LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGIMATERI (Pembuatan Media NA dan Penanaman Bakteri)

Disusun oleh :

1. Made Ayu Sri Wahyuni

(1403051003)

2. I Putu Eka Juliartawan

(1403051004)

3. Luh Putu Ayu Lakshemini Oka(1403051007)4. Putu Frisca Dora Jastrissia

(1403051010)

5. Ni Putu Crusita Mayasni Putri (1403051011)

JURUSAN ANALIS KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA

TAHUN 2015

DAFTAR ISI

Halaman judul ............iKata pengantar ..iiDaftar isi iiiPecobaan 1 ( Pengenalan Alat dan Strerilisasi) ..1Percobaan 2 (Pembuatan Media NA dan Penanaman Bakteri) ..13Percobaan 3 (Pewarnaan Gram) 26(PERCOBAAN 1) PENGENALAN ALAT DAN STERILISASI

BAB I

PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang

Pengenalan alat-alat laboratorium penting dilakukan untuk keselamatan kerja saat melakukan peelitian. Alat-alat laboratrium biasanya data rusak atau bahkan berbahaya, jika penggunaannya tidak sesuai prosedur. Sebab pentingnya dilakukan pengenalan alat-alat laboratrium adalah agar dapat mengetahui cara-cara penggunaan alat tersebut dengan baik dan benar. Sehingga kesalahan prosedur peakaian alat dapat diminimalisir sedikit mungkin. Hal ini penting supaya saat melakukan penelitian, data yang diperoleh akurat. Data-data yang tepat akan meningkatkan kualitas penelitian seseorang.

Dalam praktikum pengenalan alat-alat laboratorium dan alt-alat sterilisasi akan dijelaskan secara detail mengenai fugsi dan spesifikasi masin-masing alat tersebut. Sterilisasi adalah usaha untuk membebaskan alat-alat dari mikroba yang tidak diinginkan.

Dalam praktikum ataupun dalam penelitian terutama dalam bidang mikrobiologi, digunakan beberapa peralatan standar yang harus disterilsasi terlebih dahulu sebelum digunakan. Dalam bidang bioteknologi, kata seterilisasi sering dipakai untuk menggambarkan langkah yang diambil agar media akan atau membunuh semua bentuk kehidupan mikroorganisme, karena pentingnya car-cara mematikan, menyinkirkan dan menghambat pertumbuhan mikroorganime dalam mikrobiologimaka proses sterilisi sangat diperlukan. Oleh Karen itu, percobaan ini dilakukan agar peraktikan mengenal stadar yang dipakai dilaboratorium serta mengetahui cara-cara yang digunakan dalam proses sterilisasi.

1.2 Tujuan

Mengetahui jenis dan fungsi alat-alat yang digunakan dalam mikrobiologi serta memahami teknik aseptik.1.3 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilakukan di Lab D3 Analis Kimia , pada tanggal 04 Maret 2015.BAB II

TINJAUAN PUSTAKA Ada banyak pilihan cara sterilisai yang berbeda, namun yang penting adalah bagaimana menetapakan bahwa produk akhirnya dinyatakan sudah steril dan aman digunakan. Suatu produk dapa disterilkan melalui cara sterilisasi akhir (terminal sterilization) atau dengan cara aseptic (aseptic processing). Cara sterilisasi yang dapat dilakukan untuk mendapatkan produk steril yaitu :

1.Terminal Sterilization (sterilisasi akhir) metode sterilisasi akhir menurut PDA Technical Manograph (2005) dibagi menjadi dua yaitu :

a. Overkill Methood adalah metode sterilisasi menggunakan pemanasan dengan uap panas pada 121oC, selama 15 menit yang mampu membeikan minimal reuksi setingkat log 12 dari mikroorganisme-mikroorganisme yang memiliki nilai 0 minimal 1 menit. Kita bisa menggunakan metode overkill untuk bahan yang tahan panas seperti zat anorganik. Metode merupakan pilihan utama karena kelebihannya lebih efisien, cepat dan aman.

b. Bioburden Strilization adalah metode sterilisasi yang memerlukan monitoring ketat dan terkontrol terhadap beban mikroba sekecil mungkin dibeberapa lokasi jalur produksi sebelum menjalani proses sterilisasi lanjutan dengan tingkat sterilisasi yang dipersyaratkan SAL 10-6. Kita menggunakan metode umumnya untuk bahan yang dapat mengalami degradasi kandungan bila terlalu panas terlalu tinggi seperti za organik.(Stefanus.2006)

2. Aseptic Processing

Aseptic Processing adalah metode pembuatan produk steril menggunakan saringan dengan filter khusus untuk bahan obat steril atau bahan baku steril yang diformulasikan dan diisikan kedalam kontainer steri dalam lingkungan terkontrol. Suplai udara, material, peralatan dan petugas telah terkontrol sedemikian ruoa sehingga kontaminasi mirroba tetap ada pada level yang dapat diterima (aceptablle) dam calane zone (grade A dan B).(Stefanus. 2006)

Macam-macam sterilisasi yang dapat digunakan :

1.Sterilisasi panas dengan tekana atau sterilisasi uap (autoklaf). Pada saat melakukan sterilisasi uap, kita sebenarnya memapakan uap jenuh pada tekanan tertentu selama waktu dan suhu tertentu pada suatu objek, sehingga terjadi pelepasan energi laen uap yang mengakibatkan denaturasi atau koagulasi protein sel. Sterilisasi demikian merupakan sterilisasi paling efektif dan ideal karena :

a.Uap merupakan pembawa (carrier) energy tertanal paling efektif dan semua lapisan pelindung luar mikroorganisme dapat dilunakan, sehingga memungkinkan terjadinya koagulasi.

b.Bersifat nontosik, mudah diperoleh dan relatife mudah dikontrol.

Penggunaan autoklaf ini harus dengan suhu 121oC selama 15 menit. Factor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi uap ada 3 yaitu : waktu, suhu dan kelembaban.(Stefanus. 2006).

