REVIEW JURNAL PRAKTIKUM BIOANALISIS

“PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE KCKT-SM UNTUK

PENETAPAN DEXCHLORPHENIRAMINE MALEATE DALAM PLASMA”

Disusun Oleh:

Wanda Indriani Wibowo 098114003

Kenny Ryan Limanto 098114006

Bernadetta Arum Wijayanti 098114007

Rachelia Octavia 098114008

Johanes Putra Wicaksono 098114010

Dina Christin 098114015

Jenny Marina 098114016

KELOMPOK A1

LABORATORIUM BIOANALISIS

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2011

1

REVIEW JURNAL

Kromatografi

Kromatografi merupakan teknik analisis yang paling sering digunakan pada

analisis senyawa dalam sediaan farmasi maupun cairan biologis. Berdasarkan alat

yang digunakan, kromatografi dapat dibagi menjadi empat, antara lain: (a)

kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis; (c) kromatografi cair kinerja

tinggi; dan (d) kromatografi gas. Dalam penelitian ini akan dibahas lebih lanjut

tentang kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang juga dikenal sebagai HPLC

(High Performance Liquid Chromatography) (Gandjar, 2010).

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut

terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati

suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut

dalam fase gerak dan fase diam. Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas

delapan komponen pokok yaitu: (1) wadah fase gerak, (2) sistem penghantaran

fase gerak; (3) alat untuk memasukkan sampel; (4) kolom; (5) detektor; (6) wadah

penampung buangan fase gerak; (7) tabung penghubung, dan (8) suatu komputer

atau integrator atau perekam (Gandjar, 2010).

Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS atau alternatif KC-SM)

adalah teknik kimia analisis yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik

dari kromatografi cair (KCKT) dengan kemampuan analisis (detektor)

spektrometer massa. LC-MS adalah teknik yang banyak digunakan untuk berbagai

aplikasi yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas sangat tinggi. Pada umumnya

aplikasi LC-MS berorientasi pada deteksi dan identifikasi potensi spesifik suatu

senyawa terhadap keberadaan senyawa lainnya (dalam campuran yang kompleks).

Pendahuluan

Pada penelitian ini, dilakukan pengembangan dan validasi metode analisis

KC-MS yang sederhana, spesifik, cepat, sensitif untuk menetapkan kadar

chlorpheniramine maleate (RS-CPM) dalam plasma manusia. Tujuan dari

penetapan kadar obat dalam plasma adalah mengetahui bioavailabilitas dan

bioekivalensi dari suatu obat.

2

Gambar 1. Struktur Dexchlorpheniramine maleate

Dexchlorpheniramine maleate (RS-CPM) atau yang dikenal juga sebagai

3-(4-chlorophenyl)-N,N-dimethyl-3-(2-pyridyl) propylamine monomaleate

merupakan obat antihistamin yang poten. Dalam penggunaannya, CPM banyak

digunakan untuk meringankan gejala penyakit tertentu, seperti demam dan alergi.

Struktur dari CPM yang mempunyai atom C kiral yang mengakibatkan CPM

terdapat dalam bentuk sinister (berotasi berlawanan arah jarum jam) dan rectus

(berotasi searah jarum jam). Berdasarkan penelitian yang ada, CPM yang

mempunyai aktivitas farmakologi adalah S-CPM (dextrorotatory S-enantiomer).

Di dalam Farmakope Eropa III (European Pharmacopoeia III), metode KCKT

maksimum yang diijinkan dalam sampel yang diuji sebesar 2% b/b. Dari studi

farmakokinetika yang telah dilakukan, diketahui bahwa kadar CPM dalam plasma

sangatlah rendah, yaitu berada pada level maksimal konsentrasi sebesar 6,2 ng/mL

dan 7,0-8,2 ng/ mL untuk pemberian oral dengan dosis tunggal 2 mg dan 4 mg.

Dari penelitian terdahulu, banyak metode yang dapat digunakan untuk

menetapkan kadar RS-CPM, antara lain GC (Gas Chromatography), GC-MS

(Gas Chromatography-Mass Spectrometry), dan KCKT (High Performance

Liquid Chromatography).

