7/30/2019 Teknik Elisa
1/25
Oleh :
Dr. Ir. Tri Dewanti W., M.Kes.
7/30/2019 Teknik Elisa
2/25
PENGUJIAN BIOASSAY
Metode In Vivo
dgn hewan percobaan
Pengujian Bioassay
Metode In Vitro
dgn darah dan cairanfisiologis (urin, fases,
saliva dll.) pd hewan dpt
dgn organ tubuh
7/30/2019 Teknik Elisa
3/25
Pengujian in vivo mulai bnyk ditinggalkan
krn pengorbanan mahluk hidup
Pengujian in vitro mengurangi penggunaan
hewan percobaan
Pengujian in vitro memerlukan pemahanan
fungsi anatomi, penggunaan model-model dan
ketrampilan analitik
Pemahanan fungsi anatomi perlu difahami
untuk medptkn biomarker yg sesuai
penggunaan kultur jaringan dgn parameterviabilitas dan enzimatis
7/30/2019 Teknik Elisa
4/25
Metode uji in vitro berdasarkan teknik kultur
- dgn media sintetik yg sesuai
- sesuai dgn kondisi fisiologis alamiahnya
- kondisi lingkungan yg steril
- peralatan yg memadai (inkubator CO2 hrs ada)
7/30/2019 Teknik Elisa
5/25
Teknik ELISAEnzim-linked immunosorbent assay
(ELISA) atau disebut sebagai uji penentuan
kadar imunosorben taut-enzim
Merupakan teknik pengujian serologi yang
didasarkan pada prinsip interaksi antaraantibodi dan antigen.
Pada awalnya, teknik ELISA hanya
digunakan dalam bidang imunologi untuk
mendeteksi keberadaan antigen maupunantibodi dalam suatu sampel seperti dalam
pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada
saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia
khususnya).
7/30/2019 Teknik Elisa
6/25
Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISATeknik ELISA memiliki beberapa kelebihan :
Teknik pengerjaan relatif sederhana. Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang
digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat
biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukuptinggi.
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan
antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat
rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara
antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik)
7/30/2019 Teknik Elisa
7/25
Kekurangan dari teknik ELISA antara lain:
Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji denganteknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal
(antibodi yang hanya mengenali satu antigen)
Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada
antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA inimembutuhkan biaya yang relatif cukup mahal.
7/30/2019 Teknik Elisa
8/25
Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat
terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif
yang menunjukkan respons positif yangdisebabkan inefektivitas dari larutan blocking
sehingga antibodi sekunder atau antigen asing
dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim
signal dan menimbulkan signal.
Reaksi antara enzim signal dan substrat
berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan
harus dilakukan dengan cepat(pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi
dengan memberikan larutan untuk menghentikan
reaksi).
7/30/2019 Teknik Elisa
9/25
Alat & Bahan Yang DigunakanAlat paling utama yang digunakan dalam teknik
ELISA adalah microtiter.
Microtiter ini berupa suatu papan plastik dengancekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah
bawah dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini
terbuat dari bahan polistirena. Cekungan dari
microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter
0,7 cm. Berikut ini adalah gambarnya:
7/30/2019 Teknik Elisa
10/25
Bahan lainyang umum digunakandalam Teknik ELISA antara lain:Antigen yangdimurnikan(jika sampel yang
hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa
antibodi).
Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang
hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa
antigen).
Larutan standard (kontrol positif dan
negatif). Sampel yang ingin dites
Cairan pencuci (buffer).
Antibodi atau antigen yang tertaut dengan
enzim signal
Substrat yang bersifat spesifik terhadapenzim signal
ELISA reader (spektrofotometer) untuk
pengukuran kuantitatif.
7/30/2019 Teknik Elisa
11/25
MACAM-MACAM TEKNIK ELISA
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis,yaitu :
1. Teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugatantigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim
2. Teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan duaantibodi (primer dan sekunder).
Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua(sekunder)
akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai
signal.
Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai
teknik ELISA sandwich
7/30/2019 Teknik Elisa
12/25
ELISA DIRECT
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yangpaling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan
untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi
antigen pada sampel.
