MAKALAH IMUNOLOGIIMUNOASAI DEMAM TIFOID

KELOMPOK 1B

Elsa Elfrida 1111102000032

Faradhila Nur Saraswati 1111102000038

Yuda Kusuma Anggara 1111102000046

Arini Eka Pratiwi 1111102000051

Syaima 1111102000056

Sonia Ulfah 1111102000116

Rifda Naili Muna 1111102000130

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2012

Pertanyaan dan Jawaban

Mengapa kekeruhan antigen merupakan kelemahan uji widal dan apa cara terbaik menentukan kekeruhan antigen?

Kekeruhan antigen mempengaruhi konsentrasi dan jumlah antigennya. Sedang pada uji widal kekeruhan yang dikehendaik adalah 3 U Mc Farland. Cara terbaik untuk menentukan kekeruhan dapat dilakukan dengan spektrofotometri, karena spesifik berdasarkan spektrum antigen

Bagaimana cara mendapatkan nilai spesifitas dan sensitivitas dari uji Elisa?

Ada rumusnya.

Mengapa waktu mengerami pada uji tabung berbeda-beda?

Tiap antigen yang diuji mempunyai sifat yang berbeda sehingga memerlukan waktu untuk memberikan hasil yang berbeda

Kenapa waktu pengambilan sampel mempengaruhi sensitivitas dan spesifitas?

Selang waktu yang lama antara pengambilan sampel dan pemeriksaan akan menurunkan mutu dari sampel, bila mutu buruk dapat menurunkan sensitivitas dan spesifisitas

Apa pengertian prozone dan postzone?

Fenomena Prozone merupakan kemungkinan penyebab reaksi negatif palsu antigen-antibodi yang disebabkan oleh jumlah antibodi yang berlebihan

Pasca-zona fenomena mengacu pada Kelebihan antigen sehingga tidak ada pembentukan kisi dalam reaksi aglutinasi

Bagaimana cara menentukan control positif dan kotrol negative pada validitas interna?

Tabung kontrol (+) : larutan garam fisiologis +serum pasien + suspensi antigen aglutinat↔ harus kelihatan

Tabung kontrol (-) : larutan garam fisiologis +suspensi antigen aglutinat ↔ tidak kelihatan

Materi Tambahan

Uji ELISA untuk melacak antigen S. typhi

Rockhill et al.

- Koaglutinasi selama 18 jam- Caranya : S. aureus strain Cowan I memproduksi protein A dan dapat mengikat IgG spesifik

terhadap antigen Salmonella C1, D, dan Vi.- Sensitivitas 97% dan spesifisitas 83%

Wong

- Hasil dapat diperoleh dalam waktu 1 menit- Sensitivitas 67,5-100% dan spesifisitas 97,8-100%

Chaicumpa

- Caranya : 3 µl urin diteteskan di atas kertas nitroselulose- Sensitivitas 85%

Sadallah

- Sensitivitas 96% dan spesifisitas 92%

Uji ELISA yang sering dipakai untuk melacak adanya antigen S. typhi dalam specimen klinis adalah double antibody sandwich ELISA. Qadri dengan double antibody sandwich ELISA menggunakan antibody monoclonal terhadap Salmonella 0-9 untuk melacak antigen S. typhi dalam urin dan plasma penderita, mendapatkan korelasi 100% dengan biakan darah yang positif (sensitivitas 100%) serta spesifisitas juga 100%.

Cara menghitung nilai spesifitas dan sensitivitas dari uji Elisa

Pada alat uji Elisa tersebut akan muncul sejumlah angka, dari angka-angka tersebut kita konversikan

dengan rumus yang sesuai untuk menghitung nilai dari spesifitas dan sensitivitas dari sample yang

diujikan.

Kelemahan Uji Widal (Carpenter 1975, Sonnenwirth 1970)

a. Antigennya 1. Strain S. typhi yang dipakai amat berpengaruh pada hasil uji widal. Antigen yang dibuat dari

strain S. typhi yang bukan berasal dari daerah endemis yang bersangkutan dapat memberikan hasil yang negative maupun positif semu.

