analisis cemaran daging babi pada sosis sapi yang beredar di ...

i

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA SOSIS

SAPI YANG BEREDAR DI PASAR PARUNG

MENGGUNAKAN METODE REAL TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

SKRIPSI

SAFIZAH UMMU HARISAH

1112102000010

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

FEBRUARI 2017

ii


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA SOSIS

SAPI YANG BEREDAR DI PASAR PARUNG

MENGGUNAKAN METODE REAL TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

SAFIZAH UMMU HARISAH

1112102000010

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

FEBRUARI 2017

iii


iv


HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

v


vi


ABSTRAK

Nama : Safizah Ummu Harisah

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Analisis Cemaran Daging Babi pada Sosis Sapi yang

Beredar di Pasar Parung Menggunakan Metode Real Time

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Sosis adalah produk makanan yang diperoleh dari campuran daging halus dengan

tepung atau pati dengan atau tanpa penambahan bumbu-bumbu dan bahan

tambahan makanan lain. saat ini kemajuan teknologi telah mengalami

peningkatan di bidang analisis halal. Teknologi tersebut diaplikasikan untuk

mempermudah pengujian bahan halal yang terkontaminasi bahan haram. Salah

satu alat yang digunakan untuk deteksi kehalalan makanan adalah PCR. Pada

penelitian ini, metode Real Time Polymerase Chain Reaction digunakan untuk

mengidentifikasi cemaran DNA babi pada 6 produk sosis sapi yang beredar di

Pasar Parung. DNA genom daging babi, daging sapi dan sampel sosis sapi

diisolasi dengan reagen KIT (Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega).

DNA diamplifikasi pada daerah spesifik DNA mitokondria sitokrom b dengan

menggunakan sepasang primer spesifik DNA babi dan primer spesifik DNA sapi

dengan jumlah siklus sebanyak 30 siklus. Hasil kurva amplifikasi menggunakan

primer spesifik DNA sapi, menunjukkan bahwa semua DNA sampel sosis dan

kontrol positif DNA sapi dapat teramplifikasi, sedangkan kontrol negatif DNA

babi dan kontrol negatif ddH2O tidak teramplifikasi. Hasil primer spesifik DNA

babi menunjukkan bahwa hanya sampel kontrol positif (DNA babi) yang

menghasilkan kurva amplifikasi pada CP 19.97. Dengan demikian, dari 6 sampel

sosis yang diperiksa, tidak ada DNA mitokondria sampel yang teramplifikasi

dengan menggunakan primer spesifik DNA babi.

Kata kunci : halal, babi, sampel sosis, real time PCR, primer spesifik.

vii


ABSTRACT

Name : Safizah Ummu Harisah

Program Study : Strata-1 Pharmacy

Title : Analysis Contamination of pork in Sausage Beef which

Distributed In Parung Region Using Real Time PCR

The sausage is a food product derived from a mixture of delicate meat with flour

or starch with or without the addition of spices and other food additives. the

current technological advances have improved in the areas of analysis kosher. The

technology is applied to facilitate the testing of materials contaminated halal

haram ingredients. One of the tools used for the detection of halal food is PCR. In

this study, Real Time Polymerase Chain Reaction method was used to identify

the pork contamination in 6 beef sausage products which distributed in the Parung

market. DNA genome of pork, beef, and beef sausage samples was isolated using

KIT reagents (Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega). DNA was

amplified in a specific area of mitochondrial cytochrome b DNA by porcine

specific primer and bovine specific primer as much as 30 cycle. The results of

DNA amplification curves by bovine specific primers indicating that all the DNA

samples of sausages and control positive bovine DNA can be amplified, while the

negative control porcine DNA and negative control ddH2O are not amplified.

Results of porcine DNA specific primers showed that only positive control

samples (porcine DNA) which generate amplification curves in CP value 19.97.

Therefore, from 6 samples of sausages which are examined there is no

mitochondrial DNA samples are amplified by porcine specific primers.

Keywords : halal, pork, sausage samples, real time PCR, specific primers.

viii


KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang Maha pengasih dan

Maha penyayang, yang telah memberi kekuatan kepada penulis, sehingga penulis

dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat dan salam senantiasa terlimpahkan

kepada Baginda Rasul, Nabi Muhammad SAW yang merupakan suri tauladan

bagiumatnya.

Skripsi ini disusun dalam rangka memenuhi salah satu persyaratan untuk

memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Dalam

melaksanakan penyusunan skripsi ini, penulis menyadari bahwa penyusunan ini

tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis menyampaikan

terimakasih kepada :

1. Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt sebagai Pembimbing I dan Ibu Dr. Zilhadia,

M.Si., Apt sebagai Pembimbing II yang telah memberikan ilmu, nasehat,

waktu, tenaga dan pikiran selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

2. Bapak Chris Adhiyanto, M.Biomed,Ph.D dan Bapak Hendri Aldrat, M.Si.

Ph.D.Apt sebagai Penguji telah memberikan ilmu, saran dan nasehat kepada

penulis.

3. Bapak Dr. Arif Sumantri S.K.M, M. Kes. Selaku Dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

5. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc, Apt selaku pembimbing akademik yang

telah memberikan arahan selama masa perkuliahan.

6. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan

bimbingan dan bantuan selama menempuh pendidikan di Program Studi

Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

(UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

7. Kedua orang tua, Ayah tercinta Iljam Ebentap lubis, umma tersayang Asmia

Hasibuan S.Pd.I yang selalu ikhlas memberikan kasih sayang,dukungan moral

ix


dan materil, nasehat-nasehat yang membantu penulis bersemangat tersenyum

dan tertawa, serta lantunan do‟a setiap waktu.

8. Kakak tercinta, Ummu Salimah Albajaliah Lubis S.Pd.I, Abang M.Febryansah

Hasibuan S.Pd.I. adek-adek tersayang Irwan Junaidi Lubis, M.Asril Husein

Lubis, Hapipa Aswita Lubis, Rizki Khoirunnisa Lubis, yang memberikan

semangat dan doa tanpa henti2nya, dan memberi tawa yang luar biasa.

9. Sahabat seperjuangan dalam suka maupun duka dalam menjalankan penelitian

ini, semoga kita sama-sama sukses dunia dan akhirat “Vesty Anis Triana”.

10. Sahabat-sahabat terkasih Ayu Nopita, Apriliana Nur, Chalila Deli Gayo, Dwi

Putri Rahmawati, Vesty Anis Triana, Ratnika Sari, Tharlis Diansyah Lubis

serta teman-teman Farmasi 2012 atas semangat dan kebersamaan kita selama

perkuliahan berlangsung. Semoga ukhuwah yang telah terjalin tidak pernah

putus dan akan terus berlanjut.

11. Sahabat dalam mencari ilmu di perantauan yang selalu memberikan semangat

tanpa diminta M. Misbahuddin Mukhlis SE., Nasyidah Hannum.

12. Teman-teman seperjuangan selama di pondok pesantren Al-mukhlishin

Sibuhuan selama merantau mencari ilmu di Jakarta “IKAYAMIN JAKARTA”

13. Teman-teman Himpunan Mahasiswa Padang Lawas (HIMAPALAS) atas

semangat dan kebersamaan kita selama berperoses diorganisasi berlangsung.

14. Teman-teman seperjuangan “DIGOXYN” Farmasi UIN 2012 atas

kebersamaan kita selama ini.

15. Semua pihak yang telah membantu penulis selama melakukan penelitian dan

penulisan yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapatkan balasan dari

Allah SWT. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan

ini, oleh karena itu kritik dan saran sangat diharapkan demi perbaikan skripsi ini.

Dan semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Ciputat, 28 Februari 2017

Penulis

x


xi


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ................................................ iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. v

ABSTRAK ........................................................................................................... vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ......................................................................................... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .................... x

DAFTAR ISI ........................................................................................................ xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvi

DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... xvii

DAFTAR ISTILAH ............................................................................................ xviii

BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .............................................................................. 2

1.3 Tujuan ................................................................................................. 2

1.4 Manfaat ............................................................................................... 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 4

2.1 Daging Babi ......................................................................................... 4

2.2 Organel Sel .......................................................................................... 4

2.3 Protein dan Asam Nukleat ................................................................... 6

2.4 DNA .................................................................................................... 6

2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA .................................................. 6

2.4.2 Sifat Fisika DNA ....................................................................... 8

2.4.3 Fungsi DNA .............................................................................. 8

2.4.4 Isolasi DNA ............................................................................... 8

2.5 DNA Mitokondria ............................................................................... 11

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................... 13

Halaman

xii


2.6.1 Komponen PCR......................................................................... 14

2.6.2 Tahapan PCR............................................................................. 15

2.6.3 Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght

Polimorfisme (PCR-RFLP) ....................................................... 17

2.7 Real Time PCR ................................................................................... 18

2.7.1 Analisis Menggunakan Metode Hydrolysis Probe .................... 20

2.8 Daging Sosis ....................................................................................... 23

BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 25

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................ 25

3.1.1 Tempat .................................................................................... 25

3.1.2 Waktu ..................................................................................... 25

3.2 Alat dan Bahan ................................................................................... 25

3.2.1 Alat .......................................................................................... 25

3.2.2 Bahan ...................................................................................... 25

3.3 Tahapan Penelitian ............................................................................. 26

3.4 Prosedur Kerja .................................................................................... 26

3.4.1 Pengumpulan Sampel ............................................................. 26

3.4.2 Isolasi DNA ............................................................................ 26

3.4.3 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV ... 27

3.4.4 Amplifikasi DNA dengan Metode Real Time PCR .............. 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 29

4.1 Hasil Analisis DNA dengan Spektrofotometri UV ........................... 29

4.2 Uji Cemaran DNA Babi pada Sampel Sosis Sapi ............................. 32

4.2.1 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan NTC

Menggunakan Primer Sapi ..................................................... 34

4.2.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sampel Sosis Sapi

dan NTC Menggunakan Primer Sapi ..................................... 36


Menggunakan Primer Babi ..................................................... 38

4.2.4 Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Sampel Sosis Sapi

dan NTC Menggunakan Primer Babi ..................................... 39

xiii


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 40

5.1 Kesimpulan ......................................................................................... 40

5.2 Saran ................................................................................................... 40

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 41

LAMPIRAN ......................................................................................................... 46

xiv


DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

Tabel 1 Perbandingan Sel Prokariot dan Sel Eukariotik 5

Tabel 2 Kelebihan dan Kelemahan RFLP 18

Tabel 3 Kelebihan dan Kekurangan Real Time PCR 20

Tabel 4 Tahapan Proses Flurosensi Hydrolysis Probe 22

Tabel 5 Susunan Basa Primer dan probe 26

Tabel 6 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA 30

Tabel 7 Program Dual Color Hydrolysis Probe-UPL Probe 96-II 33

xv


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1 Sel Prokariot dan Eukariot 5

