I. NOMOR PERCOBAAN : IV

II. NAMA PERCOBAAN : TITRASI FORMAL ASAM AMINO

III. TUJUAN PERCOBAAN : Untuk Mempelajari cara kerja enzim pada asam

amino melalui titrasi formaldehyde

IV. LANDASAN TEORI :

Molekul protein merupakan rantai panjang yang tersusun oleh mata rantai asam –

asam amino. Asam amino merupakan senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus

karboksilat (-COOH) dan satu atau lebih gugus amina (-NH2), yang salah satunya terletak

pada atom C tepat disebelah gugus karboksilat (atau C-α ). Protein dapat dihidrolisis

menjadi asam amino menggunakan enzim protease melalui titrasi formal asam amino.

Titrasi formal asam amino merupakan suatu metode titrasi dengan menggunakan larutan

basa setelah penambahan formaldehid untuk menghilangkan kebasaan gugus amino. Titrasi

ini biasanya digunakan untuk menentukan jumlah asam amino yang terkandung dalam

suatu campuran.

Penentuan salah satu gugus akan memberikan indikasi untuk mengetahui derajat

hidrolisis suatu protein. Dalam titrasi ini, digunakan formaldehid yang bertujuan untuk

membentuk dimethilol sehingga gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan

mempengaruhi reaksi antara gugus karbonil (asam) dengan basa (NaOH) sehingga titik

akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Selain itu juga, agar bereaksi dengan gugus amino

yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium membuffer di daerah pH

yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan suatu

indikator. Sehingga akan didapatkan kurva hubungan banyaknya larutan NaOH yang

digunakan terhadap waktu. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan slop dan tangen.

Nilai α tersebut merupakan derajat hidrolisis suatu protein (gelatin). Sehingga dari

percoban yang dilakukan dengam memvariasikan waktu hidrolisis gelatin menggunakan

enzim tripsin, diperoleh hasil bahwa semakin lama waktu hidrolisis semakin banyak massa

nitrogen asam amino yang dihasilkan dan diperoleh derajat hidrolisis dari enzim tripsin

adalah 0,032.

Protein merupakan senyawa makromolekul polimer yang urutan liniernya adalah

asam-asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Asam amino sangat berperan

penting dalam biosintesis protein, dimana dalam protein terdapat sekitar 20 jenis asam

amino standar. Asam amino merupakan molekul organik dengan massa molekul rendah

(antara 100-200 Da) yang mengandung setidak-tidaknya satu gugus karboksil (-COOH)

dan satu gugus amino (-NH2).

Asam amino merupakan ion dipolar, yang pada umumnya mempunyai dua atau

lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, kadar asam aminonya tidak

larut di dalam eter, karena merupakan senyawa dipolar dan dalam air menunjukkan

struktur kutub ganda (zwitter ion). Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku

sebagai asam dan mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku

sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat.

Ketika protein dihidrolisis, maka jumlah asam amino yang dihasilkan tergantung

dari panjang rantai dan berat molekul itu sendiri. Selama hidrolisis suatu protein, sejumlah

gugus karboksil dan gugus amino terus bertambah. Penentuan secara kuantitatif yaitu salah

satu gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis dari suatu

protein. Menurut teori ”zwitter ion” jika suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan

basa, ini berarti ion hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Karena gugus amonium

dari asam amino adalah buffer pada pH tinggi (di atas pH 11), sehingga titrasi formal asam

amino tidak mungkin untuk menitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal yang sama

terjadi karena gugus karboksil adalah buffer pada pH rendah, tidak mungkin juga untuk

menitrasinya dengan asam.Penambahan formaldehida pada larutan asam amino tersebut

agar reaksi dengan gugus asam amino yang tidak bermuatan, sehingga memungkinkan

gugus amonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik

akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Reaksi yang terjadi dalam titrasi

dengan menggunakan formaldehid merupakan reaksi pembentukan dimethilol. Dimana,

larutan yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH), akan membentuk dimethilol.

Terbentuknya dimethilol ini, berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan

mempengaruhi reaksi antara gugus asam (karboksil) dengan basa (NaOH), sehingga titik

akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolfathalein,

yaitu terjadi perubahan warna larutan dari bening menjadi merah muda yang tidak hilang

selama 30 detik. 

