Jurnal Praktikum Fitofarmasi

Nama : Dewi Gayatri W.

NIM : 102210101057

Kelompok : S4

Hari/ tgl praktikum : Selasa, 26 Februari 2013

Dosen pembimbing : Endah Puspitasari, S. Farm., M.Sc., Apt.

Materi percobaan : Selektivitas, linieritas dan presisi

1. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan uji

validasi metode dan penetapan kadar kuersetin secara KLT densitometri.

2. Dasar Teori

Validasi metode analisis adalah suatau rangkaian percobaan yang bertujuan untuk

memastikan bahwa metode analisis yang digunakan telah memenuhi persyaratan yang telah

ditetapkan. Parameter metode validasi meliputi 10 parameter yaitu linieritas, batas deteksi

(LOD), batas kuantitas (LOQ), akurasi, presisi, selektivitas, atau spesifisitas, sensivitas,uji

ketangguhan (ruggedness), kekuatan (robustness), dan ketidak pastian (uncertainty).

(Sumardi,2002)

Suatu metode dikatakan spesifik apabila mampu mengukur analit tanpa diganggu oleh

komponen lain, sedangkan metode dikatakn selektif apabila mampu mengukur analit dalam

campuran berbagai komponen lain. Spesifitas dapat dilakukan dengan menentukan identitas

dan kemurnian dari analit yang ditentukan. Sedangkan selektivitas dilakukan dengan

menentukan nila resolusi (Rs).

Linearitas adalah metoda analisa yang digunakan untuk mensintesa formula persamaan

regresi hubungan antara absorbsi dan konsentrasi dari suatu matrik Standart Reference

Material (SRM) berdasarkan kurva linerity kalibrasi sehingga terdeteksi kemampuan metoda

memberikan kenaikan respon sesuai dengan kenaikan konsentrasi. (Tri Budi M,2005).

Sebagai parameter adanya hubungan linear atau tidak digunakan koefisen korelasi (r) dari

persamaan regresi linear y = bx + a. Sedangkan Batas Deteksi (Limit of Deteksi = LOD)

adalah konsentrasi terendah yang masih mampu terdeteksi oleh suatu metoda dan berbeda

nyata dengan pengukuran blanko .(Sumardi, 2002).

Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar

analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery)

analit yang ditambahkan. Persen rekoveri dapat ditentukan dengan menggunakan 4 macam

pendekatan yaitu :

Analisis sampel dengan konsentrasi diketahui

Perbandingan hasil dengan metode standar

Standar adisi, spiking dalam blanko

Penentuan akurasi dilakukan dengan cara membuat sampel plasebo ( eksipien obat,

cairan biologis) kemudian ditambah standar dengan konsentrasi tertentu ( 80–120

% dari kadar analit yang diperkirakan ), kemudian dianalisis dengan metode yang

akan divalidasi.

Standar adisi, spiking standar dalam sampel

Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit (standar)

dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang akan diperiksa, lalu dianalisis

dengan metode yang akan divalidasi.

Presisi adalah nilai yang menunjukkan bahwa dengan pengulangan beberapa kali

pengukuran akan menghasilkan nilai yang tidak berbeda bermakna. Parameter presisi adalah

simpangan baku relatif (RSD) dari pengukuran secara berulang. Presisi suatu metode dapat

ditentukan dengan melakukan analisis sampel yang sama secara berulang kali dan disarankan

sebanyak 10 kali dengan nilai RSD tidak boleh lebih dari 2 %. Sedangkan untuk cairan

biologis RSD 10 % masih cukup memadai.

Eluasi dengan kondisi :

1. Kloroform : Aseton : As. Formiat = 150: 33: 17

2. Kloroform : Etil Asetat : As. Formiat = 5 :4 : 1

3. Kloroform : : Metanol : Air = 85 : 15 : 1

4. Toluen : Aseton : Metanol : As. Formiat = 46 : 8: 5: 1

Tentukan resolusi dengan menotolkan 10 µl larutan sampel yang

telah dihidrolisis bersama dengan 2 µl larutan standar konsentrasi

tertentu pada lempeng KLT

3. Alat dan bahan

a. Alat

Labu alas bulat

Labu ukur 10 ml

Labu ukur 25 ml

Lempeng KLT

KLT densitometri

Termometer

Gelas ukur

Erlenmeyer

Timbangan

Mikropipet

b. Bahan

Sampel/ekstrak

Standar kuersetin

Kloroform

Asam formiat

Metanol

Aseton

Air

Toluen

Etil Asetat

4. Cara Kerja

a. Uji Selektivitas

Hitung resolusi dengan rumus :

Rs = 2∆ Z

(Wa+Wb) = 2 [ ( dR ) A−(dR ) B ]