Pada penelitian ini, dilakukan pengembangan dan validasi metode analisis

KCKT-MS yang sederhana, spesifik, cepat, sensitif untuk menetapkan kadar S-

CPM dalam plasma manusia. Pengembangan dari metode ini digunakan untuk

menetapkan kadar S-CPM dalam plasma setelah pemberian dosis tunggal tablet

yang mengandung S-CPM sebanyak 6 mg pada subjek uji pria yang sehat. Dari

dapat digunakan untuk menentukan kemurnian dari S-CPM, dimana kadar R-CPM

3

metode ini, dipeoleh nilai LOQ sebesar 1,0 ng/ mL dengan waktu pengerjaan

selama 5 menit.

Gambar 2. Struktur Simvastatin (STA)

Alat dan Bahan

Dalam penelitian ini, standar S-CPM yang digunakan mempunyai

kemurnian 99,67%. Standar internal simvastatin (STA) yang digunakan

mempunyai kemurnian 98,44%. Perlu ditambahkan standar internal sebagai faktor

koreksi sebab zat analit yang diuji memiliki konsentrasi yang sangat kecil dalam

sampel (plasma). Pemilihan simvastatin sebagai standar internal dikarenakan

alasan sebagai berikut:

1. terpisah sempurna dari peak senyawa yang dianalisis dan peak lain,

2. memiliki waktu retensi yang mirip dengan sampel,

3. tidak terdapat dalam sampel awal,

4. dapat me-mimic analit disetiap tahap preparasi sampel,

5. tidak harus memiliki kemiripan secara kimiawi dengan analit dan

6. stabil dan tidak bereaksi dengan sampel atau fase gerak.

Ada berbagai macam cairan biologis yang dapat digunakan, meliputi darah,

serum, plasma, urin, keringat, saliva, empedu, air susu dan air mata. Cairan

biologis yang digunakan dalam penelitian ini merupakan plasma. Perbedaan

plasma dan serum adalah pada plasma diberikan antikoagulan (berupa heparin),

sedangkan pada serum tidak. Pemilihan plasma sebagai sampel biologis

4

disebabkan karena protein (yang mengikat obat) dalam plasma tidak mengendap

sehingga obat masih berada di dalam plasma dan dapat diukur kadarnya.

Untuk pembuatan larutan stok S-CPM dan standar internal (STA), analit

dilarutkan dengan asetonitril sehingga dihasilkan larutan dengan konsentrasi 1000

µg/ mL. Asetonitril digunakan sebagai pelarut S-CPM dan standar internal supaya

kedua analit yang akan ditetapkan kadarnya berada dalam bentuk bebas sehingga

bersifat lebih non-polar, dapat larut dalam pelarut organik dan dapat dipisahkan

dari protein (senyawa endogen). Senyawa endogen harus dipisahkan dari larutan

uji supaya tidak mengganggu kinerja alat yang digunakan. Senyawa endogen

(seperti protein) memiliki ukuran yang besar sehingga dapat menyumbat kolom

dan mengganggu pembacaan serapan yang dihasilkan.

Larutan stok sekunder dan kerja dibuat dengan cara mengencerkan larutan

stok dengan campuran pelarut air: asetonitril (50:50 v/v). Larutan stok kerja yang

telah dibuat digunakan untuk membuat kurva baku dan uji kontrol kualitas dari

sampel yang akan ditetapkan kadarnya. Pada percobaan ini, kurva kalibrasi

digunakan untuk melihat adanya korelasi antara respon yang dihasilkan (AUC)

dan konsentrasi, dimana semakin tinggi konsentrasi maka AUC yang dihasilkan

akan semakin besar juga. Kurva kalibrasi dibuat dengan delapan seri konsentrasi

larutan baku S-CPM dalam rentang 1,0 – 150,0 ng/mL.

Kontrol kualitas sampel berfungsi sebagai kontrol dalam validasi metode

analisis untuk sampel. Kontrol ini dilakukan dengan cara menambahkan S-CPM

yang diketahui konsentrasinya ke dalam blanko plasma. Sampel kemudian

dihomogenkan dengan vortex dan disimpan pada suhu -70 ± 2oC. Sampel

disimpan pada suhu rendah (-70 ± 2oC) supaya terjadi inaktivasi enzim yang

mungkin terdapat di dalam plasma. Enzim tersebut dapat mendegdradasi obat

yang akan diuji.

