TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN.docx

8/10/2019 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN.docx

1/12

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

MAKALAH

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas

Mata Kuliah Bioteknologi

Oleh :

Erlin Fujianti 122154042

Wini Agustin 122154052

Neng Revi Rismayanti 122154061

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS SILIWANGI

TASIKMALAYA

2014


2/12

KATA PENGANTAR

Puji serta syukur penulis panjatkan kehadirat Allah swt. karena berkat

rahmat-Nya yang telah memberi nikmat kesehatan dan kesempatan sehingga

penulis mampu menyelesaikan makalahberjudul Teknologi DNA Rekombinan.

Makalah ini disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Bioteknologi.

Dengan berkembangnya ilmu pengetahuan diketahui bahwa setiap

makhluk hidup menggunakan DNA dan RNA untuk menyimpan dan metransfer

informasi genetiknya. Sehingga para ilmuwan berpikir mengenai bisa tidaknya

materi gen ini dimanipulasi sehingga bisa didapatkan DNA dan RNA yang sifat

genetiknya sesuai dengan yang diinginkan. Kemudian berkembang teknologi baru

dalam perubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan teknologi

DNA rekombinan atau disebut sebagai rekayasa genetik.

Penulis menyadari bahwa selama penulisan makalah ini banyak mendapat

bantuan dari berbagai pihak. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih

kepada :

1. Egi Nuryadin, S.Pd., selaku dosen mata kuliah Bioteknologi yang telah

membantu selama menyusun makalah ini;

2. rekan-rekan kelas yang telah memotivasi penulis untuk menyelesaikan

penyusunan makalah ini;

3. semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu.

Semoga Allah swt. memberikan balasan yang berlipat ganda. Makalah ini

bukanlah karya yang sempurna karena masih memiliki banyak kekurangan, baik

dalam hal isi maupun sistematika dan teknik penulisannya. Oleh sebab itu, penulis

sangat mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun demi

kesempurnaan makalah ini. Semoga makalah ini bisa membarikan manfaaat bagi

penulis dan bagi pembaca. Amin.

Tasikmalaya, 20 September 2014 Penulis


3/12

BAB I

PENDAHULUAN

A.Latar Belakang Masalah

Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan banyak ditemukan

penemuan-penemuan baru salah satunya tentang biologi molekular. Setelah

banyak penelitian diketahui bahwa setiap makhluk hidup menggunakan DNA

dan RNA untuk menyimpan dan metransfer informasi genetiknya. Sehingga

para ilmuwan berpikir mengenai bisa tidaknya materi gen ini dimanipulasi

sehingga bisa didapatkan DNA dan RNA yang sifat genetiknya sesuai dengan

yang kita inginkan.

Pada awal tahun tujuh puluhan, Paul Berg berhasil menyambungkan

molekul DNA secara in vitro, maka kemudian berkembang teknologi baru

dalam perubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan teknologi

DNA rekombinan atau disebut sebagai rekayasa genetik. Teknologi ini pada

dasarnya adalah teknik menyambungkan molekul-molekul DNA secara in vitro

sehingga diperoleh molekul DNA rekombinan sesuai dengan yang diharapkan.

Teknologi ini memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat

tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi

secara konvensional.

Berdasarkan uraian latar belakang di atas, maka perlu diakukan

penyusunan makalah terkait dengan teknologi DNA rekombinan untuk

mengetahui lebih jelas mengenai teknologi DNA rekombinan tersebut serta

manfaat yang diperoleh dari aplikasi teknologi tersebut bagi kehidupan

manusia.


4/12

B.Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah diatas, penulis merumuskan

rumusan masalah sebgai berikut.

1.Bagaimana teknik isolasi DNA ?

2.Bagaimana isolasi mRNA dan pembuatan cDNA ?

3.Bagaimana pembuatan gen sintetik ?

4.Bagaimana amplifikasi DNA dan teknikteknik PCR ?

5.Bagaimana pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi ?

6.Bagaimana penyambungan DNA (ligasi DNA) ?

