Pembahasan :

Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi DNA kromosom yang bertujuan

untuk memahami metode isolasi DNA kromosom sel prokariot berupa bakteri

Gram negatif menggunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit.

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom, yaitu seluruh

DNA yang ada pada suatu organisme (makhluk hidup), baik yang berfungsi atau

yang tidak, baik yang ada di inti sel, mitokondria, atau kloroplas, atau dengan kata

lain DNA genom adalah DNA mentah yang masih memiliki komponen lengkap

seperti promoter gen, bagian exon (mRNA yang akan dikirim keluar nukleus

untuk ditranslasikan), dan bagian intron (mRNA yang akan tetap berada di dalam

nukleus karena kemungkinan mRNA tersebut akan membentuk protein yang tidak

fungsional (tidak berguna) jika ditranslasikan). Bakteri gram negatif yang

digunakan adalah bakteri Eshericia coli. Bakteri gram negatif digunakan karena

struktur dinding sel bakteri gram negatif lebih tipis dibandingkan bakteri gram

positif sehingga akan lebih mudah dipecahkan. DNA kromosom yang diisolasi

adalah DNA kromosom dari bakteri Eschericia coli. Kromosom E.coli merupakan

1 untai ganda sirkular dengan ukuran sekitar 4.600kb. Ukuran DNA kromosom ini

lebih besar daripada DNA plasmid, oleh karena itu isolasi DNA kromosom harus

dilakukan secara lebih hati-hati supaya DNA tidak patah.

Hal pertama yang dilakukan adalah bakteri E.coli ditumbuhkan dengan

cara bakteri E.coli yang didapatkan dalam praktikum sebelumnya dimasukkan

kedalam 5 ml LB cair steril dan ditambahkan antibiotik Ampisilin 5 µL. Media

LB (Luria-Bertani) merupakan salah satu media yang paling umum digunakan

untuk memelihara dan menumbuhkan strain rekombinan dari  Escherichia coli

dan digunakan pada industri sejak tahun 1950-an. Selain itu, media LB juga

merupakan medium optimal untuk pertumbuhan bakteri. Komposisi umum media

LB cair diantaranya adalah tryptone, NaCl, ekstrak ragi, dan aqua bidest (fungsi

masing2 zat ???). Penambahan antibiotik bertujuan untuk agar bakteri yang sudah

terdapat plasmid yang resisten terhadap antibiotik tetap stabil dan berkembang

dengan baik. Karena apabila LB cair biakan tidak mengandung antibiotik nanti

dikhawatirkan bakteri yang sudah mempunyai plasmid tersebut melepaskan

kembali plasmid resisten yang telah dimilikinya. Setelah itu, campuran diinkubasi

pada suhu 37oC selama 12-16 jam dengan pengocokan yang bertujuan agar koloni

bakteri E.coli tersebar homogen dalam media LB cair. Inkubasi tersebut bertujuan

untuk memberikan kondisi yang sesuai dengan kondisi pertumbuhan bakteri

sehingga bakteri dapat tumbuh secara maksimal. Dan dihasilkan bakteri yang

dipanen dalam bentuk suspensi bakteri E.coli. Pada praktikum yang dilakukan,

terdapat kesalahan pada penambahan antibiotik yang dilakukan, dimana pada

praktikum sebelumnya dilakukan transformasi dengan penyisipan gen resisten

kanamisin sedangkan antibiotik yang ditambahkan adalah ampisilin. Walaupun

demikian, bakteri E.coli tetap tumbuh sehingga dapat disimpulkan kemungkinan

bakteri telah mempunyai gen resisten terhadap ampisilin.

Suspensi E.coli yang didapatkan selanjutnya dimasukkan kedalam 5

tabung appendorf masing-masing 1 mL. Pembagian kedalam 5 tabung eppendorf

tersebut agar dapat sekaligus disentrifugasi dan proses sentifugasi bisa dilakukan

lebih cepat, karena jika digunakan hanya 1 tabung appendorf lalu 5 ml suspensi

bakteri dimasukkan maka waktu yang disentrifugasi menjadi lebih lama yakni 25

menit. Selain itu, kapasitas tabug appendorf yang hanya 1,5 mL dan agar endapan

yang dihasilkan lebih banyak sehingga sel yang DNAnya akan diisolasi menjadi

lebih banyak. Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5000g selama 5 menit.

Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat

molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan

berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas

tabung. Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara

horizontal pada jarak tertentu. Apabila objek berotasi di dalam tabung atau

silinder yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat

bergerak menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya

yang berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya

tersebut adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel

menuju dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan. Hasil sentrifugasi

akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian

atas dan pelet pada bagian bawah. Pada sentrifugasi ini, didapatkan endapan dari

sel-sel DNA bakteri, karena sel-sel bakteri mempunyai berat molekul yang cukup

besar sehingga akan mengendap sebagai pelet di bagian bawah tabung. Kemudian

supernatan dari masing-masing tabung appendorf yang tidak mengandung sel-sel

bakteri (hanya mengandung sisa LB cair) dibuang. Supernatan dapat dibuang

dengan cara langsung dituang dari tabung appendorfnya kemudian sisa supernatan

yang sulit terbuang dipipet secara hati-hati dan jangan sampai pelletnya ikut

terpipet/terbuang. Kemudian pellet dari 5 tabung appendorf disatukan (dijadikan 1