ELISA direct menggunakan suatu antibodispesifik (monoklonal) untuk mendeteksi
keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel
yang diuji
7/30/2019 Teknik Elisa
13/25
Pada ELISA direct
Pertama microtiter diisi dengan sampel yangmengandung
antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat
menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter
Kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen
yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter.
Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal
dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga
antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang
diinginkan,
Membilas microtiter untuk membuang antibodi tertaut
enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen.
7/30/2019 Teknik Elisa
14/25
Lalu, kedalam lubang-lubang microtiter ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal,
sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang
telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akanbereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang
dapat dideteksi.
Pendeteksian interaksi antara antibodidengan antigen
tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakankolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point
7/30/2019 Teknik Elisa
15/25
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan,antara lain:
Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang
akibat bertautdengan enzim. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu
danmahal.
Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim(label) dariantibodi pada percobaan yang berbeda.
Amplifikasi signal hanya sedikit.
Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harusdimurnikansebelum digunakan untuk uji ELISAdirect.Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:
Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenisantibodi
Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibatreaksi silangdengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapatdiminimalisasi.
7/30/2019 Teknik Elisa
16/25
ELISA Indirect
Pada Teknik ELISA indirect yang dideteksi dan
diukur konsentrasinya merupakan antibodi.
ELISA indirect menggunakansuatu antigen spesifik
(monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertautenzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi
yang diinginkan pada sampel yang diuji.
7/30/2019 Teknik Elisa
17/25
Pada ELISA indirect,
Pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandungantigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat
menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen
yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter.
Kemudian larutan sampel yang mengandung antibodiyang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubangmicrotiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifikdengan antibodi yang diinginkan.
Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuangantibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.
7/30/2019 Teknik Elisa
18/25
Lalu, ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yangberisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal,sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi
antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunderspesifik tertaut enzim signal.
Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodisekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksidengan antibodi spesifik.
Pada tahap akhir, ditambahkan substrat yang dapatbereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertautdengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksidengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkans ignal yang dapat dideteksi
7/30/2019 Teknik Elisa
19/25
ELISA INDIRECTMEMILIKIBEBERAPAKELEMAHAN,
ANTARALAIN:
Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lamadaripada ELISA direct karena pada ELISA indirect
membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat
terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi
yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan
dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal,
Pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu
inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen
yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim
signal.
7/30/2019 Teknik Elisa
20/25
KELEBIHANDARI ELISA INDIRECTANTARA
LAIN
Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder
yang terjual secara komersial di pasar
Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target)
tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke
antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada
wadah berbeda.
Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi
yang diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa
berinteraksi dengan antibodi sekunder.
7/30/2019 Teknik Elisa
21/25
ELISA SANDWICH Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer
spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan
antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksikeberadaan antigen yang diinginkan.
Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip
dengan ELISA direct,
Hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yangdiinginkan tidak perlu dipurifikasi.
7/30/2019 Teknik Elisa
22/25
Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus
dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan
antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal,
Teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada
antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi
dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent
seperti polisakarida atau protein.
Pada ELISAsandwich, antibodi primer seringkali disebutsebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi
sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.
7/30/2019 Teknik Elisa
23/25
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyakdimanfaatkanuntuk mendeteksi keberadaan antigenmultivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutandengan tingkat kontaminasi tinggi.
Hal ini disebabkan ELISAs andwich memiliki tingkatsensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibatkeharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengankedua antibodi.
Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan
yang mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodipenangkap tersebut dapat menempel pada bagian dindinglubang microtiter.
Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodipenangkap yang tidak menempel pada dinding lubang
microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang
diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter,sehingga terjadi interaksi antara antibodi penangkap denganantigen yang diinginkan.
7/30/2019 Teknik Elisa
24/25
Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuangantigen yang tidak berinteraksi denganantibodi penangkap.
Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yangberisi antibodi detektor, sehingga pada lubang microtitertersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkandengan antibodi detektor.
Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuangantibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodispesifik.
Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkansubstrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu
enzim yang tertaut pada antibodi detektor yang telahberinteraksi dengan antigen yang diinginkan akanbereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yangdapat dideteksi
7/30/2019 Teknik Elisa
25/25
Top Related