BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Protein adalah makromolekul yang paling melimpah di dalam sel hidup

dan protein juga mempunyai berbagai peranan biologis karena protein merupakan

instrumen molukuler yang menyampaikan informasi genetik. Protein adalah

sumber asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N yang tidak

dimiliki lemak atau karbohidrat. Sesuai dengan peranan itu, protein berasal dari

kata Yunani proteios, yang artinya pertama. Apabila organisme sedang

kekurangan energi, maka protein ini dapat digunakan sebagi sumber energi.

Kandungan energi protein rata-rata 4 kkal/g atau setara dengan kandungan energi

karbohidrat.

Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino,

mempunyai rumus dasar R-CHNH2COOH dimana R adalah gugus rantai

samping. Asam amino merupakan monomer pembentuk protein, mempunyai

peranan penting dalam metabolisme sel hidup. Adanya gugus rantai samping

tersebut menyebabkan sifat berbeda antara asam-asam amino dan juga berbedanya

sifat protein. Gugus amino asam amino dan gugus karboksil memperlihatkan

semua reaksi yang dapat diharapkan dari fungsi ini, misalnya pembentukan

garam, pengesteran, dan asilasi. Gugus rantai samping juga menghasilkan reaksi

spesifik dengan pereaksi tertentu. Oleh karena itu, pada percobaan ini akan diuji

reaksi spesifik asam amino dengan pereaksi ninhidrin, Hopkins-Cole, dan garam

nitroprussida. Begitupun dengan protein akan diidentifikasi dengan reaksi biuret

dan millon.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1 Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dan memahami

reaksi-reaksi spesifik dari asam amino dan protein.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dari percobaan ini adalah :

1. Mengidentifikasi adanya gugus α-amino bebas pada asam amino dan protein

melalui tes ninhidrin.

2. Mengidentifikasi adanya gugus sulfuhidril spesifik pada asam amino sistein

dengan nitroprussida dalam amoniak.

3. Mengidentifikasi protein melalui tes biuret.

4. Mengidentifikasi adanya gugus indol spesifik pada asam amino triptofan

melalui tes Hopkis-Cole.

5. Mengidentifikasi adanya gugus hidroksifenil spesifik pada asam amino tirosin

melalui tes Millon

1.3 Prinsip Percobaan

Mengidentifikasi asam amino dan protein dengan menggunakan beberapa

pereaksi tertentu yang digunakan melalui beberapa tes yaitu tes ninhidrin, reaksi

gugus rantai samping, tes Biuret, tes Hopkins-Cole dan tes Millon yang hasilnya

ditandai dengan adanya perubahan warna dan endapan yang menunjukkan bahwa

adanya reaksi uji positif pada asam amino dan protein.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino.

Asam amino yang terdapat sebagai komponen protein yang mempunyai gugus

NH2 pada atom karbon α dari posisi gugus COOH ( Poedjiadi, 1994).

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut

organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform. Sifat asam amino ini

berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan sifat amina. Asam karboksilat

afilatik maupun aromatik yang terdiri dari beberapa atom karbon umumnya

kurang larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik, demikian pula amina

pada umumnya tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik. Asam

amino mempunyai titk lebur yang lebih tinggi ( Poedjadi, 1994).

Asam karboksilat dan gugus fungsi amina secara bersamaan berda dalam

asam amino. Asam amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil.

Gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion amonium, sedangkan gugus

karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai anion karboksilat. Struktur

dipolar ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki

titik leleh agak tinggi dan kelarutannya dalam pelarut organik relatif rendah.

Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan

mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa

dan menerima proton dari asam kuat. Ini dapat dinyatakan dalam kesetitimbangan

untuk asam amino (Hart, dkk., 2003).

