 (auxiliar) e CD 8

(citotóxico). Da mesma forma, a determinação do marcador CD 34

tem sido importante na determinação da presença de células

progenitoras do sistema hematopoiético em sangue de medula

óssea (8). As figuras 1a e 1b mostram a expressão dos

antígenos de superfície durante a maturação dos linfócitos T e

B.

14

15

Entretanto, é com relação aos linfócitos e macrófagos que

é possível antever a importância da determinação dos CD para

diferenciar subpopulações das importantes células do nosso

sistema imunológico, conforme mostra a tabela 2 (3, 6).

16

Atualmente o uso de anticorpos monoclonais para

identificar antígenos de diferenciação celular está sendo

17

aplicado para investigar e caracterizar laboratorialmente a

maioria das leucemias agudas e crônicas de origens mielóide e

linfóide (Tabela 3)(9).

 

18

 

CITOCINAS

Citocinas é o termo genérico empregado para designar um

grupo muito extenso de moléculas envolvidas na emissão de

sinais entre as células durante o desencadeamento das

respostas imunes (figura 2). Todas as citocinas são pequenas

proteínas ou peptídeos, algumas contendo moléculas de açúcar

ligadas (glicoproteínas). As diferentes citocinas podem ser

enquadradas em diversas categorias: interferons (IFN),

interleucinas (IL), fator estimulador de colônias (CSF), fator

de necrose tumoral (TNFa e TNFb), e fator de transformação de

crescimento (TGF b).

Os interferons são moléculas proteicas particularmente

importantes na limitação da propagação de determinadas

infecções virais. Um grupo de interferons (IFN a e IFNb) é

produzido por células infectadas por vírus, e um outro grupo

(IFN g) é sintetizado por determinadas células ou linfócitos T

ativados. Os interferons induzem um estado de resistência

antiviral em células teciduais não infectadas. Os IFN são

produzidos na fase inicial da infecção e constituem a primeira

linha de resistência a muitas viroses (3, 4).

As interleucinas compõem um grande grupo de citocinas

denominadas por IL-1 a IL-15, produzidas principalmente por

células T, embora algumas sejam sintetizadas também por

macrófagos e células teciduais. As interleucinas possuem uma

19

variedade de funções, mas a maioria delas está envolvida na

indução da divisão de outras células. Cada interleucina atua

sobre um grupo limitado e específico de células que expressam

receptores adequados para cada interleucina (tabela 4). É

importante destacar que a hematopoiese é regulada por mais de

uma interleucina. As IL-1 e IL-6 estão envolvidas na ativação

do ciclo celular das células-tronco em repouso (ou

autorenováveis). A IL-3 está envolvida no crescimento dos

precursores das linhagens hemopoiéticas da mesma forma que o

fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófagos (GM –

CSF). Na medida em que as células se diferenciam, citocinas

específicas de linhagens apresentam atividades importantes; a

eritropoietina para os eritrócitos, o fator estimulador de

colônias de macrófagos (M – CSF) para os macrófagos, o fator

estimulador de colônias de granulócitos (G – CSF) para os

granulócitos, entre outros (1, 6).

20

21

Os fatores estimuladores de colônias (CSF) estão

diretamente relacionados na divisão e diferenciação das

células-tronco na medula óssea, bem como dos precursores dos

leucócitos sanguíneos. A quantidade de diferentes CSF é

parcialmente responsável pelas proporções dos diferentes tipos

celulares que serão produzidos. Alguns CSF também promovem a

diferenciação extramedular de células (3, 8).

Finalmente outras citocinas além das acima citadas, como

são os casos do fator de necrose tumoral - TNFa e TNFb e

do fator de transformação de crescimento (TGF b) que, embora

22

possuem várias funções, são particularmente importantes nas

reações inflamatórias e citotóxicas (6).

Nesse contexto específico das citocinas, o futuro da

hematologia laboratorial certamente deverá estar direcionada

na monitoração quantitativa e na determinação qualitativa das

diferentes interleucinas, bem como nas respostas às reações

fisiopatológicas causadas por processos inflamatórios e

citotóxicos(9).

