Mikrobiologi adalah ilmu pengetahuan yang mempelajari berbagai kehidupan makhluk kecil yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop. Bakteri sebagai mikroorganisme memiliki kemampuan untuk beradaptasi di berbagai habitat. Pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri dipengaruhi oleh beberapa hal, misalnya tingkat kandungan air (water activity) dan nutrisi yang diperoleh dari lingkungannya.

Tujuan dari Praktikum Mikrobiologi ini adalah untuk mengetahui cara-cara mensterilkan alat dan bahan, mengetahui cara pembuatan medium dan larutan pengencer dengan komposisi yang tepat, mengetahui cara menghitung jumlah mikroba, mengetahui cara pewarnaan Gram pada mikroba serta bentuk dan struktur mikroba yang terdapat dalam sampel. Manfaat Praktikum Mikrobiologi umum ini adalah agar dapat mengetahui proses pertumbuhan dan perkembangan mikroba dalam bahan pakan dimana mikroba mempunyai banyak hubungan dan peranan yang sangat penting dalam kehidupan makhluk hidup.

2.1. Sterilisasi

Cara aseptik yang harus dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi merupakan cara kerja dimana terjadinya kontaminasi oleh mikroba lain yang tidak dikehendaki dicegah semaksimum mungkin, sedangkan substansi mikroba yang dikehendaki dipertahankan semaksimum mungkin (Fardiaz, 1989). Sterilisasi menurut pengertian medis merupakan suatu proses dengan metode tertentu dapat memberikan hasil akhir berupa suatu bentuk keadaan yang tidak dapat ditunjukkan lagi adanya mikroorganisme hidup. Metode sterilisasi cukup banyak, namun alternatif yang dipilih sangat bergantung pada keadaan dan kebutuhan. Sterilisasi merupakan kegiatan khusus yang mengelola peralatan steril yang siap pakai (Darmadi, 2008).

Mikroorganisme memiliki kerentanan berbeda terhadap bahan-bahan yang digunakan untuk mematikannya. Terdapat perbedaan antara beberapa jenis tergantung dari kadar air dan pH lingkungan, dan dari umur sel atau spora dan seterusnya (Schlegel, 1994). Metode panas kering memiliki prinsip dasar mekanisme konduksi, panas akan diabsorpsi oleh permukaan luar dari peralatan yang disterilkan. Lalu merambat ke bagian yang lebih dalam dari peralatan tersebut sampai suhu untuk sterilisasi tercapai secara merata. Mikroba terbunuh dengan cara oksidasi, dimana protein mikroba akan mengalami koagulasi. Sterilisasi ini menggunakan udara panas pada sebuah alat yang disebut oven. Suhunya dapat mencapai 160-180⁰ C, membutuhkan waktu 1-2 jam dan digunakan untuk sterilisasi alat-alat dari gelas seperti tabung reaksi, labu, cawan petri, dan sebagainya (Darmadi, 2008).

Masa sterilisasi dengan metode basah untuk mematikan spora bakteri yang mewakili jenis bakteri yang amat tahan terhadap pemanasan dalam reduksi maksimal. Suhu uap di bawah tekanan tergantung pada tekanan. Kalau masih ada udara, suhu yang sesuai dengan tekanan tertentu jauh lebih rendah. Pematian dengan sterilisasi basah tergantung pada tinggi suhu dan tidak pada besar tekanan, maka penghilangan udara sebelum autoklaf ditutup harus dilakukan secara teliti (Schlegel, 1994). Medium cair disterilkan dengan metode sterilisasi basah menggunakan alat yang bernama autoklaf pada suhu 121⁰C, tekanan 2 atm, dan selama 10-15 menit (Suwahyono, 2009).

2.2. Medium dan Larutan Pengencer

Bakteri dapat berproliferasi sangat cepat apabila lingkungannya cocok, baik dalam habitat alami atau kultur di laboratorium. Bakteri sangat mudah beradaptasi, baik dalam pengertian adaptasi evolusioner melalui seleksi alam, maupun dalam pengertian proses fisiologis terhadap perubahan lingkungan oleh masing-masing bakteri. Sel bakteri membelah diri dengan pembelahan biner, yang didahului oleh replikasi kromosom bakteri (Campbell et al., 2002). Komponen medium untuk pertumbuhan jasad renik dapat berupa campuran bermacam-macam mineral anorganik yang konsentrasinya tertentu maupun berupa bahan-bahan organik (Yuwono, 2008).

Mikroorganisme memiliki kerentanan berbeda terhadap bahan-bahan yang digunakan untuk mematikannya. Terdapat perbedaan antar beberapa jenis tergantung dari kadar air dan pH lingkungan, dan dari umur sel atau spora dan seterusnya (Schlegel, 1994). Medium merupakan media yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba. Medium dibedakan menjadi tiga, yaitu medium cair yang dapat digunakan untuk berbagai tujuan termasuk menumbuhkan atau membiakkan mikroba, fermentasi, misalnya Nutrient Broth, dan Glucose Broth. Medium padat misalnya Nutrient Agar, Plate Count Agar dan Potato Dextrose Agar yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaannya sehingga membentuk koloni yang dapat dihitung atau diisolasi. Medium setengah padat yang memiliki konsistensi di antara medium cair dan medium padat. Larutan pengencer mengandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion dari tubuh mikroba (Fardiaz, 1989).