Atom α-karbon dari asam amino, terkecuali glisin, masing-masing

dihubungkan pada empat gugus kimia yang berlainan yang merupakan

karakteristik suatu atom karbon asimetris dan pusat khiral. Serta hubungannya

didalam ruang dengan atom karbon asimetrik yang valensi-valensinya tersusun

secara tetrahedral, isomer-isomer molekul tersebut dapat digambarkan dengan

model tiga dimensi. Jika gugus R identik dalam tiap model dan di dalamnya tidak

mengandung pusat-pusat asimetrik lainnya, maka kedua model tersebut saling

merupakan baayangan cermin satu terhadap yang lain, dan masing-masing isomer

optis aktif. Kedua isomer tersebut memutar bidang cahaya terpolarisasi dengan

arah yang berbedah. Pasangan isomer semacam ini di sebut enantiomorf. Suatu

senyawa yang memutar bidang cahaya, terpolarisasi searah jarum jam dikatakan

memutar ke kanan, sebagai lawan senyawa yang memutar ke kiri, sayangnya sifat

ini tidak mempunyai hubungan yang sederhana dengan pengaturan meruang

gugus-gugus disekeliling pusat khiral (Ismadi, 1993).

Ninhidrin adalah reagen berguna untuk mendeteksi asam amino dan

menetapkan konsentasinya dalam larutan. Senyawa ini merupakan hidrat dari

triketon siklik, dan bila bereaksi dengan asam amino, menghasilkan zat warna

ungu. Hanya atom nitrogen dari zat warna ungu yang berasal dari asam amino,

asam amino selebihnya terkonversi menjadi aldehida dan karbon dioksida.

Jadizat warna ungu yang sama dihasilkan dari semua asam amino α dengan gugus

amino primer dan intensitas warnanya berbanding lurus dengan konsentrasi asam

amino yang ada. Hanya prolina yang mempunyai gugus amino sekunder, bereaksi

berbeda dan menghasilkan zat warna kuning tetapi itu pun dapat digunakan untuk

analisis (Hart, dkk., 2003).

Asam aspartat dan asam glutamat memiliki dua gugus karboksil dan satu

gugus amino. Dalam asam kuat ketiga gugus tersebut berada dalam bentuk asam.

Jika pH dinaikkan dan larutan menjadi lebih basa, setiap gugus secara berturut-

turut melepaskan protonnya. Titik isoelektrik untuk asam aspartat yaitu pH saat

asam amino ini terutama berada dalam bentuk dipolar netral adalah 2,87. Keadaan

ini berbeda untuk asam amino dengan dua gugus basa dan hanya satu gugus

karboksil (Hart, dkk., 2003).

Analisis campuran asam amino yaitu mempunyai keistimewaan bersama

semua asam amino adalah gugus amino dan gugus karboksil. Sedikit perbedaan

sifat-sifat ionik gugus ini memungkinkan pemisahan asam-asam amino.

Mesin-mesin yang serba otomatis, yang disebut penganalisis asam amino,

menggunakan kromatografi pertukaran ion untuk melakukan pemisahan ini. Asam

amino yang telah dipisahkan direaksikan dengan ninhidrin (Ismadi, 1993).

Menurut klasifikasi asli yang modifikasi, protein dapat dibagi menjadi tiga

golongan yaitu protein serat, protein bujur telur, protein gabungan. Protein serat

adalah bentuk protein yang tidak larut yang ditemukan dalam kulit, rambut,

jaringan pengikat dan tulang. Protein ini dapat dibagi lagi menjadi collagen yaitu

protein pokok dari jaringan pengikat, tulang, gigi, dan tendon, dan keratin, protein

pokok dari kulit, kuku, sayap dan rambut. Protein bujur telur bentuknya bujur

telur dan umumnya larut dalam air. Protein ini dengan menggunakan klasifikasi

yang lebih modern dan lebih mudah diklasifikasi menurut fungsinya. Cara

klasifikasi lama protein bujur telur ini dapat dibagi menjadi beberapa sub bagian

empat diantaranya adalah albumin dapat diidentifikasi karena larut didalam air

dan larutan garam. Albumin yang khas terdapat dalam darah dan putih telur.