tabung) dengan cara ditambahkan 500µL ddH2O steril dimasukkan kedalam

tabung appendorf pertama, kemudian dilakukan pipetting sampai pellet

tersuspensi dalam tabung. Selanjutnya dipipet dan dimasukan ke tabung kedua,

lakukan pipeting lagi hingga pellet tersuspensi lalu dipipet dan dimasukkan ke

tabung ketiga begitu selanjutnya hingga tabung ke 5. Penambahan aqua bidest

bertujuan untuk memudahkan dalam pemindahan pelet dari satu tabung ke tabung

selanjutnya dengan mengubah bentuknya menjadi suspensi. Aqua bidest

digunakan karena aqua yang diperoleh dari proses destilasi/penyulingan sebanyak

2 kali ini mempunyai kandungan bakteri yang sangat kecil/ tidak ada akibat proses

penguapan lalu pendinginan yang dilakukan saat pembuatannya. Selanjutnya

suspensi pellet tersebut disentrifugasi pada kecepatan 5000g selama 5 menit dan

supernatan dibuang. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000 g ini berfungsi

untuk ............... Saat sentrifugasi, peletakan tabung yang akan disentrifugasi harus

berhadapan dengan tabung kelompok 2 agar selama sentrifugasi keseimbangannya

terjaga. Jika hanya 1 tabung yang akan disentrifugasi, maka harus digunakan

tabung kosong untuk membuat seimbang. Kemudian pellet ditambahkan kembali

dengan 500 µL aqua bidest dilanjutkan dengan pipeting dan disentrifugasi pada

kecepatan 5000 g selama 5 menit, supernatan dibuang. Proses ini bertujuan agar

sel-sel bakteri tersebut bersih dan bebas dari zat-zat yang larut bersamanya

sebelumnya.

Setelah itu, kedalam tabung yang berisi pellet ditambahkan 45µL digest

solution lalu dilakukan pipetting agar pelet tersuspensi, lalu ditambahkan 5µL

proteinase K lalu vortex. Penambahan proteinase K berfungsi untuk

menghancurkan/mendegradasi dengan memotong-motong atau memutus ikatan

peptida dari protein-protein yang terdapat pada sel bakteri tersebut seperti dinding

sel yang tersusun atas protein yang berikatan dengan polisakarida (peptidoglikan)

atau membran sel yang tersusun atas lemak dan protein. Digest solution adalah

campuran apa??....... berfungsi untuk melisis membran bakteri dan membebaskan

isi sel bakteri. Sedangkan vortex dilakukan untuk mengocok campuran sehingga

diperoleh campuran yang homogen dan agar pemutusan ikatan-ikatan peptida

karena penambahan Protease K dan pelisisan membran bakteri karena

penambahan digest solution tersebut dapat terjadi lebih cepat.  Selanjutnya

suspensi sel yang pecah diinkubasi pada suhu 56oC di dalam shaking waterbath

sampai sel lisis secara sempurna kira-kira selama 30 menit. Hal tersebut bertujuan

untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur dan

sesekali divortex untuk menghomogenkan larutan, agar lisis dari sel terjadi

sempurna. Kemudian ekstrak sel ditambahkan 5uL Rnase A kemudian vortex lalu

diinkubasi pada suhu ruangan. DNA yang telah dibersihkan dari protein dengan

menggunakan proteinase K dan dari remukan sel masih tercampur dengan RNA

sehingga penambahan RNAse diperlukan untuk menghancurkan RNA sehingga

DNA dapat diisolasi secara utuh. Karena dalam praktikum yang akan diisolasi

adalah DNA maka perlu penambahan RNase untuk menghancurkan RNA

begitupun sebaliknya jika yang akan diisolasi adalah RNA, maka yang harus

dihancurkan adalah DNA dengan DNase. Suhu ruangan digunakan untuk

menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase) dan tahapan ini termasuk

dalam pemecahan dinding sel dan membran inti secara fisik. Selanjutnya ke dalam

ekstrak ditambahkan lisis solution lalu vortex selama 15 detik hingga doperoleh

campuran yang homogen. Lisis solution berisi ...... konsentrasi ........ berfungsi

untuk membantu memaksimalkan kerja dari digestion solution. Kemudian

kedalamnya ditambahkan 100µL etanol 50% lalu vortex. Fungsi dari penambahan

etanol juga untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul atau agar terjadi

dehidrasi DNA sehingga terjadi praecipitasi, karena etanol 50% akan melarutkan

senyawa lain selain DNA. Strand-strand DNA yang terikat oleh etanol akan

nampak sebagai benang-benang putih yang terapung diatas filtrat. Pemekatan

dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA. Etanol

yang digunakan mempunyai konsentrasi 50% karena...............................