2. Kekeruhan suspense antigen yang kurang tepat dapat menimbulkan fenomena prozone maupun postzone. Biasanya dipakai derajat kekeruhan sebesar 3 U Mc. Farland.

b. Kadar Aglutinin Dalam SerumKadar aglutinin yang amat tinggi dapat menimbulkan fenomena prozone sehingga dapat

menyebabkan kesalahan dalam pembacaan hasil uji Widal.

c. Cara Pembacaaan Uji WidalPembacaan dilakukan dengan mata telanjang sehingga amat subjektif dan dapat

memberikan ketidaksesuaian hasil pembacaan (discrepancy) yang cukup besar.

d. Warna AglutinatUmumnya tidak berwarna sehingga dapat menyukarkan pembacaan hasil uji Widal.

Karakteristik Uji Widal

a. Validitas

1. Validitas internaDetektibilitas : Daya lacak dari uji Widal tergolong sedang. Akurasi : Pada uji semikuantitatif, dijamin oleh adanya kontrol positif dan

kontrol negative.

Presisi : Kurang baik, ketidaksesuaian antar pembaca cukup besar.

2. Validitas eksternaSensitivitas : Sensitivitasnya cukup tinggiSpesifitas : Hanya sedang saja, sebab banyak factor yang mempengaruhinya (lihat

interprestasi hasil.

b. KepraktisanCukup praktis, hanya membutuhkan waktu inkubasi selama 24 jam pada 37C. Pada

uji Widal lempeng hanya dibutuhkan waktu kurang dari 5 menit.

c. Biaya PemeriksaanCukup murah, masih terjangkau oleh masyarakat.

Keuntungan dari spektrofotometeris dalam penentuan kekeruhan antigen

1. Penggunaannya luas, dapat digunakan untuk senyawa anorganik, organik dan biokimia yang diabsorpsi di daerah ultra lembayung atau daerah tampak.

2. Sensitivitasnya tinggi, batas deteksi untuk mengabsorpsi pada jarak 10-4 sampai 10-5 M. Jarak ini dapat diperpanjang menjadi 10-6 sampai 10-7 M dengan prosedur modifikasi yang pasti.

3. Selektivitasnya sedang sampai tinggi, jika panjang gelombang dapat ditemukan dimana analit mengabsorpsi sendiri, persiapan pemisahan menjadi tidak perlu.

4. Ketelitiannya baik, kesalahan relatif pada konsentrasi yang ditemui dengan tipe spektrofotometer UV-Vis ada pada jarak dari 1% sampai 5%. Kesalahan tersebut dapat diperkecil hingga beberapa puluh persen dengan perlakuan yang khusus.

5. Mudah, spektrofotometer mengukur dengan mudah dan kinerjanya cepat dengan instrumen modern, daerah pembacaannya otomatis.

Enzim-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa indonesianya disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut - enzim, merupakan teknik pengujian serologi yang di dasarkan pada prinsip interaksi antara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya). Namun seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan, teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bidang patologi tumbuhan, kedokteran, dll.

I. Sejarah Penemuan dan Prinsip Dasar Teknik ELISA

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidangimunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, di mana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal.Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simpel dapat dijabarkan sebagai berikut: Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu secara penempelan secara nonspesifik dengan adsorbsi ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibodi atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich).

Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel=> bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik; sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatu substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau dengan cara menentukan

jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standar dan kadar antigen atau antibodi yang tidak diketahui dapat ditentukan.

II. Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISA

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain:

Teknik pengerjaan relatif sederhana. Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga

menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi) Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut

sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik)

Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain:

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif cukup mahal.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.

Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat,sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

III. Alat & Bahan Yang Digunakan

Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter. Microtiter ini berupa suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah bawah dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini terbuat dari bahan polistirena. Cekungan dari microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter 0,7 cm. Berikut ini adalah gambarnya:

Selain itu, alat dan bahan lain yang umum digunakan dalam teknik ELISA antara lain:

Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antibodi).

Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antigen).