Sampel disiapkan dengan cara ekstraksi cair-cair. Sebanyak 0,5 mL alikuot

plasma darah manusia dicampur dengan 0,1 mL larutan standar kerja internal

(STA dengan konsentrasi 2500,0 ng/ mL) dan ditambahkan sebanyak 1,0 mL

buffer borat dengan pH 9,00, lalu dicampurkan. Tujuan penambahan buffer borat

dengan pH 9,00 adalah agar CPM berada dalam suasana basa sehingga CPM lebih

5

mudah larut dalam pelarut organik yaitu etil asetat sedangkan protein masuk ke

dalam fase air. Larutan tersebut dihomogenkan dengan vortex dan diekstraksi

dengan menggunakan etil asetat sebanyak 3 x 2 mL dengan tujuan untuk

memperoleh pemisahan yang sempurna. Tidak dilakukan dalam satu kali ekstraksi

karena dikhawatirkan masih ada CPM yang belum terlarut dalam etil asetat.

Diambil fase etil asetat karena senyawa yang akan ditetapkan kadarnya memiliki

kelarutan yang besar pada etil asetat (lapisan atas). Larutan yang terdapat pada

lapisan atas diuapkan sehingga diperoleh residu. Residu tersebut kemudian

dilarutkan dalam fase gerak dengan volume yang kecil untuk memperoleh

konsentrasi yang lebih pekat. Hal ini dikarenakan sampel yang digunakan dalam

penelitian ini merupakan trace analysis sample, dimana kmsentrasi sampel yang

akan ditetapkan kadarnya sangat kecil sehingga perlu dilakukan pemekatan.

Instrumentasi Alat

Pada analisis Dexchlorpheniramine maleate dalam plasma darah digunakan

instrumen berupa Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan detektor

spektrometer massa. Penggunaan KCKT didasarkan pada pemisahan yang relatif

baik, cepat, sensitif, dan spesifik dibandingkan dengan Kromatografi Cair (KC)

karena KCKT merupakan teknik pemisahan yang diberikan tekanan tinggi.

Kombinasi Kromatografi Cair - Spektrometer Massa (KC-SM) memiliki

beberapa kelebihan yaitu:

1. dapat digunakan untuk menganalisis molekul obat dan metabolitnya dengan

BM yang rendah maupun tinggi,

2. SM memberikan identifikasi yang baik sebagai detektor pada KCKT karena

bobot molekul merupakan salah satu determinasi yang spesifik untuk tiap

molekul dan jika informasi ini digabungkan dengan strukturnya, dapat

memberikan identifikasi yang baik

3. SM memiliki selektifitas yang tinggi terkait dengan kemampuannya dalam

identifikasi dan

6

4. selektifitas SM digunakan untuk menandai standar internal dan analit,

ditambah dengan sensitifitas, akurasi, dan presisi determinasi kuantitatif yang

baik.

Fase gerak yang digunakan pada penetapan kadar S-CPM yaitu

metanol:amonium asetat (90:10) dengan kecepatan aliran 0,5 mL/ menit. Dalam

percobaan ini, waktu pengerjaan yang dibutuhkan hanya enam menit. Hal ini

dikarenakan dalam waktu enam menit, standar dan sampel sudah terpisah dengan

baik. Pemilihan fase gerak disesuaikan berdasarkan kepolaran analit yang akan

dianalisis. Kecepatan alir yang digunakan adalah 0,5 mL/ menit karena pada

kecepatan alir tersebut diperoleh pemisahan yang baik. Hal ini ditandai dengan

resolusi peak yang dihasilkan lebih besar dari 1,5.

Pengembangan Metode

Hal ini bertujuan untuk mengembangkan dan memvalidasi metode uji yang

sederhana, cepat, dan sensitif untuk melakukan kuantifikasi S-CPM. Metode ini

cocok untuk menentukan farmakokinetika dari suatu senyawa uji. Untuk

mencapai tujuan tersebut, diperlukan optimasi ekstraksi sampel, deteksi parameter

dan kromatografi. Larutan standar S-CPM dianalisis menggunakan KC-SM

dengan sistem injeksi langsung yang kemudian diperiksa dengan bantuan ESI dan

APCI. Berdasarkan data spektra massa yang diperoleh, berat molekul untuk S-

CPM adalah 274,9.