Agar merupakan campuran agarosa dan agaropektin. Agar tidak dipengaruhi oleh berbagai mikroorganisme. Hanya saja dapat diisolasi beberapa bakteri dari air laut dan ganggang laut yang dapat menghisrolisis agar (Schlegel, 1994). Agar merupakan suatu jenis karbohidrat kompleks yang diisolasi dari alga. Agar membentuk matriks padat serupa gelatin (Elrod dan Stansfield, 2006).

Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan suatu medium yang mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup, yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa, sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi krang baik untuk pertumbuhan bakteri. Akan tetapi karena beberapa bakteri juga memfermentasi karbohidrat dan menggunakannya sebagai sumber energi, maka beberapa bakteri masih mungkin tumbuh pada PDA (Fardias, 1993). Terdapat lusinan medium pertumbuhan untuk inokulasi biakan aerobik. Pemilihan medium sesuai sifat spesimen atau tempat asal spesimen diambil. Suhu inkubasi standar untuk biakan bakteri aerobik adalah 35-37⁰C. Pencegahan biakan rusak oleh pertumbuhan spesies-spesies lain yang lebih cepat berkembangbiak selama inkubasi dapat dilakukan dengan pemberian bahan kimia untuk mematikan kontaminan secara selektif (Sacher dan McPherson, 2004).

Selain menyediakan nutrien yang sesuai untuk kultivasi bakteri, juga perlu disediakan kondisi fisik yang memungkinkan pertumbuhan optimum untuk bakteri. Suhu mempengaruhi laju pertumbuhan dan jumlah total pertumbuhan mikroorganisme pada suatu medium. pH optimum pertumbuhan bagi kebanyakan bakteri antara 6,5-7,5, namun beberapa spesies mikroba dapat tumbuh dalam keadaan pH sangat asam atau sangat basa. Gas-gas utama yang mempengaruhi pertumbuhan

bakteri ialah oksigen dan karbondioksida. Apabila medium dibuat dengan cara penuangan agar dalam, maka difusi oksigen dari udara melalui medium menjadi terhambat, sehingga daerah didasar medium tidak mengandung oksigen (aerobik) (Pelczsar dan Chan, 1986). Bakteri yang tumbuh di atas agra atau pada lapis tipis cairan yang berkontak dengan udara, biasanya mendapat suplai oksigen yang cukup. Mikroorganisme hanya dapat mengolah oksigen yang terlarut. Mikroorganisme menunjukkan perbedaan yang signifikan dari segi tuntutan keperluan akan kadar air. Mikroorganisme dapat tumbuh pada aiktivitas air dari 0,998 sampai 0,6 (Schlegel, 1994).

2.3. Metode Hitungan Cawan

Metode hitungan cawan tidak berdasarkan jenis mikroorganisme, tatapi secara kasar terhadap kelompok atau golongan besar mikroorganisme umum atau terhadap bakteri tertentu (Suriawiria, 1993). Pertumbuhan pada bakteri didefinisikan pada pertambahan berat sel. Karena berat sel relatif sama pada setiap siklus sel, maka pertumbuhan mikroba dapat didefinisikan sebagai pertambahan jumlah sel (Purwoko, 2007).

Setiap koloni dapat dianggap berasal dari satu sel yang membelah menjadi banyak sel. Penghitungan jumlah koloni dapat menggunakan rumus : jumlah koloni x 1/faktor pengenceran. Hasil penghitungan menggunakan dua angka. Apabila koloni yang terhitung kurang dari 30 koloni, hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Apabila koloni yang terhitung jumlahnya lebih dari 300, maka jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggilah yang dihitung. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30-300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingannya lebih dari 2, yang digunakan adalah pengenceran yang paling kecil (Fardias, 1993). Jumlah sel hidup yang dihitung adalah jumlah koloni yang berasal dari sel-sel yang mampu terus hidup pada kondisi pertumbuhan yang menguntungkan (Schlegel, 1994).

Jumlah kapang dan khamir di dalam contoh makanan dapat dihitung dengan metode hitungan cawan dapat menggunakan medium Potato Dextrose Agar (PDA) (Fardias, 1993). Sesuai dengan namanya, teknik ini adalah teknik menyebar sampel (yang telah diencerkan) diatas permukaan pelat agar dalam cawan petri. Umumnya antara 0,1 ml dan 1 ml sampel disebarkan di permukaan media padat dengan menggunakan tangkai gelas steril. Cawan kemudian diinkubasi dalam kurun waktu tertentu dan jumlah koloni yang muncul dihitung. Hasil yang baik adalah cawan petri yang mengandung koloni berkisar antara 30-300 koloni (Harmita dan Radji, 2006).

Mikroorganisme dibiakkandi laboratorium pada bahan nutrient yang disebut medium (Pelcszar dan Chan, 1986). Agar hasil yang didapatkan semaksimal mungkin mendekati keadaan alami, pengenceran dapat dilakukan sampai ke nilai tertinggi, umumnya 10-10. Dengan pengenceran tertinggi perhitungan jumlah sel berdasarkan koloni ataupun pewarnaan jauh lebih baik hasilnya kalau dibandingkan dengan pengenceran rendah (Suriawiria, 1993).