Gambar 2 Struktur Purin dan Pyrimidin 7

Gambar 3 Struktur Double Heliks DNA 7

Gambar 4 Struktur Mitokondria 12

Gambar 5 Struktur mtDNA 12

Gambar 6 Untai DNA Mengalami Denaturasi 16

Gambar 7 Penempelan Primer dengan Untai DNA 16

Gambar 8 Perpanjangan DNA Secara Semi-Konservatif 17

Gambar 9 Proses Amplifikasi DNA Target 17

Gambar 10 Bentuk Kurva pada Real Time PCR 19

Gambar 11 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil

Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Sapi

34


Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Sapi dan

sampel

36


Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Babi

38


Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Babi dan

sampel

39

xvi


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

Lampiran 1. Konsentrasi dan Kemurnian Hasil Isolasi 46

Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer 47

Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer 48

Lampiran 4. Komponen Campuran Reaksi Real Time PCR 49

Lampiran 5. Hasil Kurva Amplifikasi 50

Lampiran 6. Alat-Alat yang digunakan dalam Penelitian 52

xvii


DAFTAR SINGKATAN

AFL : Arbitrary Fluorescence Level

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool

CP : Crossing Point

cyt b : Cytochrome b

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : DeoxyCytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

dNTP : Deoxyribonucleaside Triphosphate

dNTPS : Deoxyribonucleaside Triphosphates

dTTP : Deoxythymidine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetat

FAM : Fluorescein Amidite

MtDNA : mitochondria DNA

NLS : Nuclei Lysis Solution

NTC : No Template Control

pb : Pasang Basa

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCR-RFLP : Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght

Polimorfisme

Pfu : Pyrococcus Furiosus

PPS : Protein Precipitation Solution

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction

RFLP : Restriction Fragment Lenght Polimorfisme

RNA : Ribonucleic Acid

RT-PCR :Real Time Polymerase Chain Reaction

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

Tag : Thermus Aquaticus

Tm : Temperature Melting

USDA : United State Department of Agriculture

xviii


DAFTAR ISTILAH

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool merupakan

program untuk menganalisis kesejajaran sekuen

query (DNA) atau protein dengan sekuen DNA

atau protein pada database NCBI.

CP : Crossing Point merupakan siklus yang

menunjukkan sinyal fluoresensi dari akumulasi

amplikon telah melewati garis threshold.

Garis Treshold : Garis penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu

saat sinyal fluoresensi berada pada tingkat

terendah (siklus 3-15).

Formasi Hairpin : Terbentuknya struktur loop/hairpin pada primer

yang disebabkan oleh interaksi intramolekular

yang dapat memicu terbentuknya amplifikasi yang

nonspesifik.

Melting Curve : Analisis data pada Real time PCR digunakan untuk

menguji spesifisitas amplikon yang terbentuk.

Mis-priming : Penempelan primer di luar sekuen target sehingga

membentuk produk amplfikasi yang nonspesifik.

NCBI : National Center for Biotechnology Information

merupakan suatu institusi milik United States

National Library of Medicine yang berperan

sebagai sumber informasi perkembangan biologi

molekular. Situs NCBI berisi database meliputi

gene bank mengenai sekuens DNA atau protein

serta memuat publikasi ilmiah.

NTC : No Template Control merupakan kontrol negatif

karena well tidak dimasukkan DNA.

Primer-Dimer : berikatannya suatu primer dengan primer sejenis

atau dengan primer lainnya sehingga membentuk

produk amplifikasi yang nonspesifik

Query : Sekuen yang dimasukkan ke dalam program

BLAST untuk diketahui kesejajarannya.

Tm : Temperature melting atau suhu melting adalah

suhu saat 50% bagian DNA telah terbuka menjadi

untai tunggal.

1


BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Islam mengajarkan umat muslim untuk menghindari hal yang dilarang

dalam Al Qur‟an dan Al Hadist. Al Qur‟an sangat tegas menyatakan kehalalan

dan keharaman makanan. Aturan tentang kehalalan makanan termuat dalam

banyak ayat, salah satunya pada Surat Al-Baqarah (2) : 173 :

“Sesungguhnya Allah hanya mengharamkan bagimu bangkai, darah,

daging babi, dan binatang yang (ketika disembelih) disebut (nama) selain

Allah”. Haramnya babi juga dijelaskan dalam firman Allah Surat Al-Ma‟idah (5) :

3, Surat Al-An‟am (6) : 145, dan Surat An-Nahl (16) : 115.

Indonesia merupakan negara dengan mayoritas penduduknya beragama

Islam. Hal ini seharusnya menjadi kewajiban bagi pemerintah untuk melindungi

konsumen dari beredarnya makanan haram yang ada dipasaran. Namun

pencampuran makanan halal dengan bahan yang diharamkan masih terjadi di

masyarakat. Pada tahun 2012 ditemukan adanya bakso sapi yang dicampur dengan

daging babi di wilayah Jakarta. September 2015 juga ditemukan kasus

pencampuran daging babi pada bakso di pasar tradisional kota malang (Wardani,

2015). Tujuan pencampuran tersebut untuk menghasilkan produk akhir dengan

harga yang lebih murah dibandingkan menggunakan bahan aslinya, mengingat

harga daging sapi yang semakin mahal (Margawati dan Ridwan, 2010). Oleh

sebab itu, untuk menghindari adanya makanan yang dicampur dengan bahan

haram, dibutuhkan pengembangan uji analisis yang dapat dipercaya dan sensitif

dalam pendeteksian bahan makanan (Rahmawati, 2012).

Pada saat ini kemajuan teknologi telah mengalami peningkatan di bidang

analisis halal. Teknologi tersebut dapat diaplikasikan dan mempermudah

pengujian bahan halal yang terkontaminasi bahan haram. Salah satu alat yang

digunakan untuk deteksi kehalalan makanan adalah PCR. Seperti halnya

2

pengujian cemaran daging babi pada makanan diperoleh dari hipermarket

lokal yang berbeda di Saudi Arabia melalui amplifikasi PCR (Alaraidha, 2008).

Pratami 2011 telah melakukan identifikasi daging babi pada burger sapi melalui

amplifikasi real time PCR. Begitu juga Mulyana (2010) yang melakukan

identifikasi daging babi pada kornet sapi dengan menggunakan metode

polymerase chain reaction (PCR).

Walaupun PCR memberikan hasil yang cukup sensitif dan akurat, metode

ini membutuhkan pemisahan produk pasca PCR dengan menggunakan gel

elektroforesis yang memakai waktu lebih lama dan hanya semi-kuantitatif

(Vivikananda, 2014). Tetapi kelemahan ini dapat di atasi dengan real time PCR

yang menggunakan sistem fluoresensi sehingga hasil amplifikasi dapat dideteksi

secara cepat dan dilihat secara langsung. Keunggulan teknik real time PCR

dibandingkan dengan PCR konvensional antara lain adalah akurasi dan

sensitivitas yang lebih tinggi, menurunkan kemungkinan terjadinya kontaminasi

dan waktu analisa yang lebih singkat karena tidak perlu melakukan elektroforesis

dan identifikasi suatu produk makanan dengan menggunakan pewarna dye SYBR

green dan primer spesifik sapi (Liyana, K. et a.l, 2009).

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa cemaran DNA babi pada bahan

makanan olahan dengan menggunakan metode real time PCR. Bahan makanan

yang diuji adalah sosis sapi dengan merek yang berbeda yang diperoleh dari pasar

Parung.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah sosis sapi yang beredar di Pasar Parung tercemar daging babi.

1.3 Tujuan Penelitian

Menganalisis cemaran daging babi pada sosis sapi yang beredar di Pasar

Parung menggunakan metode real time PCR

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi untuk masyarakat

tentang kehalalan sosis sapi yang beredar di pasar Parung. Hal ini dilakukan

3

sebagai dharma UIN terhadap masyarakat sekitar sehingga masyarakat lebih

berhati-hati dan bijaksana dalam mengonsumsi olahan daging seperti sosis sapi.

4


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Daging Babi

Babi adalah sejenis hewan ungulata yang bermancung panjang dan

berhidung ceper pemakan daging maupun tumbuh-tumbuhan dan merupakan

hewan yang berasal dari Eurasia. Daging babi merupakan daging yang sangat sulit

dicerna karena banyak mengandung lemak. Meskipun dagingnya empuk dan

terlihat begitu enak dan lezat. Babi juga memiliki lemak punggung yang tebal dan

bersifat oxidative rancidity, sehingga secara struktur kimia sudah tidak layak

dikonsumsi. Penelitian ilmiah modern di dua negara yaitu Cina dan Swedia

menyatakan bahwa daging babi merupakan penyebab utama kanker anus dan

kolon. Babi banyak mengandung parasit, bakteri, bahkan virus yang berbahaya

sehingga dikatakan sebagai Reservoir penyakit (Hilda, 2013).

2.2 Organel sel

Sel yang menyusun makhluk hidup tingkat tinggi memang sangat kecil

ukurannya sehingga tidak dapat dilihat dengan alat bantu yang sederhana, tetapi

memiliki tugas yang sangat besar layaknya sebuah kota yang memiliki bagian-

bagian untuk menunjang kehidupan kota. Bagian-bagian yang menunjang

kehidupan sel disebut organel-organel (Yuni et al, 2006).

Organisme yang hidup saat ini dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu

prokariot dan eukariot.

5


Prokariot Eukariot

Gambar 2.1. Sel Prokariot dan Eukariot (Widyastuti, 2012).

Tabel 1. Perbandingan Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik

Ciri Sel Prokariotik Sel Eukariotik

Ukuran ~ 1-10 mm ~10-100 mm (sel sperma, terpisah dari

bagian ekornya, berukuran lebih kecil)

Tipe inti Daerah nukleoid;

tanpa inti sejati

Inti sejati dengan membran ganda

DNA Umumnya sirkular Linear (kromosom) dengan protein histon

Sintesis

RNA/Protein

Keduanya

berlangsung di

sitoplasma

Sintesis RNA berlangsung di dalam hati.

Sintesis protein berlangsung di sitoplasma

Ribosom 50S dan 30S 60S dan 40S

Struktur

sitoplasmatik

Sederhana Sangat terstruktur dengan adanya membran

intraseluler dan sitoskeleton

Pergerakan sel Flagela yang

tersusun atas

protein

flagelin

Flagela dan silia yang tersusun atas protein

tubulin

Mitokondria Tidak ada Satu sampai beberapa lusin (beberapa tidak

memiliki mitokondria)

Kloroplas Tidak ada Pada alga dan tanaman

Organisasi Umumnya satu sel Sel-sel tunggal, koloni, organisme tingkat

tinggi dengan sel terspesialisasi

Pembelahan sel Pembelahan biner Mitosis (pembelahan inti) dan sitokinesis

(pembelahan sitoplasmatik)

6


Jenis organisme Bakteri dan archaea Protista, fungi, tanaman, hewan

2.3 Protein dan Asam Nukleat

Protein dan asam nukleat merupakan senyawa polimer utama yang terdapat

pada sel. Protein merupakan produk dari aliran informasi genetik. Sel

membutuhkan ribuan protein yang berbeda setiap waktu.

