PERCOBAAN IIDENTIFIKASI ASAM AMINO PADA SAMPEL PROTEIN LARUTAN ALBUMIN TELUR DAN SAMPEL UNKNOWN

I. DASAR TEORIManusia dalam melakukan aktivitasnya memerlukan banyak energi, energi yang diperoleh dapat berasal dari makanan yang dikonsumsi setiap hari. Makanan yang kita makan haruslah memiliki gizi yang cukup agar tubuh kita menjadi sehat. Di dalam makanan yang bergizi mengandung zat-zat yang bermanfaat bagi tubuh seperti protein, vitamin, karbohidrat dan zat-zat yang bermanfaat lainnya. Diantara kesemua zat tersebut, protein mempunyai fungsi yang penting bagi tubuh. Salah satu fungsi dari protein yang sangat penting adalah sebagai zat pembangun dalam tubuh dan menggantikan sel sel tubuh yang rusak.Protein dalam makanan bisa kita temukan dalam kacang-kacangan, telur, dan lain sebagainya. Salah satu contoh protein adalah telur. Kandungan penyusun telur dibagi menjadi protein putih telur dan protein kuning telur. Komposisi putih telur kandungan total protein 10-11% dasar basah, ovalbulmin 70% dari total protein, canalbumin 9% dari total protein, ovoummucoid 13% dari total protein. Sedangkan kuning telur terdiri atas hipovitelin dan hipotellenin.Protein adalah polimer biologi yang tersusun dari molekul-molekul kecil yang dinamakan asam amino. Rentang massa molekulnya dari 6000 sampai puluhan ribu, sehingga protein dapat merupakan molekul sangat besar. Selain tersusun dari asam amino, banyak protein juga mengandung komponen lain seperti ion logam (misalnya Fe2+, Zn2+, Cu2+dan Mg2+) atau mengandung molekul organik kompleks.Asam amino penyusun semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan yang tertinggi terdiri dari rangkaian dasar yang sama, yaitu dari 20 asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Semuanya merupakan asam -amino, kecuali prolin dan hidroksi prolin (Redhana, 2004). Asam amino merupakan molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200 Da) yang mengandung setidak-tidaknya satu gugus karboksil (-COOH) yang memberikan sifat asam dan satu gugus amina (-NH2) yang memberikan sifat basa. (Tika, 2010). Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik yang cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu membentuk zwiter-ion.(Redhana,2004)Berdasarkan gugus R-nya akan dapat diramalkan sifat-sifat suatu asam amino. Sebaliknya, berdasarkan sifat-sifat yang teridentifikasi akan dapat diketahui gugus R yang terkandung dalam asam amino tersebut atau akan diketahui jenis asam aminonya.

Gambar 1. Struktur Asam -aminoSumber : Redhana,2010Berdasarkan strukturnya, asam amino diklasifikasikan menjadi delapan kelompok (Tabel 1). Klasifikasi ini didasarkan pada sifat kimia gugus R-nya sehingga akan memudahkan dalam mengingat sifat-sifat umum dari setiap asam amino.

Tabel 1. Klasifikasi Asam Amino Berdasarkan Struktur KimiaSifat Gugus RContoh Asam Amino

AlifatikAromatikHidrosiklikKarbosiklikMengandung SulfurIminoAminoAmidaGly, Ala, Val, Leu, IlePhe, Tyr, TrpSer, ThrAsp, GluCys, MetPro, HypLys, ArgAsn, Gln

Sumber : Tika,2010

Analisis asam amino dengan metode kualitatif dapat dilakukan dengan cara melakukan uji-uji seperti uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, uji PbS, serta uji Nitroprusida.

Tabel 2. Beberapa Reaksi untuk Mendeteksi Asam Amino Berdasarkan Gugus RReaksi UjiReaksi/reagenAsam amino yang dideteksiWarna

Uji MilonHgNO3 dalam asam nitrat dengan sedikit asam nitrit.TirosinMerah

Uji Hopkins-ColeAsam glioksilat dalam H2SO4 pekatTriptofanUngu

Uji NinhidrinTriketohidrin HidratAsam -amino dan peptida yang memiliki gugus -amino yang bebas.Biru

Uji PbSPbS (Timbal Sulfida)Asam amino yang dapat melepaskan unsur SHitam

Uji NitroprusidaNatrium nitroprusida dalam NH3 encerSisteinMerah

Sumber : Tika,2010Dalam percobaan ini dilakukan uji asam amino pada sampel albumin telur dan sampel unknown dengan beberapa uji yaitu, uji asam amino yaitu uji Millon, Uji Hopkins-Cole, Uji Ninhidrin, Uji PbS, Uji Nitroprusida.