Lalu ekstrak dimasukkan kedalam kolom GeneJETTM (Genomic DNA

Purification Column) yang dibawahnya telah ditaruh tabung kolektor. Ekstrak

dimasukkan dengan cara dipipet tegak lurus dan secara perlahan mengarah ke

tengah membran kolom plasmid tetapi tip mikropipet tidak boleh menyentuh

membran kolom agar kolom tidak rusak.  Selanjutnya disentrifugasi pada

kecepatan 6000g selama 1 menit. Hal ini bertujuan untuk memisahkan

kontaminan yang mungkin masih terdapat pada supernatan. Prinsip kerja dari

kromatografi kolom adalah didasarkan pada absorbsi komponen-komponen

terhadap afinitas berbeda terhadap fase diam. Absoben bertindak sebagai fase

diam dan fase geraknya adalah cairan yang mengalir membawa komponen

campuran sepanjang kolom. Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap

absorben akan tertahan secara selektif dan yang afinitasnya paling kecil akan

mengikuti aliran pelarut. Dalam hal ini, fase diam merupakan menbran plasmid

yang dapat berikatan dengan DNA. Kemudian supernatan yang berisi etanol 50%

dan tidak mengandung DNA (karena telah terikat pada membran plasmid) dalam

tabung kolektor dibuang. Dan kolom dimasukkan kembali ke dalam tabung

kolektor yang sama dan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 g selama 1 menit

agar pemisahan berlangsung sempurna. Supernatan yang tertampung pada tabung

kolektor dibuang. Lalu ke dalam kolom dimasukkan wash buffer sebanyak 250µL

lalu disentrifugasi dengan kecepatan 8000g selama 1 menit. Wash buffer I

berisi................. Sedangkan sentrifugasi dengan kecepatan 8000 g berfungsi

untuk ........... Setelah disentrifugasi supernatan yang tertampung di tabung

kolektor dibuang. Kemudian ke dalam kolom dimasukkan wash buffer II, lalu

disentrifugasi dengan kecepatan 1200 g selama 1 menit. Wash buffer II

berisi............... Berbeda dengan sentrifugasi sbelumnya, sentrifugasi dengan

kecepatan 12000 g berfungsi untuk ........... Selanjutnya supernatan yang

tertampung di dalam tabung kolektor dibuang. Proses penambahan wash buffer

sebagai fase gerak pertama ini merupakan proses pencucian DNA (mencuci DNA

dari pengotor) karena wash buffer akan mengelusi residu dari kolom sedangkan

DNA akan tetap terikat pada membran plasmid (fase diam/kolom). Jika masih ada

larutan residu yang terlihat, maka disentrifugasi lagi dengan kecepatan yang sama

selama 1 menit.  Pengulangan ini dimaksudkan agar mendapatkan pellet yang

lebih murni, sehingga hasil yang didapatkan akan lebih baik dibandingkan dengan

sentrifugasi tanpa pengulangan. Pada proses pencucian ini digunakan wash buffer

I dan II yang telah ditambahkan etanol 96-100% dengan perbandingan 3:1.

Kenapa beda??

Penampung di bawah kolom diganti dengan tabung appendorf 1,5 mL.

Kedalam kolom dimasukkan Elution buffer kebagian tengah membran kolom

plasmid (kolom mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom) sebanyak

30µL yang berisi 10mM TrisCl, pH 9,0 dan 0,5 mM EDTA. Penambahan Ellution

Buffer berfungsi untuk mengelusi DNA dan mengikat pengotor selain DNA

dalam kolom sehingga DNA terpisah sempurna dari pengotor dan dapat dibawa

keluar dari membran plasmid (kolom). Elution buffer dapat mengelusi DNA

karena ......... Volume Elution Buffer yang digunakan cukup kecil karena DNA

diisolasi dari jumlah sampel yang sedikit dan diperlukan konsentrasi DNA yang

lebih pekat, tetapi semakin sedikit volume Ellution Buffer maka akan semakin

sedikit pula kadar DNA yang terelusi. Kemudian diinkubasi pada suhu ruangan

selama 2 menit berfungsi untuk ................. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan

8000g selama 1 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 8000 g berfungsi

untuk ........... Hasil dari penambahan elution buffer yang telah disentrifugasi

tersebut ditampung di tabung appendorf 1,5mL dan selanjutnya disebut fraksi A

dan disimpan pada suhu -20 oC. Setelah itu, kolom yang telah dilepas ditempatkan

pada tabung appendorf 1,5 mL baru untuk menampung hasil elusi kedua dan

ditambahkan kembali elution buffer sebanyak 30µL. Lalu diinkubasi pada suhu

ruangan selama 2 menit dan disentrifugasi pada kecepatan 8000g selama 1 menit.

Fraksi yang tertampung pada appendorf selanjutnya disebut fraksi B lalu disimpan

pada suhu -20 oC. Perlakuan tersebut dilakukan sebanyak 2 kali agar ................

Fungsi Sentrifugasi dengan kecepatan 5000g, 6000 g, 8000g

dan 12000g bisa dilihat di ncbi kata akangnya.

Warna merah : aku ga yakin jawabannya

Kuning : aku ga tau jawabnnya .. hehehe