Asam nukleat merupakan polimer dari ratusan, ribuan, bahkan jutaan

nukleotida yang bergabung satu sama lainnya melalui ikatan fosfodiester. Asam

nukleat merupakan suatu polinukleotida, yaitu polimer linier yang tersusun dari

monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Fungsi

utama asam nukleat adalah sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan

informasi genetik. Informasi ini tersusun dari sel induk ke sel anak melalui proses

reflikasi. Sel memiliki dua jenis asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat

(deoxyribonucleic acid/DNA) dan asam ribonukleat (ribonucleic acid/RNA)

(Kusuma, 2010).

2.4 DNA

2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA

DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun

dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyususn nukleotida terdiri

dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa

pada RNA), basa nitrogen dan gugus fosfat. Basa yang ditemukan pada nukleotida

adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C,

tymin = T, urasil = U). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada

posisi karbon 3‟, gugus fosfat pada posisi karbon 5‟ dan basa pada posisi karbon

1‟ molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan

fosfodiester antara gugus 5‟ fosfat dengan gugus 3‟ hidroksil (Gaffar, 2007).

7


Gambar 2.2 Struktur Purin dan Pirimidin (Adenin dan Guanin;

Cytosin, Tymin dan Urasil) (Gaffar, 2007)

Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkaian nukleotida yang tersusun

secara linier. Kedua rangkaian yang saling berikatan itu terbentuk seperti tali

berpilin, sehingga molekul DNA dikatakan sebagai double helixs (heliks ganda).

Untuk membentuk rangkaian molekul DNA heliks ganda, basa nitrogen dari

setiap nukleotida dalam satu rangkaian akan berpasangan dengan basa nitrogen

dari setiap nukleotida pada rangkaian lainnya melalui ikatan hidrogen. Pengikatan

basa nitrogen dari masing-masing nukleotida tersebut sangat spesifik. Basa A dari

satu nukleotida selalu berikatan dengan basa T dari nukleotida lainnya, sedangkan

basa G selalu berikatan dengan basa C. Pasangan A dan T terbentuk dengan dua

ikatan hidrogen, sedangkan pasangan G dan C terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh

karena itu, pasangan G dan C lebih stabil dari pada pasangan A dan T (Pratami,

2011).

Gambar 2.3. Struktur Double Helixs DNA

Untai ganda molekul DNA dapat dipisahkan atau terdenaturasi dengan

perlakuan suhu maupun senyawa alkali sehingga konformasinya berubah. Tingkat

denaturasi DNA tergantung pada tingginya suhu. Semakin tinggi suhunya maka

8


semakin banyak bagian DNA yang berubah menjadi struktur untai tunggal.

Denaturasi lengkap biasanya terjadi pada suhu 90OC. Selain dapat terdenaturasi,

DNA juga dapat terrenaturasi, yaitu untai tunggal yang terdenaturasi menjadi

untai ganda kembali dengan adanya ikatan hidrogen. Suhu renaturasi biasanya

sekitar 60OC. Faktor lain yang menentukan laju renaturasi adalah konsentrasi

DNA. Semakin tinggi konsentrasinya maka probabilitas tumbukan antara molekul

untai tunggal DNA menjadi semakin besar (Sriati, 2011).

2.4.2 Sifat Fisika DNA

DNA akan terpisah dari rantai komplemennya (denaturasi) pada suhu

mendekati titik didih dan pH ekstrim (pH<3 atau pH>10) dan bisa bergabung

kembali (renaturasi) pada suhu ± 60OC. DNA menyerap sinar UV pada panjang

gelombang 260 nm. (Pratami, 2011).

2.4.3 Fungsi DNA

DNA adalah dasar kimiawi hereditas dan penyususn gen yang menjadi unit

fundamental informasi genetik. Informasi genetik yang disimpan dalam

nukleotida berfungsi untuk memenuhi dua tujuan, yaitu sumber informasi bagi

sintesis semua molekul protein pada sel serta organisme dan memberikan

informasi yang diwariskan kepada anak atau generasi berikutnya (Pratami, 2011).

2.4.4 Isolasi DNA

Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik yang

sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom eukariot berbentuk

linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga

mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular

dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Gaffar, 2007).

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari

komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur

mikroorganisme, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan

buffer yang mengandung satu atau lebih detergen, contohnya SDS, NP-40, atau

Triton X-100 untuk membebaskan isinya. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat

9


pengrusakan oleh detergen tersebut dibersihkan dengan cara sentrifugasi.

Kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan proteinase yang berfungsi untuk

mendegradasi RNA, sehingga tertinggal hanyalah DNA. Selanjutnya ekstrak

tersebut dipanaskan sampai suhu 90OC untuk menginaktifasi enzim yang

mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol

dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Danuz, 2014).

Isolasi DNA saat ini lebih mudah dengan adanya bantuan teknologi canggih

yang disebut purifikasi DNA yang menghasilkan isolasi DNA dengan kemurnian

tinggi, hasil yang cepat, dan penggunaan yang mudah. Purifikasi DNA

menggunakan seperangkat mesin dengan reagen kit pemurnian DNA yang bekerja

secara otomatis, singkat dan efisien. Pemurnian DNA dapat dilakukan dari darah,

sel-sel, dan sampel jaringan. Instrumen ini dapat memproses sampai dengan 16

sampel dalam waktu 30-45 menit. DNA yang telah dimurnikan dapat digunakan

langsung dalam berbagai aplikasi termasuk PCR, restriksi oleh enzim

endonuklease, dan elektroforesis gel agarosa. Instrumen ini dapat memproses

sampel cair dan padat. Dilengkapi dengan cartridge yang berisi lysis buffer,

MagnesiI®

PMPs dan wash buffer (Promegaa, 2007). Pada mesin purifikasi DNA,

sampel yang telah dilisis oleh buffer lisis, dicuci dengan wash buffer dan dielusi

dengan elution buffer menggunakan bantuan Magnesil PMPs (Pratami, 2011).

Berikut adalah uraian tahapan isolasi DNA :

1. Penghancuran Membran Sel (lisis)

Penghancuran membran sel bisa dilakukan secara fisik misalnya

dengan cara sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan

menggunakan enzim lisozim, etilen diamin tetra asetat (EDTA), atau

kombinasi dari keduanya (Radji, 2011). Penggunaan lisozim biasanya

untuk ekstraksi dan isolasi DNA dari sel tumbuhan. EDTA merupakan

zat yang dapat merusak membran sel dengan cara mengikat ion Mg2+

yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun

mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat

(Izzah, 2014). Pada kondisi tertentu pemecahan dinding sel cukup

dilakukan dengan lisozim dan EDTA, akan tetapi juga sering

ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel antara lain

10


detergent triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (Radji, 2011). SDS

merupakan detergent yang dapat merusak integritas membran sel

dengan cara mengikat lipid yang terdapat pada membran sel (Izzah,

2014). Setelah sel lisis, tahapan selanjutnya adalah memisahkan sel

dibris dengan cara sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel

dalam supernatan yang jernih (Radji, 2011).

2. Pemisahan DNA dari Protein Sel

Disamping DNA, ekstrak sel juga mengandung protein dan RNA

dalam jumlah yang cukup besar. Umumnya cara pemisahan DNA

dilakukan dengan penambahan larutan fenol atau campuran fenol dan

kloroform dengan perbandingan 1:1. Sedangkan untuk pengendapan

protein dengan cara sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis

dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih

tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk

membersihkan DNA dari RNA (Radji, 2011).

3. Pemurnian DNA

Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA.

Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan

dengan cara presipitasi etanol. Dengan adanya larutan garam (kation

monovalen seperti Na+), pada suhu -20

oC etanol absolut dapat

mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan

cara sentrifugasi (Radji, 2011).

Pada umumnya, isolasi DNA dengan metode konvensional yang dijelaskan

sebelumnya cukup melelahkan karena membutuhkan waktu hingga beberapa jam

bahkan sampai beberapa hari (Izzah, 2014). Seiring berkembangnya ilmu

pengetahuan dan teknologi, metode isolasi DNA telah banyak dikembangkan dan

digunakan dalam sebuah penelitian. Salah satu metode yang mudah

pengerjaannya serta dapat menghasilkan DNA dengan kemurnian tinggi yaitu

dengan menggunakan metode kit komersial (Nishiguchi Michele K et al, 2002).

Metode kit komersial tidak hanya digunakan untuk mengisolasi DNA dari

produk makanan olahan tetapi juga dirancang untuk mengisolasi DNA yang

berasal dari sel darah putih, sel kultur jaringan hewan, jaringan tanaman, dan juga

11


dari bakteri gram negatif serta gram positif (Promega, 2014). Keuntungan yang

dihasilkan dari metode isolasi DNA dengan menggunakan kit diantaranya

menghemat waktu selama proses isolasi karena dapat menghasilkan jumlah DNA

hanya beberapa menit saja, meningkatkan sensitifitas dan keunggulan PCR dalam

menganalisis karena pada proses isolasi menghasilkan DNA dengan kemurnian

yang tinggi, mengurangi seminimal mungkin jumlah kontaminan pada DNA yang

dihasilkan, dan dapat digunakan untuk penelitian karena metode kit komersial

dapat memurnikan DNA yang berasal dari berbagai sumber (Roche, 2007).

Pengukuran kemurnian dan jumlah DNA hasil isolasi dapat dilakukan

melalui spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultraviolet

yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar

UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm,

sedangkan penyerapan oleh protein pada panjang gelombang 280 nm.

Perbandingan absorbansi pada 260 nm dan 280 nm (A260/A280) dapat memberikan

validasi kemurnian DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan murni jika nilai rasio

A260/280 antara 1,8-2,0. Nilai rasio yang lebih rendah dari 1,8 menunjukkan adanya

kontaminasi protein sedangkan nilai rasio melebihi 2,0 menunjukkan adanya

kontaminasi RNA (Hidayat, 2015).

2.5 DNA Mitokondria

DNA mitokondria (mtDNA) adalah molekul DNA rantai ganda yang

berbentuk sirkuler yang ditransmisikan secara maternal dan ukurannya relative

sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom intinya. DNA mitokondria

merupakan DNA yang ada di mitokondria yang berperan dalam sintesis protein.

Mitokondria adalah organel yang terletak di dalam sitoplasma eukariota yang

diselaputi oleh dua membran dan dua kompartemen, yaitu membran dalam dan

membran luar; matriks mitokondria (yang diselimuti langsung oleh membran

dalam) dan ruang antar membran (Hidayat, 2015).

12


Gambar 2.4. Struktur Mitokondria (Aparna, 2015)

Mitokondria memiliki diameter 1-2 µm dan mengandung bermacam-macam

salinan DNA yang berbentuk sirkular. Jumlah dan bentuk setiap mitokondria

berbeda-beda untuk setiap sel dengan tipe yang berbeda dan dapat beruba

(Mulyana, 2010).