1. Uji MillonPereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah akibat pemanasan. (Tika, 2010) Untuk protein yang mengandung tirosin atau triptofan penambahan perekasi Millon memberikan warna merah. Namun pereakasi ini tidak spesifik karena juga memberikan warna merah dengan adanya fenol. (Chairil Anwar, 1996). Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksi fenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil yang positif pada uji ini.Jika protein yang dianalisis dalam suasana basa maka perlu ditambahkan asam (bukan HCl). Jika tidak, ion merkuri dari peroksida akan mengendap sebagi Hg(OH)2. Ion Cl- dapat bereaksi dengan asam nitrat menghasilkan radikal klor (Cl). Radikal klor dapat merusak kompleks berwarna. Reagen yang digunakan adalah larutan merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrat dan asam nitrit. Warna merah terbentuk mungkin adalah garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi (Tika, 2007) .

2. Uji Hopkins-ColeReaksi yang terjadi pada uji Hopkins-Cole adalah triptofan berkondensasi dengan aldehid dari asam glioksilat dalam suasana asam sulfat pekat membentuk kompleks berwarna.

Gambar 2. 2,3,4,5-tetrahidro--karbolin-4-karboksilat(Redhana, 2003)

3. Uji NinhidrinApabila Ninhidrin (triketohidrin hidrat) dipanaskan bersama asam amino, maka akan terbentuk kompleks berwarna. Asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan jalan mengamati intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi asam amino tersebut. Pada reaksi ini dilepaskan CO2 dan NH3.RCH(NH2)COOH RCHO + NH3+ CO2Seperti, Alanin, valin, leusin, isoleusin, fenialanin, metionina. Prolin dan hidroprolin memberikan kompleks warna yang berbeda dengan asam amino setelah dioksidasi. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino. Keseluruhan reaksi asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut:a. Dekarboksilasi oksidatif dari asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, ammonia dan CO2.b. Reaksi ninhidrin tereduksi dengan ninhidrin yang lain dengan molekul ammonia yang dibebaskan.c. Pembentukan kompleks berwarna biru.Reaksi ninhidrin secara lengkap adalah sebagai berikut:

+ NH3 + CO2+RCHO+ Ninhidrin Ninhidrin tereduksi

++

Kompleks berwarna biruGambar 3. Reaksi Ninhidrin(Redhana,2003)4. Uji PbS (Uji Sistina)Bila protein dicampur dengan fusion mixture, kemudian dipansakan sampai tidak berwarna, maka unsur belerang dalam protein akan dibebaskan dalam bentuk ion sulfida (Nurlita, 2002). Belerang yang terdapat dalam asam amino sisteina dibebaskan sebagai ion sulfida dengan kehadiaran NaOH. Ion sulfida ini kemudian akan bereaksi dengan Pb2+ membentuk endapan hitam. Reaksinya dalah sebagai berikut: S2-(aq) + Pb2+(aq) PbS(s) endapan hitam 5. Uji Nitroprusida (Uji Sisteina)Pada asam amino sisteina, selain terdapat gugus COOH dan gugus NH3, gugus R pada asam amino sisteina yaitu gugus triol (gugus sulfidril) atau peptida (glutation). Pada asam amino lain dapat berekasi dengan natrium nitroprusida (Na2Fe(CN)5NO.2H2O) dalam ammonia berlebih menghasilkan kompleks berwarna merah. Beberapa protein yang memberikan hasil negatif terhadap reaksi ini, ternyata menjadi positif setelah dipanaskan sampai mengalami koagulasi dan denaturasi. Hal ini menunjukkan proses tersebut menghasilkan gugus-SH bebas. Reaksinya adalah sebagai berikut:[Fe3+(CN)5NC]2- + NH3 + RSH NH4++[Fe2+(CN)5NOSR]2- (warna Salmon) warna merahII. PROSEDUR KERJA DAN HASIL PENGAMATAN

NoProsedur KerjaHasil Pengamatan

Pembuatan Larutan Albumin

15 mL putih telur dilarutkan dalam 25 mL aqudes kemudian diaduk. Larutan almunim berwarna bening dan sedikit berlendir dan berbusa.

