วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

1

แบคเทอรโอเฟจ: ชววทยาและการประยกตใช Bacteriophages: Biology and Applications

ปารชาต พมขจร และ พงศศกด รตนชยกลโสภณ* Parichat Phumkhachorn and Pongsak Rattanachaikunsopon*

ภาควชาวทยาศาสตรชวภาพ คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยอบลราชธาน Biological Science, Faculty of Science, Ubon Ratchathani University.

*E-mail: rattanachaikunsopon@yahoo.com Received: May 08, 2018

Revised: Nov 28, 2018 Accepted: Jan 25, 2019

บทคดยอ แบคเทอรโอเฟจหรอเฟจคอไวรสทบกรกแบคทเรย แบคเทอรโอเฟจมอยเปนจ านวนมากบนโลกและพบอาศยอยในทกระบบ

นเวศ แบคเทอรโอเฟจถกคนพบมานานกวารอยป คณสมบตของแบคเทอรโอเฟจไมตางจากไวรสโดยทวไปคอมความหลากหลายทง ในดานรปรางและชนดของสารพนธกรรม สารพนธกรรมของแบคเทอรโอเฟจอาจเปน DNA หรอ RNA อยางใดอยางหนงและถกลอม ไวดวยโปรตนหรอแคปซด แคปซดของแบคเทอรโอเฟจอาจมรปรางเปนรปหลายเหลยม มลกษณะเปนเสนใย หรอมลกษณะเปนสวนหวและหาง ในการเรมตนบกรกเซลลแบคทเรย แบคเทอรโอเฟจจะตองไปยดเกาะกบโครงสรางดานนอกของโฮสตเซลลกอน โดย แบคเทอรโอเฟจใชสวนทเปนโปรตนยดเกาะ (attachment protein) ไปจบกบทรบ (receptor) ซงอยบนผวเซลล ในเซลลทตดเชอ แบคเทอรโอเฟจสามารถมวงจรชวตไดสองแบบคอไลตกหรอไลโซจนก คณะกรรมการระหวางประเทศเกยวกบอนกรมวธานของไวรส (ICTV) ได จ ดแบคเทอร โอ เฟจไว ในอนดบ (order) Caudovirales ตามรปร างและชนดของสารพนธกรรม มากกว า 96% ของแบคเทอรโอเฟจเปนแบคเทอรโอเฟจทมหางและมสารพนธกรรมเปนดเอนเอสายค หลงจากทมการคนพบแบคเทอรโอเฟจ นกวจยจ านวนมากมองเหนถงศกยภาพของแบคเทอรโอเฟจในดานการท าลายแบคทเรย และเชอวานาจะสามารถน าแบคเทอรโอเฟจมาใชเปนยารกษาโรคได แตแนวคดในการตอยอดงานวจยดงกลาวไดหยดชะงกลงหลงจากทมการคนพบยาปฏชวนะ ปจจบนแบคเ ทอรโอเฟจ ไดกลายมาเปนเครองมอส าคญส าหรบนกเทคโนโลยชวภาพ แบคเทอรโอเฟจถกน ามาใชประโยชนไดหลากหลาย เชน เปนพาหะส าหรบการโคลนยน (cloning vector) เปนสารทมฤทธตานแบคทเรยส าหรบควบคมโรคตดเชอ (phage therapy) เปนเครองมอในการตรวจวนจฉยชนดแบคทเรยกอโรค (phage typing) เปนตน นอกจากนแบคเทอรโอเฟจยงถกน าไปใชในงานบางอยาง (phage display) เพอท าใหเปปไทดทสนใจไปปรากฏอยบนโปรตนทผวดานนอกของแบคเทอรโอเฟจ ในบทความนไดกลาวสรปเกยวกบการน า แบคเทอรโอเฟจไปประยกตใชในงานเหลาน

ค าส าคญ : แบคเทอรโอเฟจ เฟจ การประยกตใช

Abstract Bacteriophages or phages are viruses that infect bacteria. Bacteriophages are the most abundant viral entity

on earth and exist in all the ecosystems. Bacteriophages were discovered over one hundred year ago. Like other types of viruses, bacteriophages vary in their shape and genetic makeups (genome). Bacteriophage genomes can consist of either DNA or RNA, surrounded by a protein coat. The capsid of a bacteriophage can be polyhedral, filamentous or head-tail structure. To start an infection, a bacteriophage virion has to first attach onto the surface of their host cell by the recognition of receptors on its host and phage attachment protein. In host cell, bacteriophages can propagate in two possible life cycles; lytic cycle and lysogenic cycle. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) classifies the bacteriophages under an order Caudovirales according to morphology and nucleic acid type. Over 96% of bacteriophages are tailed and contain double-stranded DNA. After the discovery of bacteriophages, many researchers thought about the potential of bacteriophages on killing bacteria, which could possibly make them as therapeutic agents. But most of this research effort stopped soon after the discovery of antibiotics. Today, bacteriophages have become an important instrument to biotechnologists. They have been exploited for various purposes like cloning vectors for gene cloning, antibacterial agents for controlling of infection, and effective diagnostics for detection of bacterial pathogens. They are also being used for phage display systems for revealing the peptide of interest on phage coat protein. In this review article all these applications have been summarized.