 BIOLOGIA MOLECULAR

A Biologia Molecular tem como campo de estudo as

interações bioquímicas celulares envolvidas na duplicação do

material genético e na síntese protéica.

É uma área intimamente ligada à genética e à bioquímica. A

Biologia Molecular consiste principalmente em estudar as

interações entre os vários sistemas da célula, partindo da

relação entre o DNA, o RNA e a síntese de proteínas, e o modo

como essas interações são reguladas.

Assim, o cerne da Biologia Molecular compreende o estudo

dos processos de replicação, transcrição e tradução do

material genético e a regulação desses processos. (30)

Ao longo da história, os estudos de como cada parte de

nosso corpo funciona têm se intensificado. Biologia, Química,

Física e outras áreas de estudo como Biofísica, Genética,

23

Bioquímica, incluem, em alguma parte de seus estudos,

pesquisas que buscam desvendar mistérios do nosso corpo.

Uma dessas áreas é a Biologia Molecular, apontada por

muitos como tendo início no ano de 1953. Apresenta especial

preocupação com o estudo das características genéticas

passadas de geração em geração. A chamada hereditariedade tem

participação de uma série de fatores como o DNA, os genes,

cromossomos e ainda outros fatores a serem considerados. A

genética também estuda esses fenômenos, a diferença fica por

conta do nível em que se trabalha: a genética faz análises em

nível celular, por isso o nome biologia celular; enquanto a

Biologia Molecular, como o próprio nome fala, estuda esses

acontecimentos em nível molecular.

Essa área é, relativamente, nova. Antes, já havia outras

ciências que já trabalham com seu material de estudo, talvez

por isso, a Biologia Molecular esteja intimamente ligada a

outras áreas. Sua história se mistura com a de outras ciências

e mesmo hoje sua atuação tem a cooperação de ciências como

Bioquímica, Genética e outras.

Com a possibilidade de estudar essas características em

condições mais aprofundadas, a Biologia Molecular abre uma

série de possibilidades para tratamentos, fabricação de

remédios e ainda outras soluções para saúde. Estudar como

funciona o sistema de herança genética pode ajudar a descobrir

doenças que uma pessoa recém-nascida ou que ainda vai nascer

24

tem mais possibilidade de obter ao longo da vida. Sendo assim,

essa pessoa pode receber tratamento antes mesmo que a doença

se manifeste ou que a mesma seja atingida pela tal doença.

Pelo grande potencial que tem, a Biologia Molecular é uma

área vista como promissora num cenário científico de

tradicionais campos de pesquisas. Além do mais, qualquer

estudo que busque entender o funcionamento do corpo é válido e

merece atenção. (31)

TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EM ANÁLISES CLÍNICAS

A aplicação cada vez mais abrangente de técnicas de

biologia molecular em análises clínicas pode ser resumida por

meio do uso de três métodos cientificamente aprovados para

este fim: "Southern blotting", Reação em Cadeia da Polimerase

ou PCR, e Hibridização "In Situ" por Fluorescência ou FISH.

Southern blotting

Nesta metodologia, o DNA é extraído de células e tratado

com enzimas que rompem as ligações químicas entre determinadas

bases nitrogenadas da molécula de DNA. Essas enzimas,

extraídas de bactérias, são conhecidas por endonucleases de

restrição. Os fragmentos da molécula de DNA resultantes do

tratamento enzimático são separados (ou fracionados)

eletroforeticamente. Entretanto, a separação dos fragmentos de

DNA somente poderá ser revelada por meio das suas impressões

25

extraídas do gel de agarose da eletroforese para uma membrana

de náilon ou de nitrocelulose, como se fosse um "mata borrão"

ou "blotting" (em inglês) e reveladas por sondas radioativas.

Essa técnica foi descrita pelo pesquisador E. M. Southern em

1975, surgindo daí o "Southern blotting". O grande problema

atual deste método é o tempo consumido para a revelação dos

resultados que chega a ser de aproximadamente uma semana (1,

2, 5).

Southern blotting é então, a transferência de DNA

desnaturado de um gel de agarose para uma membrana (em geral

de nylon ou material semelhante), onde ele poderá ser

analisado com o uso de uma sonda de DNA ou de RNA.