Protein gabungan adalah protein yang bergabung dalam senyawa bukan protein.

Misalnya protein dalam hemoglobin bergabung dengan besi yang mengandung

heme bukan protein ( Fessenden, 1997).

Protein dalam bentuk asalnya mempunyai tiga, kadang-kadang empat

tingkat struktur. Tingkat pertama disebut struktur primer yaitu urutan atau order

dari asam amino dalam rantai protein. Struktur dengan tingkat yang lebih tinggi

yang berhubungan dengan bentuk konformasi dari protein. Struktur sekunder

adalah bentuk dari rantai protein yang panjang yang dijadikan satu oleh ikatan

hidrogen antara proton dari amida dan gugus karbonil amida (Fessenden, 1997).

Asam aspartat merupakan satu dari 20 asam amino penyusun protein.

Asparagin merupakan asam amino analognya karena terbentuk melalui aminasi

aspartat pada satu gugus hidroksilnya. Asam aspartat bersifat asam, dan dapat

digolongkan sebagan asam karboksilat (Hidayat, 2011).

Alanin (Ala) atau asam 2-aminopropanoat merupakan salah satu asam

amino bukan esensial. Bentuk yang umum di alam adalah L-alanin (S-alanin)

meskipun terdapat pula bentuk D-alanin (R-alanin) pada dinding sel bakteri dan

sejumlah antibiotika. L-alanin merupakan asam amino proteinogenik yang paling

banyak dipakai dalam protein setelah leusin. Gugus metil pada alanina sangat

tidak reaktif sehingga jarang terlibat langsung dalam fungsi protein (enzim).

Alanina dapat berperan dalam pengenalan substrat atau spesifisitas, khususnya

dalam interaksi dengan atom nonreaktif seperti karbon. Dalam proses

pembentukan glukosa dari protein (Hidayat, 2011).

Sistein merupakan asam amino bukan esensial bagi manusia yang

memiliki atom S, bersama-sama dengan metionin. Atom S ini terdapat pada gugus

tiol (dikenal juga sebagai sulfhidril atau merkaptan). Karena memiliki atom S,

sistein menjadi sumber utama dalam sintesis senyawa-senyawa biologis lain yang

mengandung belerang. Sisteina dan metionin pada protein juga berperan dalam

menentukan konformasi protein karena adanya ikatan hidrogen pada gugus tiol

(Hidayat, 2011).

BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan

Larutan glisin, larutan alanin, larutan asam aspartat, larutan ninhydrin

0,1%, larutan albumin, larutan glioksilik, larutan natrium nitoprussida 1%, kristal

cysteina hydroklorida, NH4OH, akuades, NaOH 2,5 M, CuSO4 0,01 M, asam

sulfat pekat, pereaksi millon, tissue roll, kertas label, spiritus dan karet.

3.2 Alat

Tabung reaksi, pipet tetes, pipet skala 2 mL, rak tabung, lampu spiritus,

sikat tabung, gegep, labu semprot dan sendok tanduk.

3.3 Prosedur Percobaan

3.3.1 Tes Ninhidrin

Disiapkan 4 tabung reaksi yang kering dan bersih kemudian dimasukkan 3

mL albumin, glisin, alanin dan asam aspartat pada masing-masing tabung.

Ditambahkan 0,5 mL larutan Ninhidrin 0,1% pada masing-masing tabung lalu

dipanaskan hingga mendidih. Diamati perubahan warnanya.

3.3.2 Reaksi gugus rantai samping (gugus R)

Beberapa kristal Cysteina hidroklorida dimasukkan ke dalam tabung

reaksi, kemudian dilarutkan dengan 5 mL akuades. Lalu ditambahkan 0,5 mL

Natrium nitroprussida 1% dan 0,5 mL NH4OH. Diamati perubahan yang terjadi.

3.3.3 Reaksi Biuret

Disiapkan 4 tabung reaksi yang kering dan bersih kemudian dimasukkan 3

mL albumin, glisin, alanin dan asam aspartat ke dalam masing-masing tabung.

