BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk mengenalkan mahasiswa dengan

beberapa pengujian biokimia yang digunakan untuk karakterisasi dan

identifikasi mikrobia.

1.2 Dasar Teori

Banyaknya oksigen di lingkungan menyebabkan kebanyakan bakteri

akan memproduksi hidrogen peroksida yang bersifat toksik terhadap bakteri

yang masih hidup, untuk menjaga kelangsungan hidupnya sejumlah bakteri

mampu menghasilkan enzim katalase yang memecah H2O2 menjadi air dan

oksigen sehingga sifat toksiknya hilang. Produk toksik H2O2 yang dipecah

menjadi H2O dan O2 dipecah menggunakan enzim katalase yang terdapat

secara luas dalam jaringan khususnya hati. Reaksi oksidase asam amino

bersifat reversibel, jika katalase tidak ada maka produk α asam keto akan

mengalami dekarboksilasi non enzimatik oleh H2O2 hingga terbentuk asam

karboksilat dengan kurang satu karbon (Murray, 1995).

E.coli yang tidak mengandung enzim katalase sangat rentan terhadap

kerusakan oksidatif. Superoksida dismutase merupakan adaptasi molekuler

yang penting terhadap paparan lingkungan oksigen. Kepentingan enzim ini

diperkuat oleh penemuan terakhir bahwa mutasi superoksida dismutase

menyebabkan sklerosis amiotrofik lateral (Strayer, 2000).

Hidrogen peroksidase yang terbentuk oleh superoksida dismutase

dan reaksi katalitik dari radikal hidroperoksil dimusnahkan oleh katalase,

suatu protein yang terdapat melimpah dan mengkatalisasi dismutasi

hidrogen peroksida menjadi air dan molekul oksigen. Katalase mempunyai

daya katalitik yang besar. Menempatkannya dalam golongan enzim elit

yang memperoleh kinetik sempurna. Peroksidase yang juga enzim hem.

Mengkatalisis reaksi analog yaitu reduksi alkil peroksida menjadi air dan

alkohol oleh suatu reduktan (AH2) dapat berupa sitokrom c atau askorbat

(Strayer, 2000).

Uji katalase akan positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-

gelembung oksigen yang menunjukkan bahwa organisme tersebut

menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang menghasilkan hidrogen

peroksida tersebut adalah bakteri aerobik dan anaerobik. Bakteri tersebut

dapat tetap hidup karena adanya antimetabolit yang dihasilkan oleh katalase

(Hadioetomo, 1993).

Asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, pepton

dan peptida. Triptofan merupakan asam amino yang penting untuk

mengetahui jenis bakteri tertentu karena beberapa bakteri mampu

menghidrolisa asam amino ini. Hasil hidrolisis triftofan adalah senyawa

indol yang dapat diamati dengan tes kalorimeter. Disamping terbentuknya

indol pada medium ini juga dapat diamati sulfat dan gerakan bakteri

(motilitas bakteri) (Murray, 1995).

Hidrogen sulfida (H2S) merupakan gas yang timbul sebagai hasil

penguraian protein dan senyawa-senyawa lain yang mengandung belerang.

Biasanya hasil itu tidak banyak, namun hal ini dapat diuji dengan indikator.

Pembusukan bangkai serta penguraian sulfat ditempat-tempat yang becek

menimbulkan banyak H2S. Bakteri yang banyak menghasilkan hidrogen

sulfida ialah Desulfovibrio desulfuricans (Dwidjoseputro, 2003).

H2S diproduksi oleh beberapa bakteri melalui pemecahan asam

amino yang mengandung unsur belerang seperti sistin dan metionin. H2S

juga dapat diproduksi melalui reduksi senyawa-senyawa belerang anorganik

misalnya tiosulfat, sulfit atau sulfat. H2S yang terjadi dapat diamati dengan

menambahkan garam-garam logam berat ke dalam medium. H2S akan

bereaksi dengan senyawa-senyawa ini membentuk logam sulfida yang

berwarna hitam (Schlegel, 1993).

Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen yaitu

zat pada jaringan penghubung dan tendon hewan. Gelatin akan terurai oleh

mikrobia yang mensintesis enzim proteolisis. Larutan gelatin bersifat cair

pada suhu  ruangan atau suhu kamar dan padat apabila berada dalam

refrigerator, apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikrobia akan bersifat

cair (Murray, 1995).

BAB II

METODE PRAKTIKUM

2.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, 2 Maret 2012, pukul

10.00-12.10 WITA, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lambung Mangkurat

Banjarbaru.

2.2 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah botol semprot, jarum inokulasi/ose,

bunsen, gelas objek, inkubator, tabung reaksi dan pipet tetes.

Bahan-bahan yang digunakan adalah biakan E. coli, biakan Bacillus

sp., biakan Staphylococcus aureus, medium Tryptone Broth (TB), medium

Triple Sugar Iron Agar (TSIA), medium Nutrient Gelatin (NG), larutan

H2O2 3%, reagent Ehrlich, alkohol 70%, kertas label, sil dan kapas.

2.3 Prosedur Kerja

2.3.1 Uji Katalase

1. Dibersihkan gelas objek dengan alkohol 70%.

2. Dinyalakan bunsen, dipanaskan jarum ose sampai panas memijar.

3. Dibiarkan jarum ose beberapa saat hingga sedikit dingin.

4. Diambil biakan bakteri (Eschericia coli dan Bacillus sp.) dengan jarum

ose sebanyak 1 ose.

5. Diratakan setipis mungkin di bagian tengah gelas benda dan dikering

anginkan.

6. Ditetesi larutan H2O2 3% sampai menutup seluruh suspensi bakteri.

7. Diamati adanya gelembung-gelembung O2 yang terbentuk dari hasil

kedua bakteri (Eschericia coli dan Bacillus sp.) tersebut pada gelas

objek.

2.3.2 Produksi Indol

1. Diinokulasikan biakan E. coli dan Bacillus sp. ke dalam media Tryptone

Broth.

2. Ditambahkan 0,5 ml reagen Ehrlich ke dalam setiap tabung.

3. Digunakan tabung yang berisi medium tanpa diinokulasikan sebagai

kontrol.

4. Diinkubasikan pada suhu 35 - 37C selama 24 jam.

5. Diamati perubahan yang terjadi dalam tabung, jika terbentuk cincin

berwarna merah keunguan maka ada senyawa indol yang terbentuk.

2.3.3 Produksi H2S

1. Diinokulasikan masing-masing bakteri (E. coli dan Bacillus sp.) ke dalam

medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dengan cara gores dan diakhiri

dengan tusuk tegak.

2. Digunakan tabung yang berisi medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

tanpa diinokulasikan sebagai kontrol.

3. Diinkubasikan pada suhu 30 - 35oC selama 24 - 48 jam.

4. Diamati terbentuknya H2S yang ditunjukkan oleh adanya warna hitam di

sepanjang tusukan.

5. Diamati pula perubahan warna pada medium tersebut akibat fermentasi

gula-gula dan adanya pembentukkan gas.

2.3.4 Hidrolisis Gelatin

1. Dipersiapkan tabung-tabung yang berisi Nutrient Gelatin.

2. Diinokulasikan biakan E. coli dan S. aureus ke dalam medium Nutrient

Gelatin.

3. Digunakan tabung-tabung Nutrient Gelatin tanpa diinokulasikan sebagai

kontrol.

4. Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 1 - 7 hari atau sampai reaksi

positif muncul.

5. Diuji adanya hidrolisis dengan cara membenamkan tabung yang berisi

biakan ke dalam es yang sedang mencair/potongan es.

6. Diamati kontrol dan gelatin yang tidak terhidrolisis akan tetap cair.

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

Hasil yang diperoleh dari praktikum yang telah dilaksanakan, yaitu

sebagai berikut :

Tabel 1.1 Hasil Pengamatan Uji KatalaseNo.