C.Tujuan Makalah

Sejalan dengan rumusan masalah di atas, makalah ini disusun dengan

tujuan untuk mengetahui :

1.Teknik isolasi DNA;

2. isolasi mRNA dan pembuatan cDNA;

3.pembuatan gen sintetik;

4. amplifikasi DNA dan teknikteknik PCR;

5.pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi; dan

6.penyambungan DNA (ligasi DNA).

D.Kegunaan Makalah

Makalah ini disusun dengan harapan memberikan kegunaan baik seara

teoritis maupun secara praktis. Secara teoritis makalah ini berguna sebagai

pengembangan konsep teknologi DNA rekombinan. Secara praktis makalah ini

bermanfaat bagi :

1. penulis, sebagai wahana penambah pengetahuan dan konsep teknologi

DNA rekombinan;

2. pembaca, sebagai media informasi tentang manfaat teknologi DNA

rekombinan.


5/12

E.Prosedur Makalah

Makalah ini disusun dengan menggunakan pendekatan kualitatif.

Metode yang digunakan adalah metode deskriptif. Melalui metode ini penulis

akan menguraikan permasalahan yang dibahas secara jelas dan konprehensif.

Data teoritis dalam makalah ini dikumpulkan dengan menggunakan teknik

studi pustaka, artinya penulis mengambil data melalui kegiatan membaca

berbagai literatur yang relewan dengan tema makalh. Data tersebut diolah

dengan teknik analisis isi melalui kegiatan mengeksposisikan data serta

mengaplikasikan data tersebut dalam konteks tema makalah.


6/12

BAB II

PEMBAHASAN

A.Teknik isolasi DNA

B.Isolasi mRNA dan pembuatan cDNA

C.Pembuatan gen sintetik

Suatu gen yang tersusun atas rangkaian nukleotida juga dapat diperoleh

denga melakukan sintesis kimia sehingga diperoleh gen sintetik. Sekarang telah

banyak metode sintesis nukleotida, baik secara otomatis maupun semi-

otomatis. Meskipun demikian, gen-gen dengan ukuran besar tidak selalu

mudah disintesis sehingga seringkali harus dilakukan sintesis secara bertahap.

Hasil sintesis gen tersebut selanjutnya harus dicek kembali urutan

nukleotidanya dengan teknik penentuan urutan DNA (DNA sequencing).

Dengan metode sintesis kimiawi maka dimungkinkan untuk membuat suatu

gen yang sama sekali baru yang tidak pernah ada di alam. Meskipun

demikian, belum tentu gen baru tersebut dapat diekspresikan menjadi suatu

rangkaian asam amino suatu protein yang fungsional.

Pada tahun 1921, pasien diabetes mellitus yang mengalami peningkatan

kadar gula darah disebabkan gangguan produksi insulin, telah diterapi dengan

menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas hewan.

Meskipun insulin sapi dan babi mirip dengan insulin manusia, namun

komposisinya sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah sistem kekebalan tubuh

pasien menghasilkan antibodi terhadap insulin babi dan sapi yang berusaha

menetralkan dan mengakibatkan respon inflamasi pada tempat injeksi.

Faktor-faktor ini menyebabkan peneliti mempertimbangkan untuk

membuat Humulin dengan memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang

cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk memproduksi insulin yang secara kimia

identik dan dapat secara alami diproduksi.


7/12

D.Amplifikasi DNA dan teknikteknik PCR

Kemajuan teknologi telah memungkinkan para ilmuan untuk meniru

urutan nukleotida suatu gen dengan cara melakukan amplifikasi DNA dengan

teknis reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, atau PCR).

Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro (di dalam tabung) dengan

menggunakan :

1.Enzim DNA polimerase,

2.dNTP (dinukleatida triphosphat),

3. oligonukleatida primer,

4.Molekul DNA cetakan (DNA template)

Enzime DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi

polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA. Dalam teknik PCR, biasanya

digunakan enzim DNA polimerase yang berasal dari bakteri termotoleran yang

berasal dari laut, yaitu Thermus aquaticus, sehingga enzimnya disebut Taq

DNA polymerase. Enzim ini mempunyai kelebihan dibanding dengan enzim

Dna polimerase yang lain karena ketahanannya terhadap suhu sangat tinggi

mencapai suhu 95 - 100C. Suhu setinggi ini diperlukan sebab untuk dapat

menyalin urutan basa DNAcetakan dalam metode PCR, maka DNA cetakan

harus didenaturasi (dipisahkan ikatan antar untaiannya) dengan perlakuan

panas. Sekarang telah banyak enzim DNA polimerase termotoleran lain yang

dikembangkan untuk PCR, misalnya Tth DNA polymerase, dan Pwo DNA

polymerase.