Gambar 3. Spektra massa hasil pemisahan

7

Dalam KCKT, tujuan dari optimasi fase gerak adalah untuk mendapatkan

resolusi peak yang baik dan simetris baik analit dan standar internal (SI). Prinsip

pemisahan pada KCKT adalah molekul yang terlarut dalam fase gerak akan

melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang

kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul

yang berikatan lemah dengan kolom. Dengan demikian, berbagai macam tipe

molekul dapat dipisahkan berdasarkan kepolaran dan pergerakan pada kolom.

Fase gerak yang akan dioptimasi adalah amonium asetat, asam asetat, atau

kombinasi dari keduanya pada konsentrasi yang berbeda. Dari hasil penelitian,

diperoleh bahwa campuran dari asetonitril-air (mengandung 10 mL amonium

asetat dan 0,5% asam asetat) (90:10 v/v) dapat digunakan sebagai fase gerak. Hal

ini dikarenakan komposisi fase gerak tersebut memberikan pemisahan yang baik.

Junlah buffer yang ditambahkan (amonium asetat dan asam asetat) perlu

dioptimasi untuk mempertahankan bentuk peak karena jumlah buffer

mempengaruhi derajat ionisasi dan fragmentasi saat dideteksi dengan

spektrometer massa.

Selain itu perlu dilakukan optimasi kolom dan setelah dilakukan

pembandingan terhadap beberapa jenis kolom, maka digunakan kolom

Phenomenex (Luna)-ODS (100x4,6 mm, i.d. 5 µm) dengan flow rate 0,5 mL/

menit untuk dapat menghasilkan bentuk peak yang baik dan waktu proses yang

diijinkan adalah selama 2 menit. Ekstraksi pada tahap preparasi sampel sangat

mempengaruhi hasil pemisahan dan deteksi dari spektometer massa. Hal ini

dikarenakan adanya pengotor dapat menyumbat kolom dan bahan yang mudah

menguap dapat mengganggu saat deteksi. Oleh karena itu dilakukan optimasi

dengan menggunakan enam macam pelarut organik, antara lain dietil eter, etil

asetat, heksana, diklorometan, kloroform, dan butil metil eter, serta campuran dari

pelarut-pelarut organik tersebut dengan kombinasi dan rasio yang berbeda. Dari

hasil optimasi, etil asetat menghasilkan kromatogram yang paling baik sehingga

etil asetat digunakan sebagai pelarut untuk mengekstraksi sampel.

8

Gambar 4. Kromatogram hasil pemisahan pada blangko

Validasi

Penetapan kadar S-CPM dalam sampel plasma yang diambil dari

sukarelawan dilakukan pada kondisi kromatografi yang optimal. Parameter

validasi seperti akurasi, presisi (keterulangan dan reprodusibilitas), linearitas dan

rentang, sensitivitas (LOD dan LOQ), robustness, stabilitas, selektifitas/ spesifitas

dan uji kesesuaian sistem perlu dievaluasi terlebih dahulu. Hasil dari validasi

ditunjukkan pada tabel berikut :

Tabel 1. Studi presisi S-CPM dari hasil pengukuran (ng/ mL)

Larutan baku yang telah ditambahkan dengan standar internal, blanko tanpa

penambahan standar internal, blanko dengan penambahan standar internal, kurva

kalibrasi, uji kualitas kontrol sampel dianalisis dan direkam kromatogramnya.

Fase gerak yang digunakan untuk penelitian memberikan pemisahan yang baik

antara sampel, standar internal dan senyawa endogen. Dari kromatogram yang

dihasilkan tidak tampak adanya gangguan pada waktu retensi sampel dan standar

internal.

