90 bab iv metode penelitian - Digilib UNS

commit to user

library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

90

BAB IV

METODE PENELITIAN

A. Jadwal Penelitian

Jadwal penelitian pada tabel 4.1. berikut:

Tabel 4.1. Jadwal Penelitian

No. KEGIATAN

BULAN

-

12

-

6 0 1 4 5 9 12 13 14 16 17

1. Penelusuran

kepustakaan X X X

2. Penyusunan naskah X X X

3. Pengajuan usulan X

4. Persiapan

penelitian X X X

5.

Pelaksanaan

penelitian

Pendahuluan I

Pendahuluan II

Penelitian Akhir

X

X

X

X

X

6. Pengolahan data X X X

7. Pembuatan laporan X X X

8. Presentasi X X

B. Tempat dan Waktu Penelitian

1. Kandang hewan percobaan Laboratorium Pusat Antar Universitas (PAU)

Universitas Gadjah Mada Jogjakarta sebagai tempat pemeliharaan hewan.

2. Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret

Surakarta. Penelitan Pendahuluan I untuk menentukan dosis LD 75 LPS

mengiduksi sepsis dilakukan pada hari Senin tanggal 18 Januari sampai

dengan Minggu tanggal 24 Januari Tahun 2017.

3. Laboratorium Histologi Universitas Gadjah Mada Jogjakarta. Penelitian

Pendahuluan II untuk menentukan dosis optimal HSP70 dilakukan pada hari

90

commit to user


91

Selasa tanggal 18 April sampai dengan hari Jumat tanggal 21 April Tahun

2017.

4. Laboratorium Pusat Antar Universitas (PAU) Universitas Gadjah Mada

Jogyakarta dilakukan penelitian tahap akhir pada hari Senin, 29 Mei sampai

Rabu, 31 Mei 2017.

5. Laboratorium PAU Universitas Gadjah Mada Jogyakarta untuk pengambilan

organ sel epithel alveoler paru dan sel epithel tubulus proksimal ginjal

dilakukan pada hari Rabu, 31 Mei 2017.

6. Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas

Maret Surakarta untuk fiksasi, pengeblokan, procesing secara manual dan

teknik pewarnaan Immuno Histo Chemistry (IHC) ekspresi Cyt c, Bax dan

Caspase 3 dari sel epithel alveoler paru dan sel epithel tubulus proksimal

ginjal pada Bulan Mei sampai dengan Desember 2017.

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan Penelitian

Bahan yang dipakai adalah sebagai berikut:

a. Hewan coba: mencit galur Balb/c, jantan, umur 6-8 minggu, dan berat

badan 26 - 33 gram dari PAU Universitas Gadjah Mada Jogjakarta

yang memenuhi kriteria inklusi.

b. Obat yang dipakai:

1) LPS dari SIGMA L2880-10MG Lot #025M4040V

Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 Purified by phenol

extraction.

2) HSP70 UsBiologi Heat Shock Protein Rat (HSP70) Lot#L16020515.

commit to user


92

2. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

a. Kandang pemeliharaan hewan coba

b. Kandang perlakuan hewan coba

c. Tempat makan dan minum hewan coba

d. Meja bedah

e. Botol salep isi formalin buffer 10% sebanyak 36 buah

f. Timbangan camry

g. Alat bedah minor

h. Handscoon

i. Jarum dengan speet 2,5 cc

j. Pinset

k. Gunting bedah (lurus dan bengkok)

D. Tatalaksana Penelitian

1. Jenis Penelitian

Jenis penelitian eksperimental laboratoris design. post-test only group

Pemeliharaan dan perlakuan ini dilaksanakan di Laboratorium PAU

Universitas Gadjah Mada Jogjakarta kemudian dilanjutkan pemeriksaan IHC

di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas

Maret Surakarta.

commit to user


93

2. Model Penelitian

Model penelitian ini adalah mencit galur balb/c,jantan, umur 6-8

minggu, dan berat badan 25 - 30 gram, diperoleh dari PAU Universitas

Gadjah Mada Jogjakarta. Sebelum dilakukan perlakuan sampel terlebih

dahulu dirawat sesuai standar yaitu dikandang dengan ukuran standar,

dengan suhu kamar dan siklus gelap dan terang tiap 12 jam.

a. Kriteria Inklusi :

1) Mencit jantan sehat adalah mencit jantan dengan kondisi mata

bersinar, bulu tidak kusam, aktif dan nafsu makan baik (Kusumawati,

2004).

