Analisa DNA

download Analisa DNA

of 15

  • date post

    28-Dec-2015
  • Category

    Documents

  • view

    63
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of Analisa DNA

14

ANALISA DNA

I. PENDAHULUANAnalisis DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotipe (materi genetik) yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisa pada level ini, jauh lebih akurat dibanding dengan analisa fenotipe (morfometrik) karena ciri fenotipe merupakan hasil interaksi antara genotipe dengan lingkungan. Dengan kata lain, interpretasi hasil analisa fenotipe tidak persis mencerminkan genotipe yang dimiliki oleh organisme tertentu.Aplikasi analisis DNA antara lain penentuan marker (penanda) dalam mengukur hubungan kekerabatan antar kelompok ikan dalam populasi, baik yang di alam maupun di lingkungan budidaya, studi taksonomi, genetika populasi, dan diagnosa penyakit. Penggunaan marker pada level DNA memiliki beberapa kelebihan yaitu tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan faktor pertumbuhan, lebih sensitif, hampir semua jaringan dapat digunakan sebagai sumber material genetik dan dapat digunakan dalam jangka waktu yang relatif lebih lama. Sedangkan kelemahannya adalah prosedur yang cukup rumit dan mahalnya biaya analisa.Prosedur analisa DNA diawali dengan mengekstraksi genom DNA dari sumber sel yang diikuti dengan proses isolasi sekuen DNA tertentu. Seperti yang diutarakan oleh Lewin (1994), bahwa langkah awal dalam menganalisa DNA adalah memecahkan genom DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik yang berukuran lebih kecil.Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari molekul-molekul lain di dalam suatu jaringan yang dilarutkan. Karena secara alami, DNA adalah suatu molekul primer yang keberadaannya selalu terkait denga RNA dan protein. Sedangkan dalam menganalisa DNA yang diperlukan adalah DNA dalam bentuk murni (Stine, 1973). Langkah pertama dalam mengekstraksi DNA umumnya adalah menghancurkan sel dan isolasi asam nukleat. Selanjutnya dilakukan penghancuran inti sel sehingga DNA akan terlepas dan akan menyebabkan viskositas larutan meningkat sehingga molekul DNA terlihat lebih nyata. Langkah kedua adalah pemisahan DNA dari bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein. Dalam ekstraksi DNA, jenis sumber sel yang digunakan ada beberapa macam seperti hati, otot, sirip, darah dan sel hasil kultur. Sedangkan kondisi sumber sel meliputi sumber sel segar, sumber sel terfiksasi dan sumber sel beku.

II. BAHAN DAN ALAT Bahan

1. Jaringan ikan uji7.Primer

2. Cell lysis solution8.Master mix PCR

3. Protein precipitation solution9.Marker DNA

4. RNase10.1 x TBE

5. Proteinase K11. Etidium bromida

6. Ion Exchange water/distilled water

Alat

1. Inkubator5.Mesin PCR

2. Tabung mikro6.Vortex

3. Pipet mikro7.Satu set elektroforesis

4. Sentrifuse8.UV illuminator

III. PROSEDUR KERJA3.1. PROSEDUR EKTRAKSI DNA Penghancuran sel (Cell lysis)1. Semua peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan ekstraksi DNA diautoclave.2. Sampel ikan ditimbang sebanyak 10 20 mg, lalu dimasukkan ke dalam tabung mikro (1.5 ml).3. Tambahkan 200 l Cell Lysis Solution dan 1.5 l Proteinase K solution ke dalam tabung mikro.4. Tabung berisi suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 550C selama 3 24 jam.

Gambar 5. Inkubasi jaringan dengan Dry Thermo Unit Eliminasi RNA1. 1,5 l RNase (4 mg/ml) dimasukkan ke dalam setiap tabung lalu diaduk dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 25 kali. Kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 30 60 menit.2. Setelah inkubasi selesai, dinginkan sampel sampai mencapai kondisi suhu ruang.

Pengendapan Protein1. 200 l Protein Precipitation Solution ke dalam larutan sampel lalu divortex pada kecepatan tinggi selama 20 detik.2. Inkubasi sampel on ice selama 10 - 15 menit.3. Kemudian sampel disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit hingga terbentuk endapan protein dan larutan yang mengandung DNA.

Gambar 6. Sentrifuse Pengendapan DNA1. Larutan supernatan yang terbentuk dituangkan dengan hati-hati ke dalam tabung baru yang telah berisi 600 l Larutan Isopropanol 100%.2. Tabung yang berisi larutan DNA ini kemudian diaduk dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 50 kali hingga terlihat untaian pita DNA yang berwarna putih.3. Kemudian tabung tersebut disentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit hingga terbentuk pelet DNA di dasar tabung.4. Larutan supernatan dibuang.5. 300 l Larutan Etanol 70% dingin, kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi pelet DNA. Lalu tabung dibolak-balik beberapa kali untuk membilas sisa-sisa DNA yang berada di dinding tabung.6. Tabung disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.7. Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara selama 30 menit.8. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan menambahkan 30-50 l akuades steril (SDW) ke dalam tabung.9. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (-20C) atau langsung digunakan untuk proses selanjutnya.