As figuras abaixo resumem o processo que vai desde a

separação eletroforética do DNA fragmentado até a visualização

das bandas (fragmentos) reativos com a sonda.

Inicialmente o processo pede que o DNA do organismo em

estudo seja quebrado em pedaços que possam migrar na

eletroforese, isto pode ser feito mecanicamente (por

nebulização, por exemplo), ou com o uso de enzimas de

restrição).

O resultado será sempre um conjunto muito grande de

fragmentos com tamanhos diferentes, que formarão uma faixa

(mancha de arraste) borrada no gel, quando tentamos verificar

o resultado da corrida eletroforética. Em geral empregamos um

26

gel de agarose para isto. A cuba é horizontal e as amostras

são aplicadas em pequenos poços moldados no gel antes que ele

endureça com o auxílio de um pente adequado. Os fragmentos de

DNA, normalmente negativos, vão correr para o pólo positivo

(veja figura 1).

Figura 1: O gel de agarose (em vermelho) vai separar os fragmentos de DNA

aproximadamente de acordo com seus tamanhos. Ao ser aplicado um campo

elétrico entre um lado e o outro do gel, as amostras vão atravessar o gel.

Após a eletroforese o DNA é desnaturado (através da adição de NaOH ou de

outros produtos químicos adequados); o uso de um tampão 3M NaCl estabiliza

a desnaturação.

Uma vez separados os fragmentos e desnaturados com NaOH,

eles serão transferidos para uma membrana de nylon através de

um sistema baseado no arraste hidrodinâmico capilar,

exatamente da mesma forma como a tinta é absorvida por um

27

papel mata-borrão. Este processo é o blot, propriamente dito,

e está ilustrado na figura abaixo.

Figura 2: O gel é colocado sobre um papel de filtro Whatman, cujas pontas

estão imersas em tampão citrato/ NaCl 3M (chamado tampão de transferência).

Sobre o gel coloca-se a membrana de nylon e sobre ela uma pilha de papel

absorvente comum (papel toalha, por exemplo). Por fim coloca-se uma placa

de plástico resistente e um peso sobre tudo. O tampão que está em baixo do

gel será chupado por capilaridade através da membrana de nylon (que é

porosa) para a pilha de papel absorvente. Este movimento de líquido

transfere mecanicamente o DNA que está no gel para o filtro. A membrana de

nylon adere o DNA.

Por fim, o DNA na membrana tem que ser "sondado". Para tal

a membrana deve ser seca e o DNA fortemente ligado ao nylon, o

que é obtido com a exposição do material ao UV. Em seguida

coloca-se a membrana num saco para congelamento contendo a

solução de hibridização e a sonda marcada. Após várias horas

ou dias a membrana, já com a sonda aderida às regiões com

complementariedade, é retirada, lavada extensivamente e

cuidadosamente colocada em contato com um filme próprio (que

será exposto pela marcação da sonda: se a sonda for radiativa,

por exemplo, será um filme de raio X). Por fim, o filme é

28

retirado, revelado e as bandas observadas indicarão aa

posições no gel onde houve reconhecimento de sequências pelas

sonda. 

Figura 3: Revelação do Southern blot. A membrana seca e com o DNA já

submetido ao cross linking com a membrana é colocada para hibridizar com a

sonda a -80 oC. Em seguida ela é acondicionada num cassete junto com o

filme que deve ser sensível à marcação da sonda e por fim o filme é

revelado.( 32) Reação em Cadeia da Polimerase – PCR 

O processo de PCR foi descrito por Kary Mullis no final da

década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente, em 1993,

atribuído o Prêmio Nobel de Química pelo seu trabalho. Em

29

1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporationpatentearam

este processo.

Princípios da Reação de PCR

A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain

reaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação do DNA

ou cDNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação

enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável)

cuja atividade depende de ions Mg++

Ocorre em 3 etapas:

I) “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da

dupla fita do DNA a ser amplificado). Inicialmente é

necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam

separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove

a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Muitas

vezes a temperatura de desnaturação é determinada

empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de

guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse.