Keywords: Bacteriophage, phage, application

2

1. บทน า แบคเทอรโอเฟจ (bacteriophage) หรอเรยกสน ๆ วา เ ฟ จ (phage) ค อ ไ ว ร ส ข อ ง แ บ ค ท เ ร ย (bacterial virus) แบคเทอร โอเฟจเปนสงมชวตทมอย เปนจ านวนมาก มการด ารงชวตแบบปรสตและจ าเปนตองอาศยอยภายในเซลล (obligate intracellular parasite) แบคทเรยท แบคเทอรโอเฟจอาศยเรยกวา โฮสต (host) แบคเทอรโอเฟจนบเปนไวรสทมบทบาทส าคญในการหมนเวยนสารชวโมเลกลของระบบนเวศ เพราะสามารถท าลายเซลลแบคทเรยทมอยจ านวนมหาศาลบนโลกใบน ท าใหไดสารชวโมเลกลทอยภายในเซลลเหลานนกลบคนสธรรมชาต และสามารถถกน ากลบไปใชไดโดยสงมชวตชนดอนตอไป แบคเทอรโอเฟจสามารถด ารงชวตอยในสงแวดลอมทหลากหลาย แบคเทอรโอเฟจมความจ าเพาะ (specific) ตอโฮสตคอนขางสง โฮสตของแบคเทอรโอเฟจบางชนดจงอาจเปนแบคทเรยสายพนธใดสายพนธหนงเทานน เมอแบคทเรยทเปนโฮสตถกบกรก (infect) ดวยแบคเทอรโอเฟจ แบคเทอรโอเฟจ จะเพมจ านวนโดยอาศยกลไกภายในเซลลของแบคทเรยเพอสรางโปรตนและสารพนธกรรมของแบคเทอรโอเฟจ วธการด ารงชวตของแบคเทอรโอเฟจภายในเซลลอาจเปนแบบ lytic cycle หรอแบบ lysogenic cycle ทงนขนอยกบชนดของแบคเทอรโอเฟจ การจดจ าแนกแบคเทอรโอเฟจ (bacteriophage classification) อาศยเกณฑหลายอยาง เชน ความจ าเพาะตอโฮสต รปรางของแบคเทรโอเฟจ และชนดของสารพนธกรรม เปนตน การศกษาช ว ว ทย าขอ งแบค เทอร โ อ เฟจจน เ ข า ใ จธ ร รมชาต ข อ ง แบคเทอร โอเฟจ ชวยใหสามารถน าแบคเทอร โอ เฟจไปใชประโยชนไดหลายดาน เชน เทคโนโลยชวภาพ การแพทยและอตสาหกรรม 2. การคนพบแบคเทอรโอเฟจ “phage” มาจากค าวา “phagein” ในภาษากรกซงแปลวา “กน” สาเหตทใชค านเปนชอเรยกไวรสทมโฮสตเปนแบคทเรยนาจะเนองมาจากแบคเทอรโอเฟจมความสามารถในการก าจดหรอท า ล า ย แ บค ท เ ร ย ห ร อ ม antibacterial activity น น เ อ ง ความสามารถดงกลาวนถกคนพบครงแรกโดย Ernest Hanbury Hankin นกจลชววทยาชาวองกฤษเมอประมาณป ค.ศ. 1896 เขาพบวาน าจากแมน า Ganga river และ Yamuna river ในประเทศอนเดยมสงมชวตบางอยางทสามารถฆาหรอท าลายแบคทเรยทเปนสาเหตของโรคอหวาตกโรค (cholera) ได โดยสงมชวตดงกลาวมขนาดคอนขางเลกมาก สามารถผานแผนกรองจลนทรย (membrane filterable) และไมทนความรอน (heat labile) [1] อยางไรกตามการคนพบของ Hankin ในขณะนนยงไมคอยไดรบการยอมรบมากนก ต อ ม า ใ น ป ค . ศ . 1915 Frederick William Twort นกจลชววทยาชาวองกฤษไดพบปรากฏการณของไวรสทสามารถท าใหแบคทเรย Micrococcus เกดการเปลยนแปลงในลกษณะ ทเรยกวา “transmissible glassy transformation” โดยเขาเชอวาไวรสสามารถเพมจ านวนไดภายในเซลลแบคทเรยและสามารถ

ท าลายแบคทเรย ได อกสองปตอมา (ป ค .ศ. 1917) Felix d’Herelle น ก จ ล ช ว ว ท ย า ช า ว ฝ ร ง เ ศ ส -แ คนา ด า ค นพบปรากฏการณของไวรสอกลกษณะหนง คอ เปนจดใสขนาดเลก (ตอมาเรยกวา plaque) ทเกดจากไวรสไปท าลายแบคทเรย Shigella ซงเจรญอยบนผวหนาอาหารเลยงเชอ และเรยกลกษณะดงกลาวนวา “bacteriophage phenomenon” ผลงานของเขาไดรบการตพมพเผยแพรในเวลาตอมา ดงนนจงถอวา d’Herelle เปนนกวทยาศาสตรคนแรกท เรยกไวรสของแบคทเรยว า “แบคเทอรโอเฟจ” [1] และท าใหแบคเทอรโอเฟจเปนทรจกตงแตบดนนเปนตนมา อยางไรกตามเมอกลาวถงบคคลทคนพบ แบคเทอรโอเฟจมกจะอางองและใหเกยรตแกนกวทยาศาสตรทงสองทานคอ Twort และ d’Herelle เ นองจากเปนผ ทคนพบ แบคเทอร โอ เฟจ ในเวลาใกล เ ค ย งกน แตกต างกน เพย งปรากฏการณของแบคเทอรโอเฟจทพบเทานน 3. โครงสรางของแบคเทอรโอเฟจ แบคเทอร โอ เฟจมขนาดต งแต 20-200 นาโนเมตร (nanometer; nm) มโครงสรางหรอสวนประกอบส าคญคอสารพนธกรรม (genome) หรอกรดนวคลอก (nucleic acid) และ มโปรตนหอหมสารพนธกรรมไวเรยกวาแคปซด (capsid) ซงมกมรปรางเปนรปหลายเหลยม (polyhedral) โปรตนหนวยยอยทมาประกอบกนเปนโครงสรางแคปซดเรยกวา capsomer (หรอ capsomere) สารพนธกรรมของแบคเทอรโอเฟจอาจเปน DNA หรอ RNA อยางใดอยางหนง ทงนสารพนธกรรมอาจมรปราง เปน เสน (linear) เปนวง (circular) หรอแบ ง เปนหลายอน (segmented) [2] แบคเทอรโอเฟจบางชนดมเพยงสารพนธกรรมหมดวยแคปซดเพยงเทานน แตบางชนดมโครงสรางเปนทอกลวงยาวตอออกมาจากแคปซด จงท าใหรปรางดเหมอนมสวนหว (head) และสวนหาง (tail) และเรยกแบคเทอรโอเฟจกลมน วา tailed bacteriophage (Figure 1) นอกจากนทสวนหางยงอาจพบโครงสรางอน ๆ เพมเตมไดดวย เชน base plate, tail fiber เปนตน [3] การมหาง การยด-หดไดของหาง ชนดของโฮสต และการมไขมนหมแคปซดไวอกชนหนงซงเรยกวา เอนเวลลอป (envelope) มสวนชวยในการจ าแนกชนดของแบคเทอรโอเฟจ [4]

Figure 1 Structure tailed bacteriophage [5]

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

3

4. การบกรกเขาสเซลล การบกรก (penetration) ของแบคเทอรโอเฟจเขาสโฮสตเซลล (host cell) เปนขนตอนทส าคญของการตดเชอ (infection) ขนตอนนมความจ าเพาะ (specificity) สงมาก กลาวคอแบคเทอรโอเฟจชนดใดชนดหนงมกจะบกรกแบคทเรยเพยงสายพนธใดสายพนธหนงเทานน แบคเทอรเฟจทมโฮสตเพยงชนดเดยวจดเปน narrow-host range bacteriophage อยางไรกตาม แบคเทอรโอเฟจบางชนดสามารถบกรกโฮสตไดมากกวาหนงชนดหรออาจบกรกแบคทเรยตางจนส (genus) แตมความใกลชดทางพนธกรรม แบคเทอรโอเฟจทสามารถบกรกโฮสต ไดหลายชนดจดเปน broad-host range bacteriophage [6] ความจ าเพาะระหวางแบคเทอรโอเฟจกบโฮสตเกดขนโดยอาศยการจบกนระหวางต าแหนงทอยบนวรออน (virion) ของ แบคเทอรโอเฟจเรยกวา attachment site กบต าแหนงทอยบนผว เซลลของแบคทเรย เรยกวา receptor site ซ งอาจอย ท flagella และ cell wall (Figure 2) จากนนสารพนธกรรมของ แบคเทอรโอเฟจจะถกน าเขาสเซลลและเขาสกระบวนการเพมจ านวนของแบคเทอรโอเฟจตอไป แบคเทอรโอเฟจบางชนดสามารถปลอยเฉพาะสารพนธกรรมเขาไปภายในเซลลโดยวธการฉดสารพนธกรรม (genome injection) ซ งมกลไกคลายกบ การฉดยา (syringe-like mechanism) และทงโครงสรางอนไวนอกเซลล (Figure 3)