2) Sub spesies Mus musculus galur Balb/C.

3) Umur 6−8 minggu.

4) Berat Badan 25 - 33 gram.

b. Kriteria eksklusi : Mencit sakit dan atau mati sebelum penelitian

3. Subjek Penelitian

Subyek penelitian adalah mencit galur Balb/c, jantan, umur 6-8 minggu,

dan berat badan 26 - 33 gram, diperoleh dari PAU Universitas Gadjah

Mada Jogyakarta. Sebelum dilakukan perlakuan sampel terlebih dahulu

dirawat sesuai standar yaitu dikandang dengan ukuran standar, pemeliharaan

dan bahan makanan, minuman, dengan suhu kamar, sanitasi kandang,

kelembaban, kondisi sama dan siklus gelap dan terang tiap 12 Pemilihan

hewan coba mencit berdasarkan pertimbangan paling sering dipakai pada

penelitian biomedik, karena secara genetik mempunyai kemiripan dengan

commit to user


94

manusia dan mempunyai kemampuan beradaptasi dalam lingkungan

laboratorium (Carson et al., 2005 ). Pemilihan kelamin jantan dimaksud

untuk menghindari pengaruh hormonal.

4. Besar Sampel

Penelitian eksperimental ini dilakukan pada populasi (N) tidak

diketahui. Rumus yang dipakai untuk menentukan besar sampel (n) adalah:

n = (Steel dan Torrie, 1980)

Keterangan:

n = besar sampel masing-masing kelompok

Z½ = nilai standar normal, yang besarnya tergantung

Bila = 0,05 Z½ = 1,645

Z = nilainya tergantung yang ditentukan (berdasarkan tabel)

= error untuk menerima H0, bila H0 salah

Bila = 0,08 Z = 0,842

= selisih antara rerata variabel terapi dan kontrol yang diharapkan

oleh peneliti

= standar deviasi

Atau dengan Rumus

Berdasarkan rumus Federer (Puspitawati dkk, 2008),

yaitu: (k-1)(n-1) ≥ 15

Keterangan:

k: jumlah kelompok

commit to user


95

n: jumlah sampel dalam kelompok

Berdasarkan rumus didapatkan masing tahapan setiap kelompok sudah

memenuhi batas minimal.

5. Kelompok Hewan Coba

Penelitian dibagi beberapa tahap yaitu

a. Penelitian Pendahuluan I sebanyak 20 mencit

b. Penelitian Pendahulan II sebanyak 25 mencit

c. Penelitian Akhir sebanyak 30 mencit.

6. Variabel Penelitian

Klasifikasi variabel diukur menurut tujuan penelitian dan digolongkan

dalam beberapa variabel sebagai berikut:

a. Variabel bebas

Rangsangan dengan cara menyuntikkan kepada mencit. LPS

menjadikan sepsis, apoptosis dan MODS sedangkan HSP70 menghambat

sepsis, apoptosia dan MODS. Variabel bebas tersebut meliputi:

1) LPS

2) HSP70

b. Variabel tergantung

Variabel tergantung adalah variabel yang akan diteliti yaitu: Ekspresi

Cyt C, Bax dan Caspase 3 epithel alveoler paru dan epithel tubulus

proksimal ginjal.

commit to user


96

c. Variabel Kendali

1) Hewan coba : Mencit sehat; mencit galur balb/c, jantan, berat badan

26-33gram dari PAU Universitas Gadjah Mada Jogjakarta. Bebas dari

bakteri Staphylococcus, streptococcus, salmonella dan parasit.