Ditambahkan 1 mL NaOH 2,5 M ke dalam masing-masing tabung lalu dikocok

dengan baik. Kemudian ditambahkan setetes CuSO4 0,01 M dan dikocok. Jika ada

perubahan warna, ditambahkan lagi setetes atau lebih CuSO4.

3.3.4 Reaksi Hopkins-Cole

Disiapkan 4 tabung reaksi yang kering dan bersih kemudian dimasukkan 2

mL larutan gliosilik pada masing-masing tabung. Ditambahkan 3 mL larutan

albumin, glisin, alanin dan asam aspartat lalu dikocok. Kemudian ditambahkan

lagi setetes demi setetes asam sulfat pekat. Diamati perubahan yang terjadi.

3.3.5 Reaksi Millon

Disiapkan 4 tabung reaksi yang kering dan bersih kemudian dimasukkan 3

mL albumin, glisin, alanin dan asam aspartat pada masing-masing tabung.

Ditambahkan 4 tetes pereaksi Millon pada masing-masing tabung lalu dipanaskan.

Diamati perubahan yang terjadi. Kemudian ditambahkan pereaksi Millon yang

berlebih lalu dipanaskan kembali dan diamati lagi perubahan yang terjadi.

4.1 Hasil

4.1.1 Tabel Pengamatan Tes Ninhidrin

No.Larutan Protein dan

Larutan Asam AminoWarna

Dengan ninhidrin Setelah pemanasan

1. Albumin Bening Biru pekat

2. Alanin Bening Biru muda

3. Glisin Bening Ungu

4. Asam Aspartat Bening Bening

4.1.2 Tabel Pengamatan Tes gugus R dari asam amino sistein

No. Larutan contohWarna

Dengan natrium nitroprusida

Dengan ammonium hidroksida

1. Kristal cystein hidroklorida

Keruh Keruh agak kecoklatan

2. Alanin Keruh Kuning

3. Glisin Keruh Kuning

4.1.3 Tabel Pengamatan Tes Biuret

No. Larutan contohWarna

NaOH 2,5 M CuSo4 0,01 M CuSO4 0,01 M berlebih

1. Asam Aspartat Bening Bening Bening

2. Albumin Keruh Keruh Bening kekuningan

3. Glisin Bening Bening Bening

4. Alanin Bening Bening Bening kebiruan

4.1.4 Tabel pengamatan Tes Hopkins-Cole

No. Larutan contohWarna

Dengan natrium nitroprusida

Dengan ammonium hidroksida

1. Glisin Bening 2 fase

2. Asam aspartat Bening 2 fase

3. Alanin Bening 2 fase

4. Albumin Keruh 3 fase

4.3 Pembahasan

4.3.1 Tes Ninhidrin

Pada tes ninhidrin, penambahan ninhidrin pada ketiga larutan asam amino

tidak memberikan perubahan secara visual, sedangkan larutan protein dalam hal

ini albumin menjadi bening keruh. Setelah pemanasan, larutan asam amino

mengalami perubahan warna menjadi tidak berwarna kecuali glisin berubah warna

menjadi kekuningan. Berdasarkan teori, tes ninhidrin akan memberikan warna

yang sama pada semua asam amino α, kecuali prolin yang merupakan asam amino

sekunder. Pada albumin sendiri yang merupakan polimer asam amino terbentuk

larutan berwarna kuning. Sedangkan pada albumin yang merupakan polimer asam

amino dengan tes ninhidrin memberikan warna putih keruh, setelah pemanasan

warnanya berubah menjadi kecoklat-coklatan, warna yang terbentuk merupakan

warna spesifik tes ninhidrin untuk protein albumin. Adapun hasil yang telah

didapat menunjukkan bahwa pada larutan asam amino pada tes ninhidrin larutan

akan berubah dari bening menjadi keruh. Kompleks yang terbentuk adalah

mengandung dua molekul ninhydrin yang bereaksi dengan amonia asam amino

setelah asam amino dioksidasi. Hal ini menunjukkan bahwa asam amino glisin,

alanin dan asam aspartat mengandung gugus α-amino bebas, dan ini tidak terjadi

pada albumin karena pada molekul ini terjadi substitusi gugus α-amino

4.3.2 Tes gugus R dari Asam Amino Sistein

Pada uji reaksi gugus samping digunakan beberapa kristal sistein