Gambar. Albumin telur Sampeel 1 berwarna bening Sampel 2 berwarna bening Sampel 3 berwarna bening sedikit keruh Sampel 4 berwarna bening Sampel 5 berwarna bening

Uji Millon

15 tetes reagen millon ditambahkan ke dalam 3 mL sampel. Larutan almumin berwarna bening ditambahkan dengan reagen million Terbentuk endapan berwarna putih.

Gambar. Uji Millon Sampel Albumin Sampel 1 berwarna bening ditambahkan dengan reagen million tetap berwarna bening. Sampel 2 berwarna bening ditambahkan dengan reagen million tetap berwarna bening. Sampel 3 berwarna sedikit keruh ditambahkan dengan reagen million tetap berwarna sedikit keruh.

Gambar.Uji Millon Sampel Unknown 3 Sampel 4 berwarna bening ditambahkan dengan reagen million tetap berwarna bening. Sampel 5berwarna bening ditambahkan dengan reagen million tetap berwarna bening.

Gambar.Uji Millon Sampel 5

2Campuran dipanaskan di atas pembakar spritus. Jika terlalu banyak reagen warna akan menghilang. Larutan almumin, setelah dipanaskan larutan berubah warna menjadi merah.(uji positif)

Gambar. Uji Millon setelah dipanaskan Sampel Albumin Sampel 1, Setelah dipanaskan larutan tetap berwarna bening(uji negatif) Sampel 2, Setelah dipanaskan larutan tetap berwarna bening(uji negatif) Sampel 3, Setelah dipanaskan larutan tidak berubah warna(uji negatif)

Gambar. Uji Millon setelah dipanaskan Sampel Unknown 3 Sampel 4, Setelah dipanaskan larutan tetap berwarna bening(uji negatif) Sampel 5, Setelah dipanaskan larutan tetap berwarna bening (uji negatif)

Gambar. Uji Millon setelah dipanaskan Sampel Unknown 5

Uji Ninhidrin

30,5 mL larutan ninhidrin 0,1% ditambahkan ke dalam 3 mL larutan sampel. Larutan almumin berwarna bening ditambahkan dengan reagen ninhidrin tetap berwarna bening. Sampel 1 berwarna bening ditambahkan dengan reagen ninhidrin tetap berwarna bening. Sampel 2 berwarna bening ditambahkan dengan reagen ninhidrin tetap berwarna bening. Sampel 3 berwarna sedikit keruh ditambahkan dengan reagen ninhidrin warna tetap tidak berubah. Sampel 4 berwarna bening ditambahkan dengan reagen ninhidrin tetap berwarna bening. Sampel 5 berwarna bening ditambahkan dengan reagen ninhidrin tetap berwarna bening.

4Campuran tersebut kemudian dipanaskan sampai mendidih dan perubahan yang terjadi diamati. Larutan almumin, setelah dipanaskan larutan berubah warna menjadi sedikit biru.(uji positif)

Gambar.Uji Ninhidrin Sampel Albumin Sampel 1, Setelah dipanaskan larutan berubah warna menjadi berwarna ungu. (uji positif) Sampel 2, Setelah dipanaskan larutan berubah warna menjadi biru.(uji positif) Sampel 3, Setelah dipanaskan larutan berwarna ungu(uji positif) Sampel 4, Setelah dipanaskan larutan tetap berwarna bening(uji negatif)

Gambar.Uji Ninhidrin Sampel Unknown 4 Sampel 5, Setelah larutan berwarna ungu(uji positif)

Gambar.Uji Ninhidrin Sampel Unknown 5

Uji Pbs

55 mL larutan sampel ditambahkan 2 mL larutan NaOH dan 2 tetes Pb-asetat . kemudian dipanaskan dalam pengas air. Larutan almumin berwarna bening ditambahkan dengan Larutan NaOH dan Pb-asesat kemudian dipanaskanbdalam penagas air menghasilkan larutan hitam dan endapan hitam (uji positif)