9

Gambar 5. Kromatogram hasil pemisahan matriks biologis (plasma)

Akurasi

Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis

dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi ini dinyatakan dengan persen (%)

perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Akurasi harus diukur

dengan menggunakan minimal lima determinasi per konsentrasi dan minimal tiga

konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang diharapkan adalah dianjurkan. Nilai

rata-rata harus berada dalam jarak 15% dari nilai yang sebenarnya kecuali pada

LLOQ, di mana seharusnya tidak menyimpang lebih dari 20%. Deviasi rata-rata

dari nilai yang sebenarnya berfungsi sebagai ukuran akurasi (Anonim, 2001).

Kisaran batas akurasi harus berada dalam rentang linier. Akurasi khas dari

pemulihan zat obat dalam campuran harus sekitar 98-102%. Nilai-nilai keakuratan

data di luar rentang pemulihan harus dipertimbangkan (Anonim, 2001).

Sedangkan menurut Mulja dan Hanwar, akurasi untuk kadar obat yang besar

adalah sebesar 95-105% dan untuk bioanalisis rentang 80-120% masih bisa

diterima (Mulja dan Hanwar, 2003).

Pada penelitian ini, akurasi dari metode ini ditentukan oleh recovery relatif

dan absolut (Tabel 1). Nilai persentase recovery absolut S-CPM berkisar antara

89,06% sampai 91,32 dan nilai recovery relatif berkisar antara 88.07 % sampai

91,33%. Apabila penelitian ini mengikuti parameter dari Chan, maka penelitian

ini dapat dikatakan belum memiliki akurasi yang baik sebab Chan dalam bukunya

10

menyebutkan bahwa akurasi zat obat dalam campuran harus berada dalam range

antara 98-102%. Namun berbeda apabila penelitian ini mengikuti parameter dari

Mulja dan Hanwar karena dalam bukunya, Mulja dan Hanwar mengatakan bahwa

akurasi untuk bioanalisis dalam rentang 80-120% masih dapat diterima dimana

akurasi yang dalam penelitian ini dinyatakan dalam persen recovery masih masuk

dalam range tersebut baik recovery absolut maupun untuk recovery relatifnya.

Presisi

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang-ulang pada sampel-sampel yang diambil dari

campuran yang homogen (Harmita, 2004). Presisi dinyatakan dalam koefisien

variasi (KV). Suatu metode dapat dikatakan baik apabila memiliki KV <2%

(Harmita, 2004).

Akurasi harus diukur dengan menggunakan minimal lima determinasi tiap

konsentrasi dan minimal tiga konsentrasi dalam kisaran konsentrasi yang

diharapkan. Nilai rata-rata harus berada dalam jarak 15% dari nilai yang

sebenarnya kecuali pada LLOQ, dimana seharusnya tidak menyimpang lebih dari

20%. Deviasi dari rata-rata dari nilai yang sebenarnya berfungsi sebagai ukuran

akurasi (Anonim, 2001). Pada penelitian ini, digunakan tiga macam konsentrasi

dalam sampel yaitu 25, 75, 125 ng/ mL. Hasil ini dapat dikatakan sudah memiliki

presisi yang cukup baik apabila mengikuti parameter yang disebutkan oleh

Harmita karena % CV yang terdapat pada penelitian ini rata-rata kurang dari 2%,

hanya satu sampel yang memiliki konsentrasi lebih dari 2% yaitu sampel pada

kondisi long-term stability dengan % CV = 2,07. Dapat disimpulkan bahwa

metode yang dikembangkan cukup akurat dan dapat dipercaya.

11

Tabel 2. Uji stabilitas S-CPM pada plasma

Spesifisitas

Spesifisitas atau selektivitas suatu metode adalah kemampuan yang hanya

mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen

lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat

dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode yang dilakukan terhadap

sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai,

senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis

sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan (Harmita, 2004).

Spesifisitas metode ini diuji sebanyak enam kali, dimana blanko plasma

yang telah ditambah dengan standar dan sampel dibandingkan dengan

kromatogram dari larutan baku. Dari hasil yang diperoleh, dapat disimpulkan

bahwa metode ini bersifat selektif. Hal ini dikarenakan kromatogram yang

dihasilkan tidak mengalami gangguan waktu retensi akibat adanya senyawa

endogen pada matriks biologis yang digunakan.

Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode (pada rentang tertentu)

untuk mendapatkan hasil uji yang berupa variasi data (misal: absorban, luas area

12

kromatogram) yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit di

dalam sampel (Anonim, 2007).

