pembahasan

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram NegatifBakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram PositifBakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.SifatBakteri garam (+)Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding selKandungan lipid rendah (1-4%)Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap penisilinLebih sensitifLebih tahan

Penghambatan oleh pewarna basa (VK)Lebih dihambatKurang dihambat

Kebutuhan nutrisiKebanyakan spesies relatif kompleksRelatif sederhana

Ketahanaa terhadap perlakuan fisikLebih tahanKurang tahan

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun.

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir

Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.

Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.

Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik kemudia dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di dalam gelas benda.

Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

1. PEMBAHASAN1.1 Analisa ProsedurPada Pratikum Mikrobiologi Dasar dengan materi pewarnaan gram yang pertama kali dilakukan adalah dipersiapkan alat dan bahan alat-alat yang digunakan antara lain mikroskop, cawan petri, objek glass, jarum loop, pipet tetes dan bunsen. Sedangkan bahan yang digunakan adalah NA, kristal ungu, iodium, etanol 70% , safranin 83dan aquadest.Langkah selanjutnya yaitu bakteri diambil dari media isolasi dengan menggunakan jarum loop karena apabila menggunakan jarum osedapat merusak media, jarum loop juga terlebih dahulu dipanaskan diatas bunsen agar kondisinya aseptis. Setelah itu disentuhkan pada medium yang tidak ada bakterinya karena jika kondisi terlalu panas bakteri bisa mati setelah itu diambil bakteri dan digoreskan pada kaca objek. Kemudian kaca objek difiksasi di bunsen untuk mengkondisikan aseptis dan untuk memperjelas struktur internal dan eksternal sel. Setelah fiksasi tetesi dengan larutan kristal ungu yang berfungsi sebagai zat warna primer dan didiamkan selama 1 menit, karena pada waktu 1 menit diasumsikan dinding sel bakteri sudah mengunci kristal ungu.Setelah itu dibilas dengan aquadest hal ini bertujuan agar kristal ungu yang dapat luntur dan untuk memperjelas pengamatan. Setelah dibilas dengan aquadest lalu ditetesi iodium dan dibiarkan selama 2 menit. Iodium berfungsi sebagai penguat warna kristal ungu dan didiamkan selama 2 menit. Perlakuan inidilakukan karena selama waktu tersebut diasumsikan telah cukup jelas memberikan warna ungu pada bakteri.Setelah itu dibilas lagi dengan aquadest hal ini bertujuan untuk membersihkan sisa iodium pada bakteri.Kemudian dicuci dengan menggunakan etanol 70 %, etanol berfungsi untuk melarutkan lemak. Kemudian dibilas kembali dengan aquadest, hal ini bertujuan untuk memperjelas pengamatan setelah itu ditetesi dengan menggunukan safranin, safranin disini berfungsi sebagai pewarna sekunder dan sebagai tanda bahwa bakteri tersebut merupakan gram negatif (-) lalu dibiarkan setengah menit karena waktu tersebut diasumsikan bahwa dinding sel telah mengunci safranin. Setelah itu dibilas dengan aquadest hal ini bertujuan untuk membilas safranin dan untuk memperjelas pengamatan.Kemudian preparat diamati di bawah mikroskop dan kemudian didokumentasikan.Perbedaan gram positif dan gram negatif adalah gram positif adalah organismeyang dapat menahan komplek pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel tampak biru gelap atau ungu). Sedangkan gram negatif adalah organisme yang kehilangan komplek warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarnaan tandingan safranin (sel tampak merah muda) (Hadioetomo, 1985).

1.2 Analisa HasilDalam pratikum mikrobiologi dasar materi pewarnaan gram diperoleh hasil pengamatan dari setiap kelompok yang disajikan dalam table berikut ini.