Struktur organisasi mtDNA bersifat stabil, sehingga mtDNA hewan

memiliki jumlah gen dan ukuran yang sama, yakni terdiri atas 13 gen yang

menyandikan protein yaitu URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L,

URF4L, Cytochrom Oxidase unit I, Cytochrom Oxidase unit II, Cytochrom

Oxidase unit III, Cytochrom b dan ATPase 6 (terlibat dalam respirasi sel), 2 gen

menyandikan rRNA (12S dan 16S), 22 gen menyandikan tRNA dan beberapa

daerah lain yang tidak menyandikan protein D-loop (Control Region) dan daerah

intergenic (Hidayat, 2015).

Gambar 2.5. Struktur mtDNA (Nageswara, 2007)

13


DNA mitokondria memiliki karakteristik yang mendukung dalam

keperluan analisis biologi dan keragaman genetik, yaitu mtDNA mampu

mengcopy diri dalam jumlah yang tinggi (menjadikannya mudah diisolasi),

ukuran yang relatip kecil sekitar 14 kb sampai 34 kb sehingga dapat dipelajari

sebagai satu kesatuan yang utuh, dan memiliki laju evolusi yang tinggi sekitar 5-

10 kali lebih cepat dari DNA inti (Hidayat, 2015).

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu

mengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri. Proses

amplifikasi PCR melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, maka

diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada

proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermus

aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90OC (Agung,

2010).

Target PCR yaitu asam nukleat (DNA) untai ganda yang diekstraksi dari sel

dan terdenaturasi menjadi asam nukleat beruntai tunggal. Proses yang terjadi

dalam mesin PCR meliputi tiga tahap utama yaitu pemisahan untai ganda DNA

(denaturasi), penempelan primer (annealing) dan pemanjangan primer ekstensi

(ekstensi). Proses yang dimulai dari denaturasi, penempelan dan ekstensi disebut

sebagai satu siklus. Produk PCR dapat berlangsung melalui proses elektroforesis

dan digunakan untuk analisis lebih lanjut. Produk PCR dipisahkan dengan

elektroforesis gel yang diwarnai dengan bromida dan divisualisasikan dengan

sinar ultraviolet (Esti, 2013).

PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, dalam

tabung reaksi, tanpa perlu memasukkan ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR

dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan yang mengandung

DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru,

enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer

oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan

berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir

14


fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus

hidroksil bebas pada karbon 3‟. Setelah kedua primer menempel pada DNA

templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer

dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida

templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara

OH pada karbon 3‟ dengan gugus 5‟ fosfat dNTP yang ditambahkan. Proses

penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung

dengan arah 5‟-3‟ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya

akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat

pada rantai DNA templat (Gaffar, 2007).

2.6.1 Komponen PCR

Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu :

a. DNA cetak / DNA target

Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung

fragmen DNA target.

b. Primer

Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb

(pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target.

Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya

reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria

pemilihan primer, yaitu :

1. Panjang primer : 15-30 pb

2. Kandungan GC sekitar 50%

3. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda

4. Urutan nukleotida yang sama harus dihindari

5. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin

c. Enzim Taq DNA Polymerase

Polimerase adalah suatu molekul komplek yang memiliki tiga aktivitas

diantaranya sebagai aktivitas polimerase dari ujung 5‟-3‟, aktivitas

exonuclease (aktivitas pengoreksian) dari ujung 3‟-5‟dan bisa juga dari

5‟-3‟ (Viljoen.Gerrit.J et al, 2005). Enzim DNA polimerase berfungsi

sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR,

15


enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA

yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau

hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai

temperatur 95oC. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya

dan dari mana bakteri tersebut diisolasi. Sebagai contoh adalah enzim Pfu

polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai

aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim

Taq polimerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan

jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai

(Handoyo, et al., 2001). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA

walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air.

d. Buffer / Dapar

Buffer atau Dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang

mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase.

e. dNTPS

dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida

bebas yang berperan penting dalam perpanjangan primer melalui

pembentukan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target.

2.6.2 Tahapan PCR

Ada tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR yaitu :

1. Denaturasi

Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94OC yang

menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda menjadi untai DNA

tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA

baru yang akan dibuat.

16


Gambar 2.6. Untai DNA mengalami denaturasi (Agung, 2010)

2. Penempelan (Annealing)

Enzim Tag polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA

baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai

panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai

DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer.

Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan

sushu yang rendah sekitar 55OC selama 30-60 detik.

Gambar 2.7. Penempelan primer dengan untai DNA yang telah

terdenaturasi (Agung, 2010)

3. Pemanjangan (Ektension)

Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA

polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru

dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida. (Agung,

2010)

17


Gambar 2.8. Perpanjangan DNA secara Semi-konservatif (Agung, 2010)

Ketika tiga tahap diatas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang

baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan

pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA baru. Pengulangan proses

PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara

eksponensial. (Agung, 2010).

Gambar 2.9. Proses Amplifikasi DNA Target (Agung, 2010).

2.6.3 Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght Polimorfisme

(PCR-RFLP)

Banyak metode yang dapat digunakan untuk melakukan analisis DNA, salah

satunya yaitu amplifikasi dengan PCR-RFLP. Teknik ini adalah salah satu teknik

penandaan DNA yang didasarkan pada perbedaan sisi pemotongan (situs

Amplifikasi secara

eksponensial

18


restriksi). Enzim restriksi endonuklease yang dapat mendigesti DNA akan

memotong DNA pada sisi-sisi restriksi tertentu menjadi fragmen-fragmen yang

kemudian dengan analisis elektroforesis gel dapat ditentukan analisis yang

diinginkan sesuai dengan markernya masing-masing (Uswahdani, 2013).

Metode PCR-RFLP yang memanfaatkan amplifikasi dengan primer spesifik

atau universal yang diikuti dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi

endonuklease telah banyak digunakan untuk penentuan filogeni tanaman.

Pemanfaatan PCR-RFLP dalam identifikasi dan penentuan filogeni pada tanaman

telah banyak dilakukan, antara lain pada fungi, Phaseolus dan pisang (Ekasari,

2011).

Tabel 2. Kelebihan dan Kelemahan Restriction Fragment Lenght

Polimorfisme (RFLP)

Kelebihan Kelemahan

Bersifat kodominan sehingga

sangat baik untuk komparatif

pemetaan genom. Polymorphisme

akan menghasilkan perbedaan

ukuran fragmen yang terpotong,

sehingga setiap siklus restriksi

dapat dipetakan, dapat diturunkan

dari nuclear genom, kloroplas

genom, dan mitokondria genom

(Nurlaily, 2012).

Menyita banyak tenaga dan

waktu, kuantitas dan kualitas

DNA yang diperlukan sangat

tinggi, prosedur hibridisasinya

rumit, sehingga menyulitkan

otomatisasi, dan memerlukan

pustaka probe untuk spesies-

spesies tanaman yang belum

pernah dieksplorasi sebelumnya

(Nurlaily, 2012).

2.7 Real Time PCR

Real time polymerase chain reaction (RT-PCR) adalah salah satu teknik

yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler. Real time PCR memiliki

berbagai keunggulan. Selain amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen dapat

diamati secara cepat, teknik ini juga dapat menentukan konsentrasi DNA yang

19


terdapat pada sampel. Maka teknik ini disebut quantitative PCR (qPCR) (Sriati,

2011).

Instrumen real time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur

peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan

double-stranded DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA

hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang

terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan.

Quantitative PCR dimunginkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA

hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye

yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva

amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau

puncak dan fasa plateau atau stabil (Pratami, 2011)

Gambar 2.10. Bentuk Kurva pada Real Time PCR (Pratami, 2011)

Gambar 2.10. Bentuk Kurva pada Real Time PCR (Pratami, 2010).

Instrument real time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal

block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan sofware

sebagai analisa data. Real time PCR juga dapat menganalisa banyak sampel dalam

waktu bersama menggunakan multiwell plates (Pratami, 2011).

20


Tabel 3. Kelebihan dan kelemahan Real Time PCR

Kelebihan Kelemahan

pada real time PCR jumlah DNA

yang diamplifikasi bisa langsung

diamati secara real time sehingga

tidak memerlukan analisis dengan

elektroforesis gel untuk mengetahui

produk PCR. Real time PCR lebih

dikenal sebagai quantitative PCR

karena kemampuan analisanya

yang akurat, sensitif dan spesifik

sehingga mengurangi kesalahan

pada hasil (Pratami, 2012).

Real time PCR juga

mempunyai kelemahan yaitu

memerlukan peralatan dan

reagen yang mahal serta

pemahaman teknik yang

benar untuk hasil yang akurat

(Ayu, et al. 2014).

2.7.1 Analisis Menggunakan Metode Hydrolysis Probe

Instrumen real time PCR menggunakan pewarna fluoresensi secara

langsung dan real time, baik untuk memonitor hasil dari produk PCR selama

siklus berlangsung maupun setelah siklus pada proses melting hasil produk PCR

untuk menganalisis melting curve.

Ada beberapa analisis pewarnaan yang dapat dilakukan antara lain :

1. Uji Deteksi Sequence Independent

Mengandalkan fluorophores yang mengikat semua DNA molekul

untai ganda (dsDNA) terlepas dari urutan basanya : misalnya SYBR

Green I.

2. Uji Sequence-Specific Probe Binding

Mengandalkan fluorophores yang berpasangan ke probe oligo

nukleotida dengan Sequence-Specific yang berhibridisasi dengan

urutan komplementernya dalam target produk PCR yaitu Metode

21


Simpel Probe, Hybridization Probe (Hyb Probe) dan Hydrolysis

Probe.

Probe dilabelin oleh dua molekul, yaitu reporter pada ujung 5‟ probe yang

merupakan pewarna fluoresensi dan quencher pada ujung 3‟ probe yang

merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Hydrolysis probe memiliki

prinsip kerja, yaitu saat probe belum berkomplemen dengan target, molekul

reporter akan mengeksitasikan sinyal fluoresensi ke molekul quencher. Karena

jarak antara kedua molekul berdekatan. Probe akan berkomplemen dengan DNA

target saat mencapai suhu annealing lalu mekanisme eksitasi sinyal fluoresensi

dari reporter ke quencher terhenti karena jarak kedua molekul berjauhan. DNA

polimerase akan mengelongasi DNA target sampai DNA polimerase dan probe

berdekatan maka 5‟ nuklease yang terdapat pada DNA polimerase akan

menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi sinyal fluoresensi dapat

tertangkap oleh detektor pada real time PCR (Rasyid, 2015).

22


Tabel 3. Tahapan Proses Fluoresensi Hydrolysis Probe

No Gambar Keterangan

1

Hydrolysis probe membawa dua

fluorescent dye berdekatan dengan

quencher dye menekan sinyal

fluorescent reporter. Ujung 3‟ dari

probe terfosforilasi sehingga tidak

dapat memanjang selama PCR.

2

Di tahap annealing, primer dan probe

sama-sama menempel ke urutan basa

pada target spesifik

3

Ketika DNA polimerase

memanjangkan primer dan bertemu

dengan probe. Kemudian memecah

probe pada ujung 5‟ sehingga

menggantikan posisinya dan terus

memanjang sampai membentuk

amplikon baru.