Menurut International Conference on Harmonisation (ICH), rentang

linearitas yang baik adalah + 20% dari konsentrasi nominal. Untuk memperoleh

rentang tersebut, paling tidak digunakan lima tingkat konsentrasi. Dalam

penelitian ini, linearitas menunjukkan bahwa metode yang digunakan linear dalam

rentang konsentrasi S-CPM yang spesifik. Kurva kalibrasi diplotkan antara respon

faktor dan konsentrasi larutan standar. Linearitas ditemukan pada rentang 1

sampai 150 ng/mL. Kurva kalibrasi dibuat selama 11 hari yang berbeda dari 4

minggu untuk menentukan variabilitas slope dan intersep.

Tabel 3. Hasil analisis statistik studi bioekuivalensi dari sampel dan standar

dexchlorpheniramine maleat.

Dari tabel 3, terlihat bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan dari slopes

dan intercepts yang melewati rentang konsentrasi optimum.

Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantititation (LOQ)

LOD adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat

diukur pada kondisi percobaan tertentu tetapi tidak perlu secara kuantitatif.

Penentuan LOD pada metode instrumental didasarkan pada signal to noise ratio

yaitu dengan cara membandingkan hasil pengukuran analit yang telah diketahui

konsentrasinya terhadap respon blanko. Konsentrasi analit yang mampu

memberikan respon 2-3 kali respon blanko inilah yang kemudian ditetapkan

sebagai LOD. Penentuan LOD dapat pula didasarkan pada standar deviasi yang

diperoleh dari pengukuran sejumlah blanko yang kemudian dikalikan dengan

faktor sebesar dua atau tiga (Anonim, 1995).

LOQ adalah konsentrasi terendah dari analit dalam sampel yang masih dapat

dikuantifikasi dengan presisi dan akurasi yang baik pada kondisi percobaan

tertentu dari suatu metode. LOQ merupakan parameter uji kuantitatif untuk

senyawa berkadar rendah dalam sampel yang mengandung bahan-bahan lainnya

13

seperti bahan pengotor dalam serbuk obat dan hasil degradasi dari suatu produk

obat jadi. Penentuan LOQ pada metode instrumental biasanya didasarkan pada

standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran sejumlah blanko yang kemudian

dikalikan dengan suatu faktor sebesar sepuluh (Anonim, 1995).

Lower Limit of Quantification (LLOQ) adalah jumlah terkecil dari analit

dalam sampel yang dapat dikuantifikasi dan memberikan akurasi dan presisi yang

baik. LLOQ menunjukkan sensitivitas dari metode tersebut dimana pada

konsentrasi standar terendah akan memberikan koefisien variasi < 20%. Standar

terendah pada kurva kalibrasi dapat diterima sebagai LLOQ jika kondisi berikut

terpenuhi:

1. Respon analit (LLOQ) harus minimal lima kali respon blanko.

2. Peak analit (respon) harus dapat diidentifikasi dan memiliki keterulangan yang

berbeda, dengan presisi kurang dari 20% koefisien variasi (CV) dan akurasi 80

sampai 120%.

Dalam penelitian ini ditemukan batas deteksi (LOD) sebesar 0,25 ng/ mL

dan batas kuantifikasi (LOQ) sebesar 1,00 ng/ mL untuk S-CPM. Hasil ini

menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan sensitif. LOD dan LOQ

dipengaruhi oleh kondisi pemisahan (kolom, reagen, dan instrumentasi dan data

sistem), perubahan instrumen (misalnya sistem pompa dan detektor) dan

penggunaan pelarut yang bukan grade KCKT dapat menghasilkan perubahan

dalam signal-to-noise ratio.