30

II) “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do

iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado). A polimerase

para anexar as bases complementares, transformando as fitas

simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA já

ligado na região previamente escolhida. Para isso adicionam-

se, à solução, os “primers” ou iniciadores que são pequenos

fragmentos sintéticos de DNA de fita simples,

oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de

comprimento, que são sintetizados in vitro baseado na

sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à

seqüência do segmento de DNA de interesse. Nas duas fitas

surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita

intacta. A hibridização dos “primers” descrito como

“Annealing” (do inglês), deve ser feito a uma tempertura

inferior à da desnaturação (45 a 70°C).

31

III) “extension” (extensão ou seja a polimerização

propriamente dita). Quando os '' primers'' encontram e ligam-

se aos segmentos complementares, a DNA-Polimerase liga aos

nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples e

tornando-as duplas (extensão) A DNA-Polimerase não reconhece

apenas o bloco de início como também consegue diferenciar as

duas extremidades dos ''primers'' (3' e 5'). Ela inicia a

reação sempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a

fita simples daí em diante, portanto, sempre na direção do

fragmento procurado.

32

Automação da PCR

Um aparelho de PCR, ou um termociclador, repete o

correspondente a programa de temperaturas. O operador deve

apenas programar e dar início para que transcorra a

amplificação. Técnicamente muitas mudanças tem sido

introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua

utilização. Para cada situação experimental, novas

modificações têm de ser introduzidas, de tal forma que é

muito difícil descrever um único procedimento para um uso

generalizado. Por outro lado, é fundamental o conhecimento

33

básico das etapas envolvidas na técnica, para um desenho

experimental com sucesso.

Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um

formando-se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de

tal forma que pode ser definida matematicamente por:

N = número de moléculas amplificadas

No = número de moléculas iniciais

n = número de ciclos de amplificação

Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos

primers serve como molde para a síntese de uma nova fita. Isso

garante o aumento exponencial do

número de novas fitas.

Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR tem a

sequência dos primers na extremidade 5’ e a sequência

complementar aos primers na posição 3’.( 33)

34

O advento do PCR revolucionou a tecnologia molecular em

muitas especialidades médicas. Seu uso laboratorial teve

grande progresso devido à simplicidade técnica e à rapidez em

se obter os resultados. A técnica do PCR é um processo rápido

de replicação seletiva de um determinado trecho do DNA

genômico "in vitro". A replicação se faz por etapas, tal como

se segue:

a) Após a extração do DNA seleciona-se o trecho que se

deseja reproduzir ou amplificar até obter a quantidade

suficiente para análise;

35

b) Com drogas específicas desnatura-se a dupla hélice do

DNA, separando-a em duas fitas simples e correspondentes de

bases nitrogenadas;

c) Com o uso da DNA polimerase (obtido da bactéria Thermus

aquaticus – Taq polimerase) submetida a condições específicas de

tempo e temperatura (ou ciclos), cada fita simples se duplica

em duas novas moléculas de DNA; e este processo é repetido em

número suficiente de vezes para obter a quantidade necessária

para análise, cerca de um milhão de cópias do original.

Os produtos obtidos pela técnica do PCR podem ser

analisados por várias técnicas suplementares das quais a mais

comum é a eletroforese em gel de agarose. Uma variação do PCR

é o PCR-transcriptase reversa ou RT-PCR, que usa o RNA

extraído da amostra que se deseja analisar e dele se faz

cópias de DNA. O DNA copiado é posteriormente replicado

conforme exposição acima. O RT-PCR é particularmente usado

para análises de translocações cromossômicas (5).

36

Hibridização "in situ" por fluorescência – FISH 

Esse método molecular usa sondas fluorescentes para

observar genes ou sequências de DNA em cromossomos.

Seres humanos normalmente têm 23 pares de cromossomos: 22

pares independentes do sexo (autossomos) e um par de

cromossomos sexuais (XX em mulheres e XY em homens). Os

cromossomos contêm DNA (ácido desoxirribonucleico) e proteínas

associadas. O DNA é uma sequência de quatro bases que se

repetem formando milhares de genes que dirigem a produção de

proteínas no corpo e determinam nossas características

físicas. Contem duas cadeias complementares que formam uma

hélice dupla, como uma escada em espiral.