Figure 2 Specificity between a bacteriophage and receptor sites on a host cell: glycolipids (O antigen และ Vi antigen), integral membrane protein (เชน OmpF, BtuB และ TolC), flagella protein (เชน FliC, FljB และ FliK) [9]

Figure 3 Genome injection [10]

5. การด ารงชวตภายในเซลล การเพมจ านวนของแบคเทอรโอเฟจ (bacteriophage replication) ภายในเซลลแบคทเรยสามารถแบงเปน 2 ลกษณะคอ lytic cycle และ lysogenic cycle หรอ lysogeny (Figure 4) การเพมจ านวนของแบคเทอรโอเฟจเรมตนจากขนตอนแรก คอ การยด เกาะของแบคเทอร โ อ เฟจก บโฮสต เ ร ยกว า attachment หรอ adsorption โดยอาศยความจ าเพาะระหวางโปรตนโครงสรางของแบคเทอรโอเฟจและโปรตนบนผวเซลลของโฮสตตามทกลาวมาขางตน จากนนแบคเทอรโอเฟจจะปลอยสารพนธกรรมเขาไปภายในเซลล และใชกลไกตางๆ ภายในเซลลเพอการเพมจ านวน โดยเรมจากการสรางโปรตนหรอเอนไซม ทเกยวของกบการสรางสารพนธกรรม (genome replication) จ าก นน จ ง ส ร า ง โ ปรต น โ คร ง สร า ง ท เ ป นส วนป ระ กอ บ ของแบคเทอรโอเฟจ (structural protein) แลวน าสวนประกอบตาง ๆ ทถกสรางขนเหลานนมารวมกน (assembly) กลายเปน แบคเทอร โอเฟจ จ านวนมากเกดขนภายในเซลล เรยกวา progeny phage แลวสรางเอนไซมบางอยางออกมาท าลาย เยอหมเซลลจนท าใหโฮสตเซลลแตกเพอปลดปลอย (release) progeny phage ออกมาสภายนอก การเพมจ านวนในลกษณะเ ช น น ข อ ง แ บค เ ท อ ร โ อ เ ฟ จ เ ร ย ก ว า lytic cycle แ ล ะ แบคเทอรโอเฟจทด ารงชวตแบบนเรยกวา lytic phage หรอ virulent phage แบคเทอรโอเฟจบางชนดหลงจากปลอยสารพนธกรรมเขาไปในเซลลแลวไมท าใหเกดการสราง progeny phage ภายในเซลลและไมท าใหเซลลแตก แตกลบน าสารพนธกรรมเขาไปแทรก (integrate) อยในโครโมโซมของแบคทเรย สารพนธกรรมของ แบคเทอรโอเฟจทแทรกอยในโครโมโซมในลกษณะเชนนเรยกวา prophage เมอแบคทเรยแบงเซลลเพอ เพมจ านวน (binary fission) สารพนธกรรมของแบคเทอรโอเฟจจะยงคงแทรกอยในโครโมโซมของแบคทเรยทกเซลลทถกสรางขนใหม prophage สามารถคงอยภายในเซลลแบคทเรยไปไดหลายรน (generation) โดยไมท าใหเซลลตาย แตอาจท าใหแบคทเรยเกดการกลายพนธเ ร ย ก ว า phage conversion [7] ก า ร เ พ ม ด า ร ง ช ว ต ข อ ง แบคเทอรโอเฟจในลกษณะเชนนเรยกวา lysogenic cycle และ แบคเทอรโอเฟจทด ารงชวตแบบนเรยกวา lysogenic phage หรอ temperate phage ในบางสภาวะ prophage อาจหลดออกจากโครโมโซมของแบคทเรยและกลบเขาสการเพมจ านวนแบบ lytic cycle ไ ด เ ร ย ก ป ร า ก ฏ ก า ร ณ เ ช น น ว า induction ซงอาจเกดขนเองโดยไมทราบสาเหต (spontaneous induction) หรอเกดจากการกระตนดวย inducing agent บางอยาง เชน แสง UV และ mitomycin C เปนตน [8] ดง นน lysogenic phage จงเปนแบคเทอรเฟจทจะตองสามารถแทรกสารพนธกรรมเขาไปในโครโมโซมและสามารถกลบส lytic cycle ไดดวยในบางสภาวะ แต lytic phage จะสราง แบคเทอรโอเฟจใหมและปลอยออกนอกเซลลเพยงอยางเดยวเทานน

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

4

Figure 4 Lytic cycle and lysogenic cycle [11]

6. กลการท าลายโฮสต วงจรชวตของ lytic phage ทกชนดสนสดลงทการท าใหโ ฮ ส ต แ ตก (lysis) เ พ อ ป ล ดปล อ ย progeny phage ห ร อ แบคเทอรโอเฟจทสรางใหมออกจากเซลล แบคเทอรโอเฟจ ทกชนดท าใหเซลลแตกโดยการท าลาย peptidoglycan (PG) หรอ murein ทผนงเซลล peptidoglycan เปนโครงสรางทชวยเสรมความแขงแรงของเยอหมเซลล โดยชวยใหเยอหมเซลลทนตอแรงดนออสโมตก และท าใหเซลลแบคทเรยสามารถคงรปอยได peptidoglycan พบไดทงในแบคทเรยแกรมบวกและแกรมลบ โดยในแบคทเรยแกรมลบจะม outer membrane หมอยดานนอกสดอกชนหนง ดงนนหาก peptidoglycan ถกท าลายหรอเสยหายยอมสงผลกระทบตอเยอหมเซลล และสามารถท าใหเซลลไมทนทานตอแรงดนภายในเซลลไดอกตอไปและท าใหเซลลแตกในทสด แบคเทอรโอเฟจทกชนดทมสารพนธกรรมเปน double-stranded DNA (dsDNA) สามารถท าลาย peptidoglycan ของโฮสตไดโดยการสรางเอนไซม endolysin และ holin และมกลไกท าให เซลลแตกเรยกวา holin-endolysin lytic system [12] (Figure 5) จากการศกษากลไกการท าลาย peptidoglycan ของแบค เทอร โ อ เฟจพบว า ต า แห น ง ก า รออกฤทธ ท า ล า ย peptidoglycan ของเอนไซม endolysin ท าใหสามารถแบง endolysin อ อ ก เ ป น 4 ก ล ม ด ง น (1) lysozyme (2) transglycosidase (3) amidase และ (4) endopeptidase 7. การจดจ าแนกแบคเทอรโอเฟจ หนวยงานทท าหนาทก าหนดเกณฑและวธการจดจ าแนกไวรสเพอใชเปนมาตรฐานเดยวกนคอ International Committee for Taxonomy of Viruses ( ICTV) โ ด ย ไ ด จ ด จ า แ นก ไ ว ร สอ อ ก เ ป น 3 order, 61 family แ ล ะ 241 genus การตงชอไวรสโดยทวไปจะใชภาษาละตนหรอกรก ชอ order จะลงทายดวย–virales ชอ family จะลงทายดวย –viridae ชอ subfamily จะลงทายดวย –virinae และชอ genus จะลงทายดวย –virus แบคเทอรโอเฟจทกชนดถกจดอยใน order Caudovirales โดยแบงออกเปน 13 family และ 30 genus เมอพจารณารปรางของแบคเทอรโอเฟจพบวาสามารถแบงออกไดเปน