Kekasaran (Ruggedness) dan Ketahanan (Robustness)

Kekasaran merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh di bawah

kondisi percobaan yang beragam dan diekspresikan sebagai persen relative

standar deviation (% RSD). Kondisi-kondisi ini meliputi laboratorium, analis,

alat, reagen dan waktu percobaan yang berbeda. Kekasaran dapat diketahui jika

metode telah digunakan berulang kali. Strategi untuk menentukan kekasaran suatu

metode akan bervariasi tergantung pada kompleksitas metode dan waktu tersedia

untuk melakukan validasi. Penentuan kekerasan metode dapat dibatasi oleh

kondisi-kondisi percobaan yang kritis, seperti pengecekan pengaruh kolom

14

kromatografinya yang berbeda (pabrik dan jenisnya sama) atau pengaruh

operasional metode pada laboratorium yang berbeda (Gandjar, 2010).

Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh

adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan

melakukan variasi parameter-parameter metode seperti: persentase pelarut

organik, pH, kekuatan ionik, suhu dan sebagainya. Ketahanan suatu metode

dievaluasi dengan cara membuat variasi parameter-parameter penting dalam

metode tersebut secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan

(Gandjar, 2010).

Dalam penelitian ini tidak ada perubahan yang signifikan dalam parameter

kromatografi yang diamati (operator, instrumen, reagen dan kolom dari jenis yang

sama) dan kondisi optimum (pH, rasio fase gerak dan aliran) yang berubah.

Uji Stabilitas

Uji ini digunakan untuk memastikan bahwa sampel, reagen dan baku yang

digunakan stabil pada waktu tertentu supaya diperoleh hasil-hasil analisis yang

reprodusibel dan reliabel. Stabilitas sampel plasma yang telah di-spiking dengan

baku, diuji freeze-thaw cycles (sebanyak tiga kali siklus); stabilitas jangka pendek

dan panjang pada suhu kamar dalam tiga hari dan dalam empat minggu pada suhu

-70oC. Hasil dari percobaan dapat diperlihatkan pada tabel 2. Untuk larutan

standar, stabilitas dari larutan diuji pada suhu kamar dan keadaan membeku dalam

waktu enam minggu dan empat minggu. Hasil rerata konsentrasi yang diperoleh

dari hasil pengukuran dibandingkan dengan teoritisnya. Dari hasil tersebut, dapat

disimpulkan bahwa sampel dapat disimpan dalam keadaan beku untuk satu bulan

tanpa mengalami degradasi. Sampel stabil pada jangka pendek dan larutan sampel

dapat disimpan pada suhu kamar tanpa mengalami degradasi.

Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem bertujuan untuk menjamin bahwa suatu metode dapat

menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima (Gandjar, 2010). Uji

kesesuaian sistem dapat dilihat dari efisiensi kolom (jumlah plat teoritis), nilai

15

resolusi dan simetrisitas dari puncak yang dihasilkan. Dari hasil percobaan,

diperoleh jumlah plat teoritis sebesar 18432 hingga 22987 dan nilai resolusinya

sebesar 2,46. Nilai plat teoritis yang besar tersebut menunjukkan bahwa

pemisahan memiliki efisiensi yang baik karena nilai resolusi yang diperoleh lebih

dari 1,5. Hal ini menunjukkan pemisahan yang dihasilkan telah mencapai base

line. Hasil ini digunakan untuk mengevaluasi kesesuaian dari sistem yang

digunakan untuk menetapkan kadar S-CPM.

Dari hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan ini

telah mempunyai akurasi, presisi, selektivitas dan linearitas yang baik untuk

penetapan kadar S-CPM dalam plasma dan dapat digunakan untuk mengetahui

bioavailabilitas dan bioekivalensi dari obat tersebut.

Aplikasi dalam pengembangan metode

Metode penetapan kadar dari CPM dalam plasma ini digunakan untuk studi

bioekivalensi pada obat. Obat yang tak berlabel, untuk dua kali pemakaian, untuk

pemakaian dua periode, dosis tunggal yang dibandingkan antara sampel yang

mengandung 6 mg CPM dan standar. Pengujian bioekivalensi dari obat dilakukan

pada laki-laki yang sehat, dewasa dan memenuhi standar GCP (Good Clinical

Practice) dan aturan FDA. Studi ini dilakukan pada 24 orang pria yang sehat dan

umurnya di antara 18-45 tahun. Sampel darah dari sukarelawan diambil sebanyak

6 mL sebelum pemberian dosis, pada saat 0,5; 1,0; 1,5; 2; 3; 4; 6; 8; 12; 18; 24

jam setelah pemberian obat. Sampel yang diperoleh disimpan dalam wadah yang

mengandung natrium sitrat sebagai antikoagulan dan disentrifugasi selama 3000

rpm selama 15 menit dan pada suhu 15oC. Plasma yang ada kemudian disimpan

pada tube yang telah dilabeli. Kemudian sampel disimpan dalam freezer pada

suhu -70±5oC hingga dianalisis dengan metode KC-SM yang telah divalidasi.