4

Saat probe terpecah, reporter tidak

lagi berdekatan dengan quencher

sehingga dapat mengemisikan cahaya

fluorescent yang dibaca oleh detektor.

Semakin tinggi fluoresensi yang

dipancarkan dari reporter secara

langsung berkolerasi dengan

akumulasi pelepasan molekul reporter

dye (sekaligus menandakan jumlah

produk PCR yang dihasilkan)

23


Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multipleks quantitative real time

PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan lebih dari satu dalam satu

reaksi karena probe akan berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target

yang berbeda. Metode hydrolysis probe memiliki keunggulan dibandingkan

dengan SYBR Green karena dapat mengamplifikasi DNA lebih spesifik (Izzah,

2014).

Pewarna fluorescent yang digunakan dalam hydrolysis probe bermacam

ragamnya yang disesuaikan dengan penggunaannya. Metode hydrolysis probe

dapat digunakan secara terpisah atau dengan kombinasi pewarna. Dalam

penggunaannya dengan format deteksi monocolor biasa digunakan reporter FAM

dengan nilai eksitasi dan emisis berturut-turut 483 dan 533, pewarna lainnya yang

tersedia untuk deteksi multicolor antara lain Cyan 500, Hex, Red 610 dan Cy 5

dengan nilai eksitasi dan emisi dalam keadaan normal berturut turut 450 dan 500,

523 dan 568, dan 558 dan 610 serta 615 dan 670. Sebagai quencher terutama

untuk deteksi multicolor digunakan quencher dye gelap, direkomendasikan

menggunakan BHQ1 atau DABCYL (Rasyid, 2015).

2.8 Daging Sosis

Kata sosis berasal dari bahasa latin “salsus” yang berarti garam. Sosis

merupakan salah satu produk daging olahan atau giling yang diberi bumbu dan

dimasukkan ke dalam selongsongan atau casing menjadi bentuk silindris. Casing

yang digunakan dapat berupa usus hewan atau bahan sintesis. Dalam adonan sosis

biasanya ada tambahan tepung, susu skim, lemak, es atau air dan protein nabati

(Irawati, 2001).

Sosis adalah daging giling yang diberi bumbu dan juga mengalami proses

curing, pemanasan dan pengasapan. Curing adalah proses pengolahan daging

dengan menambahkan garam NaCl, natrium nitrit atau natrium nitrat dan bumbu-

bumbu. Bumbu-bumbu yang biasa digunakana seperti pala, bunga pala, lada,

kapulaga, cengkeh, ketumbar, paprika, jahe dan bawang putih. Penambahan nitrit

pada proses curing berguna sebagai bahan pembangkit warna khas curing (merah

24


cerah dan stabil) dan memberi cita rasa yang khas. Fosfat juga sering ditambahkan

untuk menurunkan pH dan memperbaiki warna (Irawati, 2001).

Klasifikasi sosis ada empat jenis yaitu sosis segar, sosis kering, sosis

setengsh kering dan sosis fermentasi kering dan setengah kering, sosis rebus asap

dan tanpa asap. Kategori sosis menurut USDA (United State Department of

Agriculture) dibagi menjadi lima yaitu sosis segar, sosis mentah diasap, sosis

matang, sosis kering dan semi kering serta sosis spesialitas daging masak. Sosis

segar terbuat dari 50% atau lebih daging segar. Daging yang dipakai biasanya

berasal dari daging sapi, unggas dan babi. Pembuatan sosis segar ini tidak melalui

proses curing, pengasapan atau pemanasan, sehingga sosis yang dihasilkan harus

dimasak sebelum dikonsumsi. Sosis kering dan semi kering berbeda pada kadar

air yang terkandung dalam produk akhir. Biasanya kadar air sosis semi kering

sekitar 70-80% dari berat awal, sedangkan kadar air sosis kering antara 60-70%

dari berat awal (Irawati, 2001).

Sosis asap adalah sosis yang mengalami pengasapan dalam rumah asap

(smooked house) untuk menghasilkan citarasa yang khas (Pearson dan Tauber,

1984). Tahap-tahap pembuatan sosis meliputi grinding (penggilingan), mixing

(pencampuran), chopping (penghalusan dan pencampuran semua bahan-bahan),

emulsifying (pengemulsian), stuffing (pengisian), linking dan tying (pengikatan),

smooking dan cooking (pengasapan dan pemasakan) kecuali untuk sosis segar,

chilling (pendinginan) dan pengepakan (Irawati, 2001).

Sosis adalah makanan yang dibuat dari daging yang telah di cincang

kemudian dihaluskan dan diberi bumbu-bumbu, dimasukkan ke dalam

pembungkus yang berupa usus hewan atau pembungkus buatan, dengan atau tidak

dimasak. Menurut SNI 01-3020-1995 sosis adalah produk makanan yang

diperoleh dari campuran daging halus (mengandung daging tidak kurang dari

75%) dengan tepung atau pati dengan atau tanpa penambahan bumbu-bumbu dan

bahan tambahan makanan lain yang diizinkan dan dimasukkan ke dalam

selongsong sosis (Sriati, 2011).

25


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Analisa Obat dan Pangan Halal

dan Laboratorium Penelitian II Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan dari bulan Agustus 2016 hingga

September 2016.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Real Time PCR (LightCycler® 480-Roche), Wizard

® Genomic DNA

Purification Kit (Promega), Multiwell Plate 96 (Roche®), tabung mikrosentrifuge

volume 1,5 (Biogenix), Mikropipet 0,5-10 µl (Biorad), Mikropipet 20-200 µl

(Biorad), Mikropipet 100-1000 µl (Biorad), Mikrotip volume 10 µl, 200 µl, dan

1000 µl (Genfollower), Sentrifugator (5417R-Eppendrof), Vortex, Digital

Waterbath (SB-100 Eyela), Freezer, Autoklaf, Spektrofotometer UV DNA

(DeNovix®), Timbangan Analitik, Spatula, Batang pengaduk, Gelas beaker,

Kertas perkamen, Kaca arloji, Pipet tetes, Lumpang dan Alu.

3.2.2 Bahan

Daging sapi segar, daging babi segar, 6 produk sosis sapi yang beredar di

Pasar Parung, satu set kit komersial Wizard®

Genomic DNA Purification Kit,

(meliputi: Nuclei Lysis Solution, Protein Precipitation Solution, DNA

Rehydration Solution, RNase Solution), LC TaqMan Probe Master (terdiri dari:

Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP mix, MgCl2 6,4 mM), Isopropanolol

absolut, NaOH, NaCl, Etanol 70%, Aquabidest, Primer-Probe (Tabel 3.1).

26


Tabel 3.1. Susunan Basa Primer dan Universal Probe Library untuk DNA

Sapi dan Babi (Roche®

) dengan Modifikasi

Spesies Primer Sequencing

Babi (Sus scrofa) Forward 5'- TGGGGTGTTTAGTGGGTTTG -3‟

Reverse 5'- TCCTTGTACTATTCTCACCAGACCT -3„

UPL 5'- (FAM)GACCCAGA -3'

Sapi (Bos taurus) Forward 5'- TGAGGGGGTGTGTTGAGTG -3„

Reverse 5'- TACTATTCGCACCCGACCTC -3„

UPL 5'- (FAM)GACCCAGA -3'

2.7 Tahapan Penelitian

1. Pengumpulan sampel

2. Isolasi DNA

3. Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

4. Amplifikasi DNA Menggunakan Metode Real Time PCR

2.8 Prosedur Kerja

2.8.3 Pengumpulan sampel

Sampel sosis sapi dikumpulkan dari semua merek yang beredar di Pasar

Parung dengan jumlah sampel sebanyak 6 merek sosis sapi dari produsen yang

berbeda.

3.4.2 Isolasi DNA

Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard®

Genomic DNA

Purification Kit (Promega).

1. Preparasi Jaringan Hewan

Sebanyak 20 mg dari masing-masing daging sapi segar, daging babi

segar, dan sampel sosis sapi dihancurkan sampai halus menggunakan

pisau steril, lumpang alu dan blender. Masing-masing daging dan sampel

dimasukkan ke dalam mikrosentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 600

μl nuclei lysis solution. Masing-masing campuran tersebut

27


dihomogenkan selama 10 detik kemudian diinkubasi pada suhu 650C

selama 30 menit.

2. Pelisisaan Sel dan Presipitasi Protein

Masing-masing campuran yang sudah diinkubasi ditambahkan 3 μl

larutan RNAse lalu diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 30 menit.

Selanjutnya ditambahkan 200 μl protein precipitation solution dan

divortex, kemudian didiamkan dalam ice selam 5 menit lalu disentrifus

dengan kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit.

3. Presipitasi dan Rehidrasi DNA

Endapan dan supernatan yang terbentuk dipisahkan lalu ditambahkan 600

μl isopropanol kedalam supernatan tersebut. Campuran dikocok dan

disentrifus dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Supernatan

yang terbentuk dibuang lalu ditambahkan 600 μl etanol 70%. Campuran

dikocok dan disentrifus kembali dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1

menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan etanol lalu endapan di

hairdry selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 100 μl rehidration

DNA solution dan didiamkan selama 1 jam pada suhu 650C atau selama

semalam pada suhu 40C.

3.4.3 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

DNA yang sudah diisolasi dianalisis menggunakan Spektrofotometri UV

DNA (DeNovix®

). Proses analisis dilakukan dengan cara pada layar

Spektrofotometri UV DNA (DeNovix®) dipilih Nucleic Acid. Kemudian Sample

port dibersikan menggunkan tisu steril. Siapkan DNA Rehidration Solution yang

digunakan sebagai blanko sebanyak 1 μl lalu ditaruh di atas Sample port dan

dianalisis. Sample port dibersihkan kembali menggunakan tisu steril. Identitas

sampel dimasukkan pada kolom Sampel ID dan sebanyak 1 μl DNA sampel

tersebut ditaruh di atas Sample port. Analisis dilakukan untuk mengukur

kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol “Measure”. DNA

dianalisis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Tunggu beberapa detik

akan muncul data kemurnian dan kuantitas DNA.

28


3.4.4 Amplifikasi DNA dengan metode Real Time PCR

a. Pembuatan Primer 50 μM Dari Larutan Induk 100 μM

Sebanyak 50 μl larutan induk primer 100 μM dimasukkan kedalam

mikrosentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 50 μl

aquadest kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut

dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikroppipet.

b. Pembuatan Primer 5 μM Dari Seri Larutan Induk 50 μM

Sebanyak 3 μl larutan induk primer 50 μM dimasukkan kedalam

mikrosentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 27 μl

aquadest kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut

dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikroppipet.

c. Pembuatan Mastermix Real Time PCR

Master mix dibuat dengan volume total 20 μl yang terdiri dari 5 μl DNA

template; 3,8 μl Aquabidest; 0,4 μl primer forward 5 μM; 0,4 μl primer

reverse 5 μM; 0,4 μl UPL 10 μM; dan 10 μl LightCycler® 480 probe

master (enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6,4 mM MgCl2).

d. Loading Sampel dan Taqman Probe Mastermix kedalam Multiwell Plate

(Roched, 2008)

Campuran reaksi dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang

diinginkan. Kemudian dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas

secara perlahan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses

pengaturan program LightCycler® 480 real time PCR yang akan

digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR

dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR

diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil,

kemudian diletakkan pada mesin real time PCR. Instrumen real time

PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung

memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva.

