Visualisasi DNA

download Visualisasi DNA

of 9

  • date post

    26-Dec-2015
  • Category

    Documents

  • view

    54
  • download

    0

Embed Size (px)

description

Jurnal yang mngandunng koten mengenai visualisasi DNA

Transcript of Visualisasi DNA

  • TEKNIK PENGGUNAAN MARKARAPD DENGANPCR

    ZULQOYAH LAYLA

    Balai Penelitian Ternak,Po . Box 221 Bogor 16002

    RINGKASAN

    Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001

    PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi polimerase berantaiadalah teknik amplifikasi DNA yang spesifik dengan cara melakukan prosespemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemendari utas DNA secara simultan . Untuk mengatahui hasil amplifikasi, perludilakukan migrasi produk PCR di dalam gel (elektro-foresis) dan diamatidengan UVtransiluminator . Hasil visualisasi akan menunjukkan adanyaperbedaan sifat diantara sampel yang diuji berdasarkan pada ukuran DNA yangterseparasi . Salah satu kegunaan proses PCR adalah untuk kajian keragamanmolekuler seperti RAPD. Teknik RAPD (Random Amplified PolimorphicDNA) sederhana dalam pengerjaannya, memerlukan sedikit sampel, dan palingcepat dalam penggunaannya, namun relatif cukup mahal terutama pada enzymTaq polimerase . Dari masing-masing 5 sampel darah domba bangsa Garut,Sumatera, StCroix, Merino, dan Ekor Gemuk, telah berhasil diisolasi sebanyak25 nomor DNA dengan kemumian berkisar antara 1,440-2,330, serta memilikikonsentrasi antara 87,5ng/ul - 1912,5 ng/ul . Dari hasil separasi produk PCRdengan primer OPH-03, muncul pita-pita dengan jumlah berfariasi antara 2-4 .Hal ini menunjukkan bahwa bangsa domba yang diperiksa memiliki sifatpolimorfis .

    PENDAHULi1AN

    PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi polimerase berantaiadalah teknik amplifikasi DNA yang spesifik dengan cara melakukan prosespemanjangan nukleotida dari primer yang merupakan pasangan komplemendari utas DNA secara simultan . Proses pemanjangan nukleotida merupakanproses polimerase yang dilakukan oleh DNA karena adanya "primer" yangberkomplemen dengan DNA utas tunggal.(SUHARSONO, 2000) .

    Pengulangan dari siklus berdasarkan pada perubahan suhu yang terdiridari tahap "denaturasi", "annealing " dan "extension" . Tahap "denaturasi"merupakan tahap awal dimana pada tahap ini DNA yang merupakan rantai utaspanda akan terlepas sehingga membentuk rantai utas tunggal . Tahap"annealing" merupakan tahap dimana terjadi perlekatan primer pada ikatanDNA Was tunggal_ Primer yang memiliki sekuens basa tertentu akan mengenalisekuens basa DNA utas tunggal . Tahap selanjutnya adalah tahap "extension"atau pemanjangan , dimana pada tahap ini terjadi pemanjangan primer dengan

    147

  • Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 200/

    bantuan enzym Taq DNA polimerase . Hasil produk ini berfungsi sebagaitemplate (cetakan) pada siklus berikutnya . PCR sangat sensitive, dapatmengamplifikasi sampai lebih dari sejuta kali, sehingga dapat menghasilkanDNA dalam jumlah yang sangat besar . Karena dapat mengamplifikasi demikianbanyak, maka DNA cetakan (template) dibutuhkan dalam jumlah yangsedikit.(SUHARSONO, 2000) .

    Untuk mengetahui hasil amplifikasi maka perlu dilakukan migrasiproduk PCR di dalam gel (elektroforesis) dan diamati dengan UVtransiluminator . Hasil visualisasi akan menunjukkan adanya perbedaan sifatdiantara sampel yang diuji , berdasarkan pada ukuran DNA yang terseparasi .