2. Sterilisasi panas kering (Oven)

Proses sterilisasi panas kering terjadi melalui mekanisme konduksi panas. Panas akan diabsurpsi oleh permukaan luar alat yang disterilkan, lalu merambat ke bagian dalam permukaan sampai akhirnya suhu untuk sterilisasi tercapai. Sterilisasi panas kering biasanya digunakan untuk alat-alat atau bahan dengan uap tidak dapat penetrasi secara mudah atau untuk peralatan yang terbuat dari kaca. Pada sterilisasi panas kering, pembunuhan mikroorganisme terjadi melalui mikanisme oksidasi sampai-sampai terjadinya koagulasi protein sel. Karena panas dan kering kurang efektif dalam membunuh mikroba dari autoklaf, maka sterilisasi memerlukan temperature yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang.(Stefanus. 2006)

3. Sterilisasi, Tyndllisasi.

Metode ini berupa mendidihkan medium dengan uap dengan beberapa menit saja. Sehabis didiamkan satu hari, selama itu spora-spora sempat tumbuh menjadi bakteri vegetative. Maka medium tersebut dididihkan lagi selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut dididihkan lagi, sekali lagi. Dengan jalan demikian ini diperoleh medium yang steril dan zat-zat organik yang terkandung didalamnya tidak mengalami banyak perubahan seperti halnya pada cara yang dilakukan oleh spallanzani (1729-1799).(Dwidjoseputro. 2005)

4.Sterilisasi dengan penyaringan (Filtrasi).

Medium disaring dengan saringan porselin atau dengan tanah diatom. Dengan jalan ini, maka zat-zat organik tidak akan mengalami penguraian sama sekali. Hanya sayang, virus tak dapat terpisah dengan penyaringan semacam ini. Oleh karena itu, sehabis penyaringan, medium masih perlu dipanaskan dengan autoclave meskipun tidak selama 15 menit dengan teperatur 121oC. penyaringan dapat dilakukan juga dengan saringan yang dibuat dari asbes. Saringan ini lebih murah dan lebih mudah penggunaannya daripada parselin. Saringan asbes dapat dibuang setelah dipakai, sedangkan saringan porselin terlalu mahal untuk dibuang dan terlalu sulit dibersihkan.(Dwidjoseputro. 2005)

Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas penggunaan bahan kimia dan penyaringan(filtrasi). Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah bila tanpa kelembaban maka disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering. Dipihak lain sterilisasi kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan gas atau radiasi.(Hadiotomo. 1985)

5. Sterilisasi radiasi

a. Ultraviolet

Ultraviolet merupakan gelombang elektromagnetik dengan panjang gelombang 100-400 mm dengan efek optimal pada 254 nm. Sumbernya adalah lampu uap merkuri dengan daya tembus hanya 0,01-0,2 mm. ultraviolet digunakan untuk sterilisasi ruangan pada penggunaan aseptic.

b. Jon

Mekanisme mengikutitori tumbukan yaitu sinar langsung menghantam pusat kehidupan mikroba (kromosom) atau secara tidak langsung dengan sinar terlebih dahulu membentuk molekul dan mengubahnya menjadi bentuk radikatnya yang menyebabkan terjadinya reaksi sekunder pada bagian molekul DNA mikroba.

c. Gamma

Gamma bersumber dari Cu60 dan Cs137 dengan aktivitas sebesar 50-500 kilo curie serta memiliki daya tembus sangat tinggi. Dosis efektifitasnya adalah 2,5 MRad. Gamma digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari logam, kaet serta bahan sintesis seperti pulietilen.(Ratna. 1985)

Pensterilkan Gelas-gelas, botol, pipa pipet yang sudah bersih tidak disterilkan dengan autoklaf, karena barang-barang tersebut akan tetap basah sehabis sterilisasi. Alat-alat dari gelas dimasukkan didalam oven kering selama 2-3 jam pada temperatur 160o-170oC. Hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan dalam oven. Kapas masih dapat bertahan dalam oven kering selama waktu dan temperature seperti diatas. Alat-alat yang bahan kering tidak boleh dimasukkan dalam oven kering. Pensterilan alat-alat dapat pula dilakukan dengan gas etiken oksida. Hal ini harus dikerjakan dengan hati-hati karena ada bahaya tertentu.(Ratna. 1985)

Benda yang akan dicuci dihamakan diletakkan diatas lempengan saringan dan tidak langsung mengenai air dibawahnya. Pemanasan dilakukan hingga air mendidih pada tekanan temperature yang lumayan tinggi kira-kira 121oC. organism yang tidak berspora hanya dapat mati dengan pemanasan 100oC selama kurang lebih 30 menit. Pemanasan kering ini kurang efektif apabila temperatu kurang tinggi untuk mencapai temperature antara 160oC sampai dengan 180oC. pada temperature ini akan menyebabkan kerusakan pada sel-sel hidup dan jaringan.(Ratna. 1985)

Sterilisasi dengan pemanasan merupakan cara yang paling banyak dipakai. Pada prinsipnya sterilisasi dengan pemanasan ada empat macam yaitu sebagai berikut :

1. Sterilisasi dengan pemijaran

2. Sterilisasi dengan udara panas

3. Sterilisasi dengan uap air panas

4. Sterilisasi denagan uap air panas bertekanan

Sterilisasi dengan pemijaran, cara ini terutama dipakai untuk sterilisasi jarum ose dan sebagainnya terbuat dari platina, caranya dengan membakar alat-alat tersebut diatas api lampu spirtus sampai pijar. Sterilisasi dengan udara panas, untuk keperluan ini dipakai alat yang mempunyai thermostat yang disebut hot air stelizer(oven).pada umumnya temperature yang digunakan pada sterilisasi secara kering 170-180oC, paling sedikit selama 2 jam. Sterilisasi dengan menggunakan uap air panas , bahan-bahan yang mengandung cairan, tidak dapat disterilkan dengan udara panas yang kering. Sterilisasi yang baik adalah dengan mengunakan uap air panas bahan-bahan yang disterilkan dengan cara ini pada umumnya medium kultur yang tidak tahan terhadap panasyang sangat tinggi. Sterlisasi dengan menggunakan uap panas bertekanan, alat yang digunakan untuk sterilisasi dengan uap panas bertekanan ialah autoclave. Alat ini terdiri atas suatu bejana yang tahan terhadap tekanan tinggi yang dilengkapi monometer, thermometer dan kleb. Sterilisasi dengan autoclave merupakan cara sterilisasi yang paling baik, jika dibandingkan dengan cara-carasterilsasi lainnya. Dan ada pula sterilisasi dengan penyinaran, dimksudka disini untuk merusak kemampuan sel mikroba pengkontaminan secara seluler dan genetic yang mengakibatkan mikroba tersebut tidak mampu untuk melakukan reproduksi dan pertumbuhan. Teknik sterilisasi ini biasanya menggunakan radiasi ion dengan dosisi dan waktu pemaparan yang cukup lama.(Ratna. 1985)

Dalam mikrobiologi radiasi gelombang elektromagnetik yang banyak digunakan adalah radiasi sinar ultraviolet, radiasi sinar gamma atau juga sinarX dan sinar matahari. Sinar matahari banyak mengandung sinar ultraviolet, sehingga secara langsung dapat dipakai untuk proses sterilisasi. Sinar ultraviolet biasa diperoleh dengan menggunakan katoda panas yaitu kedalam tabung katoda bertekanan rendah diisi dengan uap air panas, panjang gelomban ini yang dihasilkan dalam proses ini biasanya dalam orde sampe dengan atau kurang lebih kira-kira bersikaran 2500-2600 angstrom.(Ratna. 1985)

BAB III

METODOLOGI3.1 Alat dan Fungsi

Oven :

Kapas : kapas ini digunakan untuk menutupi alat yang akan disterilisasi.