4 กลมใหญ (Table 1) ดงน (1) tailed phage คอแบคเทอรโอเฟจ ทมหาง (2) polyhedral phage คอแบคเทอรโอเฟจทหวมรปรางหลายเหลยม (3) filamentous phage คอ แบคเทอรโอเฟจทมล ก ษณ ะ คล า ย เ ส น ใ ย แ ล ะ (4) pleomorphic phage ค อ แบคเทอรโอเฟจทมรปรางไมแนนอน แบคเทอรโอเฟจสวนใหญ มสารพนธกรรมเปน dsDNA (Figure 6) มเพยงสวนนอยเทานน ทมสารพนธกรรมเปน single-stranded DNA (ssDNA), single-stranded RNA (ssRNA) หรอ double-stranded RNA (dsRNA) แบคเทอรโอเฟจทคนพบแลวสวนใหญเปนพวก tailed phage tailed phage มอยประมาณ 96% ของแบคเทอรโอเฟจทงหมด ลกษณะโดยทวไปของแบคเทอรโอเฟจ กลมนคอ สวนหวมลกษณะสมมาตรแบบลกบาศก (cubic symmetry) อาจเปน polyhedral หรอ icosahedral โปรตนโครงสรางของสวนหาง มการเรยงตวแบบเกลยวเรยกวา helical tail สารพนธกรรม มลกษณะเปนเสน ชนด double-stranded DNA ซงมเพยงอนเดยว สารพนธกรรมถกลอมรอบดวยแคปซด แตไมมเอนเวลลอป ขนาดของสารพนธกรรมและความยาวของสวนหางแตกตางกนไปตามชนดของแบคเทอรโอเฟจ สารพนธกรรมอาจมขนาดตงแต 17 จนถงมากกวา 700 กโลเบส (kilobase; kb) และสวนหางอาจม ค ว า มย า วต ง แ ต 10 ถ ง 800 นา โ น เมตร tailed phage แ บ ง อ อ ก เ ป น 3 family [13] ค อ (1) Myoviridae ซ ง เป น แบคเทอร-โอเฟจชนดทหางสามารถยด-หดได ม sheath หมรอบหาง และม แกนกลางอย ในส วนหางเร ยกว า central tube แบคเทอรโอเฟจกลมนพบอยประมาณ 25% ของ tailed phage ทงหมด และแบงยอยออกเปน 6 genus คอ T4, P1, P2, Mu, SPO1 และ H (2) Siphoviridae เปน แบคเทอรโอเฟจทมหางยาว แตไมสามารถยด-หดได แบคเทอรโอเฟจกลมนเปนกลมทใหญทสดของ tailed phage เนองจากพบไดประมาณ 61% ของ tailed phages ทงหมด สามารถแบงออกเปน 6 genus คอ , T1, T5, L5, c2 และ M และ (3) Podoviridae เปน แบคเทอรโอเฟจทมหางสน พบไดประมาณ 14% ของ tailed phage ทงหมด แบงออกเปน 3 genus คอ T7, P22 และ 29 8. แบคเทอรโอเฟจและการประยกตใช หลงจากทมการคนพบแบคเทอรโอเฟจและทราบวา แบคเทอรโอเฟจมความสามารถในการท าลายแบคทเรย ดงนนนกวทยาศาสตรหลายทานจงเชอวาแบคเทอรโอเฟจนาจะสามารถน ามาใช เปนสารทใชในการรกษาโรค (therapeutic agent) ได แตหลงจากทมการคนพบยาปฏชวนะในชวงหลงสงครามโลก ครงท 2 บทบาทของแบคเทอรโอเฟจในดานการรกษากลดนอยลง แตกลบมการศกษาแบคเทอรโอเฟจเพอใชเปนเครองมอส าหรบใชในงานทางดานไบโอเทคโนโลยเปนส าคญ จนกระทงปจจบน แบคเทอรโอเฟจกยงนบวามความส าคญอยางมากในงานทางดานชววทยาระดบโมเลกล ความรเกยวกบ แบคเทอรโอเฟจในปจจบนคอนขางกาวหนามาก และมการน าแบคเทอร โอเฟจไปใชประโยชนไดหลายดานดงน

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

5

Figure 5 Host cell lysis by holin-endolysin lytic system [12]

Figure 6 Classification of bacteriophages [2]

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

6

Table 1 Classification of bacteriophages [2]

Shape Nucleic acid Families Genera Examples Members Characteristics Tailed DNA, ds, L

DNA, ds, L DNA, ds, L

Myoviridae Siphoviridae Podoviridae

6 6 3

T4 T7

1243 3011 696

Tail contractile Tail long, noncontractile Tail short

Polyhedral DNA, ss, C

DNA, ds, C, T DNA, ds, L RNA, ss, L RNA, ds, L, S

Microviridae Corticoviridae Tectiviridae Leviviridae Cystoviridae

4 1 1 2 1

X174 PM2 PRD1 MS2 6

40 3 18 39 1

- Complex capsid, lipids Internal lipoprotein vesicle Envelope, lipids

Filamentous DNA, ss, C

DNA, ds, L DNA, ds, L

Inoviridae Lipothrixviridae Rudiviridae

2 1 1

Fd TTV1 SIRV1

57 6 2

Filaments or rods Envelope, lipids Resembles TMV

Pleomorphic DNA, ds, C, T

DNA, ds, C, T Plasmaviridae Fuselloviridae

1 1

L2 SSV1

6 8

Envelope, lipids, no capsid Spindle-shaped, no capsid

C = circular; L = linear; S = segmented; T = superhelical; ss = single-stranded; ds = double-stranded