Gambar. Uji PbS Sampel Albumin Sampel 1 berwarna bening ditambahkan dengan NaOH dan Pb-asesat kemudian dipanaskanb dalam penagas air menghasilkan larutan putih keruh. (uji negatif) Sampel 2 berwarna bening ditambahkan dengan NaOH dan Pb-asesat kemudian dipanaskanb dalam penagas air menghasilkan bening.(uji negatif) Sampel 3 berwarna sedikit keruh ditambahkan dengan NaOH dan Pb-asesat kemudian dipanaskan dalam penagas air menghasilkan larutan kehitaman dan endapan hitam.(uji positif)

Gambar. Uji PbS Sampel Unknown 3 Sampel 4 berwarna bening ditambahkan dengan NaOH dan Pb-asesat kemudian dipanaskanb dalam penagas air menghasilkan larutan keruh. (uji negatif) Sampel 5 berwarna bening ditambahkan dengan NaOH dan Pb-asesat kemudian dipanaskanb dalam penagas air menghasilkan bening.(uji negatif)

Gambar. Uji PbS Sampel Unknown 5

Uji Nitroprusid

60,5 mL larutan nitroprusid 1% ditambahkan ke dalam laruta sampel . kemudian ditambahkan 0,5 mL amonium hidroksida. Larutan almumin berwarna bening ditambahkan dengan Larutanan nitroprusid dan amonium hidroksida menghasilkan larutan yang berwarna bening. (uji positif)

Gambar. Uji Nitroprusida Sampel Albumin Sampel 1 berwarna bening ditambahkan dengan Larutanan nitroprusid dan amonium hidroksida menghasilkan larutan yang berwarna bening. (uji negatif) Sampel 2 berwarna bening ditambahkan dengan Larutanan nitroprusid dan amonium hidroksida menghasilkan larutan yang berwarna sedikit kekuningan. (uji negatif) Sampel 3 berwarna sedikit keruh ditambahkan dengan Larutanan nitroprusid dan amonium hidroksida menghasilkan larutan yang berwarna kuning bening. (uji negatif) Sampel 4 berwarna bening ditambahkan dengan Larutanan nitroprusid dan amonium hidroksida menghasilkan larutan yang berwarna kuning bening. (uji negatif) Sampel 5 berwarna bening ditambahkan dengan Larutanan nitroprusid dan amonium hidroksida menghasilkan larutan yang berwarna bening. (uji negatif)

Gambar. Uji Nitroprusida Sampel Unknown 5

III. PEMBAHASANEksperimen yang dilakukan adalah pengujian kandungan asam amino pada larutan albumin telor dan sampel unknown dengan melakukan uji Millon, uji Ninhidrin, uji PbS dan uji Nitroprusida. Uji millonUji millon dilakukan untuk menguji larutan sampel yang spesifik terhadap asam amino Tirosin. Uji millon dilakukan dengan penambahan pereaksi millon pada larutan sampel. Pereaksi millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Pada uji ini menggunakan prisip pengendapan, dimana merupakan penetralan muatan. Dengan adanya muatan positif dari Hg+ maka akan terjadi reaksi netralisasi dengan asam amino dan dihasilkan garam netral yang mengendap. Pada penambahan garam merkuri ke dalam larutan protein akan terjadi reaksi pengendapan, hal ini dapat diamati dari endapan putih yang terbentuk setelah ditambahkan larutan garam merkuri. Kemungkinan reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:

Hg++ Hg+

endapan putih dari garam proteinat

Endapan putih yang terbentuk mengalami reaksi lebih lanjut ketika dilakukan pemanasan pada larutan asam amino. Pada pemanasan tersebut, asam nitrat yang pada awalnya bertindak sebagai pelarut mengoksidasi ion Hg+ menjadi Hg2+. Bersamaan dengan itu, Asam amino tirosin ternitrasi. Reaksi yang terjadi selanjutnya yaitu pembentukan oksida HgO yang berwarna merah. Reaksi yang terjadi adalah:

+ HgO+ Hg++HNO3

tirosin asam amino tirosin ternitrasi andapan merahGambar . Reaksi tirosin dengan reagen MillonPereaksi ini pada dasarnya positif pada gugus fenol pada tirosin, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksil yang berwarna. Dalam reaksi ini, Hg bertindak sebagai oksidator, dimana reagen yang digunakan adalah Hg ternitrasi. Gugus yang positif bereaksi dengan hidroksi fenil pada tirosin adalah NO2. Bersamaan dengan terbentuknya tirosin ternitrasi, Hg yang terdapat pada larutan teroksidasi (yang dibantu oleh pemanasan), membentuk HgO berupa endapan merah. Uji millon yang dilakukan pada larutan albumin telur memberikan hasil yang positif setelah dilakukan pemanasan. Hal ini dapat diamati dari perubahan warna yang terjadi, yaitu setelah pemanasan terbentuk larutan yang berwarna merah. Warna merah yang terbentuk merupakan garam merkuri dari asam amino tirosin yang ternitrasi. Komplek warna yang terbentuk disebabkan dalam asam amino tirosin terdapat gugus fenol yang menyebabkan terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna merah. Jadi dapat disimpulkan bahwa untuk larutan albumin telur mengandung asam amino Tirosin, uji Millon yang dilakukan positif.Untuk sampel unknown 1,2,3,4 dan 5 memberikan hasil yang negatif terhadap uji millon ini, hal ini dapat terlihat dari reaksi sampel dengan pereaksi millon tidak membentuk endapan putih dan setelah dilakukan pemanasan tidak membentuk endapan merah. Hal ini dikarenakan tidak terdapat gugus fenol pada struktur sampel unknown 1,2,3,4 maupun sampel 5 sehingga tidak dapat membentuk senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang nantinya memberikan kompleks warna merah pada larutan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa sampel 1,2,3,4 dan 5 tidak mengandung asam amino Tirosin, uji Millon yang dilakukan memberikan hasil negatif.

Uji NinhidrinUji ninhidrin merupakan uji umum untuk semua protein, dimana uji positif terhadap protein ditandai dengan terbentuknya kompleks yang berwarna biru atau ungu kecuali prolin dan hidroksi prolin yang menghasilkan warna yag berbeda, karena gugus positif dlam reaksi ini adalah gugus NH2 dan COOH pada asam amino. Asam amino yang telah diuji dengan reagen ini adalah glisin, triptofan, tirosin, serta fenilalanin. Setelah dilakukan uji terbentuk larutan berwarna biru. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino. Keseluruhan reaksi asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut.a. Dekarboksilasi oksidatif dari asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, amonia dan CO2.b. Reaksi ninhidrin tereduksi dengan ninhidrin yang lain dengan molekul amonia yang dibebaskan.c. Pembentukan kompleks berwarna biru.Larutan asam amino yang mengandung gugus seperti glisin, triptofan, tirosin dan fenilalanin ditambahkan pereaksi ninhidrin dan dipanaskan akan memberikan hasil uji positif. Uji pertama dilakukan pada sampel albumin telur, sampel ditambahkan larutan ninhidrin terbentuk larutan berwarna bening. Campuran ini dipanaskan hingga mendidih, dan terbentuk larutan berwarna biru keunguan. Dengan demikian dalam sampel albumin telur ini mengandung gugus -amino bebas. Uji ninhidrin ini juga positif untuk sampel unknown 1, unknown 2, unknown 3 dan sampel unknown 5, sedangkan untuk sampel unkonwn 4 negatif untuk uji ninhidrin karena setelah ditambahkan larutan ninhidrin dan dipanaskan sampai mendidih larutan tetap bening tidak berwarna. Jadi dapat disimpulkam bahwa sampel unknown 1, 2, 3 dan 5 merupakan asam amino yang mengandung gugus -amino bebas. Sedangkan untuk sampel unknown 4 yang negatif terhadap uji ninhidrin berarti tidak mengandung gugus -amino bebas, jadi sampel unknown 4 bukan merupakan asam amino.Uji positif terhadap sampel albumin telur dan sampel unknown 1, 2, 3 dan 5 yang membentuk kompleks berwarna biru keunguan pada uji ini mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan ammonium yang dilepaskan pada oksidasi asam amino. Reaksi ninhidrin secara lengkap adalah sebagai berikut.