Suspensi dapat disebarkan pada permukaan pelat agar atau dicampur dengan agar cair, yang kemudian dituangkan di dalam cawan petri dan dibiarkan memadat. Pelat agar tersebut kemudian

diinkubasi pada kondisi yang memungkinkan mikroorganisme untuk bereproduksi dan membentuk koloni yang terlihat tanpa bantuan mikroskop. Dengan menghitung jumlah koloni dan memperhitungkan faktor pengenceran, jumlah bakteri pada sampel asal dapat ditentukan. Kelemahan utama metode tersebut adalah keselektifan sehingga hasil perhitungan kadang kala bias. Kondisi pertumbuhan, termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan pH sangat menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh ari seluruh populasi yang ada (Harmita dan Radji, 2006). Kultur diencerkan sampai batas yang diinginkan (lebih tinggi pengenceran lebih baik), kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi satu koloni beberapa saat berikutnya, misalnya 4-12 jam. Akan tetapi cara ini memiliki keterbatasan, yaitu jumlah sel yang terhitung biasanya lebih kecil dari sebenarnya (kemungkinan besar satu koloni dapat berasal dari dua sel) dan tidak dapat diaplikasikan pada bakteri yang pertumbuhannya lambat. Pada metode ini, yang perlu diperhatikan adalah jumlah sel bakteri harus mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencernannya. Jika tidak, maka perhitungan dianggap gagal (Purwoko, 2007).

Metode hitungan cawan pada bakteri ditentukan berdasarkan penanaman bahan dalam jumlah dan pengenceran tertentu ke dalam media yang umum untuk bakteri (Suriawiria, 1993). Terdapat empat fase pertumbuhan bakteri ketika ditumbuhkan pada kultur curah (batch culture), yaitu fase adaptasi, fase perbanyakan, fase statis dan fase kematian. Proses adaptasi meliputi sintesis enzim baru yang sesuai dengan medianyadan pemulihan terhadap metabolit yang bersifat toksik (misalnya asam, alkohol, dan basa) pada media sebelumnya. Pada fase ini belum dijumpai penambahan sel, akan tetapi terjadi penambahan volume sel. Pada fase perbanyakan jumlah sel meningkat sampai batas tertentu. Sel melakukan konsumsi nutrien pada proses fisiologis lainnya. Pada fase statis, biasanya sel melakukan adaptasi terhadap kondisi yang kurang menguntungkan. Adaptsi ini dapat menghasilkan senyawa yang diinginkan manusia misalnya antibiotika dan antioksidan. Penyebab utama kematiaan adalah autolisis sel dan penurunan energi seluler (Purwoko, 2007).

2.4. Pewarnaan Gram

Cara pewarnaan Gram diciptakan pertama kali tahun 1884 oleh seorang ahli bakteriologi yang bernama Christian Gram. Cara pewarnaan ini merupakan cara pewarnaan diferensial, dimana dengan cara ini bakteri dapat dibedakan menjadi dua grup yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Fardiaz, 1989). Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan di dalam air dan dilihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna yang kontras dengan medium di sekelilingnya (Sacher dan McPherson, 2004).

Sebelum dilakukan pewarnaan, maka sel-sel bakteri harus terlebih dahulu difiksasi pada gelas objek. Jika kultur diambil dari medium cair, maka penyebaran dapat langsung dilakukan diatas kaca objek yang bersih menggunakan jarum loop atau jarum ose. Tetapi jika kultur diambil dari agar padat, maka sebelumnya diatas kaca objek harus diberi setetes air, kemudian kultur diambil sedikit menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, dan diratakan di atas kaca objek sehingga terbentuk lapisan tipis. Bakteri Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Steptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positif. Sedangkan bakteri E. coli, Enterobacter aerogenes, dan Pseudomonas tergolong bakteri gram negatif (Fardiaz, 1989). Pada proses ini yang harus dihindari adalah fiksasi panas berlebihan, yang dapat merusak integritas struktural bakteri dan morfologi sel. Alasan keberhasilan metode pewarnaan Gram adalah bahwa mikroorganisme yang tidak diwarnai,

dan bakteri terwarnai dapat dibedakan berdasarkan perbedaan struktur dinding selnya. Bakteri gram positif terwarnai ungu memiliki dinding sel yang tebal, dan bakteri gram negatif yang terwarnai merah memiliki dinding sel yang relatif tipis, dilapisi oleh membran luar yang mengandung lipopolisakarida. Etanol merupakan decolorizer yang lebih lambat dibandingkan dengan aseton (Sacher dan McPherson, 2004).

Bakteri gram positif adalah bakteri yang memepertahankan zat warna gram A yang mengandung kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri negatif akan berwarna merah atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat warna gram D (safranin) (Brooks et al., 2001).

Ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus. Ujung beberapa basilus tampak persegi, yang lain bundar, dan yang lain lagi meruncing atau lancip seperti ujung cerutu. Kadang-kadang basilus tetap saling melekat satu dengan lainnya, ujung dengan ujung, sehingga memberikan penampilan rantai. Kokus memperlihatkan penataan yang berbeda-beda, diplokokus : sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan. Streptokokus : sel membelah diri pada satu bidang dan tetap melekat membentituk rantai, tetrakokus : sel membelah diri pada dua bidang dan membentuk kelompok yang terdiri dari empat sel. Stafilokokus : sel membelah diri pada tiga bidang dan membentuk gerombolan kokus, sarsina : membentuk kubus (Pelcszar dan Chan, 1986). Bakteri terdapat dalam berbagai bentuk : basilus (seperti batang), kokus (bentuk bulat), spirilus (spiral), spiroketa (ulir atau heliks) dan bercabang. Karena sel-sel individual bakteri terlampau kecil, sehingga memiliki variasi dalam bentuk dan ukuran (Elrod dan Stansfield, 2006).

MATERI DAN METODE

Praktikum Mikrobiologi dilaksanakan pada hari Selasa, 3 Mei 2011 pada pukul 09.00-14.00 WIB dan Rabu, 4 Mei 2011 pada pukul 13.00-15.00 WIB di Laboratorium Fisiologi dan Biokimia Ternak Fakultas Peternakan Universitas Diponegoro Semarang.

Materi

Praktikum Sterilisasi, medium dan larutan pengencer, metode hitungan cawan, dan pewarnaan gram menggunakan bahan antara lain Nutrient Broth yang dugunakan untuk pembuatan Nutrient Agar (NA), agar, kentang, dendeng, aquades, larutan alkohol, larutan lugol, asam tartarat, ungu violet, etanol 95 %, safranin, dextrose, dan kapas. Alat-alat yang digunakan dalam praktikum adalah tabung reaksi yang digunakan untuk tempat larutan, cawan petri sebagai tempat penumbuhan media, erlenmeyer untuk menampung larutan, labu ukur untuk mengukur larutan, pipet ukur untuk mengambil larutan dengan akurat, kertas saring digunakan untuk menyaring filtrat yang akan digunakan, mikroskop untuk mengamati bakteri gram positif dan negatif, alumunium foil untuk

penutup saat mensterilkan sampel cair, mikropipet dan tip 1 ml, pengaduk magnetik untuk menghomogenkan larutan, colony counter untuk memudahkan penghitungan koloni setelah diinkubasi, inkubator untuk menginkubasi mikroba pada suhu yang terkontrol, autoklaf untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan menggunakan uap air panas bertekanan, api bunsen digunakan untuk pemijarn jarum ose atau jarum inokulum sebagai pemindah biakan ke media baru, kaca objek untuk meletakkan sampel yang akan diamati pada pewarnaan gram, tissue untuk membersihkan sisa aquades pada kaca objek, dan alat tulis untuk mencatat hasil praktikum.

Metode

Sterilisasi

Sterilisasi kering bertujuan untuk mensterilkan alat-alat yang akan digunakan dengan cara menyiapkan cawan petri, kemudian membersihkan cawan petri dengan alkohol dan membungkus cawan petri dengan kertas pembungkus. Bersihkan pipet hisap dan sumbat bagian pangkal pipet dengan kapas, kemudian bungkus pipet dengan kertas. Memasukkan cawan petri dan pipet ke dalam oven selama 1 jam pada suhu 1700 C atau 2 jam selama 160°C. Setelah selesai cawan petri dikeluarkan dari oven dan menunggu hingga dingin sebelum digunakan.

Sterilisasi basah bertujuan untuk menseterilkan medium dan bahan. Memasukkan medium yang akan disterilkan ke dalam erlenmeyer, kemudian menutup rapat dengan menggunakan kapas. Menyiapkan 10 tabung reksi yang masing-masing terisi aquades 9 ml dan menyumbatnya dengan kapas. Memasukkan erlenmeyer dan tabung reaksi tersebut ke dalam autoklaf, kemudian menutup autoklaf dengan rapat. Menyalakan autoklaf dan menunggu hingga manometer serta termometer menunjukkan suhu 1210 C dan 2 atm selama 15 menit. Membuka katup pengaman setelah selesai dan biarkan hingga autoklaf tidak lagi bertekanan dan mengeluarkan mediumnya.

Medium dan Larutan Pengencer

Medium Nutrient Agar (NA) dibuat dengan menyiapkan 1,5 gr agar dan 1,3 gr NB dan 100 ml aquades memasukkannya ke dalam gelas erlenemeyer dan mencampur keduanya dengan alat pengaduk. Kemudian tutup gelas enlemeyer dengan alumunium foil, memasukan larutan agar tersebut ke dalam autoklaf sampai batas yang ditentukan, kemudian meniriskan larutan agar, setelah itu baru dapat digunakan sebagai medium. Sedangkan Potato Dextrose Agar (PDA) dibuat dengan cara mengupas kentang dengan ukuran 1x1x1 cm sebanyak 75 gr. Memasukkan kentang ke dalam bekerglass dan menambahkan 150 ml aquades, kemudian menutup bekerglass dengan aluminium foil. Mengambil filtrat kentang dengan cara menyaringnya menggunakan kain saring. Membuat medium PDA dengan komposisi 60 ml filtrat kering, 1,2 gr dextrose, 1,2 gr agar dengan pH

diatur 6,8-7,2. Sterilkan medium PDA dan larutan asam tartarat 10% ke dalam autoklaf pada suhu 1210 C, 2 atm selama 30 menit. Setelah steril memasukkan medium PDA ke dalam inkubator bersuhu 500 C. Setelah keduanya mencapai suhu 50°C menambahkan dengan pipet ukur steril larutan asam tartarat 10% kedalam medium PDA secara aseptis.