Tabel 9. Hasil Pengamatan Uji Warna BakteriKelompokJenis bakteri (gram positif/gram )Hasil uji warna

1Bakteri gram positifUngu


3Bakteri gram negativeMerah















18--







Dalam pewarnaan gram ada 2 kemungkinan yang akan terjadi yaitu menjadi warna ungu yang menunjukkan gram positif dan warna merah yang menunjukkan gram negatif. Warna ungu yang terdapat digram positif didapat karena pada saat bakteri ditetesi dengan etanol dinding selnya mengkerut. Sehingga saat diberi safranin ( pewarnaan sekunder ) bakteri tetap dapat mempertahankan warna primernya karena pengaruh ketebalan dinding, oleh karena itu disebut gram positif. Sedangkan gram negatif didapat karena pada saat bakteri ditetesi dengan etanol dinding selnya tidak dapat mengkerut dengan kuat karena strukturnya yang tipis., sehingga saat diberi safranin ( pewarnaan sekunder ) bakteri tidak dapat mempertahankan warna primernya, sehingga warna ungu pudar menjadi merah muda, oleh karena itu disebut gram negatif. Perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gam negatif terletak pada struktur dinding sel dan kandungan asam ribonukleatnya. Hasil yang diperoleh dari setiap kelompok mengenai pewarnaan gram bakteri berbeda beda. Ada yang jenis bakterinya gram (+) dan ada yang jenis bakterinya gram (-). Gram (+) berwarna ungu karena bakteri tersebut mengikat komplek zat warna kristal ungu, gram (-) berwarna merah karena mengikat zat warna sekunder. Jika sedian kemudian di cuci dengan air, lalu dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama zat warna tambahan terhapus, sehingga yang nampak ialah zat warna yang asli (ungu). Dalam hal ini sedian (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak, dalam hal ini sedian (bakteri) kita katakan gram negatif(Dwidjosaputro,2005)

Tabel 10. Mekanisme Penyerapan WarnaLarutan dan Urutan penggunaannyaReaksi dan Tampang Bakteri

Gram PositifGram Negatif

1. Ungu Kristal (UK)Sel berwarna ungu.Sel berwarna ungu.

1. Larutan Yodium (Y)Kompleks UK-Y terbentuk di dalam sel, sel tetap berwarna ungu.Kompleks UK-Y terbentuk di dalam sel; sel tetap berwarna ungu.

1. AlkoholDinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun, UK-Y tak dapat keluar dari sel; sel tetap ungu.Lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori mengembang, kompleks UK-Y keluar dari sel; sel menjadi tak berwarna.

1. SafraninSel tak terpengaruhi, tetap ungu.Sel menyerap zat pewarna ini, menjadi merah.

Bakteri yang diwarnai dalam pewarnaan gram ini dibagi menjadi 2 kelompok , salah satunya gram positif yang mempertahankan zat warna ungu kristal. Bakteri gram negatif kehilangan warna ungu Kristal ketika dicuci dengan alkohol dengan waktu diberi pewarnaan kandungan dengan safranin yang berwarna merah ( Zubaidah, 2006 ).

2. PENUTUP2.1 KesimpulanKesimpulan dari pratikum Mikrobiologi Dasar materi Pewarnaan Gram adalah Pewarnaan adalah umtuk membuktikan larutan dalam prosesnya yaitu zat warna penutup, zat warna lawan dan zat warna pelunturan warna. Pewarnaan dibedakan menjadi 3 yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, dan pewarnaan gram. Pewarnaan bertujuan untuk menjelaskan sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri Macam-macam pewarnaan yaitu pewarnaan tunggal, pewarnaan negatif, pewarnaan tahan gram dan pewarnaan struktur sel Bahan-bahan yang digunakan yaitu Kristal ungu, iodium, etanol 70%, dan safranin. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel yang tipis, dan kandungan lemak tipis Bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berbeda diantara dua lapis membran sel dan kandungan lemak tebal Tujuan difiksasi adalah untuk mematikan bakteri dan membuat lekat sel bakteri pada objek glass tanpa merusak strukturnya Pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna, dibedakan menjadi 2 yaitu gram positif dan gram negatif Contoh bakteri gram positif yaitu Bacillus Subtilis dan gram negatif contohnya E. Coli

Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatifditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarnaungu. 2. akteri gram positif ialah yang dapat mempertahankan warna kristal violet dan bentuk bakterinya berbentuk basil dan cocus. 3. Pada penyataan bakteri semua kelompok adalah mono pada semua sampel yang diteliti. 4. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. 5. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif. Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain: a. Pembuatan olesan bakteri b. Fiksasi c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. 6. Teknik pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu: a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin. .

pembahasan

Documents

Transcript of pembahasan