Reagen yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelatin, yang merupakan

produk alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin adalah protein yang

bersifat gelling agent(bahan pembuat gel) atau sebagai ion gelling egent. Sumber bahan

baku gelatin dapat berasal dari tulang dan kulit dari sapi atau babi. Gelatin terdiri dari

glisin dengan komposisi yang besar, protein dan 4-hidroksi residu dari protein yang

strukturnya adalah -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyp-Gly-Pro-.

Semua enzim murni yang telah diamati sampai saat ini adalah protein ; aktivitas

katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Sebagai contoh, jika

suatu enzim didihkan dengan asam kuat atau diinkunbasi dengan tripsin, yaitu perlakuan

yang memotong rantai polipeptida, aktivitas katalitiknya biasanya akan hancur; hal ini

memperlihatkan bahwa struktur kerangka primer protein enzim dibutuhkan untuk

aktivitasnya. Selanjutnya, jika kita mengubah berlipatnya rantai protein yang khas dari

suatu protein enzim utuh oleh panas, oleh perlakuan pH yang jauh menyimpang dari

keadaan normal, atau oleh perlakuan dengan senyawa perusak lainnya, aktivitas enzim

penting bagi aktivitas katalitiknya.

Enzim, seperti protein lain, mempunyai berat molekul yang berkisar dari kira-kira

12.000 sampai lebih dari 1 juta. Oleh karena itu, enzim berukuran amat besar dibandingkan

dengan subtrat atau gugus fungsional targetnya. Beberapa enzim hanya terdiri dari

polipeptida dan tidak mengandung gugus kimiawi selain residu asam amino.

V. ALAT DAN BAHAN

1. Alat

Gelas ukur

Beker gelas

Termometer

Pipet tetes

Statif, klem

Erlenmeyer

Biuret

2. Bahan

Larutan Gelatin 5%

NaOH 0,2 M

Phenolpthalein

HCl 0,1 M

Formaldehyde 40%. Netralkan dengan alkali.

Larutan tripsin atau pancreatin 1%

VI. PROSEDUR PERCOBAAN

Siapkan 100 ml larutan gelatin 5%. Atur temperatur 38oC. Tambahkan kedalamnya 1

ml phenolpthalein dan 0,2 M NaOH tetes demi etets sampai warna merah muda timbul.

Tambahkan 0,1 M HCl tetes demi tetes sampai tepat warna merah muda tadi hilang (pH =

8,0). Hati-hati jangan terlalu asam. Masukkan gelatin yang telah dinetralisir tadi kedalam

inkubator 38oC. Pada 40 ml larutan tripsin tambahkan beberapa tetes phenolpthalein.

Tambahkan tetes demi tetes 0,2 M NaOH sampai warna merah muda. Kemudian teteskan

0,1 M HCl sampai warna tersebut tepat hilang (pH = 8,0). Tepat pada jam “Nol”

tambahkan larutan tripsin tersebut ke dalam larutan gelatin. Aduk! Setelah tercampur rata,

ambil 10 ml campuran, masukkan ke dalam 100 ml beker gelas. Didihkan untuk merusak

enzimnya. Catat waktunya! Dinginkan. Tambahkan 15 ml formalin netral dan 3 tetes

phenolpthalein. Pada interval 15 menit lakukan hal yang sama seperti di atas (seperti

kontrol). Pada masing-masing hasil reaksi di atas pada interval 0, 15, 30, 60, 90, dan 120

menit dan dititrasi dengan NaOH 0,02 M hingga berwarna merah muda.

VII. HASIL PENGAMATAN

110 ml Gelatin 5% (tak berwarna) dipanaskan

38oC Gelatin (tak berwarna) + PP (1ml) +

NaOH (9 tetes) larutan merah muda + HCl (1 tetes) larutan tak berwarna

pH 8,05 100 ml diinkubasi

10 ml dididihkan (larutan tak berwarna) didinginkan (tak

berwarna) + 15 ml formaldehid (tak berwarna) + 3tetes PP +

NaOH 0,02M 84 tetes

35 ml Tripsin 1% (tak berwarna) dipanaskan

38oC Tripsin (tak berwarna) + PP (3 tetes) +

NaOH (3 tetes) larutan merah muda + HCl (5 tetes) larutan tak berwarna

pH 7,99 25 ml diinkubasi

10 ml dididihkan (larutan tak berwarna) didinginkan (tak

berwarna) + 15 ml formaldehid (tak berwarna) + 3tetes PP +

NaOH 0,02M 60 tetes

Campuran 100 ml gelatin + 25 ml tripsin yang telah diinkubasi

X(waktu) Y (Volume NaOH)