Larutan pengencer memerlukan perlakuan pengenceran pada bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml. Menimbang irisan dendeng sekitar 200 gr lalu melarutkannya dengan air pada erlenmeyer yang sudah disterilisasikan menggunakan pengaduk magnetik. Perlakuan pengenceran dilakukan sebelum mencampurkan bahan dengan medium agar atau medium lain di dalam cawan petri, sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah terbaik adalah diantara 30 – 300 koloni. menggunakan larutan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer pospat, larutan garam fisiologis 0,85 %, larutan ringer maupun aquades.

3.2.3. Metode Hitungan Cawan

Metode Tuang dengan menyiapkan larutan sebanyak 1 ml atau 0,1 ml tersebut di pipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet 1 ml menuangkan ke dalam cawan petri tidak boleh lebih dari 30 menit. Kemudian memasukan ke dalam cawan tersebut agar cair steril yang telah didinginkan sampai 47-50 0 C sebanyak 10 – 15 ml. Selama penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindarkan kontaminasi dari luar. Setelah penuangan cawan menggerakan diatas meja secara hati – hati untuk menyebarkan sel mikroba secara merata yaitu dengan gerakan angka delapan. Setelah memadat, cawan – cawan tersebut dapat diinkubasi di dalam inkubator dengan posisi terbalik.

Penghitungan koloni dilakukan dengan cara memilih dan menghitung cawan yang mengandung jumlah koloni antara 30 – 300. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni. Suatu deretan koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Mencatat hasil penghitungan pada buku hasil pengamatan.

3.2.4. Pewarnaan Gram

Menggenangi objek dengan larutan gram A selama 1 menit. Membuang sisa zat warna pada nampan, kemudian membilas objek dengan aquades. Menggenangi objek dengan larutan gram B selama 2 menit. Membuang sisa zat warna pada nampan, kemudian membilas objek dengan aquades. Membilas objek dengan larutan gram C sampai warna birunya tidak luntur lagi, lalu membilas dengan aquades. Menggenangi objek dengan larutan gram D selama 30 detik. Membuang sisa zat warna pada nampan, kemudian membilas objek dengan aquades. Membersihkan sisa

aquades dengan tissue. Kemudian mengamati dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran 100 kali. Menggambar bentuk bakteri yang tampak pada mikroskop.

4.1. Sterilisasi

Sterilisasi yang dilakukan ada dua macam, yaitu sterilisasi kering dan sterilisasi basah. Alat yang mendapat perlakuan sterilisasi kering adalah alat-alat yang terbuat dari gelas, misalnya pipet, tabung reaksi dan cawan petri. Pipet, tabung reaksi dan cawan petri yang disterilkan masing-masing berjumlah 10 buah. Tujuan dari sterilisasi ini adalah untuk mematikan segala bentuk kehidupan termasuk mikroba, hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz (1989) yang menyatakan bahwa sterilisasi merupakan cara aseptik yang harus dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi merupakan cara kerja dimana terjadinya kontaminasi oleh mikroba lain yang tidak dikehendaki dicegah semaksimum mungkin, sedangkan substansi mikroba yang dikehendaki dipertahankan semaksimum mungkin. Sterilisasi kering menggunakan oven selama 1-2 jam. Hal ini sesuai dengan pendapat yang dinyatakan oleh Darmadi (2008) yaitu sterilisasi kering dilakukan dengan udara panas pada sebuah alat yang disebut oven, suhunya dapat mencapai 160-180⁰ C, membutuhkan waktu 1-2 jam dan digunakan untuk sterilisasi alat-alat dari gelas seperti tabung reaksi, labu, cawan petri, dan sebagainya.

Sterilisasi basah dilakukan pada larutan yang akan digunakan untuk bahan pembuatan medium dan larutan pengencer. Sterilisasi ini dilakukan dengan autoklaf pada suhu 121⁰C dan dalam waktu 10-15 menit, hal ini sesuai dengan pendapat Suwahyono (2009) medium cair disterilkan menggunakan alat yang bernama autoklaf pada suhu 121⁰C, takanan 2 atm, dan selama 10-15 menit. Sebelum autoklaf digunakan, terlebih dahulu menghilangkan udara yang ada di dalam autoklaf, untuk menyesuaikan tekanan pada medium yang akan disterilkan. Hal ini sesuai dengan pendapat Schlegel (1994) yang menyatakan bahwa Kalau masih ada udara, suhu yang sesuai dengan tekanan tertentu jauh lebih rendah, maka penghilangan udara sebelum autoklaf ditutup harus dilakukan secara teliti.