hidroklorida yang dilarutkan dalam akuades, hal ini bertujuan untuk melarutkan

kristal sisteina hidroklorida sehingga mudah bereaksi dengan natrium

nitroprussida dan NH4OH. Natrium nitroprussida berfungsi sebagai pemberi

kompleks warna sedangkan NH4OH berfungsi sebagai larutan basa untuk

mempercepat terjadinya reaksi. Karena asam amino sistein mempunyai gugus

–HS yang dapat bereaksi dengan nitroprussida dalam suasana basa yang akan

menghasilkan warna merah. Hasil ini menunjukkan bahwa dalam asam amino

sistein terdapat gugus sulfuhidril.

4.3.3 Tes Biuret

Berdasarkan tabel di atas dapat dilihat dengan jelas perubahan yang terjadi

pada larutan protein dan larutan asam amino. Dimana pada larutan protein

(albumin) terbentuk kompleks biru. Hal ini dikarenakan oleh terbentuknya

kompleks Cu2+ dengan gugus CO dan NH dari rantai peptida dalam suasana basa.

NaOH disini berfungsi memberikan suasana basa pada larutan asam amino dan

protein. Selanjutnya larutan tersebut dicampurkan dengan larutan CuSO4 dimana

glisin, asam aspartat dan alanin tidak mengalami perubahan warna karena asam

amino tidak memiliki ikatan polipeptida seperti yang dimiliki oleh protein

sedangkan pada albumin jika direaksikan dengan CuSO4 maka akan menghasilkan

larutan yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena protein memiliki ikatan

polipeptida yang apabila bertemu dengan pereaksi biuret akan membentuk

kompleks Cu dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai polipeptida dalam

suasana basa. Dari percobaan ini didapatkan bahwa albumin memberikan reaksi

positif terhadap penambahan CuSO4. Penambahan CuSO4 berlebih

memperlihatkan perubahan intensitas warna semakin tua.

4.3.4 Tes Hopkins-Cole

Dari tabel terlihat bahwa protein dalam hal ini albumin mengandung asam amino

triptofan yang mempunyai gugus indol spesifik, karena dapat direaksikan dengan

pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat

dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan

pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat ditambahkan sehingga membentuk lapisan di

bawah larutan protein kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua

lapisan tersebut. Namun lama kelamaan akan berubah warna menjadi kuning.

4.3.5 Tes Millon

Berdasarkan tabel di atas, terlihat jelas bahwa setelah penambahan

pereaksi Millon terbentuk endapan putih yang segera berubah warnanya menjadi

merah saat dipanaskan. Bila ditambahkan reagen Millon berlebih dan dipanaskan

lagi maka endapan merahnya akan tertarik ke permukaan (terjadi proses

koagulasi) dan cairan di bawahnya menjadi bening. Adanya warna merah bata

yang dihasilkan pada saat penambahan albumin dengan Millon menunjukkan

reaksinya positif sebab pereaksi Millon dapat bereaksi dengan gugus fenol dari

asam amino yang terdapat pada albumin. Albumin yang mengandung tirosin akan

memberikan uji positif yang mengandung gugus fenol.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5. 1 Kesimpulan

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, dapat ditarik kesimpulan yaitu:

Pada tes ninhidrin, asam aspartat, alanin dan glisin memberikan hasil memberikan

hasil positif yaitu dengan terbentuknya kompleks ungu dan pada albumin

terbentuk warna coklat. Hal ini sesuai dengan teori bahawa semua asam amino

dan protein memberikan hasil positif dengan reaksi ninhidrin.