37

No método FISH, uma amostra de células da pessoa é fixada

em uma lâmina de vidro, incluindo células do sangue, da medula

óssea, do líquido amniótico ou de tumores, dependendo da

indicação do exame. As lâminas são, então, aquecidas para

separar as duas cadeias do DNA das células. Sondas

fluorescentes que contêm sequências de DNA complementares à

que se deseja observar são adicionadas e se ligarão à

sequência pretendida nas células. Quando as lâminas são

examinadas em um microscópio de fluorescência, os genes

correspondentes às sondas podem ser observados como manchas

fluorescentes brilhantes contra um fundo escuro.

Esse método é usado para mostrar a presença de um excesso

de cópias de um gene (genes duplicados ou amplificados) e

sequências que estão em falta (deleções de genes) ou se

moveram (translocação de genes). Um aumento do número de

cromossomos, como na trissomia 21, ou síndrome de Down, também

pode ser diagnosticado com esse método. Diversas sequências de

DNA podem ser investigadas na mesma lâmina usando sondas com

corantes fluorescentes de cores diferentes.( 34)

Exemplo em

Hematologia:Leucemia A Figura mostra o

método FISH usado para pesquisar

a sequência BCR-ABL na leucemia

mieloide crônica. Essa sequência

anormal é formada pela translocação de uma parte do cromossomo 22 (BCR, em

verde) com uma parte do cromossomo 9 (ABL1, em vermelho). A mancha amarela

38

(mistura de vermelho e verde) mostra o gene formado pela fusão. O achado da

sequência BCR-ABL confirma o diagnóstico de leucemia mieloide crônica e

permite prever a resposta ao medicamento imatinib.(34)

A técnica de FISH se resume na detecção de sequências

específicas de DNA ou RNA diretamente nos cromossomos de

células previamente isoladas para este fim. A análise é

realizada em microscópio por meio da geração de um sinal

brilhante e colorido nos núcleos das células em metafase e

interfase. A FISH é particularmente útil na demonstração de

monossomias ou trissomias cromossômicas, bem como nas

translocações – notadamente para a identificação da leucemia

mielóide crônica – e também na detecção de deleções e

amplificações de genes específicos (4).

USO DA GENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS NA ELUCIDAÇÃO DE CASOS

INCONCLUSIVOS NA FENOTIPAGEM ERITROCITÁRIA

Os sistemas de grupos sanguíneos são caracterizados por

antígenos na membrana eritrocitária, com características

funcionais e polimórficas definidas. Atualmente, já foram

descritos 30 sistemas de grupos sanguíneos, de acordo com a

ISBT (International Society for Blood Transfusion)(10). Na

medicina transfusional, a compatibilidade para o sistema ABO e

para o antígeno D do sistema Rh é fundamental na prevenção de

reações hemolíticas, embora seja desejável que outros

antígenos sejam compatibilizados, especialmente C, c, E, e do

sistema Rh, assim como os principais antígenos dos sistemas

Kell, Kidd, Duffy e MNS(11,12,13). O conhecimento das bases

genéticas dos polimorfismos dos grupos sanguíneos, adquirido39

nos últimos anos, permitiu o desenvolvimento de diversos

protocolos para deduzir o fenótipo eritrocitário, usando

técnicas de biologia molecular, com aplicação na prática

transfusional(14,15). Essas metodologias são vantajosas, em

muitos casos, em relação aos métodos sorológicos utilizados na

fenotipagem eritrocitária, como: identificação do risco para a

doença hemolítica do recém-nascido, determinação dos grupos

sanguíneos quando os anticorpos (reagentes) não estão

disponíveis, identificação de variantes raras, auxílio na

identificação de anticorpos irregulares e, principalmente, na

conclusão do grupo sanguíneo em pacientes que receberam

transfusão recente ou apresentam resultado positivo no teste

direto de antiglobulina humana (TAD). Na hemoterapia, a

determinação correta do grupo sanguíneo é importante não

apenas para prevenir problemas devido a transfusões

incompatíveis, mas também para permitir um melhor uso das

unidades de hemocomponentes com fenótipos menos frequentes, já

que a frequência dos grupos sanguíneos depende da etinicidade

da população(16).