Aktivitas fisik lincah, nafsu makan baik, buang air besar tidak diare,

mata bersinar dan tidak piloerection.

2) Pemeliharaan dan bahan makanan, minuman, sanitasi kandang,

kelembaban, sinar matahari dan malam hari dikondisikan sama.

3) Injeksi: tehnik injeksi intra peritoneal pada mencit

Kelompok Kontrol Normal negative diinjeksi intra peritoneal dengan

Noral Salin 1cc, Kelompok Kontrol Positive diinjeksi intra peritoneal

dengan LPS dosis LD75 0,25 mg/KgBB dan Kelompok Kontrol

Perlakuan diinjeksi intra peritoneal HSP70 dosis optimal 200

µg/kgBB/i.p.

4) Epithel alveoler paru dari organ paru yang diambil untuk diteliti

ekspresi Cyt C, Bax dan Caspase 3. Epithel tubulus proksimal ginjal

dari organ ginjal yang diambil untuk diteliti ekspresi Cyt C, Bax dan

Caspase 3.

5) Pewarnaan preparat : IHC pada pembesaran 400X.

7. Batasan Operasional

Mencit sehat; mencit galur balb/c, jantan, berat badan 26-33gram dari

PAU Universitas Gadjah Mada Jogjakarta. Bebas dari bakteri

Staphylococcus, streptococcus, salmonella dan parasit. Aktivitas fisik lincah,

commit to user


97

nafsu makan baik, buang air besar tidak diare, mata bersinar dan tidak

piloerection.

Epithel alveoler paru dari organ paru yang diambil untuk diteliti

ekspresi Cyt C, Bax dan Caspase 3. Epithel tubulus proksimal ginjal dari

organ ginjal yang diambil untuk diteliti ekspresi Cyt C, Bax dan Caspase 3

dan pemeriksaan IHC pada pembesaran 400X.

Tabel 4.2 Jenis Variabel dan Definisi Operasional

No Variabel Definisi Operasional Unit Skala

1. LPS Endotoksin membran luar bekteri

gram negatif (E. colli) dari

SIGMA L2880-10MG Lot

#025M4040V

Lipopolysaccharides from

Escherichia coli 055:B5.LPS

dosis LD 75 0,25 mg/kkbb.

mg/ul -

2.

HSP70 Pada penelitian ini mencari dosis

HSP70 survival LD50 diantara

100 µg/kgBB/i.p ;

200 µg/kgBB/i.p; dan

300µg/kgBB/i.p.

(dariUSBiological Life Sciences)

dengan menghambat /

meningkatkan ekspresi Cyt c,

Bax, dan Caspase 3 , yang

nantinya digunakan sebagai dosis

hasil penelitian.

ug/kgBB Ordinal

3. Cyt c Protein dalam membran

mitokondrial terekspresi ke

sitosol dengan Western Blottin

pada apoptosis merupakan

gambaran kerusakan mitokondria.

Semakin besar ekspresi Cyt c,

semakin rusak membran

mitokondria dan sepsis semakin

berat. Pada Cyt c manusia

12,3kDa. Penelitian ini ekspresi

Cyt c dihitung perlapang

pandang dengan menggunakan

IHC.

kDa Ratio

commit to user


98

No Variabel Definisi Operasional Unit Skala

4.

Bax Protein pro-apoptosis dari

keluarga B-cell Lymphoma

2.Berat molekul sebesar 21 kDa.

Semakin tinggi ekspresi Bax

menunjukkan semakin besar

kerusakan pada apoptosis dan

lebih tinggi pada MODS.

Penelitian ini ekspresi Bax

dihitung perlapang pandang

dengan menggunakan IHC.

kDa Ratio

5 Caspae 3 Caspae eksekutor pada apoptosis

sehingga terjadi perubahan

karakteristik morfologi dan

biokimia tertentu serta kematian

sel. Penelitian ini ekspresi

Caspase 3 dihitung perlapang

pandang dengan menggunakan

IHC.

kDa Ratio

6.