Bakteri Gambar Keterangan

1. E. coli 1

1. Positif () terbentuk

gelembung-gelembung

O2

2. Bacillus sp. 1

1. Positif () terbentuk

gelembung-gelembung

O2

Tabel 1.2 Hasil Pengamatan Produksi IndolNo.

Bakteri Gambar Keterangan

1. E. coli

1

2

Negatif (-) tidak

terjadi perubahan

Warna kuning keruh

1. Bakteri E. coli

2. Kontrol

2. Bacillus sp.

1 2

Negatif (-) tidak

terjadi perubahan

Warna kuning keruh

1. Bakteri Bacillus sp.

2. Kontrol

Tabel 1.3 Hasil Pengamatan Produksi H2SNo.

Bakteri Gambar Keterangan

1. E. coli 1 2

Negatif (-) tidak

terjadi perubahan

Warna coklat tua

1. Bakteri E. Coli

2. Kontrol

2. Bacillus sp.

1 2

Negatif (-) tidak

terjadi perubahan

Warna coklat tua

1. Bakteri Bacillus sp.

2. Kontrol

Tabel 1.4 Hasil Pengamatan Hidrolisis GelatinNo.

Bakteri Gambar Keterangan

1. E. coli 1 2

Positif () bakteri

terhidrolisis

1. Bakteri E. coli

2. Kontrol

2. S. aureus 1 2

Positif () bakteri

terhidrolisis

1. Bakteri S. aureus

2. Kontrol

3.2 Pembahasan

Praktikum kali ini membahas tentang pengujian sifat biokimia.

Melakukan identifikasi suatu mikrobia hasil isolasi, tidak cukup hanya

berdasarkan sifat morfologinya saja. Perlu pula diteliti sifat biokimianya.

Pengujian sifat biokimia adalah uji yang dilakukan untuk karakterisasi dan

identifikasi suatu mikrobia hasil isolasi dengan melihat sifat biokimianya

karena mikroba tertentu memiliki sifat khusus yang dapat memproduksi

maupun mereduksi senyawa-senyawa kimia. Pengujian sifat biokimia

merupakan suatu dasar yang digunakan untuk menentukan karakterisasi dan

klasifikasi sebagian besar mikrobia.

Praktikum kali ini menggunakan beberapa pengujian biokimia untuk

karakterisasi dan identifikasi mikrobia, yaitu uji katalase, produksi indol,

produksi H2S dan hidrolisis gelatin.

Uji katalase merupakan uji biokimia yang dilakukan untuk

membedakan mikroorganisme yang memiliki enzim katalase yang

digunakan untuk mendegredasi hidrogen peroksida yang bersifat toksik.

Katalase adalah enzim yang mengatalisis penguraian hidrogen peroksida

(H2O2) menjadi H2O dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel

karena bahan ini dapat menginaktivasikan beberapa jenis enzim dalam sel.

Uji katalase berguna dalam identifikasi kelompok bakteri aerobik,

bakteri anaerobik aerotoleran dan bakteri anaerobik fakultatif. Kebanyakan

bakteri aerobik dan anaerobik fakultatif yang menggunakan oksigen

menghasilkan hidrogen peroksida yang bersifat racun bagi sistemnya

sendiri, tetapi bakteri ini dapat bertahan dengan adanya antimetabolit yang

dihasilkan enzim katalase. Bakteri anaerob obligat akan mati jika ada

oksigen karena tidak adanya pembentukkan enzim katalase sehingga H2O2

meracuni bakteri tersebut.

Hasil pengamatan untuk uji katalase pada biakan E. coli dan Bacillus

sp. menunjukkan reaksi positif terhadap uji katalase. Hal tersebut dapat

dilihat dari adanya gelembung-gelembung O2 yang dihasilkan setelah kedua

bakteri tersebut ditetesi dengan larutan H2O2 3%. Gelembung-gelembung ini

terjadi sebagai hasil perombakan hidrogen peroksida (H2O2) dengan bantuan

enzim katalase. Adapun reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:

H2O2 enzim katalase

→H2O + ½ O2 (g) (Lay, 1994).