Pada reaksi gugus rantai samping (gugus R), asam amino sistein yang

berbentuk kristal cysteina hidroklorida memberi hasil positif dengan

menghasilkan warna merah anggur yang menunjukkan bahwa asam amino

tersebut mengandung gugus sulfhidril.

Pada reaksi Biuret, albumin memberikan hasil positif dengan membentuk

kompleks ungu yang menunjukkan adanya ikatan peptida. Sedangkan pada glisin,

asam aspartat dan alanin memberikan hasil negatif karena tidak terdapat ikatan

peptida.

Pada reaksi Hopkins-Cole, albumin memberikan hasil positif karena

terbentuk cincin flokulasi berwarna ungu. Ini disebabkan karena adanya asam

amino dengan gugus indol spesifik yaitu triptofan yang terkandung dalam albumin

sedangkan pada alanin, glisin, dan asam aspartat memang tidak memberikan hasil

positif karena tidak mengandung asam amino triptofan.

Pada reaksi Millon, albumin memberikan hasil positif dengan membentuk

endapan putih yang berubah menjadi merah bata karena mengandung asam

amino tirosin sedangkan pada alanin, glisin, dan asam aspartat.

1.2 Saran

5.2.1 Untuk Percobaan

Sebaiknya digunakan asam-asam amino yang lain agar dapat diketahui

dengan baik reaksi-reaksi spesifik yang terjadi pada asam–asam amino dan

protein tersebut sehingga hasilnya dapat dibandingkan dan wawasan praktikan

bertambah.

1.2.2 Untuk Laboratorium

Alat dan bahan masih ada yang kurang dan ruangan sudah bagus, dan

aman digunakan dalam pratikum.

DAFTAR PUSTAKA

Fressenden, J.R., dan Fressenden, S.J., 1997, Dasar-Dasar Kimia Organik, Binarupa Aksara, Jakarta.

Hart, H., dkk., 2003, Kimia Organik, Erlangga, Jakarta.

Hidayat, H.E., 2011, Asam Amino Penyusun Protein, (http://hernandi-asam amino.com), Diakses Pada Hari Jumat Tanggal 28 Februari 2014 Pukul 19.00 WITA.

Ismadi, M., 1993, Biokimia, Gadja Mada Universiti Press, Jakarta.

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta

3 mL albumin

Dimasukkan ke dalam tabung reaksiDitambahkan 0,5 mL larutan Ninhidrin 0,1 %Dipanaskan hingga mendidihDiamati

Hasil

Kristal Cysteina HCl

Dimasukkan ke dalam tabung reaksiDilarutkan dengan 5 mL akuadesDitambahkan 0,5 mL Natrium Nitroprussida 1 %Ditambahkan 0,5 mL NH4OHDiamati

Hasil

BAGAN KERJA

A. Tes Ninhidrin

Diulangi percobaan di atas dengan menggunakan asam amino alanin, glisin dan

asam aspartat

B. Tes Gugus R dari Asam Amino Sistein

3 mL albumin

Dimasukkan ke dalam tabung reaksiDitambahkan 1 mL NaOH 2,5 M, dihomogenkanDitambahkan setetes CuSO4 0,01 M, diamatiDitambahkan lagi CuSO4 berlebih, diamati

Hasil

2 mL albumin

Dimasukkan ke dalam tabung reaksiDitambahkan 2 mL pereaksi Hopkins, dihomogenkanDitambahkan 4 mL H2SO4 pekatDiamati

Hasil

C. Tes Biuret

Diulangi percobaan di atas dengan menggunakan asam amino alanin, glisin dan

asam aspartat

D. Tes Hopkins-Cole

Diulangi percobaan di atas dengan menggunakan asam amino alanin, glisin dan

asam aspartat

5 mL albumin

Dimasukkan ke dalam tabung reaksiDitambahkan 4 tetes pereaksi Millon, diamatiDipanaskan, ditambahkan pereaksi Millon berlebihDiamati

Hasil

E. Tes Millon