Mencit

Sepsis

Mencit yang diinduksi dengan

LPS. Dosis yang digunakan

adalah LD75 (LPS 0.25mg/KgBB

i.p )

Ekor

7.

Sepsis

1-4 hari setelah mencit diinduksi

LPS 0,25mg/KgBB/ i.p dan

terjadi kerusakan pada MODS.

Pada penelitian ini diperiksa

dengan sel epithel alveoler paru

dan sel epithel tubulus proksimal

ginjal.

Sub Sel

Waktu

72jam

(3hari) dan

78 jam

8. Apoptosis Apoptosis dengan jalur intrinsic

mitokondria.

OMM

9.

Jalur

Intrinsik

Membran luar mitokondria terjadi

kerusakkan.

OMM

terbuka

Ratio

10. MODS

Kerusakkan 2 organ atau lebih

yaitu paru dan ginjal. Dinilai

dengan imunohistokimia Cyt c,

Bax dan Caspase 3.

Ekspresi

Cyt c,

Bax dan

Caspase

3

Ratio

commit to user


99

8. Alur Penelitian

Gambar 4.1. Bagan Alur Penelitian

HSP70200 µg/kgBB / i.p

paska LPS 0,25

mb/KgBB/ip 10 mencit

KN(Kontrol

Negativ )

10 mencit

LPS 0,25 mg/kgBB/i.p(

Kontrol

positive)

10 mencit

30 mencit

72 jam

5 mencit 78jam

5 mencit

SEL EPITHEL

ALVEOLER PARU

SEL EPITHEL

TUBULUS

PROKSIMAL GINJAL

SEL EPITHEL

ALVEOLER PARU

SEL EPITHEL

TUBULUS

PROKSIMAL GINJAL

72 jam

5 mencit

78 jam

5 mencit

SEL EPITHEL

ALVEOLER PARU

SEL EPITHEL

TUBULUS

PROKSIMAL GINJAL

SEL EPITHEL

ALVEOLER PARU

SEL EPITHEL

TUBULUS

PROKSIMAL GINJAL

72 jam

5 mencit

78 jam

5 mencit

SEL EPITHEL

ALVEOLER PARU

SEL EPITHEL

TUBULUS

PROKSIMAL GINJAL

SEL EPITHEL

ALVEOLER PARU

SEL EPITHEL

TUBULUS

PROKSIMAL GINJAL

Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3

Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3 Cty

c

Bax Caspa

se 3

Cty

c

Bax Caspa

se 3

Kruskal Wallisdilanjutkan Mann Whitney

Kesimpulan

Keterangan:

KN : Kontrol Normal

: tahapan penelitian

: hasil yang diharapkan

99

commit to user


100

Penjelasan Alur Penelitian

a. Sebelum Perlakuan

1) Kandang mencit disiapkan. Satu kandang 1 kelompok mencit.

2) Mencit diadaptasikan dengan lingkungan selama 7 hari.

Mencit sebanyak 20 ekor dikelompokkan secara acak menjadi 5

kelompok masing masing 4 mencit untuk penelitian pendahuluan I

(Lampiran 1) Kemudian 25 mencit dikelompokan menjadi 5

kelompok untuk penelitian pendahuluan II (Lampiran 2) .

b. Perlakuan

Sebanyak 30 mencit dibagi menjadi 3 kelompok masing masing i)

Kontrol Normal (Kontrol Negative) tanpa perlakuan disini diinjeksi NaCl

0,5 ml/ i.p sebanyak 10 mencit ii) Kelompok LPS dosis LD75 0,25

mg/kgBB/i.p (Kontrol Positve) sebanyak 10 mencit dan iii) Kelompok

HSP70 dosis optimal 200 µg/KgBB/i.p paska injeksi LPS dosis LD75

0,25 mg/kgBB/ i.p sebanyak 10 mencit. Masing masing kelompok dibagi

lagi menjadi 2 bagian yaitu i) Kelompok Kontrol Normal (Kontrol

Negative) 72 jam sebanyak 5 mencit dan 78 jam sebanyak 5 mencit ii)