Pipet tetes : untuk menggambil larutan dengan volume 0,1 sampai 1ml.

Koran : digunakan untuk membungkus alat yang akan disterilisasi.

Tali : digunakan untuk mengikat bungkusan koran pada alat yang akan disterilisasi.

Autoclave : digunakan untuk sterilisasi alat.

3.2 Bahan dan Fungsi

Bahan yang digunakan tidak ada.

3.3 Cara Kerja

1. Alat dicuci lalu dikeringkan.

2. Alat yang telah kering ditutup dengan menggunakan kapas.

3. Ditancapkan saklar pada listrik.

4. Bila air dalam autoclave kurang , maka tambah dengan air sampai menutupi elemen panas

5. Dimasukkan alat-alat yang akan disterilisasi dalam keranjang.

6. Ditutup dan dikunci secara diagonal

7. Diatur suhu 121oC.

8. Dinyalakan tombol on.

9. Diatur waktu 15 menit.

10. Ditunggu hingga autoclave berbunyi (0,1 Mpa) selama 15-20 menit

11. Dibuka klep uap perlahan-lahan.

12. Ditunggu sampe dengan 0 Mpa.

13. Dibuka tutup.

14. Dikeluarkan alat yang disterilisasi.

15. Didinginkan.

16. Diama

BAB VI

PEMBAHASAN4.1 Analisa Prosedur

Pada alat yangdicuci sebelum digunakan itu bertujuan agar alat tersebut tidak terkontaminasi oleh zat lain, untuk melakukan sterilisasi alat yang sudah dicuci dan di keringkan tersebut yang ditutupi dengan kapas bertujuan agar pada saat disterilisasi pada bagian dalam dari alat tersebut ikut steril dengan tidak adanya zat yang tidak diinginkan masuk kedalam alat tersebut. Ditambahkannya air pada autoclave bila air pada autoclave kurangdari batas yang ditentukan , dan air pada autoclave juga tidak boleh melebihi batas yang ada pada autoclave. Alat yang dimasukkan kedalam autoclave tersebut ditempatkan pada keranjang autoclave, dikuncinya autoclave bertujuan agar pada saat sterilisasi alat yang berada didalam autoclave tetap steril dan tetap aman. Suhu pada autoclave yaitu 121 karenan autoclave merupakan alat sterilisasi secara kering, dengan waktu 15-20 menit. Sterilisasi ditunjukkan agar terjadi denaturasi protein dan terutama tidak aktifnya enzim yang digunakan untuk metabolism bakteri, dan perlakuan panas ditunjukkan untuk membunuh spora bakterinya. Sedangkan sterilisasi pada medium dan alat bertujuan untuk mencegah adanya bakteri yang tidak diinginkan dalam pemiaraan. 4.2 Analisa Hasil

Sterilisasi dalam mikrobiologi ialah suatu proses untuk mematikan semua organism yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Hal ini diperlukan agar mikroba yang ingin ditumbuhkan diamati dan diisolasi terbebas dari mikroba lain (mikroba kontamina). Suatu bahan atau alat dikatakan steril bila alat atau bahan tersebut bebas dari mikroba, baik dalam bentuk sel vegetatife maupun spora sterilisasi dilakukan tehadap bahan dan alat sehingga terbebas dari kontaminasi mikroorganisme lain. Sterilisasi perlu dilakukan karena kontaminasi mikroba lain akan memberikan dampak yang tidak menguntungkan. Sterlisasi dengan pemanasan ada 4 macam yaitu pemijaran, udara panas, uap air panas dan uap air panas bertekanan. Kemudian ada juga sterilisasi dengan metode penyinaran dan penyaringan.(dwidjoseputro. 2005)

Autoclave merupakan cara sterlisasi yang paling baik jika dibandingkan dengan cara-cara sterilisasi lainnya. Autoclave ini merupakan cara sterilisasi dengan menggunakan uap panas bertekanan. Bahan-bahan yang disterilkan ialah bahan-bahan atau alat-alat yang tidak rusak karena pemanasan dengan tekanan tinggi. Prinsip kerja autoclave pada dasrnya menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Medium yang akan disterilkan ditempatkan didalam autoclave ini selama 15-20 menit. Medium yang an disterilkan itu lebih baik ditepatkan dalam beberapa botol yang agak kecil daripada dikumpul dalam suata botol yang besar. Setelah pintu autoclave ditutup rapat, barulah kran pipa uap dibuka, dan temperature akan terus menerus naik sampai 121oC. Biasanya autocave suda diatur sedemikian rupa sehingga pada suhu tersebut, tekanan ada sebesar 15 Ibs(pounds) perinch persegi yang berarti 1 atm per 1 cm2. Perhitugan waktu 15 atau 20 menit dimulai sejak thermometer pada autoclave menunjukkan 121oC.(dwidjoseputro. 2005)

Dalam praktikum dalam bidang mikrobiologi digunakan beberapa alat, diantaranya yaitu: cawan petri digunakan dalam praktikum yang berfungsi sebagai wadah untuk menumbuhkan mikriba, untuk penyelidikan bahan yang akan diuji dan juga untuk mengukur bakteri, khamir, spora, atau biji-bijian. Tabung reaksi berfungsi sebagai tempat untuk mereaksikan zat-zat kimia di dalam laboratorium. Rak tabung reaksi berfungsi sebagai tempat meletakkan tabung reaksi. Hot plate digunakan untuk memanaskan, dalam pembuatan media serta menghomogenkan larutan. Magnetic stirrer digunakan untuk menyebarkan bakteri yang berada pada cawan petri. Erlenmeyer digunakan untuk berbagai keperluan laboratoriu terutama dalam titrasi pada analisis kimia.