40

APLICAÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR EM HEMATOLOGIA 

As aplicações da tecnologia molecular em hematologia

poderão elucidar o conhecimento das alterações moleculares de

doenças, tal como ocorre atualmente na caracterização das

lesões do gene da globina beta nas talassemias do tipo beta e

na identificação dos haplótipos da Hb S. Entre as técnicas de

biologia molecular, o PCR revolucionou as tendências de

aplicabilidade da biologia molecular, não somente pela sua

simplicidade, mas pelo rápido diagnóstico de doenças

infecciosas, na detecção de doença residual mínima em diversas

malignidades hematológicas onde se conhece o defeito

molecular, e notadamente na detecção de portadores e no

diagnóstico pré-natal de hemofilias e anemias hereditárias.

Finalmente, os objetivos mais profundos das aplicações dos

conhecimentos de biologia molecular se direcionam na clonagem

e sequenciamento de genes para identificar, caracterizar e

manipular os gene responsáveis por doenças e produtos tóxicos

específicos(1,5).

TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS EM HEMOTERAPIA E

BANCO DE SANGUE

O conhecimento atual sobre genética dos grupos sanguíneos

tem permitido o uso das técnicas de biologia molecular como

uma importante ferramenta na prática hemoterápica. Além da

acurácia na determinação do fenótipo eritrocitário, a

genotipagem de grupos sanguíneos pode auxiliar na

41

identificação de anticorpos irregulares, bem como na economia

de unidades de sangue de fenótipos menos freqüentes na

população. Isto pode ser exemplificado em resultados

encontrados em pacientes portadores de anemia falciforme,

cujos fenótipos RhD eram indeterminados e puderam ser

concluídos como RhD positivo por genotipagem. Estes pacientes,

que antes recebiam transfusões com hemocomponentes RhD

negativo, passaram a receber sangue RhD positivo com

segurança(10).

A eficiência dos testes moleculares na genotipagem de

grupos sanguíneos deve considerar a complexidade dos sistemas,

em relação aos polimorfismos de seus alelos. A aloimunização é

comum em pacientes politransfundidos. Embora não obrigatória

pela legislação vigente, a frequência de aloimunização pode

ser diminuída com o uso da fenotipagem estendida para doadores

e pacientes, que pode ser auxiliada pela genotipagem.

A genotipagem de grupos sanguíneos já vem sendo utilizada

com êxito na medicina transfusional. Atualmente, muito se tem

falado sobre novas metodologias de genotipagem, especialmente

as que permitem sua utilização em larga escala(23,24). A

esperança é que esta metodologia permita a realização da

genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala, de forma

automatizada, rápida e segura e que possa ser utilizada nas

rotinas dos bancos de sangue(27). Estudos demonstram que mesmo

as técnicas moleculares convencionais (PCR alelo-específica e

PCR-RFLP) podem ser usadas com sucesso em um banco de sangue

de grande porte, no esclarecimento de casos em que as técnicas

42

sorológicas são ineficazes para conclusão dos resultados. O

sucesso dessa metodologia reside principalmente na ausência da

necessidade de equipamentos especializados e de alta

tecnologia, o que frequentemente inviabiliza a aplicação de

determinadas técnicas. Ao contrário, a metodologia empregada

necessita apenas de equipamentos e insumos básicos de biologia

molecular. Além disso, os custos não são elevados, o que

permite seu uso rotineiro como metodologia auxiliar na

hemoterapia(10).

A utilização das ferramentas de biologia molecular tem

sido fundamental para a inserção de novas metodologias na

rotina laboratorial da Imuno-hematologia, aumentando a

segurança e eficácia transfusional de pacientes

politransfundidos. Isto pode ser facilmente visualizado

durante os procedimentos de genotipagem de grupos sanguíneos,

onde as técnicas moleculares suprem as deficiências das

técnicas de hemaglutinação, principalmente na fenotipagem de

pacientes com transfusão recente, quando há hemácias do doador

na circulação do receptor e em pacientes com autoanticorpos.

Estudos mostram que a presença de leucócitos nos produtos de

sangue transfundidos não interfere na genotipagem de grupos

sanguíneos. Assim, pacientes politransfundidos com transfusão

recente podem ser genotipados para a determinação do seu

perfil antigênico, possibilitando a utilização de transfusões

fenótipo compatível e maior segurança na investigação

sorológica e identificação do(s) anticorpo(s)(27).

