Teknik Elisa

7/30/2019 Teknik Elisa

1/25

Oleh :

Dr. Ir. Tri Dewanti W., M.Kes.


2/25

PENGUJIAN BIOASSAY

Metode In Vivo

dgn hewan percobaan

Pengujian Bioassay

Metode In Vitro

dgn darah dan cairanfisiologis (urin, fases,

saliva dll.) pd hewan dpt

dgn organ tubuh


3/25

Pengujian in vivo mulai bnyk ditinggalkan

krn pengorbanan mahluk hidup

Pengujian in vitro mengurangi penggunaan

hewan percobaan

Pengujian in vitro memerlukan pemahanan

fungsi anatomi, penggunaan model-model dan

ketrampilan analitik

Pemahanan fungsi anatomi perlu difahami

untuk medptkn biomarker yg sesuai

penggunaan kultur jaringan dgn parameterviabilitas dan enzimatis


4/25

Metode uji in vitro berdasarkan teknik kultur

- dgn media sintetik yg sesuai

- sesuai dgn kondisi fisiologis alamiahnya

- kondisi lingkungan yg steril

- peralatan yg memadai (inkubator CO2 hrs ada)


5/25

Teknik ELISAEnzim-linked immunosorbent assay

(ELISA) atau disebut sebagai uji penentuan

kadar imunosorben taut-enzim

Merupakan teknik pengujian serologi yang

didasarkan pada prinsip interaksi antaraantibodi dan antigen.

Pada awalnya, teknik ELISA hanya

digunakan dalam bidang imunologi untuk

mendeteksi keberadaan antigen maupunantibodi dalam suatu sampel seperti dalam

pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada

saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia

khususnya).


6/25

Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISATeknik ELISA memiliki beberapa kelebihan :

Teknik pengerjaan relatif sederhana. Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang

digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat

biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)

Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukuptinggi.

Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan

antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat

rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara

antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik)


7/25

Kekurangan dari teknik ELISA antara lain:

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji denganteknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal

(antibodi yang hanya mengenali satu antigen)

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada

antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA inimembutuhkan biaya yang relatif cukup mahal.


8/25

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat

terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif

yang menunjukkan respons positif yangdisebabkan inefektivitas dari larutan blocking

sehingga antibodi sekunder atau antigen asing

dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim

signal dan menimbulkan signal.

Reaksi antara enzim signal dan substrat

berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan

harus dilakukan dengan cepat(pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi

dengan memberikan larutan untuk menghentikan

reaksi).


9/25

Alat & Bahan Yang DigunakanAlat paling utama yang digunakan dalam teknik

ELISA adalah microtiter.

Microtiter ini berupa suatu papan plastik dengancekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah

bawah dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini

terbuat dari bahan polistirena. Cekungan dari

microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter

0,7 cm. Berikut ini adalah gambarnya:


10/25

Bahan lainyang umum digunakandalam Teknik ELISA antara lain:Antigen yangdimurnikan(jika sampel yang

hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa

antibodi).

Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang

hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa

antigen).

Larutan standard (kontrol positif dan

negatif). Sampel yang ingin dites

Cairan pencuci (buffer).

Antibodi atau antigen yang tertaut dengan

enzim signal

Substrat yang bersifat spesifik terhadapenzim signal

ELISA reader (spektrofotometer) untuk

pengukuran kuantitatif.


11/25

MACAM-MACAM TEKNIK ELISA

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis,yaitu :

1. Teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugatantigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim

2. Teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan duaantibodi (primer dan sekunder).

Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua(sekunder)

akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai

signal.

Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai

teknik ELISA sandwich


12/25

ELISA DIRECT

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yangpaling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan

untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi

antigen pada sampel.

ELISA direct menggunakan suatu antibodispesifik (monoklonal) untuk mendeteksi

keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel

yang diuji


13/25

Pada ELISA direct

Pertama microtiter diisi dengan sampel yangmengandung

antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat

menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter

Kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen

yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter.

Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal

dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga

antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang

diinginkan,

Membilas microtiter untuk membuang antibodi tertaut

enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen.


14/25

Lalu, kedalam lubang-lubang microtiter ditambahkan

substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal,

sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang

telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akanbereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang

dapat dideteksi.

Pendeteksian interaksi antara antibodidengan antigen

tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakankolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point


15/25

ELISA direct memiliki beberapa kelemahan,antara lain:

Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang

akibat bertautdengan enzim. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu

danmahal.

Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim(label) dariantibodi pada percobaan yang berbeda.

Amplifikasi signal hanya sedikit.

Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harusdimurnikansebelum digunakan untuk uji ELISAdirect.Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:

Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenisantibodi

Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibatreaksi silangdengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapatdiminimalisasi.


16/25

ELISA Indirect

Pada Teknik ELISA indirect yang dideteksi dan

diukur konsentrasinya merupakan antibodi.

ELISA indirect menggunakansuatu antigen spesifik

(monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertautenzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi

yang diinginkan pada sampel yang diuji.


17/25

Pada ELISA indirect,

Pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandungantigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat

menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen

yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter.

Kemudian larutan sampel yang mengandung antibodiyang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubangmicrotiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifikdengan antibodi yang diinginkan.

Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuangantibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.


18/25

Lalu, ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yangberisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal,sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi

antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunderspesifik tertaut enzim signal.

Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodisekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksidengan antibodi spesifik.

Pada tahap akhir, ditambahkan substrat yang dapatbereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertautdengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksidengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan

substrat dan menimbulkans ignal yang dapat dideteksi


19/25

ELISA INDIRECTMEMILIKIBEBERAPAKELEMAHAN,

ANTARALAIN:

Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lamadaripada ELISA direct karena pada ELISA indirect

membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat

terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi

yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan

dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal,

Pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu

inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen

yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim

signal.


20/25

KELEBIHANDARI ELISA INDIRECTANTARA

LAIN

Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder

yang terjual secara komersial di pasar

Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target)

tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke

antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada

wadah berbeda.

Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi

yang diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa

berinteraksi dengan antibodi sekunder.


21/25

ELISA SANDWICH Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer

spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan

antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksikeberadaan antigen yang diinginkan.

Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip

dengan ELISA direct,

Hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yangdiinginkan tidak perlu dipurifikasi.


22/25

Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus

dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan

antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal,

Teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada

antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi

dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent

seperti polisakarida atau protein.

Pada ELISAsandwich, antibodi primer seringkali disebutsebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi

sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.


23/25

Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyakdimanfaatkanuntuk mendeteksi keberadaan antigenmultivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutandengan tingkat kontaminasi tinggi.

Hal ini disebabkan ELISAs andwich memiliki tingkatsensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibatkeharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengankedua antibodi.

Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan

yang mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodipenangkap tersebut dapat menempel pada bagian dindinglubang microtiter.

Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodipenangkap yang tidak menempel pada dinding lubang

microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang

diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter,sehingga terjadi interaksi antara antibodi penangkap denganantigen yang diinginkan.


24/25

Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuangantigen yang tidak berinteraksi denganantibodi penangkap.

Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yangberisi antibodi detektor, sehingga pada lubang microtitertersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkandengan antibodi detektor.

Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuangantibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodispesifik.

Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkansubstrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu

enzim yang tertaut pada antibodi detektor yang telahberinteraksi dengan antigen yang diinginkan akanbereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yangdapat dideteksi


25/25

Teknik Elisa

Documents

Transcript of Teknik Elisa