Jarum ose/ sengkelit digunakan untuk memindahkan biakan dari medium padat ke medium cair atau untuk membuat preparat. Gelas piala digunakan untuk berbagai macam keperluan seperti memanaskan cairan mereaksikan dan membuat endapan. Gelas ukur digunakan untuk mengeluarkan jumlah tertentu volume cairan secara tidak tepat atau kira-kira ukurannya bervariasi 5 ml sampai 2 L.

Mikropipet digunakan untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil, dalam penggunaan mikropipet memerlukan tip. Pipet digunakan untuk mengambil cairan sesuai volume yang diinginkan. Lampu Bunsen digunakan sebagai alat pemanas atau pembakaran gas yang dapat menghasilkan macam-macam gas. Incubator dalah alat yang berfugsi untuk menginkubasi atau memeran mikroba pada suhu tertentu.

Pada autoclave digunakan suhu 121oCpada suhu ini sudah cukup untuk mendenaturasikan atau mengkoagulasikan protein pada organism hidup dan dengan demikian mematikannya sampai spora-sporanya, karena pada suhu 100oC masih kurang dalam membunuh kuman yang resisten.

Lama pensterilisasi alat dan bahan berbeda-beda, perbedaan ini disebabkan, karena ketahana alat dan bahan bebeda. Bila alat terlalu lama dipanaskan dapat etrjadi perubahan bentuk, bila pada bahan dipanaskan terlalu lama maka baha dapat rusak seperti penguraian gula, ph dan lain-lain. Lama sterilisasi pada alat sekitar 15-30 menit, sedangkan pada bahan 15 menit.

Faktor kesalahan pada percobaan pada posisi cawan petri yang salah ketika disterilkan menggunakan autoclave(terbalik) membuat uap air dari autoclave jatuh atau masuk kedalam cawan petri sehingga bahan tidak steril atau basah.

BAB VPENUTUP5.1 Kesimpulan- Beberapa alat yang ada di laboratorium di antaranya adlah autoclave untuk sterilisasi dengan uap panas bertekanan, cawan petri untuk meletakan objek atau media, koran dan kapas untuk membungkusalat yang akan disterilisasi, sengkelit untuk mengambil suspensi mikroba, tabung reaksi untuk meletakkan objek, dan lain-lain

- Cara mensterilkan cawan petri, posisi cawan petri diatas, dimasukkan kedalam autoclave setelah dibungkus dengan kertas, dan jarum ose hanya perlu di panaskan hingga memijar

- Metode sterilisasi ada beberapa macam, diantaranya sterilisasi dengan pemijaran, sterilisai dengan udara panas(oven), sterilisasi dengan uap panas, dan sterilisasi dengan uap bertekanan(autoclave)

5.2 Saran Sebaiknya metode sterilisasi lebih bervariasi lagi, sehingga tidak hanya menggunakan metode uap air panas bertekanan (autoclave), bisa dengan uap air, pemyaringan dan lain-lain. Agar lebih dapat memahami metode-metodenya.

DAFTAR PUSTAKA

Blacksweetheart., 2008 , http:/wordpress.com/Pengenalan- alat/Blacksweetrangers /Blog.htm .diakses tanggal 15 Juni 2015 Ferdias, S., 1992, Mikrobiologi Pangan, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Indra., 2008, http//ekmon-saurus/bab-3-Sterilisasi/.htm . diakses tangga15 Juni 2015 Lay, B., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Raja Grafindo Persada, Jakarta. Moningka, Harvey., 2008, http://harveymoningka.wordpress.com/teknik- laboratorium- pengenalan-alat-dan-bahan/trackback/.diakses tanggal 15 Juni 2015

(PERCOBAAN 2) PEMBUATAN MEDIA DAN PENANAMAN BAKTERI

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat zat hara yang berguna untuk membiakkan mikroba dengan menggunakan bermacam macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian, sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Sutedjo et al, 1991)Menurut Murachman et al,(1995), macam macam media yaitu sebagai berikut :

1. Media cair (liquid media) yaitu media yang berbentuk cair.

2. Media padat (solid media) yaitu media yang berbentuk padat. Media dapat berupa bahan organik alamiah misalnya media wortel, media kentang atau anorganik (silika gel).

3. Media padat yang dapat dicairkan (semi solid) yaitu media yang dalam keadaan panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, misalnya mengandung agar atau gelatin.

Media biakan yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri terdapat dalam bentuk padat,semi padat dan cair. Media padat diperoleh dengan menambahkan agar. Agar berasal dari ganggang merah. Agar digunakan sebagai bahan pemadat karena tidak diuraikan oleh mikroorganisme,dan membeku pada suhu diatas 45C kandungan agar berbagai bahan pemadat dalam media adalah

1,5-2% (Lay,1994).

Media merupakan suatu tempat yang digunakan untuk perkembangbiakan mikroorganisme.Media dapat dibagi menjadi 3 yaitu media padat,media semi padat dan media cair.Media harus berisi zat hara yang penting untuk pertumbuhan mikroorganisme.

1.2 Maksud dan Tujuan

Maksud dari Praktikum Mikrobiologi Dasar materi Pembuatan Media, dan Penanaman adalah agar praktikan dapat mengetahui dan memahami cara pembuatan media, dan penanaman bakteri dan jamur.

Tujuan dari praktikum Mikrobiologi Dasar materi Pembuatan Media, dan Penanaman adalah untuk mengetahui dan memahami cara pembuatan media, dan penanaman bakteri.1.3 Waktu dan Tempat

Praktikum Mikrobiologi Dasar materi materi Pembuatan Media dan Penanaman dilaksanakan pada hari Rabu, tanggal 25 Maret 2013 di Laboratorium DIII Analis Kimia UNDIKSHA Singaraja. BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian dan Fungsi Media

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat zat hara (nutrien) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Sutedjo, et al., 1991)

Menurut Hadioetomo (1985), medium ialah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya. Untuk dapat menumbuhkan mikroorganisme dengan sebaik sebaiknya. Pertama pertama harus dapat memahami kebutuhan dasarnya, Lalu mencoba memformulakan meskipun persyaratan nutrien mikroorganisme amat beragam, namun sebagai makhluk hidup, mereka mempunyai kebutuhan dasar yang sama yaitu meliputi air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh.Menurut Suriawiria (1995), untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu substrat yang disebut media. Sedang media itu sendiri sebelum dipergunakan harus dalam keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.2.2 Macam Macam Media

Menurut Sutedjoet al., (1991), media dapat digolongkan berdasarkan atas susunan, sifat wujudnya dan fungsinya. Penggolongan media berdasarkan susunan kimia :

1. Media Anorganik, yaitu media yang tersusun dari bahan bahan anorganik.

2. Media Organik, yaitu media yang susunannya terdiri dari bahan - bahan organik.

3. Media Sintetik, yaitu media yang susunannyan kimianya diketahui dengan pasti, umumnya digunakan untuk mempelajari makanan suatu mikroba.