Molekul dNTP (yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP) diperlukan untuk

teknik PCR sebagai bahan dasar untuk membuat untaian DNA karena molekul

DNA disusun oleh keempat nukleotida tersebut.

Oligonukleotida primer adalah molekul nukleotida berukuran pendek

(sekitar 10 30 basa nukleotida) yang diperlukan dalam mengawali proses

sintesis DNA. Perlu diketahui bahwa proses sintesis DNA, baik secara in vivo

(di dalam sel) maupun secara in vitro (di luar sel) memerlukan molekul primer.

Urutan basa nukleotida pada primer ditentukan agar menempel (komplementer)


8/12

pada bagian molekul DNA cetakan yang akan disalin atau diamplifikasi.

Molekul primer dapat dibuat dengan cara sintesis kimiawi.

Molekul DNA cetakan adalah molekul DNA yang urutan nukleotidanya

akan disalin. DNA cetakan diisolasi dari sel dan selanjutnya digunakan sebagai

cetakan yang akan dibaca oleh enzim DNA polimerase untuk membuat salinan

urutan nukleotida.

PCR silakukan dengan mencampurkan empat komponen tersebut dalam

tabung Eppendorf kemudian dimasukan ke dalam alat thermocycler. Volume

total campuran reaksi diperlukan biasanya berkisar antara 25 100 l.

Thermocycler adalah alat yang dapat diatur untuk membuat suatu siklus

perubahan suhu yang diperlukan dalam proses amplifikasi DNA. Mesin PCR

dilengkapi dengan program komputer yang mengatur secara otomatis pada

setiap siklus. Pertama kali suatu alat diatur sehingga mencapai 95 - 100C

selama beberapa menit (biasanya sekitar 5 menit). Pada saat ini, molekul DNA

cetakan mengalami denaturasi sehingga dua untaiannya terpisah. Pemisahan

untaian ini diperlukan agar oligonukleat primer dapat menempel, karena primer

tidak akan dapat menempel pada DNA cetakan yang masih dalam bentuk

untaian ganda (double stranded).

Setelah beberapa menit pada suhu denaturasi, suhu alat diturunkan

sehingga mencapai suhu yang sesuai untuk penempelan primer (primer

annealing) pada DNA cetakan. Biasanya suhu diperlukan sekitar 50 - 60C,

tetapi suhu yang tetap harus ditentukan secara empiris tergantung pada basa

nukleotida primer yang digunakan. Pada suhu yang tepat, molekul primer akan

menempel pada daerah DNA yang komplementer. Sebagai contoh, jika urutan

nukleotida primer adalah GATCTTCG, maka primer tersebut akan menempel

pada daerah DNA cetakan yang mempunyai urutan CTAGAAGC. Molekul

primer yang menempel tersebut berfungsi sebagai molekul awal dalam proses

polimerisasi DNA. Nukleotida-nukleotida baru akan ditempelkan di ujung

primer tersebut sesuai dengan urutan nukleotida pada DNA cetakan.

Proses penempelan primer biasanya memerlukan waktu beberapa menit

(sekitar 2-3 menit), selanjutnya suhu alat dinaikan ke suhu yang optimum


9/12

untuk aktivitas polimerisasi DNA oleh DNA polimerase. Jika digunakan Taq

DNA polymerase, maka biasanya suhu dinaikan menjadi 72C. Pada suhu

inilah terjadi proses polimerisasi (sintesis) DNA baru dengan adanya aktivitas

DNA polimerase, dNTP, primer, dan DNA cetakan. Proses polimerisasi

biasanya berlangsung selama 2-5 menit.