8.1 Phage therapy phage therapy คอการน าแบคเทอรโอเฟจมาใชในการรกษาโรคตดเชอทเกดจากแบคทเรย [14] แบคเทอรโอเฟจ ทน ามาใชในงานนตองเปน lytic phage เพราะสามารถท าลายแบคทเรยเปาหมายใหลดนอยลงหรอหมดไปในทสด หลงจากทมก า ร คนพบแบคเทอร โ อ เฟจ (ป ค . ศ . 1917) แม ว า จ ะมนกวทยาศาสตรเรมหนมาสนใจศกษาเกยวกบแบคเทอรโอเฟจและใหความส าคญกบงานดาน phage therapy กนมากขน โดยหวงวาจะน าแบคเทอรโอเฟจมาใชเปนยารกษาโรค แตการวจยเกยวกบ phage therapy ในซกโลกตะวนตก (อเมรกาและยโรปตะวนตก) แทบจะหยดชะงกหรอเลกราไป (ในราวป ค.ศ. 1940) เ น องจากข อถก เถ ย ง ในเ ร อ งความปลอดภยของการ ใช แบคเทอรโอเฟจเพอการรกษา ประกอบกบเปนยคของการคนพบย า ป ฏ ช ว น ะ แ ต ป ร ะ เ ทศ ท ย ง ค ง ใ ห ค ว า มส น ใ จ ศ ก ษ า แ บค เ ทอ ร โ อ เ ฟ จ อ ย า ง ต อ เ น อ ง น บต ง แ ต ม ก า ร ค นพ บ แบคเทอร โอเฟจเปนตนมา คอรสเ ซยและประเทศในย โรปตะวนออก สงผลใหขอมลและผลงานวจยเกยวกบ phage therapy ทมตพมพเผยแพรในยคแรกๆ ทเปนภาษาองกฤษจงมไมมากนก [15] การน า phage therapy ไปใชในการรกษาโรคตดเชอไดผลคอนขางดทงในคนและในสตว (Table 2) เชน สามารถน า

แบคเทอรโอเฟจทจ าเพาะตอ Shigella dysenteriae ไปใชในการรกษาโรคบด (bacillary dysentery) ทเกดจากเชอดงกลาวในคน สามารถน าแบคเทอร โอเฟจทจ าเพาะตอ Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas, Staphylococcus แ ล ะ Proteus ไปใชในการรกษาโรคตดเชอทมหนอง (suppurative infection) ในคนทตดเชอเหลาน สามารถน าแบคเทอรโอเฟจทจ าเพาะตอ Klebsiella pneumoniae ไปใชในการรกษาโรคไขสนหลงอกเสบ (cerebrospinal meningitis) ทเกดจากเชอดงกลาวในทารกแรกเ ก ด ส ามา รถ น า แบค เทอร โ อ เฟจ ท จ า เ พ า ะต อ E. coli ไปใชในการรกษาโรคทองรวง (diarrhea) ทมสาเหตมาจากเชอดงกลาวทพบในลกหม ลกววและลกแกะ และสามารถน า แบคเทอรโอเฟจทจ าเพาะตอ E. coli ไปใชในการรกษาภาวะตดเชอในกระแสเลอด (septicemia) และโรคเยอหมสมองอกเสบ (meninigitis) ทเกดจากเชอดงกลาวในไกและในลกวว เปนตน phage therapy ม ข อ ด ท เ ห น อก ว า ก า ร ร กษา ด ว ย ยาปฏชวนะอยหลายประการ ซงสามารถสรปไดดงน (Table 3) (1) แบคเทอร โ อ เฟจม ความจ า เพาะต อแบคท เ ร ย (high specificity) มากกวายาปฏช วนะ ซงมกจะยบย งการเจรญ ข อ ง แ บ ค ท เ ร ย แ บ บ broad-spectrum inhibition ด ง น น แบคเทอรโอเฟจจงสามารถก าจดหรอท าลายแบคทเรยทเปนสาเหตของโรคใหหมดไป

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

8

Table 2 Examples of phage therapy for treatment of bacterial infections in human and animals [18] Infection Causative agent Suppurative skin infection E. coli, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus Gastrointestinal, head, neck, skin infection E. coli, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus Suppurative infection Staphylococcus, Gram-negative bacteria Brucellosis Brucella abortus Conjunctivitis, dermatitis, pharyngitis, rhinitis Enterococcus, E. coli, P. aeruginosa, Staphylococcus,

Streptococcus Recurrent subphrenic abscess E. coli Cerebrospinal meningitis K. pneumoniae Recurrent furanculosis Staphylococcus Diarrhea in calves E. coli Septicemia, meningitis in chickens and calves

E. coli

Table 3 Comparison between treatment of bacterial infections by antibiotics and by phage therapy [19]

Antibiotics Phage therapy Specificity Broad spectrum, affecting more than the

targeted organism

Generally species or strain specific

Side effects Many, including allergies and intestinal disorders

No side effects

Resistance Occurs and is not limited to targeted bacteria Occurs, but can be linked to host virulence attenuation. Also, phage can co-evolve with host

Development Time-consuming and expensive Rapid

โดยเชอนนไมสามารถกลบมากอโรคไดอก หรอเรยกวาชวยลดการเกด secondary infection จากเชอเดม (2) แบคเทอรโอเฟจสามารถเพมจ านวนไดเมอไดเจอกบโฮสต ดงนนการใช แบคเทอรโอเฟจเพอการรกษาโรคตดเชอจงไมจ าเปนตองให แบคเทอร โอเฟจซ า (repeated administration) ตราบเทาทโฮสตยงอยแบคเทอรโอเฟจกจะยงคงสามารถเพมจ านวนได และท าลายโฮสตจนกวาโฮสตจะหมดไป (3) ตนทนการผลต แบคเทอรโอเฟจเปนยารกษาโรคมราคาถกกวาการผลตยาปฏชวนะมาก (4) การใชแบคเทอรโอเฟจในการรกษาโรคไมมผลขางเคยง (side-effect) ตอผใช (5) โอกาสทแบคทเรยกอโรคจะดอตอแบคเทอร โอเฟจแมวาจะเปนไปได แต เ นองจาก แบคเทอรโอเฟจมกม receptor site อยบนโครงสรางทเปนปจจยกอโรค (virulence factor) ของแบคทเรย ดงนนหากแบคทเรย มการเปลยนแปลงโครงสรางทเปน receptor site เพอปองกนการบกรกของแบคเทอรโอเฟจ มกสงผลใหแบคทเรยนนสญเสยความสามารถในการกอโรคหรอมความสามารถในการกอโรค ลดต าลงดวย ประเดนนจะตรงกนขามกบการรกษาดวยยา