4. Media Non Sintetik, yaitu media yang susunan kimianya tidak diketahui dengan pasti, umumnya digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroba.

Penggolongan media berdasarkan sifat wujudnya :.

1. Media cair, yaitu media yang berbentuk cair.

2. Media padat, yaitu media yang berbentuk padat, dapat berupa bahan organik alamiah atau dapat juga berupa bahan anorganik.

3. Media padat yang dicairkan (semikoloid).

Menurut Suriawira (1995), macam bentuk media dibedakan menjadi 3 yaitu :

1. Media padat, umumnya dipergunakan untuk bakteri, ragi, jamur, dan kadang kadang juga mikroba.

2. Media air, dipergunakan untuk pembiakan mikroalga tetapi juga mikroba lain terutama bakteri dan ragi.

3. Media semi padat dan semi cair, umunya digunakan untuk pertumbuhan mikroba yang memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik atau fermentatif.

2.3 Media NA, PDA dan TCBS beserta komposisinya

Menurut Murachman et al., (1991), pembuatan medium potato dektrosa agar (PDA) kentang sudah ditimbang dan direbus dengan ukuran kentang 50,31 gram dan agar 40,3 gram. Disini digunakan agar untuk mengentalkan medium.

Media PDA (Potato Dekstro Agar) diperoleh dari laboratorium kesehatan medan sebanyak 39 gram. Media PDA selanjutnya ditambahkan dengan 500 ml aquadest. Kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf bersama dengan alat alat yang akan digunakan dalam penanaman kapang dengan temperatur C selama 15 menit. Didinginkan hingga suhu C - C. Setelah itu media dituangkan ke dalam masing masing cawan sebanyak 20 ml (Restuati,2008).

Menurut Dwijoseputro (1978), NA, PDA, TCBS beserta komposisinya adalah sebagai berikut:

a. NA : digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri, komposisinya terdiri dari ekstrak beef segar, pepton 3 gram, NaCl 2,5 gram dan aquades 1 L

b. PDA : digunakan sebagai media penanaman bakteri dan jamur, komposisinya adalah agar 5 gram, ekstrak yeast 2,5 gram, pepton 5 gram, dan glukosa 1 gramc. TCBS: digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri yang dikehendaki, komposisinya adalah agar, tiosulfat, sitrat, bile, garam dan sukrosa2.4Pembuatan Media NA

Menurut Amelia,et al., (2005), pembuatan median NA (Nutrient Agar) adalah dengan melarutkan 25 gram agar batang yang sudah dipotong kecil kecil dalam 1000 mL aquades di dalam microwave untuk mempermudah larutnya agar. Lalu disaring dengan menggunakan kain kassa agar kotorannya terbuang, selanjutnya ke dalam larutan tersebut ditambahkan 3 gram ekstrak yeast dan 5 gram bacto pepton, diaduk sampai rata. Kemudian media ini disterilkan dalam otoklaf.Setelah agak dingin, media dituang ke dalam cawan petri yang sudah disterilisasi kira kira 20 mL.setelah dingin dan beku cawan yang telah diisi media disimpan di dalam plastic dengan posisi terbalik.

2.5 Macam Metode Penanaman beserta Kelebihan dan Kekurangannya

Menurut Hadioetomo (1990), macam penanaman beserta kelebihan dan kekurangannya adalah sebagai berikut :

1. Metode Cawan Gores

Kelebihan dari metode cawan gores adalah :

a. Hanya spesies tertentu yang dapat tumbuh pada media sehingga memudahkan piaraan bakteri murni.

b. Pengamatan morfologi koloni lebih baik.

Kekurangan dari metode cawan gores adalah :

a. Bentuk koloni sulit diamati karena adanya permukaan yang sempit, terutama pada bagian atas.

b. Bakteri anaerob tidak dapat tumbuh.

2. Metode Cawan Tuang

Kelebihan dari metode cawan tuang adalah :

a. Kemungkinan terjadinya kontaminasi kecil.

b. Bakteri anaerob dapat tumbuh.

c. Dapat mengamati bentuk koloni yang ada pada bagian atas.

Kekurangan dari metode cawan tuang adalah :

a. Koloni dan beberapa spesies tidak dapat memberikan penangkap yang sama.

b. Sulit memindahkan koloni apabila ingin dipelajari lebih lanjut.

c. Memboroskan bahan dan waktu tidak memerlukan keterampilan yang terlampau tinggi.

Menurut Lay (1994), cara mendapatkan biakan murni yaitu:

1. Teknik penggoresan agar, kelebihan dari teknik pengembangbiakan ini adalah memerlukan biaya yang lebih murah dan tidak memakan waktu yang lama, namun memerlukan memerlukan keterampilan peneliti karena pada prinsipnya menggores media pada cawan petri , apabila penggoresan tidak sempurna akan menumbuhkan koloni yang terpisah

2. Teknik agar tuang, kelebihan dari teknik ini adalah tidak memerlukan keterampilan khusus, sedangkan kekurangannya adalah boros bahan dan waktu

3. Teknik agar sebar, kelebihan dari teknik ini adalah lebih mudah ditangkap koloninya dan butuh keterampilan

4. Teknik pemindahan biakan

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Fungsi Pada praktikum Mikrobiologi Dasar mengenai Pembuatan Media dan Penanaman, alat-alat yang digunakan antara lain:

Hot Plate

: sebagai sumber panas

Gelas beaker

: tempat perebusan

Timbangan

: untuk mengukur massa bahan/sampel

Tabung reaksi

: untuk mereaksikan zat dalam jumlah kecil

Autoklaf

: untuk alat sterilisasi basah

Cawan petri

: tempat media biakan

Erlenmeyer

: tempat pembuatan media NA

Gelas ukur

: untuk mengukur volume aquades

Timbangan digital

: untuk mengukur massa bahan dengan ketelitian

0,01 gram.