+ NH3 + CO2+RCHO+ Ninhidrin asam amino Ninhidrin tereduksi

+

+ 3H2O+

Kompleks berwarna biruKompleks berwarna biru keunguanGambar. Reaksi NinhidrinDari reaksi diatas dapat dijelaskan bahwa pada tahap awal reaksi ninhidrin akan bereaksi dengan asam amino sehingga asam amino akan mengalami dekarboksilasi oksidatif sehingga dihasilkan ninhidrin tereduksi, amoniak dan karbon dioksida. Ninhidrin tereduksiyang dihasilkan pada tahap reaksi pertama akan bereaksi dengan molekul ninhidrin yang lain dan juga beraksi dengan amonia yang dibebaskan pada reaksi pertama. Dari hasil reaksi tersebut akan dihasilkan kompleks yang berwarna biru keunguan.

Uji PbSPada uji belerang digunakan untuk mengidentifikasi adanya gugus belerang pada struktrur dari asam amino. Uji ini memberikan hasil yang positif pada asam amino Sistein, hal ini dikarenakan pada asam amino sistein terdapat gugus SH bebas. Reagen yang digunakan pada uji belerang ini adalah timbal-asetat. Belerang yang terdapat dalam asam amino sistein akan dibebaskan sebagai ion sulfida dengan kehadiran basa dari NaOH. Penambahan NaOH adalah untuk mendenaturasi protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus dengan adanya Pb-asetat yang kemudian akan membentuk PbS. Ion sulfida ini kemudian akan bereaksi dengan ion Pb2+ pada pereaksi membentuk endapan yang berwarna hitam (PbS). Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:S2-(aq) + Pb2+(aq) PbS(s) endapan hitamUji belerang yang dilakukan pada larutan albumin telur dan sampel unkown 3 memberikan hasil yang positif terhadap uji ini. Hal ini dapat diamati dari endapan hitam yang terbentuk setelah dilakukan pemanasan dalam penangas air. Maka pada larutan albumin dan sampel unknown 3 merupakan asam amino Sistein, karena larutan albumin dan sampel unknown 3 membebaskan ion sulfida dengan ditambahkan larutan NaOH yang kemudian bereaksi dengan ion Pb2+ membentuk endapan hitam. Sampel unknown 1,2,4 dan 5 memberikan hasil yang negatif terhadap uji ini, hal ini dapat diamati dari tidak terbentuknya endapan hitam setelah dilakukan pemanasan. Sampel yang diuji tetap memberikan larutan yang berwarna bening setelah ditambahkan larutan NaOH dan Pb-asetat kemudian dilakukan pemanasan. Hasil negatif yang diberikan menunjukan bahwa pada sampel 1,2,4 dan 5 tidak mengandung asam amino sistein. Berarti pada sampel tersebut terdapat atom belerang (S).

Reaksi NitroprusidaUji nitroprusida merupakan uji untuk protein yang mengandung gugus SH bebas (sistein). Uji ini positif ditandai dengan terbentuknya kompleks yang berwarna merah. Uji nitroprusida dilakukan dengan mereaksikan sampel albumin telur dengan larutan natrium nitroprusida Na2Fe(CN)5NO.2H2O dalam larutan amonia menghasilkan kompleks yang berwarna merah. Uji nitroprusida ini juga positif pada sampel unknown 2, sedangkan untuk sampel unknown 1, 3, 4 dan 5 negatif karena tidak terbentuk kompleks berwarna merah setelah direaksikan dengan larutan nitroprusidan dan amonia.Jadi pada sampel albumin telur dan unknown 2 mengandung asam amino sistein, sedangkan pada sampel unknown 1, 3, 4 dan 5 tidak mengandung asam amino sistein. Kompleks yang berwarna merah yang terbentuk merupakan Na2Fe(CN)5NO.2H2O, yang dihasilkan dari reaksi antara gugus SH dari sistein dengan natrium nitroprusida dalam larutan amoniak. Penambahan amonia berfungsi sebagai kation kompleks yang nantinya menggantikan posisi Na+ sebagai kation. Penambahan amonia dilakukan tidak berlebih karena nantinya amonia dapat bertindak sebagai ligan bagi kompleks besi, yang dapat menggangu hasil reaksi. Adapun persamaa reaksinya adalah sebagai berikut:

Kompleks berwarna merahSampel unknown 3 memberikan uji yang negatif pada uji nitroprusida, tetapi sampel unknown 3 ini positif pada uji PbS. Uji PbS merupakan uji untuk protein yang mengandung asam amino sistein juga. Uji pada sampel unknown 3 terhadap reaksi nitroprusid tidak memberikan warna merah setelah direaksikan dengan natrium prusida dalam larutan amoniak. Hasil yang negatif ini, ternyata memberikan uji yang positif setelah dilakukan pemanasan sampai mengalami koagulasi atau denaturasi. Hal ini menyebutkan bahwa pada proses tersebut telah menghasilkan gugus SH bebas. Hal ini juga terlihat pada uji yang dilakukan sampel known memberikan uji yang negatif terhadap reaksi nitroprusid dimana larutan yang terbentuk bening, setelah dilakukan pemanasan dalam penangas air memberikan warna merah pada larutan. Hal ini menunjukan bahwa sampel unknown 3 merupakan asam amino sistein. Tabel Hasil Pengamatan Uji Asam Amino pada Sampel Albumin dan UnknownSampelUjiMillonUji NinhidrinUjiPbSUji Nitroprusida

Albumin telur(+) Terbentuk endapan berwarna merah.

(+)warna campuran berubah menjadi biru (+)Terbentuk endapan hitam.(+)Terbentuk komplek yang berwarna merah

Sampel 1(-)tidak terjadi perubahan warna menjadi merah.

(+)warna campuran berubah menjadi biru keunguan.

(-)Tidak terbentuk endapan hitam.(-)tidak terjadi perubahan warna menjadi merah

Sampel 2(-)tidak terjadi perubahan warna menjadi merah.

(+)warna campuran berubah menjadi biru keunguan.

(-)Tidak terbentuk endapan hitam.(-)Terbentuk komplek yang berwarna merah

Sampel 3(-)tidak terjadi perubahan warna menjadi merah.

(+)warna campuran berubah menjadi biru keunguan.

(-)Tidak terbentuk endapan hitam.(-)tidak terjadi perubahan warna menjadi merah

Sampel 4(-)tidak terjadi perubahan warna menjadi merah.

(-)warna campuran tidak berubah tetap bening tidak berwarna (-)Tidak terbentuk endapan hitam.(-)tidak terjadi perubahan warna menjadi merah

Sampel 5(-) tidak terjadi perubahan warna menjadi merah.

(+)warna campuran berubah menjadi biru keunguan.

(-)Tidak terbentuk endapan hitam.(-)tidak terjadi perubahan warna menjadi merah

JAWABAN PERTANYAANUji Milon1. Apa yang terjadi jika garam merkuri ditambahkan ke dalam larutan protein?Ketika garam merkuri ditambahkan ke dalam larutan protein campuran yang terbentuk berwarna putih. Selanjutnya terjadi perubahan kimia dengan adanya perubahan warna menjadi berwarna merah ketika campuran dipanaskan.2. Mengapa larutan albumin terkoagulasi?Larutan garam dalam uji Milon adalah HgNO3.dalam asam nitrat dengan sedikit asam nitrit sehingga anion dari garam ini bersifat asam yang membuat protein dalam keadaan di bawah titik isoelektrik, sehingga protein bertindak sebagai basa dan sebagian besar terdapat sebagai anion. Anion dari protein inilah yang bereaksi dengan ion logam (Hg2+)serta membentuk garam proteinat yang tidak larut dalam air. Hal inilah yang membuatlarutan albumin terkoagulasi. Reaksinya adalah sebagai berikut.

3. Asam amino mana yang memberikan uji positif?mengapa?Asam amino yang memberikan uji positif adalah tirosin. Uji Millon digunakan untuk mengidentifikasi asam amino yang mengandung gugus fenol. Uji positif terhadap uji Millon ditandai dengan terbentuknya endapan yang berwarna merah setelah campuran dipanaskan. Warna merah yang terbentuk adalah berasal dari tirosin yang ternitrasi oleh larutan Millon yang terbuat dari merkuri dalam asam nitrat. Endapan putih yang terbentuk merupakan oksida dari Hg (I), dimana pada awalnya Hg dalam HNO2 mula-mula teroksidasi menjadi Hg22+. Ion Hg22+ ini selanjutnya membentuk garam dengan gugus karboksil dari tirosin. Adapun reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut.