(Wa+Wb)

Encerkan larutan baku induk dengan konsentrasi 300, 600, 900,

1200, dan 1800 ppm

Ditimbang seksama 30 mg standar kuersetin

Masukkan dalam labu ukur 10 ml

Tambahkan etanol ad tanda, kocok pelan ad larut

Dimana :

Δ Z : Jarak dua noda analit

( dR )A : Jarak yang ditempuh analit A

( dR )B : Jarak yang ditempuh analit B

WA : Lebar noda analit A

WB : Lebar noda analit B

b. Linieritas

1. Pembuatan Larutan Baku Induk

2. Pembuatan Larutan Baku Kerja

3. Penentuan Linieritas

Buat garis regresi linier dari data yang diperoleh antara

konsentrasi dengan area noda

Hitung nilai koefisien regresi

Tentukan linieritas dengan menotolkan larutan baku kerja

sebanyak 2 µl pada lempeng KLT

Timbang standar kuersetin 30 mg

Eluasi dengan fase gerak

Kloroform : Aseton : As. Formiat = 150 : 33 : 17

Masukkan dalam labu ukur 10 ml

Scan lempeng KLT dengan KLT Densitometer untuk

menentukan area masing-masing konsentrasi pada λmax

Tambahkan etanol ad tanda, kocok pelan ad larut

( larutan baku induk )

Encerkan larutan baku induk untuk mendapatkan larutan

baku kerja dengan konsentrasi 300, 600, 900, 1200, dan

1800 ppm

c. Presisi

1. Preparasi Standar Kuersetin

Totolkan hasil preparasi masing – masing 10 µl pada lempeng KLT

bersama larutan standar kuersetin konsentrasi 300, 600, 900, 1200, dan

1800 masing – masing 2 µl

Timbang sampel 250 mg ( replikasi 3 kali )

Scan lempeng KLT dengan KLT Densitometer

Eluasi dengan fase gerak :

Kloroform : Aseton : As. Formiat = 150 : 33 : 17

Tambahkan etanol 21 ml dan HCl 57 % 0,6 ml

Masukkan dalam labu alas bulat

Hidrolisis pada suhu 70ºC selama 30 menit

Masukkan hasil hidrolisis dalam labu ukur 25 ml

Tambahkan etanol ad tanda

2. Preparasi sampel

3. Penentuan Presisi

Buat kurva regresi antara konsentrasi standar kuersetin dengan

area

Tentukan kadar kuersetin dengan menginterpolasikan area ke

dalam kurva regresi larutan standar kuersetin

Tentukan presisi dengan menghitung SD dan KV kadar

kuersetin

`

Lakukan preparasi seperti pada penentuan presisi

Timbang sampel 250 mg ( 3 x replikasi ), masing – masing

tambahkan kuersetin 1 mg

Masukkan dalam labu alas bulat

Tambahkan etanol 21 ml dan HCl 57% 0,6 ml

Hidrolisis pada suhu 70 ºC selama 30 menit

Masukkan hasil hidrolisis dalam labu ukur 25 ml dan

tambahkan etanol ad tanda

Totolkan hasil preparasi masing – masing 10 µl pada lempeng

KLT bersama – sama dengan larutan standar kuersetin

konsentrasi 300, 600, 900, 1200, dan 1800 ppm masing –

masing sebanyak 2 µl

d. Akurasi

1. Preparasi Standar Kuersetin

2. Preparasi sampel

3. Penentuan akurasi

Eluasi dengan fase gerak

Kloroform : Aseton : Asam Formiat = 150 : 33 : 17

Scan lempeng KLT dengan KLT Densitometer

Buat kurva regresi antara konsentrasi standar kuersetin

dengan area

Tentukan kadarkuersetin dalam sampel dengan

menginterpolasikan area ke dalam kurva regresi larutan

standar kuersetin

Tentukan akurasi dengan rumus :

% Recovery = Kadar yangdiperole h

Kadar sebenarnya = Ct

Cp+Cstx 100 %

Dimana :

Ct = Kadar kuersetin yang diperoleh

Cp = Kadar kuersetin dalam sampel

Cst = Kadar standar kuersetin yang ditambahkan

Daftar Pustaka

Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya.

Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 – 135. Jakarta :

Departemen Farmasi FMIPA-UI.

Infansyah, N. Metode Analisis KLT Densitometri.Unit Layanan Pengujian dan

Kerjasama Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

Sumardi, 2002 . Validasi Metoda Pengujian . Jakarta : Pusat Standardisasi dan

Akreditasi Sekjen Deptan .

Tri Budi U . 2005 . Validasi Metode Uji . Bogor : Balai Penelitian Veteriner .