3.2 Bahan dan FungsiBahan-bahan yang digunakan dalam praktikum Mikrobiologi Dasar mengenai Pembuatan Media dan Penanaman antara lain:

Air destilata 250 ml: untuk merendam daging

NA

: bahan pembuatan media NA

Aquades

: sebagai pelarut

Tali

: untuk mengikat cawan petri dan pipet serologis

dalam koran

Kapas

: untuk menyumbat ujung pipet serologis

Kertas Koran: untuk membungkus cawan petri dan pipet

serologis saat sterilisasi basah

Kertas label: untuk menandai

3.3 Cara KerjaPembuatan Media NA

NA yang dibutuhkan ditimbang sebanyak 1,84 gram. Selanjutnya diukur dengan aquades sebanyak 30 ml, langkah selanjutnya NA dan aquades dihomogenkan dalam Erlenmeyer, kemudian Erlenmeyer di tutup dengan kapas dan dibungkus dengan Koran dan diikat. Setelah itu direbus selama 15 menit kemudian disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit dan didapatkan media NA steril.

Penanaman

Media NA dimasukkan sebanyak 15-20 mL ke dalam masing-masing cawanpetri, kemuadian didiamkan hingga media berubah menjadi padat. Setelah media NA padat media siap untuk ditanami bakteri dengan menggunakan tekhnik apusan zigzag menggunakan bantuan sengkelit.sesudah bakteri ditanam di permukaan media NA cawan petri kemudian ditutup dan dibungkus dengan Koran kemudian diikat dengan tali, untuk selanjutnya diinkubasi di dalam incase.

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Pembuatan Media NA

Pada pratikum Mikrobiologi Dasar materi Pembuatan Media, Pengenceran dan Penanaman. Langkah pertama yang dilakukan adalah disiapkan alat dan bahan . Alat-alat yang digunakan adalah hot plate sebagai sumber panas, autoklaf sebagai sterilisasi basah, cawan petri untuk tempat melakukan penanaman, erlenmeyer untuk tempat menghomogenkan larutan, pembakar sspritus untuk pengkondisian aseptis, gelas ukur untuk mengukur volume larutan, pipet volume untuk memindahkan larutan dalam skala 1-10 ml, timbangan digital untuk menimbang massa/berat dengan ketelitian 10^(-2).

Bahan-bahan yang digunakan adalah air destilasi untuk campuran atau pelarut dalam pembuatan media, NA sebagai media pertumbuhan bakteri, aquadest untuk melarutkan sampel, tali untuk mengikat bungkusan koran, kapas untuk mengatur laju larutan, koran untuk membungkus cawan petri, dan kertas label untuk memberi tanda.

Pertama ambil NA sebanyak yang dibutuhkan.Kemudian ditimbang sebayak 1,84 gram kemudian NA dimasukkan kedalam erlenmeyer.Ditambahkan aquades sebanyak 30 ml.Lalu homogenkan NA dan aquades dengan spatula agar larutan menyatu.Lalu mulut erlenmeyer ditutup dengan menguunakan kapas agar tidak terjadi kontaminasi dengan lingkungan luar.Setelah itu dibungkus dengan koran agar dapat menyerap air.Kemudian diikat dengan tali supaya tidak mudah lepas saat perebusan.Lalu direbus dalam panci selama 15-20 menit.Hal ini bertujuan agar larutan tersebut menjadi homogen.Kemudian distrerilisasi dengan autoclaf pada suhu 121 dan tekanan 1 atm selama 15-20 menit dan didapatkan NA steril.

gramNA = 20/1000 x cawan x 20 mL. Penanaman Bakteri

Untuk penanaman bakteri, metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah metode tuang.Pertama-tama disiapkan cawan petri steril.Kemudian dimasukkan sampel sebanyak 1mL dari tabung reaksi, setelah itu dimasukkan media Na sebanyak 15-20 mL.Lalu NA yang ada dicawan petri digoyang membentuk angka 8 untuk meratakan dan memadatkan, lalu didinginkan sampai media NA menjadi padat.Kemudian cawan petri dibalik agar uap air tidak mengenai media yang dapat menyebabkan spreader.Penanaman dilakukan degan menggunakan tekhnik zigzag dengan bantuan jarum loop sebagai alat penanamnya. Setelah itu cawan petri dibungkus koran dan diikat tali agar kertas koran tidak terlepas.Kemudian diinkubasi di dalam etalase bakteriselama 2 malam. Tujuannya untuk menghindari tumbuhnya mikroba yang tidak diinginkan, lalu akan didapatkan hasilnya.

4.2 Analisa Hasil

Menurut Fardiaz (1993),NA adalah suatu medium yang mengandung sumber nitrogen dalam jumlah yang cukup yaitu 0,3% ekstrak sapi, dan 0,5 % pepton tetapi tidak mengandung sumber karbohidrat. Oleh karena itu baik untuk pertumbuhan bakteri, tetapi kapang dan khamir tidak dapat tumbuh dengan baik. Berikut adalah hasil visualisasi media NA,PDA dan media kaldu setelah dan sebelum disterilisasi:MediaSebelum SterilisasiSetelah Sterilisasi

NAAgak keruh,warna kuning, terdapat substrat dibawah dan menggumpal.

Kuning,substrat megental dan bercampur serta tidak ada endapan kuning, bening, agak mengental.

BAB V

PENUTUP5.1 Kesimpulan

Pada praktikum Mikrobiologi Dasar mengenai pembuatan media dan penanaman, diperoleh beberapa kesimpulan antara lain:

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrient, yang bertujuan untuk membiakkan mikroba.

Bakteri yang tumbuh pada media sangat tergantung pada komposisi nutrisi dalam media itu sendiri.

Komposisi Nutrient Agar (NA) antara lain ekstrak yeast 2 gram, pepton 5 gram, agar 10 gram, sodium chloride 5 gram, lab lemco powder 1 gram.

Metode penanaman bakteri terdiri dari metode tuang (pour plate) dan metode tebar (spread plate).

Metode yang penanaman digunakan dalam praktikum adalah metode gores (zig-zag).

NA (NUTRIEN AGAR) adalah padatan yang bermaksut membuat media jadi padat, komposisi NA : Ekstrak daging sapi 3 gr Pepton

5 gr Agar

15 gr Air

1000 ml Hasil visualisasi media NA sebelum sterilisasi adalah warna agak keruh kekuniangan, terdapat substrat di bawah dan menggumpal. Setelah direbus warna kekuningan, substrat bercampur, mengental. Setelah sterilisasi warna lebih pekat dan lebih kuning. DAFTAR PUSTAKA

Amelia, G .2005.Dunia Mikroba 2. Balroom Karya Aksara : Jakarta.

Amelia, G., R. Handajani, I. Saskiawan, I. Khusniati, A. Cholik. 2005. Isolasi dan Pengujian Aktivitas Enzim Amilase dan Profase Mikroba dari Terasi Asal Kalimantan Timur. Program Studi Kimia, FMIPA, IPB: Bogor.