4.2. Medium dan Larutan Pengencer

Pembuatan medium Nutrient Agar membutuhkan bahan Nutrient Broth, agar dan aquades. Pembuatan Potato Dextrose Agar membutuhkan filtrat kentang, aquades, dextrose, agar, serta penyesuaian pH pada medium yang akan dibuat menjadi medium biakan bakteri. Penyesuaian pH pada medium yang akan dibuat dikarenakan pertumbuhan bakteri dipengaruhi juga oleh pH. Hal ini sesuai dengan pendapat Pelcszar dan Chan (1986) yang menyatakan bahwa pH optimum pertumbuhan bagi kebanyakan bakteri antara 6,5-7,5, namun pada beberapa spesies dapat tumbuh dalam keadaan sangat asam atau sangat basa. Pembuatan larutan pengencer dilakukan dengan menggunakan 6 tabung reaksi, memasukkan masing-masing 9 ml pada tabung reaksi dan menutupnya dengan kapas dan di sterilisasi menggunakan autoklaf. Setelah medium dan larutan pengencer disiapkan, maka disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121⁰C selama 10-15 menit, hal

ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Suwahyono (2009) yaitu medium cair disterilkan menggunakan alat yang bernama autoklaf pada suhu 121⁰C, takanan 2 atm, dan selama 10-15 menit.

4.3. Metode Hitungan Cawan

Berdasarkan hasil praktikum denagn menggunakan metode hitungan cawan diperoleh hasil pengamatan :

Tabel 1. Metode Hitungan Cawan

Sampel Pengenceran

SPC

10-4 10-5 10-6

Nutrient Agar (NA) 320 TBUD TBUD 3,2 x 106

Potato Dextrose Agar (PDA) 152 396 184 1,5 x 106

Sumber : Data Primer Praktikum Mikrobiologi, 2011.

Berdasarkan pengamatan diketahui jumlah bakteri pada sampel Nutrient Agar (NA) sebanyak 3,2 x 106 CFU/ml. Pengenceran 10-5 dan 10-6 diperoleh hasil TBUD (terlalu banyak untuk dihitung) yang berarti bahwa jumlah koloni yang terhitung lebih dari 300 koloni, hasil ini mungkin dikarenakan terjadinya kontaminasi pada saat penanaman bakteri. Hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Harmita dan Radji (2006) yang menyatakan bahwa hasil yang baik adalah cawan petri yang mengandung koloni berkisar antara 30-300 koloni. Hasil perhitungan jumlah koloni yang dapat digunakan adalah pada pengenceran 10-4, hal ini dikarenakan pada hasil penghitungan, syarat penghitungan koloni yang memiliki range 30-300 tidak terpenuhi, sehingga digunakan hasil perhitungan koloni yang memiliki kedekatan dengan range yang telah ditentukan. Hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Fardias (1993) yang menyatakan bahwa pabila koloni yang terhitung jumlahnya lebih dari 300, maka jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggilah yang dihitung.

Berdasarkan pengamatan, diketahui jumlah bakteri pada sampel Potato Dextrose Agar (PDA) sebanyak 1,5 x 106 CFU/ml. Pada sampel Potato Dextrose Agar pada pengenceran 10-4, diperoleh hasil perhitungan koloni bakteri sebanyak 152, pada pengenceran 10-5 diperoleh 396 koloni yang terhitung dan pada pengenceran 10-6 koloni yang terhitung sebanyak 184. Karena pada pengenceran 10-4 dan 10-6 memenuhi persyaratan range 30-300 koloni, maka dengan mencari rata-ratanya dan kemudian membagi hasil pengenceran tetinggi dan pengenceran terendah apabila hasil rata-ratanya lebih dari 2, lalu diperoleh hasil 1,5x 106 CFU/ml. Hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Fardias (1993) yang menyatakan bahwa jika cawan dari dua tingkat pengenceran

menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30-300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran lebih dari 2, yang digunakan adalah pengenceran yang paling kecil. Penghitungan pada metode hitungan cawan dapat dilihat tanpa bantuan mikroskop, hal ini sesuai dengan pendapat yang diungkapkan oleh Harmita dan Radji (2006) yaitu pelat agar kemudian diinkubasi pada kondisi yang memungkinkan mikroorganisme untuk bereproduksi dan membentuk koloni yang terlihat tanpa bantuan mikroskop.

4.4. Pewarnaan Gram

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap kultur padat Lactobacillus acidophillus dan Streptococcus thermophilus dengan perbesaran 100x, diperoleh hasil sebagai berikut :

Ilustrasi 1. Struktur Lactobacillus acidophillus

Bentuk : bacillus (batang)

Koloni : berkelompok

Warna : biru gelap

Gram : positif

Bentuk : bacillus (batang)

Koloni : berkelompok

Warna : biru keunguan

Gram : positif

Sumber : Data Primer Praktikum Sumber : sitemaker.umich.edu

Mikrobiologi, 2011.

