Sejarah ELISA

Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan

suatu immunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen

berlabel radioaktif atau antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas

memberikan sinyal, yang menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau

antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam

kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun

1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA)

immunosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode untuk deteksi cepat

antigen p24 HIV dalam sampel darah.

Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial,

alternatif yang lebih aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk

radioimmunoassay akan mengganti sinyal non-radioaktif di tempat sinyal

radioaktif. Ketika enzim (seperti peroksidase) bereaksi dengan substrat yang

sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine), perubahan warna

terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan

dengan keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa enzim harus

dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses menghubungkan secara

independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce. Karena itu perlu

untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau

antigen harus tetap ke permukaan wadah;. Yaitu, immunosorbent telah harus

dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan

Jerker Porath pada tahun 1966. 

Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas

Stockholm di Swedia, dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda

mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk

melakukan EIA / ELISA.

 

  Pengertian ELISAEnzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik

biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi

kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan

sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai

bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal

ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada

permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini

terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang

dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA

fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu disinarkan pada

suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah

antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk

antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi

pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene),

baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik

(melalui penangkapan oleh antibodi lain yang  spesifik untuk antigen yang sama,

disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi

ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat

berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi  secara langsung oleh antibodi

sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap,

plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan

protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam

plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel,

yang menunjukkan  kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama

menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru

mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISAELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu

sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi

konsentrasi  antibodi  dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk

mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri

makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu,

kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA  juga dapat digunakan dalam bidang

toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena

kepekaan tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan

diterapkan pada pelat yang antigen HIV yang terpasang. Jika antibodi terhadap

HIV hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat ini kemudian

dicuci untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi

sekunder" khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian

diterapkan ke piring, mencuci diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder secara

kimiawi terkait di muka untuk enzim.

"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA

Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah

antibodi sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan

katalisis oleh enzim mengarah ke perubahan pada warna atau fluoresensi. Hasil

ELISA dilaporkan sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini adalah

menentukan "cut-off" titik antara positif dan hasil negatif. Sebuah titik cut-off

dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika

tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50

ng / mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi analit standar

akan disiapkan. Diketahui bahwa menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada

sampel dikenal adalah "positif." Mereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang

"negatif." Dokter Dennis E Bidwell dan Alister Voller menciptakan tes.

Kegunaan lain dari ELISA meliputi:

1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.

2. deteksi rotavirus dalam tinja.

3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.

4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

  Tipe-tipe ELISAAda beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:

1.      Indirect ELISA

2.      Sandwich ELISA

3.      Competitive ELISA

 

  1.     Indirect ELISA

(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk

mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

a)      Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada

permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada

permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang

diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk

mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

b)      Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin

(BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini

dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik

dari protein lain ke plate.

c)      Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel

serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama

dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam

tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus

sama dengan antigen standar.

d)     Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji

dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen

terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau

protein yang terbloking.

e)      Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,

ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi

enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi

berkonjugasi dengan enzim.

f)       Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak

terikat.

g)      Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal

kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

h)      Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/

elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi

terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai

molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode

imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan

menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil

dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada

permukaan lubang.

  2.     Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

a)      Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’

b)      Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

c)      Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

d)     Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

e)      Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan  antigen

f)       Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan

berikatan dengan antibodi primer

g)      Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang

h)      Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/

berfluoresensi/ elektrokimia

i)        Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya

menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen

yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein

pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh

permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.

Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

  3.     Competitive ELISATahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang

telah dibahas sebelumnya, yaitu:

a)      Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

b)      Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah

dilapisi antigen

c)      Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam

sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel

pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

d)     Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi

sekunder ini berpasangan dengan enzim

e)      Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal

kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,

semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar

berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai

berikut:

http://pandalikespurple.blogspot.co.id/2012/04/test-elisa.html