29


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini dilakukan analisis cemaran daging babi pada produk

sosis sapi yang beredar di Pasar Parung menggunakan metode Real Time

Polymerase Chain Reaction. Pemilihan alat real time dikarenakan pada real time

PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara real time

sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui

produk PCR. Real time PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena

kemampuan analisanya yang akurat, sensitif dan spesifik sehingga mengurangi

kesalahan pada hasil. Selain amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen dapat

diamati secara cepat, teknik ini juga dapat menentukan konsentrasi DNA yang

terdapat pada sampel. Cytochrome b adalah salah satu bagian dari sitokrom yang

terlibat dalam transportasi elektron dalam mitokondria. Cyt b berisi delapan

transmembran heliks yang dihubungkan oleh intramembran atau domain

ekstramembran. Gen cyt b dikodekan oleh DNA mitokondria. Adanya variasi

urutan pada cyt b menyebabkan gen ini banyak digunakan untuk membandingkan

spesies dalam genus atau famili yang sama. Keunikan sekuen cyt b yaitu terdapat

bagian yang bersifat kekal (conserve sequence) di dalam tingkat spesies, sehingga

dapat digunakan untuk pengelompokan berdasarkan jenis hewan atau untuk

penentuan hubungan kekerabatan antar jenis hewan. Sekuen gen cyt b yang

berasal dari sapi (Bos taurus) dan babi (Sus scrofa) mempunyai panjang sekuen

1140 pb (Primasari, 2011). Analisis dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isolasi

DNA, pengukuran kemurnian dan kuantifikasi DNA hasil isolasi, amplifikasi

DNA dan analisis DNA hasil amplifikasi.

30


4.1. Hasil Analisis DNA dengan Spektrofotometri UV

Tabel 4.1 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA

No Sampel Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian (A260/A280)

1. Daging Babi 127.419 1.84

2. Daging Sapi 84.086 1.89

3. Sampel 1 146.477 1.87

4. Sampel 2 164.050 1.69

5. Sampel 3 145.785 1.90

6. Sampel 4 48.115 1.87

7. Sampel 5 73.760 1.82

8. Sampel 6 90.532 1.90

Isolasi DNA dilakukan terhadap daging sapi, daging babi, dan 6 sampel

sosis sapi yang beredar di Pasar Parung. Metode isolasi DNA dilakukan dengan

menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega. Prinsip kerja

isolasi DNA menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit yaitu lisis,

ekstraksi, homogenisasi, presipitasi protein, dan rehidrasi DNA. Bahan-bahan

yang digunakan pada proses isolasi DNA pada daging sampel adalah nuclei lysis

solution, RNAse, protein precipitation solution, isopropanol, etanol 70%, dan

DNA rehydration solution (Promega, 2012). nuclei lysis solution untuk

penghancur dinding sel maupun membran sel. Reagen yang digunakan pada

proses lisis adalah NLS. Penambahan NLS merupakan cara kimia yang berfungsi

untuk menghancurkan membran sel dan nukleus. NLS menghancurkan membran

sel dengan cara mengganggu ikatan kimia pada membran tersebut. Ekstraksi

bertujuan untuk menghancurkan sel sehingga materi yang ada didalam sel dapat

keluar. Homogenisasi bertujuan untuk mencampurkan zat. Homogenisasi biasanya

dilakukan pada setiap penambahan suatu zat. Presipitasi atau pengendapan

bertujuan untuk memisahkan supernatan dengan endapan. Reagen yang digunakan

pada proses presipitasi adalah protein precipitation solution. PPS tersusun atas

garam penyangga (salt buffer) sehingga reagen ini dapat menurunkan kelarutan

31


protein sehingga protein dapat mengendap. DNA yang telah dibersihkan dari

protein masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk

membersihkan DNA dari RNA. RNAse merupakan enzim yang berfungsi untuk

mendegradasi RNA. Hal tersebut dapat memudahkan proses isolasi karena RNAse

akan merusak RNA sedangkan DNA tidak. Molekul DNA yang telah diisolasi

kemudian dimurnikan dengan cara presipitasi etanol. Dengan adanya larutan

garam (kation monovalen seperti Na+ pada suhu -20

0C etanol absolut dapat

mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara

sentrifugasi. Rehidrasi DNA merupakan tekhnik pemurnian DNA dengan cara

mengeringkan atau menguapkan (Radji, 2011).

Isolat DNA yang dihasilkan dari tahapan kerja di atas, didapatkan

konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometri DNA

(DeNovix). Hasil isolasi diukur konsentrasinya dengan menggunakan

spektrofotometer Denovix pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

Pengukuran kuantitas (konsentrasi) dan kualitas (kemurnian) didasarkan pada

prinsip penyinaran sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein

dalam larutan (Muladno, 2010). Konsentrasi yang dihasilkan dari masing-masing

sampel bervariasi antara 48,115 ng/µl-164,050 ng/µl (Lampiran 1). Berdasarkan

hasil isolasi dan konsentrasi DNA (Lampiran 1), sampel nomer 2 memiliki

konsentrasi paling besar yaitu 164,050 ng/µl. Sampel nomer 4 dengan konsentrasi

terendah yaitu 48.115 ng/µl. Dengan demikian, konsentrasi DNA yang didapatkan

dari tiap sampel masih dapat dilanjutkan ke tahap amplifikasi DNA menggunakan

real time PCR karena batas konsentrasi minimal untuk melanjutkan real time PCR

adalah 0,03-0,80 pg (Andreo et al, 2005).

Perbandingan antara panjang gelombang 260 nm dan 280 nm merupakan

nilai kemurnian DNA. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang

gelombang 260 nm, sedang protein akan menyerap cahaya UV pada panjang

gelombang 280 nm. Sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung

nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (A260/A280), dan

nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0 (Stephenso, 2003; Muladno, 2010;

Sambrook, et al, 1989; Fatchiyah, 2010). Nilai kemurnian yang dihasilkan dari

genom yang diperoleh memiliki nilai antara 1,69-1,90 (Lampiran 1). Sampel yang

32


memiliki nilai kemurnian dibawah 1,8 sebanyak satu sampel yang menunjukkan

adanya kontaminasi protein. Sedangkan sampel yang memiliki nilai kemurnian

diatas 2,0 tidak menunjukkan adanya kontaminasi RNA.

Setelah proses isolasi DNA, sampel di amplifikasi menggunakan real time

PCR primer dan UPL yang spesifik (Roche, 2008) dianalisis secara in silico

dengan BLAST berdasarkan informasi database NCBI melalui internet. Selain

BLAST, primer dan UPL diuji spesifikasinya dengan cara kedua primer dan UPL

digunakan untuk mengamplifikasi daging sapi segar dan daging babi segar

(gambar 4.1 dan gambar 4.3).

Campuran reaksi total PCR (Lampiran 4) dibuat dalam volume 20 µL

dengan konsentrasi tiap primer forward dan reverse 20 µM dan untuk konsentrasi

UPL/probe. Konsentrasi primer dibuat dari larutan induk 100 µM. Konsentrasi

primer untuk PCR sebaiknya berkisar antara 0,3-1 μM dan untuk konsentrasi

hydrolysis probe berkisar antara 0,05-0,2 μM (Roche, 2008). Konsentrasi primer

yang optimal adalah konsentrasi terendah yang dapat menghasilkan nilai CP awal

dan kurva fluoresen yang baik, begitu juga dengan probe (Roche, 2008).

4.2 Uji Cemaran DNA Babi pada Sampel Sosis Sapi

Amplifikasi DNA daging sapi, daging babi dan 6 sampel sosis sapi yang

beredar di Pasar Parung dilakukan dengan menggunakan dua primer yaitu primer

sapi dan primer babi. Penggunaan primer sapi bertujuan untuk memastikan bahwa

sampel sosis yang berlogo sapi mengandung daging sapi. Sedangkan primer babi

digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya kandungan babi didalam sampel

sosis sapi.

Konsentrasi primer pada PCR yang dianjurkan berkisar antara 0,1-0,5 µM.

Konsentrasi primer yang tinggi (≥0,5 µM) dapat meningkatkan kesalah

penempelan primer pada DNA cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan

primer yang tidak spesifik. Namun, penggunaan konsentrasi primer yang terlalu

rendah akan memberikan hasil amplifikasi yang tidak jelas (Bintang, 2010).

Proses amplifikasi pada PCR biasanya 35-40 siklus (Muladno, 2010),

namun pada penelitian ini hanya menggunakan 30 siklus. Hal ini dikarenakan

sebelum mencapai siklus ke 30 sudah terjadi amplifikasi pada sekuen DNA.

33


Program amplifikasi yang digunakan pada real time PCR dipilih berdasarkan

penanda yang digunakan. Penelitian ini menggunakan UPL sebagai penanda pada

reaksi real time PCR sehingga program yang digunakan dapat dilihat pada tabel

4.2 dibawah ini:

Tabel 4.2 Program Dual Color Hydrolysis Probe – UPL Probe 96-II

Analisis kurva amplifikasi dilihat dari kenaikan kurva dan nilai CP

(Crossing Point) pada kurva amplifikasi. Spesifisitas hasil amplifikasi dapat

dilihat melalui nilai TM (Melting Temperature) pada melting curve. CP adalah

jumlah siklus dimana sampel mulai terbaca diatas Arbitrary Fluorescence Level

(AFL) yang menunjukkan awal mulainya fase pertumbuhan eksponensial (Roche,

2008). Semakin rendah nilai CP maka semakin tinggi konsentrasi DNA target. Tm

adalah suhu dimana 50% bagian dari DNA telah terbuka menjadi untai tunggal.

Nilai Tm tergantung dari jumlah basa A, G, T dan C. Primer yang spesifik akan

menghasilkan satu puncak Tm pada DNA target (Izzah, 2014).

34



Menggunakan Primer Sapi

Gambar 4.1. Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi

Menggunakan Primer Spesifik Sapi. *Keterangan: NTC (No Template Control)


Menggunakan Primer Spesifik Sapi. *Keterangan: NTC (No Template Control

Analisa menggunakan real time PCR memungkinkan untuk dilakukan

pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi

dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari

probe (penanda). Saat probe terpecah, reporter tidak lagi berdekatan dengan

quencher sehingga dapat mengemisikan cahaya fluorescent yang dibaca oleh

detektor. Semakin tinggi fluorescent yang dipancarkan dari reporter secara

langsung berkolerasi dengan akumulasi pelepasan molekul reporter (sekaligus

menandakan jumlah produk PCR yang dihasilkan). Apabila dilihat pada grafik

amplifikasi positif kontrol (kurva standar) ditandai dengan adanya akumulasi pada

signal fluorescent dan melintasi base line threshold. Sedangkan kontrol negatif

dan NTC tidak melintasi base line threshold sehingga menunjukkan hasil negatif.