ปฏชวนะโดยสนเชง กลาวคอเมอแบคทเรยดอยาปฏชวนะ แบคทเรยนนกลบดเหมอนยงทวความรนแรงในการกอโรคไดมากขน เพราะยาทมใชอยไมสามารถควบคมแบคทเรยได โรคตดเชอแบคทเรยทเคยรกษาไดผล กลบกลายเปนโรคทรกษาไมไดและอาจสงผลรนแรงจนท าใหผตดเชอถงขนเสยชวตได (6) การหา แบคเทอรโอเฟจมายบยงการเจรญของแบคทเรยท าไดงายกวาและใชเวลานอยกวาการพฒนายาปฏชวนะ อยางไรกตามขอเสยอยางหนงของแบคเทอรโอเฟจเมอเทยบกบยาปฏชวนะคอ เนองจาก แบคเทอรโอเฟจมความจ าเพาะสง ดงนนจงจ าเปนตองตรวจวนจฉยแบคทเรยทเปนสาเหตกอนจงจะเลอกใชแบคเทอรโอเฟจ ท เ ห ม า ะ ส ม ไ ด แ ต ป ญ ห า น ส า ม า ร ถ แ ก ไ ด โ ด ย ก า ร ใ ช แบคเทอรโอเฟจหลายชนดรวมกนเพอการรกษา เรยกวา phage cocktail [16] ปจจบนงานทางดาน phage therapy มผใหความสนใจมากขนเรอย ๆ ทงนเนองจากปญหาการดอยาปฏชวนะของแบคทเรยหลายชนดซงมแนวโนมทจะรนแรงมากขนในอนาคต จนท าใหนกวทยาศาสตรหลายทานเปนกงวลวาโลกของเราจะกลบเขาสยคกอนทจะมการคนพบยาปฏชวนะ (pre-antibiotic era)

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

9

อกครง สงผลใหในระยะหลง (นบตงแตป ค.ศ. 2000 เปนตนมา) งานวจยเกยวกบการคนหาแบคเทอรโอเฟจใหมทจ าเพาะตอแบคทเรยกอโรคทงในคนและสตวมมากขน [4] และหวงวา แบคเทอรโอเฟจนาจะเปนทางเลอกหนงทสามารถน ามาใชในการแกปญหาการรกษาโรคตดเชอทดอยาได [17] 8.2 Phage cloning vector phage cloning vector หมายถงการน าแบคเทอรโอเฟจไปใชเปน DNA พาหะส าหรบการเพมจ านวนยน (gene cloning) ทสนใจ ซงการใชแบคเทอรโอเฟจมประสทธภาพดกวาพลาสมด (plasmid) หลายเทา แบคเทอรโอเฟจทนยมน ามาใหเปน cloning vector เชน และ M13 เปนตน [20] เพอให เข าใจถ งการประย กต ใ ช แบค เทอร โ อ เฟจ เป น cloning vector ใน ท น จงขอยกตวอยางของแบคเทอรโอเฟจ ซงเปน temperate phage มสารพนธกรรมเปน double-stranded DNA ขนาดประมาณ 49 kb มโฮสตคอ E. coli และบกรกเขาสโฮสตเซลลโดยวธ genome injection หลงจากสารพนธกรรมเขาสเซลลแลว ปลายของสารพนธกรรมสามารถจบกนเองได เนองจากทปลายทงสองดานมสวนทเปน single-stranded DNA ยนออกมา และมล าดบเบส complementary กน ต าแหนงนเรยกวา cos site gt10 เ ป น cloning vector ช น ด insertion vector ( Figure 7) ม ก า รต ด เ อ าย นบา งส วน ท ไ ม จ า เ ป น ส า ห ร บ การด ารงชวตของแบคเทอร โอเฟจออกไป จนมขนาดสารพนธกรรมลดลงเหลออยประมาณ 40 kb สามารถบรรจสารพนธกรรมทมขนาดไมเกน 52 kb ซงหมายถงขนาดของ cloning vector รวมกบ DNA fragment ทตองการจะแทรก ( insert) เขาไป cloning vector นสามารถแทรก DNA fragment ทมขนาดตงแต 8-10 kb และทส าคญคอในต าแหนง cI gene ของ vector นมจดตดของเอนไซม EcoRI อย ดงนนจงสามารถน า DNA fragment ทถกตดดวย EcoRI เขาไปแทรกอยใน vector นได การแทรก DNA fragment เขาไปทต าแหนง cI gene สงผลใหยนดงกลาวสญเสยหนาทและไมสามารถสรางโปรตน CI ได ห ล ง จ า ก ท ท า ligation เ พ อ ใ ห ไ ด recombinant DNA ท า in vitro assembly เพอใหไดวรออนแบคเทอรโอเฟจทสมบรณ แลวน าไป infect โฮสตทเหมาะสมคอ E. coli Hfl strain (Hfl =

High frequency lysogeny) เพอกระตนการแสดงออกของ cII gene แบคเทอรโอเฟจทม recombinant DNA เปนสารพนธกรรมจะไมสามารถเขาส lysogenic cycle ได แตจะเขาส lytic cycle เทานน จงท าใหเกด clear plaque เมอน าไปเลยงรวมกบโฮสตบนอาหารเลยงเชอ สามารถน าแบคเทอรโอเฟจตรงต าแหนงนนไปเพาะเลยงและเพมจ านวนไดตอไป

8.3 Phage typing phage typing หมายถงการน าแบคเทอรโอเฟจมาใชเปนเครองมอในการจ าแนกชนดแบคทเรยวธนอาศยความจ าเพาะระหวางแบคเทอรโอเฟจและแบคทเรย ท าใหสามารถการจ าแนกแบคทเรยไดถงระดบจ นส (genus) และสปชส (species) [21] การทดสอบท าไดโดยใชไลตกเฟจททราบชนดของโฮสตมาใชเพอการทดสอบ แบคเทอร โอเฟจหลายชนดเหลาน รวมเรยกวาช ด แบคเทอรโอเฟจ (phage panel) และอาศยความไว (susceptibility) ของแบคทเรยตอแบคเทอร โอเฟจ เมอแบคเทอร โอเฟจใดมความสามารถในการบกรกและเพมจ านวนในเซลลแบคทเรยทดสอบ (bacterial sample) จะพบการตายของแบคทเรยชนดนนบนผวหนาอาหารแขง (agar surface) โดยปรากฏเปนจดใส (plaque หร อ clear zone) เ ก ด ข น บน lawn of bacteria ( Figure 8) ดงนนจงสามารถบอกไดวาแบคทเรยทดสอบนนเปนแบคทเรย ทไวตอแบคเทอรโอเฟจใดและนาจะเปนแบคทเรยใด phage typing สามารถบอกชนดของแบคทเรยไดถงระดบสายพนธ (strain) เชน Staphylococcus aureus สายพนธหนงถกบกรกไดโดยแบคเทอรโอเฟจหลายชนด และไมถกบกรกโ ดย แบค เทอ ร โ อ เฟจ บา ง ช นด ด ง น น Staphylococcus aureus ต า ง ส ายพ น ธ ก น จ ง ม ร ป แบบการถ กบ ก ร ก ด ว ย แบคเทอรโอเฟจ (phage typing patterns) ทตางกน phage typing นบวามประโยชนอยางมากส าหรบงานทางระบาดวทยา เชน การตรวจ phage typing ของแบคทเรยทเปนสาเหตของโรคตดเชอในโรงพยาบาล (nosocomial infection) เปรยบเทยบกบ phage typing ของแบคทเรย ทแยกไดจากสวนตาง ๆ ทอยภายนอกรางกาย (เชน ผวหนง) ของบคลากรทางการแพทย (เชน แพทยและพยาบาล) รวมทง