Dwijoseputro, D. 1978. Dasar Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta

Ferdiaz.1993.Mikrobiologi Pangan. PT.Raja Grafindo Persada:Jakarta.Hadioetomo.1985.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek .Gramedia :Jakarta.Hadioetomo.1990.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Jilid 2.Gramedia: Jakarta. Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. Raja Grafindo Persada: Jakarta.

Murachaman, Ahmad Soewarso, dan Heppy Nursyam .1991 .Buku Panduan Praktikum Mikrobiologi. FPIK. Universitas Brawijaya : Malang

Murachman, Ahmad Soewarso, dan Heppy Nursyam.1995. Buku Panduan Praktikum Mikrobiologi jilid 2. FPIK. Universitas Brawijaya : Malang.

Pratiwi. 2005. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga : Jakarta.

Restuati. 2008. Perbandingan Chitosan Kulit Udang dan Kulit Kepiting dalam Menghambat Pertumbuhan Kapang Aspengilus idalius.Unsu : Jakarta.

Stanier, Roger Y., Edward A. Adelberg., dan John L. Ingraham. 1984. Dunia MikrobeII. Bhratara Karya Aksara: Jakarta.

Suriawiria, Unus.1995. Mikrobiologi Dasar. Papasinas Sunar : JakartaSutedjo, Mulmulyani., A. E. Kartapoerta, dan S. Sastroatmojo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta : Jakarta.(PERCOBAAN 3) PEWARNAAN GRAM

BAB IPENDAHULUAN1.1 Latar belakang

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1853-1938 yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae. Dalam melakukan pewarnaan gram diperlukan empat macam pewarn aan dengan fungsi yang berbeda yaitu :

Pewarnaan primer,(dapat memberikan warna pada semua jenis bakteri)

Pengikat (memperkuat ikatan kompleks antara pewarna dengan komponen dinding bakteri

Penghilang warna (melarutkan sisa zat warna dan kompleks zat warna dengan lipid pada dinding bakteri)

Pewarnaan pengganti (memberikan warna pada dinding bakteri yang kehilangan pewarna primernya.

Pada dasarnya bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu (tongkat), kokus dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagianya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setenggah melengkung dan tidak melengkung. Stapylococcus aureus adalah bakteri gram positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur.Beberapa karakteristik yang dimiliki staphylococcus Aureuss diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negative, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCI pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu, biasanya Stapylococcus aureus merupaka pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru, radang kelenjar dada, radang urat darah serata menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan superantigens kedalam aliran darah.

E.coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 mikrometer dan diameter 0,5 mikrometer. Volume sel E.coli berkisar 0.6-0,7 mikrometer kubik. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C, optimum pada 37 derajat. Kita mungkin banyak yang tidak tahu jika diusus besar manusia terkandung sejumlah E.colli yang berfungsi membusukkan sisa makanan.

Pseudomonas auruginosa adalah aerob obligat yang tumbuh dengan mudah pada banyak jenis media pembiakan, karena memiliki kebutuhan nutrisi yang sederhana. Medium paling sederhana untuk pertumbuhannya terdiri dari asetat (untuk karbon) dan ammonium sulfat (untuk nitrogen). Metabilisme bersifat respirator tetapi dapat tumbuh tanpa O2 bila tersedia NO3 sebagai akseptor electron kadang-kadang berbau manis seperti anggur yang dihasilkan aminoasetofenon. Beberapa strain menghemolisis darah. bakteri ini pada dasarnya merugikan bagi pertanian, Bakteri ini juga memiliki karakteristik antara lain berwarna hijau kebiru-biruan serta berbentuk batang.

1.2 Maksud dan Tujuan

Maksud dari praktikum ini adalah agar mahasiswa :

Mengetahui prosedur kerja pewarnaan gram

Mengetahui bentuk-bentuk (morfologi) bakteri

Mengetahi sifat bakteri berdasarkan pewarnaan gram

Tujuan dari praktikum ini adalah :

Membuat sediaan untuk pewarnaan gram

Melakukan proses pewarnaan gram

Mengamati morfologi dan sifat bakteri yang terdapat pada sediaan berdasarkan pewarnaan gram1.3 Waktu dan Tempat

Praktikum pewarnaan gram dilaksanakan pada hari Rabu 22 April 2015 di Laboratorium Istrument, Jurusan Analis Kimia, Fakultas Matematika dan ilmu Pengetahuan Alam, Universitas pendidikan Ganesha Singaraja.BAB IITINJAUAN PUSTAKA

1. Bakteri

Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam kelompok prokariot dan berukuran sangat kecil (mikroskopik) yaitu 0,5-5 m, serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Bakteri dapat ditemukan di hampir semua tempat: di tanah, air, udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit (patogen), bahkan dalam tubuh manusia. Bakteri yang ingin diamati dalam praktikum ini ditangkap dari kandang biologi UM dan kantin FE Universitas Negeri Malang (Wikipedia,2014)

2. Pewarnaan Bakteri

Bakteri sulit diamati di bawah mikroskop cahaya karena pada umumnya bakteri tembus cahaya, tidak mempunyai butir warna dan tidak mempunyai perbedaan warna yang kontras antara sel dengan medium. Tujuan dari pewarnaan bakteri adalah memperjelas bentuk dan ukuran sel, melihat struktur luar dan dalam (jika memungkinkan) dan melihat reaksi sel terhadap zat pewarna. Teknik pewarnaan bakteri ada dua yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan diferensial. Pewarnaan sederhana dibedakan menjadi dua yaitu pewarnaan langsung dan tidak langsung. Berikut tabel untuk memudahkan penggolongan pewarnaan bakteri secara sederhana:

PembedaPewarnaan sederhana secara

LangsungTidak langsung

Jumlah zat pewarna1 macam (kristal violet, safranin, methylene blue)1 macam (tinta cina, nigrosin)

Sifat pewarnaanlangsung/positif, karena zat warna dapat bereaksi dengan sel bakteri, sehingga sel bakteri berwarna.tidak langsung/ negatif, karena sel bakteri tidak dapat menyerap zat warna, sehingga tidak berwarna, sedang latar belakangnya berwarna

PerlakuanDifiksasiTidak difiksasi

Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan yang memakai beberapa macam zat warna dan dapat membedakan bakteri berdasarkan afinitas (daya gabung) antara zat warna dengan bakteri (Hastuti1, 2012)

3. Sifat bakteri berdasarkan pewarnaan gram

Pewarnaan gram dirintis oleh Cristian Gram yang bertujuan untuk menentukan golongan bakteri atas bakteri gram positif dan gram negatif. Pada bakteri Gram positif setelah pelunturan warna dengan alkohol, sel akan mengalami dehidrasi dan terjadi pengerutan pori-pori. Hal ini menyebabkan permeabilitas membran sel bakteri turun dan kompleks kristal violet iodium tidak dapat keluar dari sel. Pada bakteri gram negatif, setelah pelunturan warna dengan alkohol, lemak akan dikeluarkan dari dinding sel, akibatnya porositas membran meningkatdan kompleks kristal violet iodium akan keluar dari sel (Hastuti1, 2012).