    Proses PCR dapat dipergunakan untuk berbagai keperluan diantaranyauntuk identifikasi suatu gen atau DNA yang spesifik ; untuk identifikasi adanyasuatu patogen penyebab suatu penyakit, seperti HepatitisB, TBC, AIDS, ataukelainan lainnya ;perbanyakan gen untuk berbagai keperluan ; untuk kajiankeragaman molekuler seperti RAPD(Random Amplified Polimorphic DNA) ;untuk pengurutan DNA, dll .

    RAPD merupakan salah satu teknik yang paling luas dipergunakankarena kesederhanaannya . . Primer yang digunakan adalah primeroligonukleotida dimana urutan basanya dibuat secara random (acak) . DalamRAPD diperlukan sedikit sampel DNA untuk analisa . Teknik ini merupakanteknik yang paling cepat dalam penggunaannya, namun relatif cukup mahal,tenitama untuk enzym Taq DNA polimerase .(WILLIAM at al, 1990) .

    Tujuan penulisan ini adalah untuk mengemukakan salah satu metodeisolasi DNA, pelaksanaan metode marka RAPD yang digunakan dilaboratorium Genetika Balitnak Bogor terhadap sampel darah domba .

    Alat dan bahan yang digunakan

    Mikropipet, tips, tabung eppendorf 1500 ul, tabung eppendorf 200 ul,mikrosentrifus, spektrofotometer double beam UV150-02 Shimadzu, tangkielektroforesis, cetakan gel + sisir mesin PCR MJ Research, kamera Polaroid .,UV transiluminator, sarung tangan latex .

    Larutan yang digunakan

    BAHAN DAN METODA

    Penyangga TE, penyangga TBE, NP-40, SDS, alkohol 70 %, alkoholabsolut, NaOAc 3M, Proteinase-K , buffer PCR(Promega), dATP(Promega),dCTI'(Promega), dGTP(Promega), dTTP(Promega), MgCl z(Promega), DNATaq polimerase(Promega), primer OPH-03(Operon), dd HZO. Penanda ukuranmolekuler 1 Kb dan 100 bp .

  • Metode

    Isolasi DNA

    Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 100/

    DNA cetakan diisolasi dari darah domba berdasarkan metodeSAMBROOK at al, (1989) yang telah dimodifikasi . Sebanyak 5 ekor darimasing masing domba bangsa Ekor gemuk, Merino, Garut, StCroix danSumatra diambil darahnya secara aseptis melalui vena jugularis . Pengambilandarah sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung vacutainer yang telah berisianti koagulant EDTA. Sebanyak 350 ul plasma darah dimasukkan ke dalamtabung eppendorf 1500ul, ditambah sebanyak 70 ul larutan NP40, 350 ullarutan SDS dan 10 ul Proteinase K . Tabung divortex, kemudian diinkubasipada suhu 50C semalam . Keesokan harinya ditambah 350ul larutan fenol,disentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit . Fase atas diambil untukdipindahkan ke dalam tabung eppendorf baru, ditambah 1/10 bagian larutanNaOAc 3M dan 2 bagian larutan alkohol absolut dingin . Tabung digoyangperlahan ( dasar tabung di jentik jentik ) hingga terbentuk endapan putih(DNA). Tabung disimpan pada suhu --20C semalam . Keesokan harinyatabung disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit . Cairanyang ada di dalam tabung di buang dengan hati hati hingga yang tersisaberupa endapan (DNA) berwarna putih . Ke dalam tabung yang berisi DNAtersebut ditambahkan sebanyak 1 ml larutan alkohol 70 %, campur perlahan,sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 5 menit . Cairan alkoholdibuang, tabung diinkubasi pada suhu 50C selama 1 jam , atau dikeringanginkan hingga terbentuk pelet DNA didasar tabung . Ke dalam tabung yangberisi pelet DNA diisikan sebanyak 200 ul larutan TE untuk melarutkankembali DNA, diinkubasi pada suhu 65C sampai DNA larut . Ke dalam DNAditambahkan 5 ul larutan RNAse, diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37C,kemudian direbus selama 5 menit untuk menghentikan reaksi . DNA yangdihasilkan selanjutnya diukur kualitas dan kuantitasnya .