dalam tetes

Y (Volume NaOH)

dalam ml

0 63 tetes 3,15 ml

15 66 tetes 3,3 ml

30 70 tetes 3,5 ml

60 72 tetes 3,6 ml

90 74 tetes 3,7 ml

120 77 tetes 3,85 ml

VIII. PERSAMAAN REAKSI

Reaksi gelatin didegrasi dengan enzim tripsin

Struktur Gelatin

Asam – asam amino hasil pemecahan gelatin

O H O

R – CH – C R – C - C NH OH NH3

+ O-

Asam Amino Ion dipolar

H O H

R – C – C + CH2O R – C – COOH

NH3+ O- HOH2C – C – CH2OH

Ion dipolar formalin Metil diol

H H O

R – C – COOH + NaOH R – C – C ONa HOH2C – C – CH2OH HOH2C – C – CH2OH Metil diol Natrium Hidroksida Natrium Metil diol

IX. ANALISA DATA

Volume NaOH Vs Waktu secara praktek

X(waktu) Y (Volume

NaOH) dalam

tetes

Y (Volume

NaOH) dalam ml

0 63 tetes 3,15 ml

15 66 tetes 3,3 ml

30 70 tetes 3,5 ml

60 72 tetes 3,6 ml

90 74 tetes 3,7 ml

120 77 tetes 3,85 ml

0 15 30 60 90 1200

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

3.153.3

3.5 3.6 3.73.85

waktu

volu

me

NaO

H

Kurva Titrasi antara volume NaOH terhadap waktu

X Y XY X2

0 3,15 0 015 3,3 49,5 22530 3,5 105 90060 3,6 216 360090 3,7 333 8100120 3,85 462 14400315 21,1 1165,5 27225

Slope (A) = n . Σ XY – ΣX . ΣY n . ΣX2 – (ΣX)2

= 6( 1165,5 ) – 315( 21,1 )

6(27225) – (315)2

= 346,564125

= 0,0054

Intersept (B) = ΣY . ΣX 2 – ΣXY . ΣX n . ΣX2 – (ΣX)2

= 21,1(27225) – 1165,5(315) 6(27225) – (315)2

= 20731564125

= 3,2329

Persamaan Y = 0,0054x + 3,2329Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(0) + 3,2329 = 3,2329

Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(1) + 3,2329 = 3,2383

Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(2) + 3,2329 = 3,2437

Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(3) + 3,2329 = 3,2491

Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(4) + 3,2329 = 3,2545

Y = Ax + B = 0,0054x + 3,2329 = 0,0054(5) + 3,2329 =3,2599

X 0 1 2 3 4 5

Y 3,2329 3,2383 3,2437 3,2491 3,2545 3,2599

0 1 2 3 4 53.215

3.22

3.225

3.23

3.235

3.24

3.245

3.25

3.255

3.26

3.265

3.2329

3.2383

3.2437

3.2491

3.2545

3.2599

X

Y

Perhitungan mg N asam amino.Karena 1 mL NaOH 0,1 N sama dengan 1,4 mg nitrogen asam amino sedangkan dalm percobaan ini menggunakan NaOH 0.02 N maka:

0,02 N0.01 N

= X mg

1.4 mgx = 0.028 mgjadi 1 ml NaOH 0.02 N sama dengan 0.028 mg nitrogen asam amino

Mg Asam amino = V rata−rata NaOH

1mlx0.028 mg

t =0’ 3.15 ml

1 mlx 0.028 mg=0.0882 mg

t = 15’3.3 ml1ml

x 0.028 mg=0.0924 mg

t = 30’3.5 ml1 ml

x 0.028 mg=0.098 mg

t = 60’3.6 ml1ml

x 0.028 mg=0.1008 mg

t = 90’3.7 ml1 ml

x 0.028 mg=0.1036 mg

t = 120’3.85 ml

1mlx 0.028 mg=0.1078 mg

waktu (X)

Mg asam amino (Y)

XY X2 Y2

0 0.0882 0 0 0.007779215 0.0924 1.386 225 0.008537830 0.098 2.94 900 0.00960460 0.1008 6.048 3600 0.010160690 0.1036 9.324 8100 0.010733120 0.1078 12.936 14400 0.0116208

∑X = 315

∑ Y = 0.5908

∑XY =32.634

∑ X2

=27225∑ Y2

=0.0584354

Slope (A) = n .ΣXY −ΣxΣY

n ΣX2−¿¿

= (6)(32.634 )– (315)(0.5908)