Dinding sel bakteri gram positif tebal yang terdiri dari peptidoglikan (50-90%). Peptidoglikan terutama polisakarida terdiri dari dua subunit yaitu N-asetil glukosamin dan N-asetil asam muramic. Sebagai lapisan yang berdekatan dari peptidoglikan terbentuk, N-asetil glukosamin dan N-asetil asam muramic dihubungkan oleh rantai pendek peptida dengan bantuan enzim transpeptidase, sehingga dinding sel menjadi kaku. Lapisan peptidoglikan yang tebal memungkinkan organisme untuk mempertahankan violet-iodine kompleks kristal. Asam lipoteikoat (LTA) juga merupakan unsur utama dari dinding sel bakteri Gram-positif.

Bakteri Gram-negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (10% dari dinding sel) dan mengalami kehilangan violet-iodine kompleks kristal selama dekolorisasi dengan bilasan alkohol, tetapi dapat mempertahankan noda kontra Safranin, sehingga muncul kemerahan atau merah muda. Bakteri gram negatif juga memiliki membran luar tambahan yang berisi lipid, yang dipisahkan dari dinding sel dengan cara ruang periplasma.BAB IIIMETODOLOGI

3.1 Alat dan Fungsi

Jarum Loop untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru.

Kaca Obyek untuk meletakan onyek yang akan diamati dengan mikroskop.

Mikroskop untuk mengamati obyek dengan ukuran sangat kecil yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.

Pembakar Bunsen untuk mensterilkan alat atau sebagai sumber panas untuk memanaskan alat atau bahan yang akan digunakan dalam praktikum.

Alat Penetes untuk meneteskan larutan yang akan digunakan.

3.2 Bahan dan Fungsi

Sampel Bakteri

Kristal Ungu

Aquades

Iodium

Etanol 70%

Safranin3.3 Cara Kerja

Diambil bakteri yang telah diisolasi dengan menggunakan jarum loop kemudian gesekkan jarum loop yang berisi bakteri pada kaca obyek. Fiksasi kaca obyek tersebut diatas Bunsen lalu preparat yang telah difiksasi ditetesi dengan Kristal ungu dan didiamkan selam 1 menit. Kemudian bilas dengan akuades, lalu tetesi dengan iodium dan diamkan selama 2 menit. Bilas dengan akuades, kemudian dicuci dengan etanol 70% kemudian bilas dengan akuades kembali kemudian ditetesi dengan safranin dan didiamkan selama menit. Bilas dengan akuades, kemudian amati preparat di bawah mikroskop kemudian di dokumentasikan.BAB IVPEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

Pewarnaan Bakteri dilakukan dengan menggunakan 2 isolat bakteri yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan Kristal ungu selama 1 menit agar melekat pada dinding sel bakteri. Kemudian dibilas dengan akuades. Ditetesi dengan iodium selama 2 menit yang berfungsi untuk pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat, kemudian dibilas dengan akuades. Dicuci dengan etanol 70%. Ditetsi safranin sehingga berwarna merah berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target dilakukan selama menit agar bakteri yang cat warnanya luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000).

4.2 Analisa Hasil

4.2.1 Data hasil pengamatan

PembedaLokasi

Pasar Anyar

Hasil tangkapan

Hasil pewarnaan

Bentuk selStreptococcus

Warna sel setelah diwarnaiMerah

Sifat Gram bakterinegatif

4.2.2 Pembahasan

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Pada langkah pertama, pemberian ammonium oksalat kristal violet pada bakteri yang dicobakan akan memberi warna ungu pada seluruh bagian dinding sel. Pada langkah kedua (yang merupakan langkah kunci dari keempat tahap pewarnaan gram), bakteri diberi iodium atau mordant. Larutan ini bekerja sebagai penstabil (stabilizer) yang menyebabkan larutan pertama membentuk kristal violet yang besar dalam lapisan peptidoglikan dinding bakteri. Dalam hal ini, apabila bakteri yang dicobakan merupakan bakteri gram negatif yang memiliki lapisan peptidoglikan tipis, maka kristal violet tersebut hanya akan menempel pada membran lipid. Sedangkan pada bakteri gram positif akan tertanam lebih dalam (peptidoglikannya tebal). Penggunaan alkohol pada tahap ketiga ini yang akan melarutkan lapisan lipid pada dinding bakteri (khususnya bakteri gram negatif) dan melunturkan warna ungu dari kristal violet tadi. Sebaliknya, pada bakteri gram positif pemberian larutan ini tidak berpengaruh banyak karena kristal violet telah tertanam pada lapisan peptidoglikannya yang tebal sehingga tidak mudah luntur. Karena pemberian alkohol menyebabkan lunturnya warna ungu dari dinding sel bakteri gram negatif (dinding sel tidak berwarna lagi), maka penambahan larutan safranin akan menyebabkan dinding sel kembali berwarna lagi, namun dengan warna merah (safranin merupakan larutan berwarna merah).

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan

Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan struktur sel bakteri dilakukan dengan cat gram A, gram B, gram C, dan gram D. Bentuk sel bakteri yang ditemukan adalah bentuk Streptococcus dan bakteri ini adalah bakteri gram negatif. Lama pewarnaan dan langkah-langkah urutan pewarnaan harus diperhatikan. Etanol terhindin adap bakteri dapat menyebabkan tereksistasinya lapisan lipid sehingga memperbesar daya serap atau permiabilitas dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu kristal iodium yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam proses pewarnaan dapat tereksistasi. Karena itu organisme gram negatif pewarnaan kehilangan warna tersebut, disebabkan kandungan lipidnya yang lebih rendah.5.2 Saran

Sebaiknya pada saat praktikum benar-benar diperhatikan prosedur pewarnaan terutama pada lama waktu dan urutan pewarnaan agar tidak terjadi kesalahan dan warna yang terlalu tebal. Pada saat pengembalian isolat juga diperhatikan apakah isolat tersebut benar-benar sudah diangkat sehingga preparat apusan yang dihasilkan baik.

1