Figure 7 Use of gt10 as a cloning vector

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

10

Figure 8 Phage typing [21] เครองมอและอปกรณทตองใชกบผปวย (เชน สายสวน) ซงชวยใหทราบแหลงทมาของเชอทปนเปอนในโรงพยาบาล นอกจากน phage typing ยงสามารถใชในการตดตามการระบาดหรอการแพรกระจายของแบคทเรยในแตละชมชนหรอทองถน และชวยใหทราบแหลงทมาของเชอทก าลงระบาดอย ในขณะนน ทงน Salmonella typhi ซงเปนสาเหตของไขไทฟอยดสามารถจ าแนกไดมากกวา 100 ชนดโดยวธ phage typing phage typing สามารถน าไปประยกตใชรวมกบงานทางดานพนธวศวกรรม โดยการน ายนบางชนดทก าหนดการสรางโปรตน ทสามารถ เร องแสงได (bio-luminescent protein) เ ช น green fluorescent protein (GFP) ใ ส เ ข า ไ ป ใ น ส า รพนธกรรมของแบคเทอรโอเฟจ ดงนนเมอแบคเทอรโอเฟจทมยน GFP ไปบกรกโฮสต จะสงผลใหเกดการแสดงออกของยนและสรางโปรตนดงกลาวขนภายในเซลลซงการเรองแสงของแบคทเรยทถกบกรกดวยแบคเทอรโอเฟจชนดนสามารถตรวจวด (detect) ไดดวยเครองมอพเศษ วธนสามารถใชในการตดตามแบคทเรยกอโรค ทปนเปอนในน าและอาหาร [22] เชน E. coli O157:H7 เปนตน 8.4 Phage display phage display เ ป น ก า ร ส ร า ง เ ปป ไทด (peptide) ทสนใจใหปรากฏหรอแสดง (display) อยบนโครงสรางดานนอกของแบคเทอรโอเฟจ (เชน แคปซด) ซงเปนโปรตนโครงสราง (structural proteins) ของแบคเทอรโอเฟจโดยอาศยเทคนค ทางพนธวศวกรรม [15] อาจกลาวไดวา phage display เปนการเชอมความสมพนธระหวางยนทสนใจ และการแสดงออกของยนน น (genotype-phenotype linkage) บ น ว ร อ อ น ข อ ง แบคเทอร โ อ เฟจ ว ธ น ท า ใ ห ส ามารถ “display” โปรต นหลากหลายชนดบนวรออนของแบคเทอรโอเฟจ เชน เปบไทดสายส น ๆ (short peptide) โปรตนบางส วน (protein domain) โปรตนทงโมเลกล (whole protein) ชนสวนของแอนตบอด (antibody fragment) โปรตน ท เปน receptor และ เอนไซม ปจจบนเทคนค phage display ถกน าไปประยกต ใช อย า งกวางขวาง เชน การคดคนยารกษาโรค การพฒนาวคซน ศกษาก า ร จ บ ก น ร ะ ห ว า ง โ ป ร ต น ก บ โ ป ร ต น (protein-protein

interaction และ receptor-ligand characterization) และการหาวธควบคมหรอท าลายไวรส เปนตน [23] แบคเทอรโอเฟจทนยมน ามาใชในงาน phage display คอแบคเทอรโอเฟจในกลม filamentous phage (เชน Ff, M13, fd และ f1) แบคเทอรโอเฟจทนยมใชมากทสดในงาน phage display คอ M13 ซงมขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 6-7 nm มความยาวประมาณ 900 nm มสารพนธกรรมขนาด 6.4 kb และเปนชนด (+) single stranded DNA มโฮสตคอ E. coli โครงสรางทเปน attachment site ของ M13 คอโปรตน pIII (adsorption protein) ซงพบอยทปลายดานหนงของวรออน และม receptor site อยท sex pilus (F pilus) ของแบคทเรย สารพนธกรรมของ M13 ก าหนดการสรางโปรตน 10 ชนด (pI-pX) ซงสามารถแบงออกเปน 3 กลมตามหนาท [24] คอ (1) replication proteins ไดแกpII, pX และ pV (2) morphogenesis proteins ไดแก pI แ ล ะ pIV (3) structural proteins ไ ด แ ก pVIII, pIII, pVI, pVII และ pIX โปรตนกลมนยงสามารถแบงออกเปน 2 กลมยอยตามจ านวนทพบ คอ major protein (pVIII) พบมาก และ minor protein (pIII, pVI, pVII, pXI) พบนอย การด ารงชวตของแบคเทอรโอเฟจ M13 ภายในเซลลจะไมท าใหเซลลแตก แตสามารถสราง progeny phage และปลอยออกนอกเซลลได ดงนนแบคทเรยทตดเชอยงคงสามารถเจรญเตบโตและแบงเซลลได แตดวยอตราการเจรญทชาลง การท า phage display จ าเปนตองอาศย vector เชน phagemid ซงมกมยนทควบคมการสราง coat protein ชนดใดชนดหนง หลกการของ phage display มดงน (Figure 9) น ายนทควบคมการสรางโปรตนทสนใจ (displayed peptide) แทรกเขาไปใน phagemid เพอใหยนนนไปเชอมตอกบยนทควบคม ก า ร ส ร า ง structural protein ( ห ร อ phage coat protein) โดยทวไปนยมใชยนทควบคมการสรางโปรตน pIII หรอ pVIII (แบคเทอรโอเฟจแตละวรออนสามารถสรางโปรตน pIII ไดป ร ะ ม า ณ 3-5 copy แ ล ะ ส ร า ง โ ป ร ต น pVIII ไ ด ม า ก ถ ง 2700 copy) จาก นนจ งน า recombinant phagemid ไปท า transformation เพอน าเขาสโฮสตเซลล หากโปรตนทแทรกเขาไปนนมการแสดงออก จะปรากฏอยท N-terminus ของโปรตน

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

11

pIII หรอ pVIII บนวรออนของแบคเทอรโอเฟจ โดยทวไป pVIII เ ห ม า ะ ก บ ก า ร display โ ป ร ต นห ร อ เ ปป ไทด ขน า ด เ ล ก (ประกอบดวยกรดอะมโนเพยง 6-7 ตว) สวน pIII เหมาะแกการ display โปรตนขนาดใหญ (อาจประกอบดวยกรดอะมโนมากถง 38 ตวแตตองไมท าใหแบคเทอรโอเฟจสญเสยความสามารถในการบกรกเซลลแบคทเรย ) เมอ phagemid ทม DNA fragment ซงก าหนดการสรางโปรตนทสนใจถกน าเขาสเซลลแบคทเรยแลว phagemid จะเพมจ านวน (replicate) ไดเชนเดยวกบ plasmid และในขณะเดยวกนกมการสราง fusion protein (โปรตนทสนใจและโปรตนโครงสรางของแบคเทอรโอเฟจ) เกดขนภายในเซลลดวย เซลลแบคทเรยทม phagemid vector อยภายในจะไมสราง progeny phage จนกระทงเซลลนนถกบกรกดวย helper virus แบคเทอรโอเฟจทเกดขนใหมภายในเซลลนจงจะมโปรตนทสนใจปรากฏอยบนวรออนและถกปลอยออกนอกเซลล [25] การท า phage display สามารถสราง (construct) phage display library ซ งม โปรตน ทแตกต างกนใหปรากฏอย บน วรออนของแบคเทอรโอเฟจแตละวรออน และเกดขนพรอมกนใน