Berdasarkan literatur uji katalase akan positif ditandai dengan

terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang menunjukkan bahwa

organisme tersebut menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang

menghasilkan hidrogen peroksida tersebut adalah bakteri aerobik dan

anaerobik. Bakteri tersebut dapat tetap hidup karena adanya antimetabolit

yang dihasilkan oleh katalase (Hadioetomo, 1993).

Uji produksi indol merupakan uji biokimia yang dilakukan untuk

mengetahui apakah dalam proses pertumbuhan bakteri dapat memproduksi

indol dari asam amino esensial triptofan. Senyawa indol adalah hasil

hidrolisis triftofan. Asam amino triptofan merupakan komponen asam

amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan

mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme dari penguraian protein.

Bakteri menguraikan triptofan membentuk asam piruvat yang kemudian

dapat digunakan sebagai sumber energinya.

Hasil pengamatan untuk uji produksi indol pada biakan E. coli dan

Bacillus sp. menggunakan media Trytone Broth (TB) menunjukkan reaksi

negatif. Hal tersebut diketahui setelah kedua bakteri tersebut diinkubasi

pada suhu 35-370C selama 24 jam dan setelah ditetesi 0,5 ml reagen Ehrlich

tidak terjadi perubahan, tidak ada timbul cincin berwarna merah keunguan,

warnanya tetap kuning keruh.

Bakteri tertentu seperti Escherichia coli mampu menggunakan

triptofan sebagai sumber karbon. Adapun reaksi yang terjadi adalah sebagai

berikut:

(Lay, 1994).

Berdasarkan literatur uji produksi indol yaitu isolat bakteri

diinokulasi ke dalam medium Tryptone Broth (TB) pada tabung reaksi

secara aseptik, diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam, setelah

diinkubasi ditetesi dengan 10 tetes reagen Kovac’s dan uji akan positif

merupakan indikasi bahwa bakteri mampu memecah asam amoni triptofan

dengan pembentukan warna merah pada permukaan medium (Hadioetomo,

1993).

Uji produksi H2S (hidrogen sulfida) merupakan uji biokimia yang

dilakukan untuk mengetahui apakah dalam proses pertumbuhan bakteri

dapat memproduksi H2S. H2S diproduksi oleh bakteri melalui pemecahan

asam amino yang mengandung belerang atau melalui reduksi senyawa-

senyawa belerang anorganik. H2S yang terjadi dapat diamati dengan

menambahkan garam-garam logam berat ke dalam medium. H2S akan

bereaksi dengan senyawa-senyawa tersebut membentuk logam sulfida yang

berwarna hitam.

Hasil pengamatan untuk uji produksi H2S pada biakan E. coli dan

Bacillus sp. menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dengan

cara gores dan diakhiri dengan tusuk tegak menunjukkan reaksi negatif. Hal

tersebut diketahui setelah kedua bakteri tersebut diinkubasi pada suhu 30-

350C selama 24 jam tidak terjadi perubahan dan tidak ada warna hitam di

sepanjang tusukan, warnanya tetap coklat tua.

Pembentukan H2S oleh mikroorganisme menunjukan adanya

penguraian asam amino yang mengandung sulfur. Produksi H2S merupakan

langkah awal di dalam proses deaminasi sistein dari protein yang

mengandung gugus sulfur seperti pada reaksi berikut:

CH2SH CH2 CH3 CH3

H—C—NH2 H2S + C—NH2 C = NH C = O + NH2

COOH COOH COOH COOH

Sisitein Asam Asam Asam

α-amino amino piruvat

akrilat

(Cappuccino & Sherman, 1992).

Berdasarkan literatur untuk uji produksi H2S yaitu isolat bakteri

diinokulasi ke dalam medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dalam tabung

reaksi secara vertikal pada bagian buut dan secara streak pada bagian slant.

Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 - 48 jam dan diamati perubahan yang

terjadi pada medium. Indikator terbentuknya H2S dengan adanya warna

H2O

hitam pada medium dan terbentuknya gas ditandai dengan pecahnya

medium di bagian ujung bawah tabung reaksi (Hadioetomo, 1993).