35


Amplifikasi yang pertama dilakukan menggunakan primer sapi. daging sapi

sebagai kontrol positif, daging babi sebagai kontrol negatif dan NTC sebagai

blanko. Amplifikasi terhadap kontrol dilakukan untuk mengetahui primer sapi

yang digunakan spesifik atau tidak terhadap daging sapi. Kurva amplifikasi

terhadap kontrol menggunakan primer sapi dapat dilihat pada gambar 4.1.

Hasil uji terlihat pada gambar 4.1 dimana primer sapi hanya

mengamplifikasi daging sapi segar pada CP 11,31 sedangkan pada daging babi

dan NTC tidak menghasilkan nilai CP. Nilai CP yang dihasilkan oleh daging sapi

menunjukkan telah terjadinya proses amplifikasi, sedangkan pada daging babi dan

NTC tidak terjadi proses amplifikasi. Hal ini menunjukan bahwa primer sapi

dapat mengamplifikasi DNA daging sapi secara spesifik. Hasil amplifikasi yang

spesifik dikarenakan tidak terjadi mis-priming ataupun primer dimer. Primer

dimer adalah terbentuknya struktur sekunder karena menempelnya sesama primer

sejenis ataupun primer yang tidak sejenis yaitu antara primer forward dengan

komplemen primer reverse (Widowati, 2013). Sedangkan mis-priming adalah

penempelan primer diluar sekuen DNA target (Izzah, 2014). Berdasarkan hasil

amplifikasi diatas, maka primer sapi dapat digunakan untuk tahap selanjutnya

yaitu untuk menganalisa kandungan sosis sapi yang digunakan sebagai sampel.

36


4.2.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sampel Sosis Sapi, dan NTC

Menggunakan Primer Sapi


Sampel Menggunakan Primer Spesifik Sapi. *Keterangan: 1 (Sampel 1), 2 (Sampel 2),3 (Sampel 3),4 (Sampel 4), 5 (Sampel 5), 6

(Sampel 6), NTC (No Template Control).

Amplifikasi kedua yang dilakukan menggunakan primer sapi sebagai

kontrol positif, sosis sapi sebagai sampel, dan NTC sebagai blanko. Amplifikasi

terhadap sampel menggunakan primer sapi dilakukan untuk memastikan bahwa

sosis sapi yang digunakan sebagai sampel mengandung daging sapi. Kurva

amplifikasi terhadap kontrol positif, sampel dan NTC menggunakan primer sapi

dapat dilihat pada gambar 4.2.

Seluruh sampel diuji menggunakan primer sapi dan UPL sebagai penanda

pada reaksi real time PCR. Hasil amplifikasi menggunakan primer sapi dapat

dilihat pada gambar 4.2 terlihat adanya perbedaan kenaikan kurva dan CP pada

tiap sampel. Kontrol positif memberikan CP lebih awal yaitu pada 11,15

meskipun dalam data konsentrasi DNA daging sapi segar hanya 84,086 ng/µL.

Dan sampel nomor 1 memiliki konsentrasi paling besar kedua yaitu 146.477

ng/µL memberikan CP lebih awal pada 16,78 sedangkan sampel nomor 3

37


memiliki konsentrasi paling tinggi kedua yaitu 145.785 ng/µL tetapi memberikan

CP paling lama yaitu pada 27,12. Perbedaan kenaikan kurva pada tiap sampel

dipengaruhi oleh konsentrasi DNA dalam sampel (Roche, 2008). Sampel dengan

konsentrasi DNA paling tinggi membutuhkan siklus amplifikasi lebih sedikit

untuk mencapai CP. Begitu juga dengan konsentrasi DNA yang rendah

membutuhkan siklus amplifikasi lebih panjang untuk mencapai CP. Namun

kenyataannya, konsentrasi DNA sampel yang besar membutuhkan siklus

amplifikasi lebih panjang dengan memberikan nilai CP yang besar. Hal ini

disebabkan hasil isolasi DNA sampel yang didapat bukan hanya pada DNA yang

spesifik terhadap desain primer dan probe.

DNA organisme eukariotik terdapat di dalam inti sel yang terbentuk sebagai

kromosom (Stansfield et al, 2006) dan di dalam mitokondria atau yang biasa

disebut mtDNA. Desain primer dan UPL yang digunakan dalam penelitian ini

hanya spesifik pada daerah mitokondria sitokrom b (Tanabe et al, 2007).

Meskipun dengan konsentrasi DNA yang besar namun jika tidak mengandung

sekuen DNA mitokondia sitokrom b, maka tidak akan terjadi amplifikasi.

Pemilihan DNA mitokondria sebagai desain primer karena DNA mitokondria

terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi. Jumlah kopi yang tinggi ini

menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk berbagai keperluan analisis

genom. Kemudian ukuran DNA mitokondria yang relatif kecil (14-39 kb)

sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh (Sholihin, 1994).

38


4.2.3 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, dan NTC

Menggunakan Primer Babi

Gambar 4.3 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil

Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Babi. *Keterangan: NTC (No Template Control

Amplifikasi yang pertama dilakukan menggunakan primer babi. Daging

babi sebagai kontrol positif, daging sapi sebagai kontrol negatif dan NTC sebagai

blanko. Amplifikasi terhadap kontrol dilakukan untuk mengetahui primer babi

yang digunakan spesifik atau tidak terhadap daging babi. Kurva amplifikasi

terhadap kontrol menggunakan primer babi dapat dilihat pada gambar 4.3.

Hasil uji terlihat pada gambar 4.3 dimana primer babi hanya

mengamplifikasi daging babi segar pada CP 16,31 sedangkan pada daging babi

dan NTC tidak menghasilkan nilai CP. Nilai CP yang dihasilkan oleh daging

babi menunjukkan telah terjadinya proses amplifikasi sedangkan pada daging sapi

dan NTC tidak terjadi proses amplifikasi. Hal ini menunjukan bahwa primer babi

dapat mengamplifikasi DNA daging babi secara spesifik.

39


4.2.4 Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Sosis Sapi, dan NTC

Menggunakan Primer Babi


Sampel Menggunakan Primer Spesifik Babi *Keterangan: NTC (No Template Control).

Amplifikasi yang kedua dilakukan menggunakan primer babi sebagai

kontrol positif, sosis sapi sebagai sampel, dan NTC sebagai blanko. Amplifikasi

terhadap sampel sosis sapi menggunakan primer babi dilakukan untuk mengetahui

ada atau tidaknya kandungan daging babi di dalam sampel sosis. Kurva

amplifikasi terhadap kontrol positif, sampel dan NTC menggunakan primer babi

dapat dilihat pada gambar 4.4.

Seluruh sampel diuji menggunakan primer babi dan UPL sebagai penanda

pada reaksi real time PCR. Amplifikasi menggunakan primer babi pada sampel

sosis sapi yaitu 15,29 dengan konsentrasi DNA daging babi sebesar 127.419

ng/µL. Sedangkan NTC dan seluruh sampel hanya memberikan garis lurus. Hal

tersebut menandakan tidak terjadinya amplifikasi primer babi pada DNA sampel.

Terbukti bahwa produk sosis sapi yang diuji masih sesuai dengan bahan asal yang

digunakan tanpa kontaminasi daging babi.

40


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai

berikut :

1. Amplifikasi DNA menggunakan primer spesifik babi dan sapi dapat

dilakukan dengan real time PCR sebanyak 30 siklus dengan kondisi suhu

denaturasi 950C selama 10 detik dan annealing pada suhu 60

0C selama

30 detik.

2. Kurva amplifikasi real time PCR menggunakan primer spesifik babi

menunjukkan bahwa kontrol positif teramplifikasi dengan nilai CP 19,97

sedangkan kontrol negatif dan enam sampel sosis sapi tidak

teramplifikasi.

3. Kurva amplifikasi DNA menggunakan real time PCR, menunjukkan

bahwa produk sosis sapi yang diuji tidak mengandung daging babi.

5.2 Saran

Perlu dilakukan optimasi dan evaluasi terhadap alat real time PCR dan

mesin isolasi DNA.

41


DAFTAR PUSTAKA

Alaraidha, Ibrahim Abdullah. 2008. Improved DNA Extraction Method for

Porcine Contaminants, Detection in Imported Meat to The Saudi Market.

Saudi Arabia : Saudi Journal of Biologic Sciences 15 (2) 225-229 December

2008. htt:www.saudibiosoc.com. diakses pada 23 Maret 2016 pukul 18.17

Ali, M.E., U. Hashim., S.Mustafa., Y.B. Che Man., Th.S.Dhahi., M.Kashif., Md.

Kamal Uddin., S.B.Abd Hamid. 2012. Analysis of pork adulteration in

commercial meatballs targeting porcine-specific mitochondrial cytochrome

b gene by TaqMan probe real-time polymerase chain reaction. Malaysia.

Andreo, Mario Lopez., Laura Lugo., A Garrido-Pertierra., M. Isabel Prieto and A

Puyet. 2005. Identification and quantitation of species in complex DNA

mixtures by real-time polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry.

339(1), 73-82Bio-Rad. 2006.

Ayu, D.H., Dharmayanti NLPI. 2014. Perkembangan Teknologi Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom

Avian Influenza dan Newcastle Diseases. Balai Besar Penelitian Veteriner,

Jl. RE Martadinata No. 30, Bogor 16114.

Bio-Rad. 2006. Real Time PCR Application Guide. http://www.bio-rad.com,

diakses pada 22 Februari 2016 pukul 10.11

Bintang, Maria. 2010. Biokimia Tekni Penelitian. Jakarta. Erlangga

Burns, Malcolm J., Gavin J Nixon., Carole A Foy., Neil Harris. 2005.

Standardisation of data from real-time quantitative PCR methods-

evaluation of outliers and comparison of calibration curves. BMC

Biotecnology doi.10.1189/1472-6750-5-31

Danuz, Sonia Zulfa Deshi. 2014. Amplifikasi DNA Leptospira dengan

Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-

PCR). Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Dono, Nanung Danar S.Pt.,M.P. Skema Manfaat dan Penggunaan Babi. Dosen

Fakultas Peternakan UGM Yogyakarta dan Sekretaris Eksekutif/Auditor

Halal LPPOM MUI Propinsi DIY. diakses pada 29 Februari 2016 pukul

09.19

http://www.bio-rad.com/

42


Fatchiyah. 2010. Uji Kualitatif dan Kuantitatif DNA dan RNA.

http://www.scribd.com/doc/31385295/Uji-Kuantitatif-Dan-Kuantitatif-

DNA-Dan-RNA-2010, diakses pada 25 Desember 2016 pukul 10.00 WIB.

Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung :

Universitas Padjajaran.