(6 )(27225)−¿¿

= 195.804−186.102

163350−99225

= 9.70264125

= 0.0001

Intersept (B) = ΣX 2 ΣY −ΣxΣXYn ΣX2−¿¿

= (27225)(0.5908) – (315)(32.634)

(6 )(27225)−¿¿

= 16084.53−10279.71

163350−99225

= 5804.8264125

= 0.0905

Persamaan Garis Lurus : Y = Ax+B

= 0.0001x+ 0.0905

Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(0)+ 0.0905

= 0.0905

Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(1)+ 0.0905 = 0.0906

Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905

= 0.0001(2)+ 0.0905 = 0.0907

Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(3)+ 0.0905 = 0.0908

Y = Ax + B = 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(4)+ 0.0905

= 0.0909

Y = Ax + B

= 0.0001x+ 0.0905 = 0.0001(5)+ 0.0905 =0.091

X 0 1 2 3 4 5

Y 0.0905 0.0906 0.0907 0.0908 0.0909 0.091

Grafik hubungan mg N asam amino dan Waktu

0 15 30 60 90 1200

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.0882 0.0924 0.0980000000000002

0.1008 0.1036 0.1078

Grafik hubungan mg asam amino dan Waktu dalam regresi linier

0 1 2 3 4 50.09020.09030.09040.09050.09060.09070.09080.0909

0.0910.0911

0.0905000000000001

0.09060.0907

0.09080.0909

0.091

waktu

mg

N a

sam

Am

ino

X. PEMBAHASAN

Praktikum ini titrasi uji formaldehid ini yaitu untuk mempelajari aktivitas enzim

dan apa saja yang dapat mempengaruhi aktivitas dari enzim tersebut. Dengan

menggunakan protein yaitu gelatin.

Sebelum melakukan percobaan larutan gelatin diinkubasi terlebih dahulu larutan

gelatin diinkubasi sekitar 38oC. Namun, suhunya harus dijaga konstan jangan sampai naik,

karena bila suhunya mencapai lebih dari 50oC protein akan terdenaturasi. Sehingga akan

merusak struktur dari protein itu sendiri.

Yang bertindak sebagai enzim adalah tripsin, yaitu enzim yang terdapat dalam

tubuh kita yaitu pada air seni. Sebagai perlakuan, gelatin ditambahkan dengan tripsin,

dengan begitu, kita melakukan pemotongan pada rantai polipeptida pada protein. Sama

seperti gelatin tadi, maka tripsin pun harus diinkubasi pada suhu 38oC, hal ini dimaksudkan

agar enzim tripsin dapat bekerja secara optimum pada suhu tersebut.

Larutan protein yang diinkubasi akan semakin banyak membutuhkan NaOH jika

dilakukan penitrasian. Hal ini disebabkan oleh semakin banyaknya gugus amino dan

karboksil pada asam amino yang terpotong oleh tripsin. Residu asam amino yang terpotong

ini akan mengikat NaOH yang dititrasikan kelarutan protein.Penitrasian dengan NaOH

pada larutan protein yang ditambahkan dengan tripsin dimaksudkan untuk melihat

kecepatan reaksi yang terjadi berdasarkan volume NaOH yang digunakan. Larutan protein

bertindak sebagai subtratnya. Jadi, kecepatan reaksi tergantung dengan konsentrasi

gelatinnya. Tapi, bila enzim tripsin seolah-olah “jenuh” dengan subtrat, artinya enzim tidak

dapat lagi menampung gelatin.

Percobaan ini, dilakukan pencampuran antara larutan gelatine dan larutan tripsin.

Pada waktu ke 0, 15, 30, 60, 90, dan 120 menit diambil sebanyak 10 mL larutan (campuran

gelatin dengan tripsin). Larutan itu didihkan pada masing-masing interval waktu yang

bertujuan untuk merusak protein. Setelah didinginkan, larutan yang diperlakukan pada

masing-masing interval waktu tersebut ditambahkan formaldehid (formalin) dan indikator

PP kemudian dilakukan titrasi. Penambahan PP digunakan untuk mengetahui dari akhir

titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang selama 30

detik. Penambahan formaldehid pada larutan asam amino agar bereaksi dengan gugusan

amino yang tak bermuatan sehingga memungkinkan gugusan ammonium membuffer di

daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir suatu indicator secara

kuantitatif. Formaldehid menghasilkan derivate hidroksimetil yang mempunyia keasaman

lebih kuat dari senyawa semula. Dengan demikian penambahan PP dan Titrasi formalin

hanya tepat untuk menunjukkan atau menentukan suatu proses terjadinya pemecahan

protein tetapi kurang tepat untuk penemuan protein.

