Pemeriksaan Kadar C-Peptida dengan metode ELISA

Oleh:Indah Puspa Dewi (1213015020)Josanti Pitri Sagala (1213015014)Muhammad Ardan (1213015037)

Nunuk Hidayanti (1213015035)Puji Rahayu (1213015019)

Definisi C-Peptida

C-peptida merupakan rantai tunggal 31 asam amino dengan berat molekul 3021 dalton (Da), menghubungkan polipeptida A dan B pada molekul proinsulin. Dalam proses biosintesa insulin, C-peptida dibentuk sebagai suatu prosuk bersama-sama dengan insulin oleh pemecahan proteolitik dari molekul precursor insulin, disimpan di dalam granul sekretori dalam kompleks golgi dari sel beta pancreas. Sedangkan proinsulin dipecah dari preproinsulin.

ELISA (Enzim-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA merupakan salah satu metode yang sensitif untuk mendeteksi antibodi, antigen, hormon maupun bahan toksik. Metode ini merupakan pengembangan dari sistem deteksi dengan imunofluorescence atau radioaktif. Dalam teknik ini beberapa enzim dapat dikonjugasi pada antigen dan antibodi. Dalam praktiknya, enzim yang dipilih menunjukkan kinetika sederhana, dan dapat diuji dengan prosedur sederhana. Pertimbangan lain dalam penggunaan teknik ini adalah murah, ketersediaan dan kestabilan substrat.

Macam-macam ELISA1. direct ELISA2. indirect ELISA 3. sandwich ELISA4. capture ELISA 5. sel ELISA

1. Direct ELISA

Direct ELISA adalah salah satu model ELISA yang langsung diikatkan antara antigen dan antibodi, dimana antibodi harus dilabel dahulu baru divisualisasi dengan cara menambahkan substrat

2.Indirect ELISA

Model ini dilakukan dengan cara melapiskan antibodi pada dasar mikroplate selanjutnya ditambahkan dengan antigen dan diinkubasi dalam waktu 45 menit pada temperature 37oC baru ditambahkan antibody monoclonal dan akhirnya ditambahkan substrat yang dilabel dengan enzim alkalin fosfatase atau peroksidase.

3. Sandwich ELISA

Sandwich ELISA adalah model tes ELISA yang menggunakan perangkat tiga macam antibodi. Antibodi pertama biasanya menggunakan antibody monoclonal yang dilapiskan pada mikroplate dan selanjutnya direaksikan dengan antigen. Setelah dilakukan pencucian baru ditambahkan antibodi kedua atau sampel serum yang akan dideteksi dan selanjutnya direaksikan dengan antibodi ketiga yaitu fragmen immunoglobulin anti immunoglobulin yang akan dideteksi.

4.Capture ELISA

Capture ELISA adalah model yang dikembangkan untuk deteksi IgM karena untuk deteksi IgM sering terjadi faktor negatif yaitu adanya faktor rheumatoid, sehingga sering terjadi positif palsu.

5. Sel ELISA

Sel ELISA dikembangkan untuk mendeteksi antigen atau agen yang terdapat dalam sel. Sehingga pada model ini tidak diperlukan pelapisan antigen pada mikroplate tetapi dengan cara fiksasi sel yang diinokulasikan sampel yang dideteksi agennya.

kolorimetri

Fluoresence

ANALISIS C-Peptida

1. Pra- Analitik2. Analitik3. Pasca- Analitik

1. Pra- Analitik

Menggunakan Serum darah puasa ataupun serum setelah stimulasi dengan glukosa atau glukagon yang diambil melalui vena.

Untuk serum darah puasa diambil setelah 6-12 jam puasa

2.AnalitikMaterial :1. Microwell Strips (96 wells)2. Enzyme Conjugate (11 mL): Anti-C-peptide Antibodies conjugated to

horseradish peroxidase. 3. Sample (11 mL) 4. Reference Standard Set (0.75 mL/each): Human C-PEPTIDE. References: 0.5,

2.5, 5, 10, 20 ng/mL. The Standard’s nature is not stable and should be stored tightly capped at –20C in aliquot. Once opened, it is stable for 5 days 4C.

5. Positive Control (0.75 mL)6. TMB Solution (11mL): Buffer solution containing hydrogen peroxide and TMB. 7. Washing Buffer Concentrate (100X) (10 mL): Prepare working washing

solution by adding 10 mL washing buffer concentrate into 990 mL distilled water.

8. Stop Solution: 2 N HCl. 9. Well holder .

Prosedur :1. Diambil darah dari venipuncture kemudian di sentrifuge

dan diambil serumnya.2. Diambil 25 µL ke dalam well3. Ditambahkan 100 µL enzym konjugat, diaduk selama 5

detik4. Diinkubasi 30 menit di dalam suhu ruangan5. Dicuci dengan washing buffer (300 µL/well)6. Ditambahkan 100 µL larutan TMB (tetrametil benzidin)7. Diinkubasi selama 15 menit dalam suhu ruangan8. Ditambahkan 50 µL larutan stop9. Dimasukkan dalam microwell reader, diatur dengan

panjang gelombang 450 nm

3. Pasca- Klinik

Nilai referensi kadar C-Peptida :1. Puasa : 0.78- 1.89 ng/mL (0.25- 0.6 nmol/L)2. Stimulasi glukosa dan glukagon :

2.73- 5.64 ng/mL (0.9- 1.87 nmol/L)3. Urine : 74 ± 26 µg/L (25 ± 8.8 µmol/L )

Terima Kasih……..