Handoyo, Darmo., & Rudiretna, Ari. 2001. General Principles and

Implementation of Polymerase Chain Reaction. Unitas, 9(1) : 17-29

Hidayat, Rian. 2015. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA Babi dan DNA

Sapi untuk Deteksi Kehalalan Cangkang Kapsul Keras dari Gelatin

dengan Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Hildaa, Dr. Lelya, M.Si. 2013. Pandangan Sains Terhadap Haramnya Lemak

Babi. TSAIN Padangsidimpuan. diakses pada 20 Januari 2016 pukul 03.28

Hildab, Dr. Lelya, M.Si. 2014. Analisis Kandungan Lemak Babi dalam Produk

Pangan di Padang Sidimpuan secara Kualitatif dengan Menggunakan Gas

Kromatografi (GC). IAIN Padangsidimpuan. diakses pada 20 Januari 2016

pukul 03.30

Irawati, Yiyin. 2001. Pemanfaatan Primer Pengapit Pre-1 (Porcine Repetitive

Element) untuk Mendeteksi Daging Babi pada Beberapa Produk Sosis.

Skripsi. Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.

Izzah, Nurul Afifah.2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi

dengan Menggunakan Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.

Kusuma, Sri Agung Fitri,M.Si.Apt. Polymerase Chain Reaction

(PCR).2010.Universitas Padjadjaran Fakultas Farmasi. diakses pada 30

Januari 2016 pukul 13.24

Liyana, Farihah K., Shuhaimi, M., Che Man, Y.B., Sazili A.Q., Aida A.A., Raha

A.R. 2009. Porcine Specific Real time Polymerase Chain Reaction (PCR)

for Halal Verification. Proceedings of the 3rd IMT-GT International

Symposium on Halal Science and Management 2009. Malaysia : UPM

Serdang, Selangor.

http://www.scribd.com/doc/31385295/Uji-Kuantitatif-Dan-Kuantitatif-DNA-Dan-RNA-2010

http://www.scribd.com/doc/31385295/Uji-Kuantitatif-Dan-Kuantitatif-DNA-Dan-RNA-2010

43


Margawati, Endang Tri., Muhamad Ridwan. 2010. Pengujian Pencemarann

Daging Babi Pada Beberapa Produk Bakso Dengan Teknologi PCR:

Pencarian Sistem Pengujian Efektif. Bogor : Pusat Penelitian Bioteknologi,

LIPI.

Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetik Edisi Kedua. Bogor : IPB press

Mulyana,Yopi. 2010. Analisis Cemaran Daging Babi pada Kornet Sapi di

Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction

(PCR). Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Nurlaily, Enik Afifah. 2012. Penggunaan Penanda Molekuler untuk Mempercepat

dan Mempermudah Perbaikan Kualitas Tanaman Teh (Camellia Sinensis

(L.) O. Kuntze). Skripsi. Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

Oebaidillah, Syarief. 2011. 60 % Produk yang Beredar tidak Dijamin Halal

http://bataviase.co.id/node/522354, diakses tanggal 22 Februari 05.54

Pasaribu, Dian Tantri Y. 2009. Pengaruh Taraf Penambahan Tepung Terigu

sebagai Bahan Pengikat Terhadap Kualitas Sosis Daging Ayam. Medan :

Departemen Peternakan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara

Medan 2009. diakses pada 29 Februari 2016 pukul 08.36

Pratami, D.F. 2011. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Burger Sapi

yang Beredar di Wilayah Ciputat Melalui Amplifikasi DNA Menggunakan

Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Primasari, Almira. 2011. Sensitivitas Gen Sitokrom B (Cyt b) Sebagai Marka

Spesifik pada Genus Rattus dan Mus untuk Menjamin Keamanan Pangan

Produk Asal Daging. Tesis. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Promega. 2007. Technical Manual Maxwell® 16 DNA Purification Kits.

http://www.promega.com. diakses pada 26 Maret 2016 pukul 23.58

Radji, Maksum. 2011. Rekayasa Genetika. Jakarta: ISBN : 978-602-8674-40-9

Rahmawati, Putri. 2012. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Dendeng

Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA

Menggunakan Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

http://bataviase.co.id/node/522354

44


Rahmawati., Sismindari., Raharjo., T.J., Sudjadi and Rohman,A. 2016.

Analysis of pork contamination in Abon using mitochondrial D-Loop22

primers using real time polymerase chain reaction method. Indonesia.

International Food Research Journal 23(1): 370-374 (2016). diakses pada

23 Maret 2016 pukul 18.08

Rasyid, Sulaiman. 2015. Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Bakso Sapi

yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real Time Polymerase

Chain Reaction dengan Metode Hydrolysis Probe. Skripsi. UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

Rochea. 2008. The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual.

http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 20 Januari 2016

pukul 20.54

Rocheb. 2008. The LightCycler® 480 System, Unleash the Potential of Real Time

PCR. http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 20 Januari 2016

pukul 20.54

Rochec. 2008. LightCycler® 480 Probes Master. Version February 2008.

http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 20 Januari 2016

pukul 20.54

Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A

Labolatory Manual. 2nd

edition. New York : Cold Spring Harbour

Laboratory Press. Book 1.6.1-6.17

Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA)

dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. Bogor

: FMIPA IPB. ISSN 0854-8587

Stansfield, William D., Jaime S.Colome., Raul J.Cano. 2006. Shaum’s Easy

Ountlines Biologi Molekuler dan Sel; alih bahasa, Varian Fahmi ; editor,

Amalia Safitri. Jakarta : Erlangga

Stephenson, Frank, H., 2003. Calculations in Molecular Biology and

Biotechnology, A Guide to Mathematics in The Laboratory, Academic

Press, California, USA.

45


Sriati, Nur. 2011. Analisis Cemaran DNA Mitokondria Babi pada Produk Sosis

Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Metode Real Time

PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Tanabe, Soichi., Makiko Hase., Takeo Yano., Masahiko Sato., Tasuya Fujimura.,

and Hiroshi Akiyama. 2007. A Real Time Quantitative PCR Detection

Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Japan :

Setagaya-ku, Tokyo. 71 (12). 3131-3135.2007

Uswahdani, Rohati Hikmah. 2013. Keanekaragaman Molekuler Durian

Berdasarkan Fragmen Internal Transcribed Spacers (ITS) DNA Ribosomal

Melalui Analisis PCR-RFLP. Skripsi. Universitas Negeri Semarang.

Vivikananda, Evira.2014.Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan

Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR). Skripsi.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Wardani, Agustin Krisna., Elok Puji Kurnia Sari. 2015. Deteksi Molekuler

Cemaran Daging Babi pada Bakso Sapi di Pasar Tradisional Kota Malang

Menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction). Malang : Jurnal Pangan

dan Agroindustri Vol. 3 No 4 p. 1294-1301. diakses pada 15 Januari 2016

pukul 16.59.

Widyastuti, Endrika. 2012. Sel Struktur dan Fungsi. Fakultas Teknologi Pertanian

UB. diakses pada 22 Januari 2016 pukul 21.51

Wijaya, Yoga Permana. 2009. Fakta Ilmiah Tentang Keharaman Babi.

http://yogapw.wordpress.com. diakses pada 29 Februari 2016 pukul 09.17

http://yogapw.wordpress.com/

46


Lampiran 1

Tabel 4. Konsentrasi dan kemurnian hasil isolasi

No Sampel Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian

(A260/A280)

1. Daging Babi 127.419 1.84

2. Daging Sapi 84,086 1.89

3. Sampel 1 146.477 1.87

4. Sampel 2 164.050 1.69

5. Sampel 3 145.785 1.90

6. Sampel 4 48.115 1.87

7. Sampel 5 73.760 1.82

8. Sampel 6 90.532 1.90

47


Lampiran 2.

Perhitungan Pembuatan Larutan Primer

a. Membuat larutan primer 50 µM dari larutan induk 100 µM

V1 x N1 = V2 x N2

V1 x 100 = 100 x 50

V1 = 50 µL

Maka, 50 µl diambil dari larutan induk primer konsentrasi 100 µM, kemudian

ditambahkan aquabidest sampai volume 100 µl.

b. Membuat larutan primer 5 µM dari seri konsentrasi primer 50 µM.

V1 x N1 = V2 x N2

V1 x 50 = 30 x 5

V1 = 3 µL

Maka, diambil 3 µl dari larutan primer konsentrasi 50 µM, kemudian

ditambahkan aquabidest sampai volume 30 µl.

c. Membuat larutan primer 0,1 µM dari konsentrasi 5 µM.

V1 x N1 = V2 x N2

V1 x 5 = 20 x 0,1

V1 = 0,4 µL

Maka, diambil 0,4 µL dari larutan primer konsentrasi 50 µM.

48


Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

PRIMER SAPI PRIMER BABI

Primer Sapi Forward Primer Babi Forward

Tm = 2oC (2 + 6) + 4

oC (11 + 0) Tm = 2

oC (1 + 9) + 4

oC (10 + 0)

= 60oC = 60

oC

Primer Sapi Reverse Primer Babi Reverse

Tm = 2oC (4 + 5) + 4

oC (2 + 9) Tm = 2

oC (5 + 9) + 4

oC (2 + 9)

= 62oC = 72

oC

Tm rata-rata primer sapi: Tm rata-rata primer babi:

Tm = (60 + 62) / 2 Tm = (60 + 72) / 2

= 6oC = 66

oC

Rumus Tm = 2oC (A + T) + 4

oC (G + C)

49


Lampiran 4.

Tabel 5. Komponen Campuran Reaksi Real Time PCR

Komposisi Jumlah

Primer Forward 20µM 0,4 µl

Primer Reverse 20µM 0,4 µl

UPL 0,4 µl

Buffer PCR 10 µl

ddH2O 3,8 µl

Template 5 µl

Total 20 µl

50


Lampiran 5. Hasil Kurva Amplifikasi

Gamabar 5.1 Kurva Amplifikasi Uji Spesifitas Primer dan UPL

Gambar 5.2 Kurva Amplifikasi Uji Spesifitas Primer Babi

51



Sampel Menggunakan Primer Spesifik Sapi.

52


Gambar 5.4 . Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi

Sampel Menggunakan Primer Spesifik Babi.

Lampiran 6

Gambar. Alat – alat yang digunakan dalam Penelitian

Gambar 5.3

Spektrofotometri DNA

Gambar 5.4

Kit Ekstraksi (Promega)

Gambar 5.5

Masker, Glove Gambar 5.6

Mikrotips, Microsentrifuge, tube

53


Gambar 5.7

Microsentrifugasi

Gambar 5.8

vortex

Gambar 5.9

Mikropipet (1) Vol 1000 µl;

(2) Vol 200 µl; (3) Vol 20 µl

Gambar 5.10

Multiwell Plates, Sealing Foil

Gambar 5.11

Real Time PCR

Gambar 5.12

Timbangan Analitik

54


Gambar 5.13

Microsentrifugase 5417R

Gambar 5.14

Lemari pendingin suhu -21

Gambar 5.15

Oven

Gambar 5.16

Autoklav

Gambar 5.17

Sosis

Gambar 5.18

Daging Babi

analisis cemaran daging babi pada sosis sapi yang beredar di ...

Documents

Transcript of analisis cemaran daging babi pada sosis sapi yang beredar di ...