Larutan standard (kontrol positif dan negatif). Sampel yang ingin dites. Cairan pencuci (buffer). Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.

IV. Macam-Macam Teknik ELISA

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.

Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagai macam jenis teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain:

ELISA Direct

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel. ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel

pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi

antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain:

Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertautdengan enzim. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu danmahal. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dariantibodi pada

percobaan yang berbeda. Amplifikasi signal hanya sedikit. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikansebelum digunakan

untuk uji ELISA direct.

Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:

Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silangdengan antibodi lain

(antibodi sekunder) dapat diminimalisasi.

ELISA Indirect

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.

Pada ELISA indirect, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen

spesifik dengan antibodi yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu, ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain:

Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal.

Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain:

Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual secara komersial di pasar. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan

enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada wadah berbeda. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki beberapa

epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder.

ELISA Sandwich

Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi)

aatau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISAsandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.

Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.

Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi detektor, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Selanjutnya

microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi detektor yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain:

Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang microtiter Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen

Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

ELISA Biotin Streptavidin (Jenis ELISA modern)

Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibodi, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan pada teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detektor (antigen bertaut enzimsignal, bersifat optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut dengan enzim signal).

Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin yang tertaut dengan suatu antibodi avidin dengan mengubah antibodi avidin menjadi antibodi streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.

ELISA Kompetitif

Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu. Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu kompetitor ke dalam lubang microtiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi.

Pada pendeteksian antigen, pertama microtiter diisi antibodi spesifik yang dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik tertaut enzim signal, sehingga antibodi spesifik

tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antibodi spesifik yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen spesifik tertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibodi spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen yang telah berinteraksi dengan antibodi spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibodi spesifik.

Sedangkan, pada pendeteksian antibodi, pertama microtiter diisi antigen spesifik yang dapat berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan maupun antibodi spesifik tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu larutan yang mengandung antibodi spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibodi spesifik tertaut enzim signal dengan antibodi yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi spesifik tertaut enzim signal atau antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibodi spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antibodi yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik.

Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen.

ELISA Multiplex

Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian secara simultan, sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.

V. Contoh Langkah Kerja Teknik ELISA

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA,yaitu:

Pendeteksian antibodi dengan ELISA indirect:

1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding / permukaan selama 30-60 menit.

2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer 3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein

yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk),4. Membilas protein yang tidak melekat.5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibodi

spesifik untuk berikatan dengan antigen.6. Membilas antibodi yang tidak terikat. 7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik

(sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.

8. Membilas kompleks antibodi-enzim yang tidak terikat.9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim

akan dikonversi menjadi produk.10. Inkubasi sampai muncul warna dan11. ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteksi, maka makin

besar kadar antibodi spesifik dalam sampel.

Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:

1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antibodi menempel pada dinding / permukaan selama 30-60 menit.

2. Membilas antibodi (yang tidak terikat) dengan buffer 3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein

yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk),4. Membilas protein yang tidak melekat.5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibody untuk

berikatan dengan antigen spesifik dari simpel.6. Membilas antigen yang tidak terikat.7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk

epitop yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.8. Membilas antibodi-enzim yang tidak terikat.9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim

akan dikonversi menjadi produk.10. Inkubasi sampai muncul warna.11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteksi, maka makin

besar kadar antigen spesifik dalam sampel.

VI. Aplikasi Teknik ELISA

Berikut ini adalah beberapa contoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:

a. Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus: HIV-1 and HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV) Hepatitis C (presence of antibodies) Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus) HTLV-1 and -2 (keberadaan antibody)

b. Pengukuran level hormon hCG (sebagai tes kehamilan) LH (menentukan waktu ovulasi) TSH, T3 and T4 (untuk fungsi thyroid)

c. Pendeteksian infeksi-Agen penularan secara seksual, HIV, syphilis, and chlamydia Hepatitis B and C-Toxoplasma gondiid.

d. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.

e. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatan terlarang, seperti-cocaine-opium Δ-9-tetrahydrocannabinol, campuran aktif pada marijuana.