Uji hidrolisis gelatin merupakan uji biokimia yang dilakukan untuk

mengetahui kemampuan bakteri dalam membentuk enzim semacam

proteolitik (gelatinase) yang dapat menghidrolisis gelatin. Gelatin adalah

protein yang diperoleh ketika proses merebus tulang rawan atau jaringan

ikat hewan lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk gel.

Hasil pengamatan untuk uji hidrolisis gelatin pada biakan E. coli dan

Staphylococcus aureus menggunakan media Nutrient Gelatin (NG)

menunjukkan reaksi positif. Hal tersebut diketahui setelah kedua bakteri

tersebut diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam dan tabung yang berisi

biakan bakteri tersebut dibenamkan dalam potongan es batu, hasilnya kedua

bakteri tersebut mampu mencairkan gelatin.

Hidrolisis gelatin oleh mikroorganisme dikatalisasikan oleh enzim

gelatinase. Gelatin yang telah dicerna oleh mikroba tidak dapat membentuk

gel dan akan berwujud cair.

Gelatingelatinase→

peptida-peptida kecil (Lay, 1994).

Berdasarkan literatur untuk uji hidrolisis gelatin yaitu biakan

diinokulasi pada media Nutrient Gelatin (NG) dengan cara menusukkan

mikroba yang akan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan

media, kemudian diinkubasi pada suhu 350C selama 24 jam. Media gelatin

yang mencair menunjukkan uji positif. Namun jika tidak mencair maka di

inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 350C. Hasil uji negatif, jika

setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun (Lay, 1994).

Larutan H2O2 3% digunakan dalam uji katalase. Larutan H2O2 3%

berfungsi sebagai pereaksi penentu (reagen uji) adanya enzim katalase pada

suatu bakteri dengan adanya reaksi gelembung-gelembung gas O2.

Sedangkan reagen Ehrlich digunakan dalam uji produksi indol. Reagen

Ehrlich berfungsi sebagai pereaksi (reagen uji) adanya produksi indol hasil

hidrolisis dari triptofan oleh bakteri. Penambahan reagen Ehrlich dalam

media biakan dapat mengetahui adanya penumpukan senyawa indol,

ditandai dengan terbentuknya warna merah keunguan di lapisan bawah

media.

BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum ini adalah sebagai berikut:

1. Pengujian sifat biokimia merupakan suatu dasar yang digunakan untuk

menentukan karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikrobia.

2. Uji katalase pada biakan E. coli dan Bacillus sp. menunjukkan reaksi

positif dengan adanya gelembung-gelembung O2.

3. Uji produksi indol pada biakan E. coli dan Bacillus sp. menggunakan

media Trytone Broth (TB) menunjukkan reaksi negatif, tidak ada timbul

cincin berwarna merah keunguan dan warnanya tetap kuning keruh.

4. Uji produksi H2S pada biakan E. coli dan Bacillus sp. menggunakan

media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) menunjukkan reaksi negatif, tidak

ada warna hitam di sepanjang tusukan, warnanya tetap coklat tua.

5. Uji hidrolisis gelatin pada biakan E. coli dan Staphylococcus aureus

menggunakan media Nutrient Gelatin (NG) menunjukkan reaksi positif,

kedua bakteri tersebut mampu mencairkan gelatin.

4.2 Saran

Sebaiknya praktikan dapat berhadir pada saat pengamatan, sehingga

dapat mengetahui secara jelas perubahan yang terjadi pada setiap perlakuan.

DAFTAR PUSTAKA

Capuccino, J.G & Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. The Benjamin/Cummings Publish. USA.

Dwidjoseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan. Jakarta.

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Murray, R.K. 1995. Biokimia Harper Edisi 22. Buku Kedokteran ECG. Jakarta.

Schlegel. 1993. General Microbiology. Cambrige University Press. Australia.

Strayer, L. 2000. Biokimia Vol 2. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.