    Kuantitas DNA dapat dilihat dengan UVspektrofotometer padapanjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Adapun prosedurnya yaitumemasukkan sebanyak 5 ul DNA ke dalam tabung cuvet ditambah 2495 ul TEsebagai pengencer, dilihat (dibaca) nilai optikal densitinya padaUVspektrofotometer dengan panjang gelombang 260nm dan 280 nm. Sebagailarutan standar dipakai larutan penyangga TE. Dari hasil pengecekkan tersebutdidapat data kemurnian DNA yang dapat dihitung dengan melihatperbandingan bacaan pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 260nm dan 280 nm . Selanjutnya dari hasil pengukuran tersebut dapat ditentukanjumlah DNA sampel yang diperoleh dengan rumus : Jumlah DNA = [ 260 x2500/5 x 50 ]/1000 . Informasi kuantitas ini dapat digunakan untuk menentukanperhitungan dalam pengenceran DNA agar dapat diketahui secara tepatkonsentrasi DNA diinginkan .

    Uji kualitas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis . DNA basilisolasi diambil sebanyak 3 ul dan dicampur dengan larutan blue juice(pemberat/penanda migrasi), lalu diisikan ke dalam sumuran gel yang

    149

  • mengandung 1 % agarose . Pada sumuran lain, diisi penanda DNA berukuran1Kb . Gel dielektroforesis dengan tegangan 90 volt selama 1,5 jam, kemudiandirendam dalam larutan Ethidium Bromida selama 10 menit, dibilas denganmerendam gel di dalam air suling, diamati dengan bantuan UV transiluminator,bila perlu selanjutnya difoto dengan kamera Polaroid .

    Metode RAPD dengan PCR

    1 . Sampel DNA yang akan diuji

    masing-masing diencerkan dengankonsentrasi 5 ng/ul .dalam larutan penyangga TE. Untuk setiap bangsadibuat larutan gabungan (bulk) 10 ul DNA 5ng/ul setiap individu dijadikansatu .

    2 . Membuat larutan campuran(cocktail) untuk tiap sampel bulk DNA kedalam tabung eppendorf isi 200 ul dengan komposisi :

    150

    Buffer PCR [ Promega]

    2,5 uldATP [Gibco]

    0,5 uldCTP

    [ Gibco]

    0,5 uldGTP

    [ Gibco]

    0,5 uldTTP

    [ Gibco]

    0,5

    ulMgC12 [ Promega]

    1,5 ulPrimer [Operon] H-03

    1,25 ulTaq DNA Polimerase [Promega]

    1,2 ulddHZ0

    7,5 ulTemplat DNA 5ng/ul

    10 ulTotal volume

    25

    ul

    "Cocktail "yang sudah dibuat, kemudian disentrifugasi dengankecepatan 6000 rpm agar bahan- bahan dalam "cocktail" dapat tercampursempurna . Untuk menghindari terjadinya penguapan pada saat prosesamplifikasi berlangsung, diatas permukaan larutan "cocktail "dilapisi minyakmineral sebanyak 25 ul .

    "Cocktail" dibuat dengan tujuan untuk memudahkan cara kerja . BufferPCR berfungsi sebagai larutan penyangga pada proses amplifikasi . SedangkandATP dCTP dGTP, dTTP, digunakan untuk pemanjangan primer dalammembentuk utas DNA baru . Primer yang digunakan adalah OPH-03 buatanOperon yang mempunyai urutan basa 5'-AGACGTCCAC-3' . Enzim TaqDNA polimerase berfungsi untuk memanjangkan primer pada tahap"elongasi/extension (BUDIARTI.P,1993) .

    Amplifikasi DNA dengan PCR

    Temu Teknis Fungsionnl Non Peneliti 2001

    Setelah "cocktail" selesai dibuat maka tahap selanjutnya adalahmengamplifikasi DNA sample dengan mesin PCR (MJ Research Inc ) .

  • Mengetahui hasil amplifkasi [separasil

    Hasil amplifikasi dapat dilihat dalam gel agarose yang diamati denganUVtransiluminator. Tahapannya ada