Setelah proses polimerisasi, kemudian dilakukan lagi siklus seperti

semula, yaitu dengan menaikan suhu menjadi 95-100C (denaturasi), kemudian

diturunkan menjadi 50-60C (penempelan primer), dan kemudian dinaikan lagi

menjadi 72C (polimerisasi). Siklus perubahan suhu semacam ini dilakukan

berulang-ulang sekitar 25-35 kali. Dengan demikian dalam proses PCR terjadi

sintesis DNA secara berulang-ulang sehingga diperoleh molekul DNA baru

dengan jumlah yang jauh berlipat ganda dibanding dengan molekul DNA

cetakannya. Inilah yang disebut sebagai proses reaksi berantai polimerase atau

PCR. Dengan teknik ini dimungkinkan mengamplifikasi suatu fragmen DNA

dengan cepat dan dalam jumlah banyak. Selain itu, amplifikasi juga dapat

diarahkan hanya pada bagian-bagian tertentu suatu gen sehingga dapat

dikembangkan untuk tujuan rakayasa struktur suatu gen atau suatu protein.

Skema dasar proses PCR.

GAMBAR

Reaksi berantai polimeraseatau lebih umum dikenal sebagai PCR

(kependekan dari istilahbahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan

suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi)DNA secaraenzimatik tanpa

menggunakanorganisme.Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam

jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai

teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis olehKary Mullispada

tahun 1983

Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah metode

enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara eksponensial suatu

sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini ditemukan oleh Kary B.

Mullis pada tahun 1985, seorang saintis dari perusahaanCETUS Corporation.

Metode PCR ini pada awalnya hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul

DNA, akan tetapi dalam perkembangannya dapat digunakan untuk

melipatgandakan molekul mRNA.
http://id.wikipedia.org/wiki/Bahasa_Inggrishttp://id.wikipedia.org/wiki/Replikasihttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullishttp://id.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullishttp://id.wikipedia.org/wiki/Organismehttp://id.wikipedia.org/wiki/Enzimhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Replikasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Bahasa_Inggris


10/12

Metode PCR dapat melipatgandakan (amplification) suatu fragmen molekul DNA

menjadi molekul DNA (110 bp/5x10-19) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan20 siklus reaksi selama 220 menit. Kelebihan dari metode PCR adalah DNA

cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga

metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuen DNA dalam

genom bakteri hanya dengan mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR.

Cara kerja

Prinsip kerja reaksi berantai polimerase

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali

siklus yang tergantung oleh kebutuhan. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap.Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan(melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung

pada suhu tinggi, 9496 C) ikatan hidrogenDNAterputus (denaturasi)

dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR

tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua

berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan

siap menjadi templat ("patokan") bagiprimer.Durasi tahap ini 12 menit.

2. Tahap penempelanatau annealing. Primer menempel pada bagian DNA

templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu

antara 4560 C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat

menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di

sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit.

3. Tahap pemanjanganatau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari

jenisDNA polimerase(ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai.

DenganTaq-polimerase,proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 C.

Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan

renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer

lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yangdipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi

secaraeksponensial.

Aplikasi PCR

Sejak ditemukannya metode PCR, perkembangan dunia biologi molekular dan

bioteknologi semakin pesat. Beberapa contoh penerapan PCR antara lain:

- analisis tindakan kriminal dengan sedikit sampel darah, sperma, sidik jari atau

jaringan

- deteksi DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV
http://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://id.wikipedia.org/wiki/Primerhttp://id.wikipedia.org/wiki/Primerhttp://id.wikipedia.org/wiki/Primerhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerasehttp://id.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerasehttp://id.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerasehttp://id.wikipedia.org/wiki/Taq-polimerasehttp://id.wikipedia.org/wiki/Taq-polimerasehttp://id.wikipedia.org/wiki/Taq-polimerasehttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Eksponensial&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Eksponensial&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Eksponensial&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Eksponensial&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Taq-polimerasehttp://id.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerasehttp://id.wikipedia.org/wiki/Primerhttp://id.wikipedia.org/wiki/DNA


11/12

- pengujian kualitas air minum

- identifikasi jenis kelamin

E.Pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi

F.Penyambungan DNA (ligasi DNA)

BAB III

PENUTUP


12/12

A.Simpulan

B.Saran

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN.docx

Documents

Transcript of TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN.docx