Kelompok LPS dosis LD75 0,25 mg/kgBB/i.p (Kontrol Positve) 72 jam

sebanyak 5 mencit dan 78 jam sebanyak 5 mencit dan iii) Kelompok

HSP70 dosis optimal 200 µg/kgBB/ i.p paska injeksi LPS dosis LD75

0,25 mg/kgBB/ i.p 72jam sebanyak 5 mencit dan 78 jam sebanyak 5

mencit. Kemudian masing masing diamati modulasi ekspresi ekspresi

Cyt, Bax dan Caspase 3 epithel alveoler paru dan epithel tubulus

commit to user


101

proksimal ginjal pada apoptosis di MODS mencit model sepsis. Penelitian

ini untuk menganalisis respon modulasi ekspresi Cyt c, Bax dan Caspase

3 serta gambaran IHC pada pembesaran 400X di epithel alveoler paru

dan epithel tubulus proksimal ginjal pada apoptosis di MODS mencit

model sepsis. serta HSP70 diukur dengan metode dengan Western

Blottin.

Pengambilan organ paru dan ginjal dari 30 mencit setelah

dimatikan secara dikapitasi dengan menggunakan alat bedah minor kita

lakukan pembedahan untuk pengambilan organ (Lampiran 3) sbb:

1).Siapkan 30 botol salep steril yang diisi formali buffer 10% .2). Ambil

obat dengan pipet Grisson sesuai yang dibutuhkan kemudian diinjeksikan

2.i) Kontrol Normal (Kontrol Negative) tanpa perlakuan disini diinjeksi

NaCl 0,5 ml/ i.p sebanyak 10 mencit 2. ii) Kelompok LPS dosis LD75

0,25 mg/kgBB/i.p (Kontrol Positve) sebanyak 10 mencit dan2. iii)

Kelompok HSP70 dosis optimal 200 µg/KgBB/i.p paska injeksi LPS

dosis LD75 0,25 mg/kgBB/ i.p sebanyak 10 mencit. 3) Pembedahan

mencit dengan alat gunting bedah. 4) Pengambilan organ paru dan ginjal

menggunakan pinset 5) Masing masing botol diberi label 6) Organ

dimasukkan kedalam botol yang disediakan yang sebelumnya diisi

dengan formalin buffer 10% sampai dengan organ terendam kemudian

ditutup rapat. Kemudian dengan tempat khusus suhu fresser dibawa ke

Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas

Maret Surakarta untuk dilakukan pemeriksaan IHC.

commit to user


102

c. Setelah Perlakuan

Hasil penelitian Sukamto et al (2017) diperoleh dosis LD 50 adalah

0,2 mg/kkBB/ i.p dan LD75 0,25 mg/kkBB/i (Lampiran 1). dan diperoleh

dosis optimal injeksi HSP70 sebesar200 µg/kgBB/i.p p (Lampiran 2).

Pada penelitian, 72 jam dan 78 jam paska intervensi masing masing

i) kelompok kontrol(Kontrol Negative) ii) kelompok LPS dosis LD75

0,25mg/kgBB/i.p (Kontrol Positve) dan iii) kelompok HSP 70 dosis

optimal200 ug/KgBB/i.p paska injeksi LPS dosis LD75 0,25mg/kkKg/i.p

dinilai modulasi ekspresi Cyt c, Bax dan Caspase 3 serta gambaran IHC

pembesaran 400X pada epithel alveoler paru dan epithel tubulus

proksimal ginjal pada MODS mencit model sepsis di Laboratorium

Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret

Surakarta.

1) Metode prosesing sediaan secara manual :

Metode prosessing IHC secara manual adalah sebagai berikut:

preparat epithel proksimal ginjal diambil dari organ ginjal dipotong

membujur sedangkan preparat epithel alveoler paru dari organ paru

dipotong melintang. Preparat dimasukkan ke dalam larutan fiksasi

formalin buffer selama 6-24 jam. Dengan ideal volume formalin

buffer 10% kali volume organ.