Pemurnian DNA1. Ambil 20 l sampel DNA dan masukkan ke dalam tabung mikro (0.6 ml)2. Kemudian tambahkan 20 l larutan Phenol/Chloroform mix (1:1)3. Larutan di vortex dan di inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit sampai tebentuk 3 lapisan4. Ambil lapisan atas (larutan DNA) dengan sangat hati-hati dan pindahkan ke tabung yang baru.5. Tambahkan 2 l NaOAC (3M pH 5.2) kedalam tabung mikro berisi DNA.6. Tambahkan 60 l Etanol absolut dan campuran larutan divortex. 7. Kemudian di inkubasi di dalam freezer -80C selama 15 menit.

Gambar 7. Tiga lapisan yang terbentuk setelah inkubasi8. Sentrifuse tabung pada kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit9. Buang supernatant, kemudian cuci pellet DNA dengan 20 l Etanol 70%.10. Sentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.10. Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara selama 30 menit.11. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan menambahkan 10 l akuades steril (SDW) ke dalam tabung.12. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (-20C) atau langsung digunakan untuk proses selanjutnya.

3.2. PROSEDUR PENGUKURAN KONSENTRASI DNA DAN RNA1. Larutan DNA diencerkan terlebih dahulu 80 kali dengan SDW (RNA dengan DEPC) dengan volume akhir 100.2. Alat Gene Quant dinyalakan, dan kuvet dikeluarkan dari tempat penyimpanan lalu dibilas dengan akuades.3. Kalibrasi dilakukan dengan mengukur absorbansi pelarut (SDW untuk DNA dan DEPC untuk RNA), dengan memasukkan 80 l pelarut tersebut ke dalam kuvet. Kemudian kuvet dimasukkan ke dalam alat, lalu tekan tombol set ref, hasil pembacaan akan menunjukkan nilai absorbansi 0.000. Dilanjutkan dengan pengukuran konsentrasi DNA atau RNA.4. Kuvet yang akan digunakan, dibilas terlebih dahulu dengan akudes. Setelah itu larutan asam nukleat yang akan diukur dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak 80 l dan kuvet ditempatkan di dalam alat.5. Setelah tombol sample ditekan dan konsentrasi larutan sudah terbaca, kuvet dikeluarkan dan dibilas dengan akuades.

Gambar 8. Gene Quant3.3. PROSEDUR PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)a. Preparasi sampel dapat dilakukan dengan beberapa cara sesuai dengan Taq Polymerase yang digunakan : Menggunakan ExTaq Polymerase1. Pembuatan larutan premix yang terdiri dari :BahanJumlah

10 x Buffer Ex Taq1.00 l x jumlah sampel + 1

DNTP1.00 l x jumlah sampel + 1

Primer

Forward 1.00 l x jumlah sampel + 1

Reverse1.00 l x jumlah sampel + 1

Ex Taq0.05 l x jumlah sampel + 1

SDW4.95 l x jumlah sampel + 1

2. Larutan premix dibagi ke dalam masingmasing mikrotube sebanyak 9 l.3. Masukkan masingmasing sampel DNA sebanyak 1 l sehingga volume akhir tiap mikrotube adalah 10 l.

Menggunakan Pure Taq Ready-To-Go- PCR BeadsTambahkan pada tube yang berisi PCR Beads masing-masing bahan berisi berikut ini, hingga volume akhir setiap mikrotube adalah 25 l.Sampel DNA 2 l

Primer Forward 2 l

Primer Reverse 2 l

SDW 19 l

Total Volume 25 l

Menggunakan My PCR KIT 1 (Vivantis)1. Pembuatan premixBahanJumlah

2 x Taq Master Mix5.00 l x jumlah sampel + 1

MgCl20.50 l x jumlah sampel + 1

Primer

Forward 1.00 l x jumlah sampel + 1

Reverse1.00 l x jumlah sampel + 1

SDW1.5 l x jumlah sampel + 1

2. Larutan premix dibagi ke dalam masingmasing mikrotube sebanyak 9 l.3. Masukkan masingmasing sampel DNA sebanyak 1 l sehingga volume akhir tiap mikrotube adalah 10 l.b.Masukkan masing-masing mikrotube ke dalam mesin PCR yang telah diprogram sebagai berikut :ProsesSuhuLama WaktuSiklus

Denaturasi awal940C3 menit1

Siklus PCR :DenaturasiAnnealingExtension940C590C720C30 detik30 detik 30 detik

30

Final ekstension720C3 menit1

Note : Program PCR dapat berubah sesuai DNA yang akan dianalisa. Suhu annealing disesuaikan dengan sekuen primer yang digunakan.

Setelah proses PCR selesai mesin dimatikan dan hasil PCR disimpan di dalam freezer -200C untuk selanjutnya dapat dielektroforesis.

Gambar 9. Mesin PCRPEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI Pemotongan mtDNA dengan enzim restriksi dilakukan dengan cara mencampurkan bahan-bahan berikut :

Buffer enzim1 l

Enzim1 l

Hasil PCR2 l

SDW6 l

Volume Akhir 10 l

Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 1- 3 jam. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi ini dapat langsung dilihat dengan elektroforesis.\ Contoh jenis jenis enzim dan situs pemotongannya.

No.NamaSumberSitus Pemotongan

1Hinf IHaemophilus influenza RfG A N T CC T N A G

2Hae IIIHaemophilus aegyptiusG G C CC C G G

3Alu IArthrobacter luteusA G C TT C G A

4Mbo IMoraxella bovis sp.G A T CC T A G

5Cfr 13 ICitobacter freundii RFL 13G G N C CC C N G G