43

A aplicação da biologia molecular em imuno-hematologia sem

dúvida terá um grande impacto na medicina transfusional. Os

problemas encontrados na rotina de doadores de sangue, como a

busca de hemácias antígeno-negativo e a identificação correta

de indivíduos RhD-negativo serão facilmente solucionados(27).

Na área da medicina transfusional, a possibilidade de

fornecer sangue fenótipo compatível para pacientes

politransfundidos abre uma nova perspectiva, podendo inclusive

reduzir o número de testes pré-transfusionais. Embora seja

pouco provável que a genotipagem molecular venha a substituir

totalmente a hemaglutinação nos próximos anos, estas técnicas

utilizadas em conjunto têm um valor potencial importante na

segurança transfusional e materno-fetal(27).

No Brasil, esta abordagem vem sendo introduzida aos poucos

em algumas instituições de reconhecida competência na

Hemoterapia, mas sua disponibilização deve tornar-se mais

generalizada, através da formação de centros de referência

para atendimento das diversas unidades hemoterápicas.

Mostrando que é possível implantar o aprimoramento tecnológico

para aplicação de novos métodos diagnósticos no atendimento

aos pacientes da rede SUS. Pelo nosso conhecimento, este é o

primeiro serviço público de saúde a usar técnicas de

genotipagem de grupos sangüíneos para atendimento a seus

pacientes(10).

44

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Biologia Molecular apresenta especial preocupação com o

estudo das características genéticas passadas de geração em

geração. Pelo grande potencial que tem, a Biologia Molecular é

uma área vista como promissora em um cenário científico de

tradicionais campos de pesquisas. Além do mais, qualquer

estudo que busque entender o funcionamento do corpo é válido e

merece atenção.

Das técnicas mencionadas no contexto, podemos notar que :

45

A reação em cadeia de polimerase (PCR) aumentou a acurácia

diagnóstica, mas as técnicas ainda não foram padronizadas e os

resultados variam entre os laboratórios Também tornou-se

possível determinar o genótipo do patógeno por método de

diagnóstico molecular em laboratórios clínicos, o que pode ser

útil em situações específicas. A disponibilidade de diferentes

testes viabiliza o diagnóstico precoce, minimizando o

potencial para disseminação da infecção e torna relevante a

discussão das indicações de cada teste a partir de sua

sensibilidade e especificidade.Há quase vinte anos após os

primeiros relatos do emprego da PCR para o diagnóstico

molecular terem sido publicados, tais testes ainda não foram

disponibilizados comercialmente e não são usados além do

ambiente de pesquisa. Além do custo, pode ser citada a

necessidade de sua execução em laboratórios com elevada

tecnologia e com espaço exclusivo para a sua realização, como

os principais fatores limitantes no que diz respeito ao

emprego do teste de PCR em situação ambulatorial ou

hospitalar, ou mesmo na rotina dos bancos de sangue. Diante

desta situação, existe a necessidade de padronização das

técnicas de PCR em diagnósticos por meio de mais estudos de

como devem ser os padrões-ouro, para depois ocorrer uma

padronização nas técnicas que culminem, inclusive, na sua

redução de custo, tornando-a disponível nos ambientes clínicos

e hospitalares. A FISH demonstra ser uma técnica com grande

potencialidade de uso rotineiro, pois associa agilidade de

execução, alta sensibilidade e especificidade e visualização

do agente infeccioso viável no tecido.

46

Em alguns casos, os patologistas são forçados a utilizar

métodos in situ, como a imunofluorescência , para detecção dos

micro-organismos, porém, o número de anticorpos disponíveis

comercialmente é restrito, e a aplicação desse método requer

uma suspeita etiológica prévia. A possibilidade de associar

lesões histológicas com análise molecular de genes que

abrangem domínios como “gêneros” atendem essa demanda. Outra

grande vantagem da técnica é a possibilidade de estudos

retrospectivos, pois a hibridização é feita em cortes

histológicos fixados em formalina e parafinizados, portanto,

materiais de arquivo ou museus representam um estoque único de

uma doença específica a ser confirmada.

47

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