Metode prosesing sediaan secara manual pada suhu ruang:

a) Dehidrasi dengan tujuan untuk menghilangkan air dalam jaringan

- Preparat direndam dengan Alkohol 50% selama semalam

commit to user


103

- Dilanjutkan Alkohol 70% selama 0,5 jam

- Alkohol 90% selama 1 jam

- Alkohol absolut selama 1 jam



b) Clearing dengan tujuan : Melepaskan alkohol yang terbawa oleh

preparat dan memberi warna bening pada preparat

Cara clearing dengan:

- Xylol selama 0,5 jam

- Xylol selama 1 jam

- Xylol selama 1 jam

c) Impregnasi

Sediaan preparat yang telah selesai didehidrasi direndam

dan clearing dengan menggunakan kombinasi paraffin dengan

titik lebur 48oC dan 58

oC pada suhu inkubator 60

oC selama

semalam. Kombinasi paraffin ini bertujuan agar pita-pita paraffin

yang telah dipotong di mikrotom dan dibentangkan pada

waterbath yang berisi air hangat akan lebih mudah untuk

mengembang/tidak melipat.

d) Pembuatan blok paraffin

Dalam pembuatan blok paraffin sangat penting untuk

diperhatikan orientasi sediaan dengan benar sehingga akan

diperoleh potongan yang representatif.

commit to user


104

e) Pemotongan blok dan deparafinisasi

Sebelum dilakukan pemotongan blok paraffin pada

mikrotom, blok direndam dulu dengan air es atau didinginkan

pada lemari es. Siapkan obyek glass dengan diolesi dengan

perekat yang dibuat dari campuran gliserin dan putih telur dengan

perbandingan 1:1. Ketebalan pita paraffin antara 3-5 µ tergantung

dari jenis sediannya. Misalnya untuk kelenjar getah bening 3-4 µ,

untuk soft tissue atau lemak 4-5 µ, untuk ginjal 2 µ, dan lain-lain.

Kemudian pita paraffin tersebut dibentangkan pada waterbath

yang berisi air hangat, setelah pitanya mekar/mengembang

tangkap dengan obyek glass. Setelah itu keringkan pada inkubator.

Deparafinisasi dilakukan dengan merendam preparat dalam

xylol selama 4X5 menit. Kemudian bersihkan sisa paraffin dengan

menggunakan kapas yang dibasahi dengan alkohol. Kemudian

dilakukan proses rehidrasi dengan cara merendam dalam alkohol

bertingkat selama 4X5 menit dimulai dengan alkohol

berkonsentrasi tinggi. Rehidrasi diperlukan karena pewarnaan

yang dipakai adalah berbasis air. Kemudian cuci dengan air

mengalir selama 5 menit.

f) Pewarnaan histopatologi

Setelah selesai rehidrasi dan dicuci dengan air mengalir,

preparat dimasukkan ke dalam hematoxylin Mayer’s selama 10

menit. Dicuci dengan air mengalir kemudian clearing dengan

commit to user


105

menggunakan HCl 1% untuk membersihkan kelebihan

hematoxylin. Dicuci kembali dengan air mengalir kemudian

masukkan dalam eosin selama 30 detik. Dicuci kembali dengan air

mengalir. Kemudian cuci dengan alkohol. Kering udarakan,

clearing dengan xylol kemudian ditutup dengan coverglass. Untuk

menutup preparat diperlukan lem khusus. Biasanya dipakai

Canada balsam, karena Canada balsam harganya sangat mahal

maka dibuat lem alternatif yang terbuat dari bahan pelitur (mata

kuning) yang dilarutkan dengan xylol.

2) Metode Tehnik Pewarnaan IHC (di Lab PA FK UNS Surakarta)

a) Alat dan Bahan

1) Alat

- Tissue cassette

- Beaker glass

- Mikrotom

- Poly-L-Lysine preparat

- Deckglass

- Humidity chamber vertikal

- Humidity chamber horisontal

- Mikro pipet 10 µl



- Mikro tube

commit to user


106

- Shaker

2) Bahan

- Formalin buffer

- Alkohol absolut, 95%, 80%, 70%, 50%.