Berdasarkan pewarnaan Gram pada Lactobacillus acidophillus, diperoleh hasil : bentuk bakteri basil (batang), koloninya berkelompok dengan jumlah koloni 20, warna biru gelap. Warna biru gelap pada dinding sel Lactobacillus acidophillus menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif, hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan Sacher dan McPherson (2004) yaitu bakteri gram positif terwarnai ungu atau biru gelap memiliki dinding sel yang tebal. Bentuk basil

pada bakteri Lactobacillus acidophillus panjang dan ramping serta ada pula yang tidak panjang dan ramping, hal ini sesuai dengan pendapat Pelczsar dan Chan (1986) yang menyatakan bahwa ada banyak perbedaan dalam ukuran panjang dan lebar di antara berbagai spesies basilus.

Ilustrasi 2. Struktur Streptococcus thermophilus

Bentuk : coccus (bulat)

Koloni : berkelompok

Warna : biru gelap

Gram : positif

Bentuk : coccus (bulat)

Koloni : berkelompok

Warna : biru gelap

Gram : positif

Sumber : Data Primer Praktikum Sumber : picazilla.co.cc

Mikrobiologi, 2011.

Berdasarkan pewarnaan Gram pada Streptococcus thermophilus, diperoleh hasil : bentuk bakteri coccus (bulat), jumlah koloni TBUD dan warna dinding selnya biru gelap. Hal ini sesuai dengan pendapat Fardiaz (1989) yang menyatakan bahwa bakteri Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Steptococcus merupakan bakteri yang termasuk bakteri gram positif. Pada hasil pengamatan, bakteri Streptococcus thermophilus tampak bulat dan tidak menggerombol, hal ini menunjukkan bahwa bentuknya berpasangan (diplokokus). Hal ini sesuai dengan pendapat yang dikemukakan oleh Pelczsar dan Chan (1986) yaitu kokus memperlihatkan penataan yang berbeda-beda, diplokokus : sel membelah diri pada satu bidang pada satu bidang dan tetap saling melekat terutama berpasangan.

KESIMPULAN

5.1. Simpulan

Berdasarkan hasil praktikum sterilisasi, sterilisasi dilakukan berdasarkan bentuk alat atau bahan yang akan disterilkan. Berdasarkan hasil praktikum medium dan larutan pengencer, pembuatannya harus dilakukan dalam kondisi yang benar-benar steril agar tidak terkontaminasi mikroorganisme yang lain. Berdasarkan hasil praktikum metode hitungan cawan, bakteri yang dapat dihitung diantara 30-300 koloni. Berdasarkan hasil praktikum pewarnaan Gram, bakteri yang bereaksi positif akan berwarna biru gelap.

5.2. Saran

Pelaksanaan Praktikum Mikrobiologi pada dasarnya sudah dilaksanakan dengan baik, namun perlu pemahaman yang lebih untuk memahami metode yang digunakan. Alat dan bahan yang digunakan pun sudah memadai, namun diperlukan persiapan yang lebih matang lagi agar proses praktikum berjalan dengan waktu yang efektif dan efisien.

DAFTAR PUSTAKA

Brooks, G. F., Janet, S. B., dan Stephen A. M. 2001. Mikrobiologi Kedokteran Penerbit Salemba Medika, Jakarta.

Campbell, N.A., J. B. Reece, dan L. G. Mitchell. 2002. Biologi Jilid 1 Edisi Kelima. Erlangga, Jakarta.

Darmadi. 2008. Infeksi Nosokomial. Penerbit Salemba Medika, Jakarta.

Elrod, S. L. dan W. D. Stansfield. 2006. Genetika Edisi Keempat. Erlangga, Jakarta.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Penerbit IPB, Bogor.

Fardias, S. 1993. Analisis Mikrobiologi. PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Harmita dan Radji, M. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi 3. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Pelczsar, M. J. dan Chan ESC. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1. UI-Press, Jakarta.

Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara, Jakarta.

Sacher, R. A. dan R. A. McPherson. 2004. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Schlegel, H. G. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Suriawiria, U. 1993. Mikrobiologi Air. Penerbit Alumni, Bandung.

Suwahyono, U. 2009. Biopestisida. Penebar Swadaya, Jakarta.

http://www.sitemaker.umich.edu

http://www.picazilla.co.cc

Yuwono, T. 2008. Boiologi Molekuler. Erlangga, Jakarta.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Pertanyaan

Pertanyaan Sterilisasi

Jelaskan perbedaan sterilisasi kering dan sterilisasi basah !

Jawab :

Sterilisasi kering digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari gelas, misalnya cawan petri, pipet dan tabung reaksi. Sterilisasi kering menggunakan oven dengan jangka waktu 1-2 jam.

Sterilisasi basah digunakan untuk mensterilkan medium cair. Sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121⁰C selama 10-5 menit.

Jelaskan tujuan sterilisasi !

Jawab : tujuan dari sterilisasi adalah untuk menghilangkan segala bentuk kehidupan, bahkan sampai tingkat mikroba.

Pertanyaan Medium dan Larutan Pengencer

Jelaskan fungsi dari masing-masing komponen di bawah ini dalam medium :

Pepton c. ekstrak sapi

Agar d. NaCl

Jawab : a. pepton berfungsi sebagai sumber utama nitrogen organic dari sumber nutrisi

agar berfungsi sebagai pemadat medium PDA

Ekstrak sapi berfungsi sebagai perangsang spermiasi pada sapi

NaCl berfungsi sebagai media pendingin

Jelaskan perbedaan masing-masing medium di bawah ini :

Nutrien Agar

Potato Dextrose Agar

Lactose Broth

Plate Count Agar

Brilliant Green Lactose Bile Broth

Jawab :

Nutrient Agar merupakan medium umum untuk uji air dan prosuk diary yang digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof.