คราวเดยว ดงนนการคดเลอกวรออนทสนใจจงเปนขนตอน ทส า คญ การ คด เล อกว ร ออน ทสนใจสามารถท า ได โ ดย วธ biopanning [26] (Figure 10) คอน า phage display library ไปเต มลง ใน microtiter plate ซ งก นหล มต ด ( immobilize) ไวดวยกบโมเลกล (ligand หรอ receptor) ทสามารถจบกบโปรตนทแสดง (display) อยบนโครงสรางดานนอกของแบคเทอรโอเฟจไดอยางจ าเพาะลางแบคเทอรโอเฟจ สวนเกนทไมสามารถจบกบโมเลกลดงกลาวทงไป จากนนแยก (elution) แบคเทอรโอเฟจทจบกบโมเลกลทตดไวกนหลมและน าไปเพมจ านวนในโฮสต วธนท าใหไดแบคเทอร โอเฟจบรสทธ ทม โปรตนทสนใจตดอย ทโครงสรางดานนอกตามทตองการ และยงทราบชนดโปรตนทแบค เ ทอร โ อ เฟ จ น นส า ม า ร ถ จ บ (binding) ไ ด ด ว ย ก า ร ท า biopanning สามารถท าซ าหลายรอบได (2-4 รอบ) เพอใหแนใจวา แบคเทอรโอเฟจทแยกไดมความจ าเพาะตอโปรตนทตดไวทกนหลม เมอน าสารพนธกรรมของแบคเทอรโอเฟจทคดเลอกไดนไปศกษาตอ สามารถทราบล าดบเบสของยนทควบคมการแสดงออกของโปรตนทปรากฏอยบนวรออน ของแบคเทอรโอเฟจนน [27]

Figure 9 Phage display by using phagemid vector [25]

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

12

Figure 10 Selection of interested bacteriophages by biopanning [26]

เอกสารอางอง [1] Sulakvelidze, A., Alavidze, Z. and Morris, J. G. Jr. 2001.

“Bacteriophage therapy”. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 45: 649-659.

[2] Ackermann, H. W. 2003. “Bacteriophage observations and evolution”. Research in Microbiology. 154: 245-251.

[3] Leiman, P. G. and et al. 2003. “Structure and morphogenesis of bacteriophage T4”. Cellular and Molecular Life Sciences. 60: 2356-2370.

[4] Sharma, S. and et al. 2017. “Bacteriophages and its applications: an overview”. Folia Microbiologica. 62: 17-55.

[5] Doss, J. and et al. 2017. “A review of phage therapy against bacterial pathogens of aquatic and terrestrial organisms”. Viruses. 9(13): 50.

[6] Ross, A., Ward, S. and Hyman, P. 2016. “More is better: selecting for broad host range bacteriophages”. Frontiers in Microbiology. 7: 1352.

[7] Takeda, Y. and Murphy, J. R. 1978. “Bacteriophage conversion of heat-labile enterotoxin in Escherichia coli”. Journal of Bacteriology. 133(1): 172-177.

[8] Weinbauer, M. G. and Suttle, C. A. 1996. “Potential

significance of lysogeny to bacteriophage production and bacterial mortality in coastal waters of the gulf of Mexico”. Applied and Environmental Microbiology. 62(12): 4374-4380.

[9] Chaturongakul, S. and Ounjai, P. 2014. “Phage-host interplay: examples from tailed phages and gram-negative bacterial pathogens”. Frontiers in Microbiology. 5: 442.

[10] Cotter, P. 2011. “Microbiology: Molecular syringes scratch the surface”. Nature. 475: 301-303.

[11] Fortier, L. C. 2017. “The contribution of bacteriophages to the biology and vilulence of pathogenic clostridia”. Advances in Applied Microbiology. 101: 169-200.

[12] Oliveira, H. and et al. 2013. “Molecular aspects and comparative genomics of bacteriophage endolysins”. Journal of Virology. 87(8): 4558-4570.

[13] Ackermann, H. W. 1998. “Tailed bacteriophages: the order caudovirales”. Advances in Virus Research. 51: 135-201.

[14] Abedon, S. T. and et al. 2011. “Phage treatment of human infections”. Bacteriophage. 1(2): 66-85.

วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยอบลราชธาน ปท 21 ฉบบท 3 กนยายน – ธนวาคม 2562

13

[15] Haq, I. U. and et al. 2012. “Bacteriophages and their implications on future biotechnology: a review”. Virology Journal. 9(9): 1-8.

[16] Chan, B. K., Abedon, S. T. and Loc-Carrillo, C. 2013. “Phage cocktails and the future of phage therapy”. Future Microbiology. 8(6): 769-783.

[17] Roach, D. R. and Debrabieux, L. 2017. “Phage therapy: awakening a sleeping giant”. Emerging Topics in Life Sciences. 1: 93-103.

[18] Inal, J. M. 2003. “Phage therapy: a reappraisal of bacteriophages as antibiotics”. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 51: 237-244.

[19] Semler, D. D., Lynch, K. H. and Dennis, J. J. 2012. “The promise of bacteriophage therapy for Burkholderia cepacia complex respiratory infections”. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 1(27): 1-12.

[20] Chauthaiwale, V. M., Therwath, A. and Deshpande, V. V. 1992. “Bacteriophage lambda as a cloning vector”. Microbiological Reviews. 56(4): 577-591.

[21] van de Merwe, R. G. and et al. 2014. “Phage-based detection of bacterial pathogens”. Analyst. 139: 2617-2626.

[22] Schmelcher, M. and Loessner, M. J. 2014. “Application of bacteriophages for detection of foodborne pathogens”. Bacteriophage. 4: e28137: 1-14.

[23] Bakhshinejad, B., and Sadeghizadeh, M. 2014. “Bacteriophages and their applications in the diagnosis and treatment of hepatitis B virus infection”. World Journal of Gastroenterology. 20(33): 11671-11683.

[24] Rami, A. and et al. 2017. “An overview on application of phage display technique in immunological studies”. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 7(7): 599-602.

[25] Qi, H. and et al. 2012. “Phagemid vectors for phage display: properties, characteristics and construction”. Journal of Molecular Biology. 417: 129-143.

[26] Bazan J. Calkosinski, I. and Gamian, A. 2012. “Phage display-a powerful technique for immunotherapy”. Human Vaccine & Immunotherapeutics. 8(12): 1817-1828.

[27] Arap, M. A. 2005. “Phage display technolog-Application and innovations”. Genetics and Molecular Biology. 28(1), 1-9.