Reaksi kimia dipengaruhi oleh suhu, sebagian enzim akan terdenaturasi pada suhu

di atas 60oC, maka reaksi antara gelatin-tripsin juga dipengaruhi oleh suhu pada waktu

melakukan inkubasi. Kenaikan suhu sebelum terjadinya proses denaturasi (atau pada saat

suhu ±38oC) maka akan dapat menaikkan kecepatan reaksi. Volume NaOH yang dititrasi

menjadi berkurang seiring dengan pertambahannya waktu dalam inkubasi.

XI. KESIMPULAN

1. Tujuan tripsin diinkubasi pada suhu 38oC, yaitu agar tripsin dapat bekerja secara

optimum pada suhu tersebut. Oleh karena itu, suhu tersebut harus dijaga konstan

agar tripsin tidak terdenaturasi.

2. Kecepatan reaksi gelatin-tripsin juga dipengaruhi oleh suhu. Kenaikan suhu

sebelum tripsin terdenaturasi maka akan menaikkan kecepatan reaksi.

3. Penambahan NaOH pada gelatin dan tripsin agar larutan tersebut bersifat basa yang

ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi warna merah muda setelah

ditambahkan indikator.

4. Penambahan formaldehid agar adanya reaksi dengan gugusan amino yang tak

bermuatan hingga memungkinkan gugusanm ammonium buffer didaerah pH yang

lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir dengan indicator PP.

5. Pemanasan pada campuran gelatin-tripsin dilakukan untuk menghentikan aktivitas

enzim tripsin agar tidak lagi bereaksi dengan substrat.

XII. DAFTAR PUSTAKA

Lehninger, A. L. (1982). Dasar - Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga. BIBLIOGRAPHY Mertanjaya, I. P. (2011). Penentuan Derajat Hidrolisis Suatu Protein Melalui Titrasi

Formal Asam Amino. Laporan Praktikum Biokimia .

Poedjiadi, A. (1994). Dasar - Dasar Biokimia . Jakarta: Universitas Indonesia.

XIII. GAMBAR ALAT

Pipet tetes Beaker Gelas

Gelas Ukur

Alat Titrasi Erlenmeyer

XIV. Jawaban pertanyaan

1. Buatlah kurva titrasi antara volum alkali (ordinat) terhadap waktu (absis)

Grafik hubungan volum NaOH dan Waktu

Grafik hubungan volum NaOH dan Waktu dalam regresi linier

0 1 2 3 4 53.215

3.223.225

3.233.235

3.243.245

3.253.255

3.263.265

3.23293.2383

3.24373.2491

3.25453.2599

X

Y

2. Buat kurva antara mg nitrogen asam amino (ordinat) terhadap waktu (absis)

Grafik hubungan mg N asam amino dan Waktu

0 15 30 60 90 1200

0.51

1.52

2.53

3.54

4.5

3.15 3.3 3.5 3.6 3.7 3.85

waktu

volu

me

NaO

H

0 15 30 60 90 1200

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.0882 0.0924 0.0980000000000002

0.1008 0.1036 0.1078

Grafik hubungan mg asam amino dan Waktu dalam regresi linier

0 1 2 3 4 50.09020.09030.09040.09050.09060.09070.09080.0909

0.0910.0911

0.0905000000000001

0.09060.0907

0.09080.0909

0.091

waktu

mg

N a

sam

Am

ino

3. Mengapa harus ditambahkan alkali pada formalin sampai merah muda dan

phenolphthalein?

Karena dengan ditambahkan alkali pada formalin maka akan terbentuk dimethiol dan

dengan terbentuknya dimetiol ini berarti gugus anionnya sudah terikat, sehigga tidak

akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa (NaOH) dan titik akhir titrasi

dapat ditentukan dengan tepat. Penambahan PP berguna untuk melihat titik akhir

titrasi tersebut, yaitu terjadi perubahan warna.

4. Apa tujuan melakukan titrasi formal ini?

Untuk mempelajari cara kerja enzim pada asam amino dan untuk mengetahui factor

– factor penyebab kecepatan reaksi enzim seperti suhi dan konsentrasi zat.