Endapan putih yang terbentuk mengalami reaksi lebih lanjut ketika dipanaskan. Pada pemanasan tersebut, asam nitrat yang pada awalnya bertindak sebagai pelarut mengoksidasi ion Hg+ menjadi Hg2+. Bersaman dengan itu, Asam amino tirosin ternitrasi. Reaksi yang terjadi selanjutnya yaitu pembentukan oksida HgO yang berwarrna merah. Reaksi yang terjadi adalah.

Uji Hopkins-Cole1. Asam amino mana memberikan uji positif?Asam amino triptofan menunjukkan hasil yang positif terhadap uji ini dengan ditandai dengan terbentuknya cincin yang berwarna ungu pada bagian antara larutan triptofan dengan larutan reagen. Cincin ini disebut cincin indol yang strukturnya sebagai berikut.

2. Gugus apa yang memberikan reaksi uji positif?Reaksi uji positif jika terbentuk cincin berwarna ungu antara larutan sampel dan reagen. Cincin ungu terbentuk akibat kondensasi dari triptofan oleh gugus aldehida dari glioksilat dan asam sulfat berupa asam 2,3,4,5-tetrahidro--karbolin-4-karboksilat dengan struktur sebagai berikut.

Gambar. Rumus Struktur asam 2,3,4,5-tetrahidro--karbolin-4-karboksilatDi dalam uji Hopkins-Cole, asam sulfat pekat berfungsi sebagai oksidator dan berfungsi sebagai dehydrator bagi asam glioksilat. Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut.

Uji Ninhidrin1. Warna apa yang terbentuk? Mengapa?Campuran ninhidrin dengan asam amino dipanaskan maka akan terbentuk kompleks berwarna biru atau ungu. Penambahan reagen ninhidrin pada larutan albumin menyebabkan terbentuk larutan yang keruh, setelah dipanaskan terbentuk kompleks yang berwarna ungu kemerahan. Adapun reaksinya adalah sebagai berikut.

2. Gugus apa memberikan uji positif?Uji ini bersifat positif untuk semua jenis asam amino, kecuali prolin dan hidroksi prolin, mengingat gugus positif dalam reaksi ini adalah gugus NH2 dan COOH pada asam amino. Asam amino yang telah diuji dengan reagen ini adalah glisin, triptofan, tirosin, fenilalanin. Reaksi keseluruhan asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut: a. Derkakbosilasi oksidatif dari asam amino dan menghasilkan ninhidrin yang tereduksi, amoniak dan karbondioksida.b. Reaksi ninhidrin tereduksi dengan molekul ninhidrin yang lain dan dengan molekul amoniak yang dibebaskan membentuk kompleks berwarna biru atau ungu. Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut.

Uji PbS1. Senyawa apa yang berwarna hitam?Endapan yang berwarna hitam pada permukaan larutan pada reaksi sistein dengan Pb(CH3COO) adalah endapan PbS. Reaksi : Pb2+ + S2- PbS2. Terangkan fungsi NaOH!Asam amino sistein yang akan diuji sebelumnya ditambahkan dengan NaOH dengan tujuan untuk membuat ion sulfida yang terdapat dalam sistein dapat terbebas sebagai ion sulfida. Dengan lepasnya ion sulfida, maka ion ini akan bereaksi dengan reagen Pb(CH3COO)2 membentuk endapan hitam PbS.

Uji Nitroprusida1. Warna apa yang terbentuk?Reaksi antara sulfidril dari sistein, peptida (gutation), atau protein dengan natrium nitroprusida dalam amoniak berlebih menghasilkan komplek berwarna merah

2. Apakah sistein memberikan uji positif?Pada uji nitroprusida, sistein akan memberikan uji positif. Sistein dalam aquades akan mengalami reaksi antara gugus sulfidril dari sistein dengan natrium nitroprusida dalam amonia berlebih sehingga akan terbentuk pada bagian atas larutan berwarna ungu kemerahan. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut.

Kompleks berwarna ungu kemerahan]2-NH4+ + [Fe2+(CN)5NOS[Fe3+(CN)5NC]2- + NH3 +

3. Senyawa apa selain asam amino sistein yang memberikan uji positif?Senyawa peptida, karena peptida memberikan uji positif yang membentuk komplek berwarna merah jika direaksikan dengan natrium nitroprusida dalam amonia berlebih.