- Xylol

- Parafin

- Aquadest

- Buffer sitrat pH 6

- PBS pH 7,2 - 7,4

- Metanol H2O2 0,3%

- Universal Link

- Hematoxylin

- Canada balsam

- Kapas/tissue

b) Proses Pewarnaan Immuno Histo Chemistry (IHC) dengan cara

manual

Tahap-tahap :

I Deparafinisasi

1. Preparat dimasukkan ke xylol 4 kali masing-masing

selama 5 menit

2. Dimasukkan ke alkohol absolut 2 kali masing-masing 5

menit

3. Dimasukkan ke alkohol 96% selama 5 menit

4. Dimasukkan ke alkohol 80% selama 5 menit

commit to user


107

5. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit

II Pewarnaan Immuno Histo Chemistry (IHC)

1. Slide ditetesi dengan H2O2 dalam methanol 3% selama

20 menit

2. Dicuci dengan air mengalir selama 5 menit dilanjutkan

cuci dengan aquades selama 5 menit kemudian cuci

dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) 2 kali masing-

masing selama 5 menit

3. Dipanaskan dengan buffer sitrat pH 6 atauTris

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) pH 9 (sesuai

data sheet) pada decloaking chamber/microwave

dengan suhu tinggi hingga mendidih kemudian turun

ke suhu rendah selama 10 menit.

4. Ditunggu hingga suhu ruang

5. Dicuci 2 kali dengan PBS masing-masing selama 5

menit

6. Ditetesi dengan bloking serum selama 10 menit (sesuai

data sheet)

7. Ditetesi dengan antibody primer, inkubasi over night

pada suhu 4oC.


menit

commit to user


108

9. Ditetesi dengan universal link/antibody sekunder

selama 15 menit (data sheet)


menit.

11. Ditetesi dengan Horseradish Peroxidase (HRP)

label/streptavidin selama 10 menit (data sheet).


menit

13. Dietesi dengan Diamono Benzidine (DAB) selama 3-5

menit

14. Dicuci dengan air mengalir selama 5 menit

15. Diwarnai dengan counterstaining memakai

hematoxylin selama 2-4 menit

16. Dicuci dengan air mengalir

17. Dicuci dengan alkohol 96% selama 1 menit

18. Dicuci dengan alkohol absolute selama 1 menit

19. Direndam dalam xylol selama 1 menit

20. Ditutup dengan coverglass dan diberi label

9. Evaluasi

Penelitian untuk menilai modulasi ekspresi Cyt c, Bax, BCl2 dan

Caspase 3 pada i) Kelompok Kontrol (Kontrol Negative) ii) kelompok LPS

dosis LD75 0,25mg/kgBB/i.p (Kontrol Positve) dan iii) kelompok HSP 70

dosis optimal 200 ug/KgBB/i.p paska diinjeksi LPS 0,25mg/kkKg/i.p pada

commit to user


109

epithel alveoler paru dan epithel tubulus proksimal ginjal pada 72 jam dan 78

jam apoptosis MODS pada mencit model sepsis dan pemeriksaan IHC pada

pembesaran 400X.

10. Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan uji One Way

Anova menggunakan program SPSS for Windows Release 11.5 dan p <0,05

dipilih sebagai tingkat minimal signifikansinya. Syarat uji One Way Anova

adalah skala numerik, distribusi data normal dan homogen. Jika uji One Way

Anova menunjukkan perbedaan signifikan (p< 0,05) maka dilanjutkan dengan

dengan LSD Pos Hoc Test. Jika syarat uji One Way Anova tidak dapat

dipenuhi maka digunakan uji alternatif nonparametrik yaitu Kruskal Wallis.

Apabila uji Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan signifikan(p<0,05) maka

dilanjutkan dengan Pos Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney.

90 bab iv metode penelitian - Digilib UNS

Documents

Transcript of 90 bab iv metode penelitian - Digilib UNS