Potato Dextrose Agar merupakan medium mikroorganisme yang terbuat dari infus kentang dan dextrosenya atau gula jagung.

Lactose Broth merupakan medium yang digunakan untuk pendektesian bakteri coliform (Eschericia dan Enterobacter), sebagai preenrichment untuk Salmonella dan studi fermentasi laktosa bakteri secara umum.

Plate Count Agar merupakan media pertumbuhan umum yang digunakan untuk menila atau memantau pertumbuhan bakteri yang layak sampel.

Briliant Green Lactose Bile Broth merupakan medium yang digunakan untuk mendeteksi bakteri coliform dalam air, makanan, dan produk susu.

Sebut dan jelaskan klasifikasi medium !

Jawab :

Medium berdasarkan sifat fisik

Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15 % sehingga setelah dingin dingin menjadi media yang padat.

Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-1,4

Pertanyaan Metode Hitungan Cawan

Bagaimana prosedur perhitungan total mikroba pada sampel susu bubuk hingga pengenceran 10-5. Hitung pula kebutuhan alat dan bahan !

Laporkan “Standard Plate Count” dari sampel di bawah ini !

Sampel Pengenceran SPC

10-2 10-3 10-4 10-5

Kaldu daging 280

262 45

28 3

1 -

-

Susu segar TBUD

TBUD TBUD

TBUD 708

782 158

302

Sosis TBUD 294 35 5

Dendeng 55 15 1 0

Jawab :

Pertanyaan Pewarnaan Gram

Jelaskan perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif !

Jawab : bakteri Gram positif menunjukkan warna ungu apabila diuji menggunakan pewarnaan Gram, sedangkan bakteri Gram Negatif menunjukkan warna merah.

Sebutkan jenis dan bentuk koloni bakteri yang termasuk patogen !

Jawab :

Lampiran 2. Hasil Perhitungan Metode Hitungan Cawan

Sampel Pengenceran SPC

10-4 10-5 10-5

Nutrient Agar (NA) 320 TBUD TBUD 3,2 x 106

Potato Dextrose Agar (PDA) 152 396 184 1,5 x 106

Nutrient Agar (NA)

Karena perhitungan pada ketiga pengenceran yang dapat dihitung adalah pada pengenceran 10-4, maka yang dihitung adalah :

SPC = Σ koloni x 1/(faktor pengenceran)

= 320 x 1/〖10〗^(-4)

= 3, 2 x 106

Potato Dextrose Agar (PDA)

Karena terdapat dua hasil hitungan yang memenuhi syarat range antara 30-300, maka dihitung terlebih dahulu rata-ratanya. Apabila lebih dari dua maka yang digunakan adalah perhitungan pada factor pengenceran yang paling kecil.

Rata-rata = (pengenceran 〖10〗^(-6))/(pengenceran 〖10〗^(-4) )

= (1,84 x 〖10〗^8)/(1,52 x 〖10〗^6 )

= 121, .. 102 → >2 , maka

SPC = Σ koloni x 1/(faktor pengenceran)

= 152 x 1/〖10〗^(-4)

= 1,5 x 106

Lampiran 3. Gambar dan Fungsi Alat Praktikum

Tabung reaksi :

Sebagai tempat untuk mereaksikan bahan kimia, melakukan reaksi kimia dalam skala kecil.

Cawan Petri :

Terbuat dari porselen dan biasa digunakan untuk wadah larutan.

Oven :

Digunakan untuk pemanasan alat-alat pada sterilisasi kering dengan suhu 1700 C.

Timbangan Digital :

Digunakan untuk menimbang bahan yang akan digunakan dengan ketelitian yang sangat tinggi.

Tabung Ukur :

Digunakan untuk mengukur cairan dalam volume yang kecil.

Pipet hisap :

Berfungsi untuk mengambil larutan dan memindahkan larutan pada lubang yang kecil.

Bunsen / pembakar spiritus :

Digunakan untuk memanaskan bahan kimia.

Magnetic stirrer :

Berfungsi untuk mengaduk atau menghomogenkan suatu campuran larutan.

Gelas ukur :

Untuk mengukur volume larutan tidak memerlukan tingkat ketelitian yang tinggi dalam jumlah tertentu.

Labu Erlenmeyer :

Untuk menyimpan dan memanaskan larutan dan menampung filtrat hasil penyaringanm menampung titran (larutan yang dititrasi) pada proses titrasi.

Jarum Inokulasi :

Digunakan untuk memindahkan mikroba pada biakan atau pun pada pewarnaan.

Autoklaf :

Digunakan dalam sterlisasi basah yaitu untuk memanaskan dengan derejat dan tekanan tertentu juga untuk mensterilkan alat-alat gelas seperti erlenmeyer, cawan petri, pipet hisap, tabung reaksi, dsb.