Parameter farmakokinetika yang dianalisis antara lain konsentrasi maksimal

obat dalam plasma (Cmax), waktu saat obat pada konsentrasi maksimal (Tmax),

AUC dari konsentrasi obat dalam plasma sebelum diberikan obat hingga waktu

pengukuran terakhir (AUC0-t), AUC konsentrasi obat dalam plasma sebelum

diberikan obat hingga obat habis terabsorbsi (AUC0-∞), kecepatan eliminasi dan

16

waktu paruh eliminasi obat. Berdasarkan hasil uji statistik dengan taraf

kepercayaan 90%, disimpulkan Cmax, AUC0-t dan AUC0-∞ yang kemudian

dibandingkan dengan standar, bioekivalensi dari obat mempunyai rentang dari

80,0-125,0% untuk Cmax, AUC0-t dan AUC0-∞. Rerata (±SD) konsentrasi dari

konsentrasi obat maksimal dalam plasma dari standar sebesar 22.1150 (4.4148)

ng/ mL dan untuk obat yang diuji sebesar 25,3421 (2,0605) ng/ mL.

Tabel 4. Profil farmakokinetika dari hasil pengujian.

Daftar Pustaka

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta

Anonim, 2001, Analytical Method Validation and Instrument Performance

Verification, John Wiley and Sons, Inc., New Jersey, pp. 118-120.

Anonim, 2007, The United States Pharmacopeia, Edisi 30, United States

Pharmacopeia Convention, Inc., USA

Gandjar, I.G., 2010, Kimia Farmasi Analisis, Penerbit Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, pp. 466-472.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungannya,

http://jurnal.farmasi.ui.ac.id/pdf/2004/v01n03/harmita010301.pdf, diakses

tanggal 1 November 2011

Mulja, M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium yang

Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Indonesia Airlangga,

Vol. III, No. 2, Universitas Airlangga Press, Surabaya, pp. 71-76.

Archi

ve o

f SID

Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences Summer 2007: 3(3): 161-170www.ijps.ir

R

Original Article

Development and Application of a Validated LiquidChromatography-Mass Spectrometry Method for the

Determination of Dexchlorpheniramine Maleate in Human Plasma

Aravindaraj Joghee Rajua,*, Gopinath Rama, Rajan Sekara, Mahesh Kumar Siddaiahb, Nanjan Moola Jogheeb, Suresh Bhojrajc

aCADRAT, JSS College of Pharmacy,bTIFAC CORE, JSS College of Pharmacy, cPrincipal, JSS College ofPharmacy, Rock lands, Ootacamund, India

Abstract A convenient liquid chromatographic-single Quadrupole mass spectrometric

(LC-MS) method was developed and validated for dexchlorpheniramine maleate (INNname: chlorphenamine) determination in human plasma. The need for just a singleliquid-liquid extraction with ethyl acetate and being highly sensitive were theadvantages of this method. The linearity was also excellent over the range of 1 to150 ng.ml-1 of dexchlorpheniramine maleate concentration. The method wasstatistically validated for its selectivity, linearity, precision and robustness. This methodwas successfully applied to the analysis of chlorpheniramine maleate in clinicalstudies.

Keywords: Bioequivalence; Dexchlorpheniramine maleate; LC-MS.Received: February 5, 2007; Accepted: April 11, 2007.

1. Introduction Chlorpheniramine maleate (RS-CPM) (3-

(4-chlorophenyl)-N,N-dimethyl-3-(2-pyridyl)propylamine monomaleate) (Figure 1) is ahighly potent and widely used antihistaminicdrug. It has been widely used for symptomaticrelief of common colds and allergic diseases.Its activity is predominantly attributed to thedextrorotary S-enantiomer [1]. The EuropeanPharmacopoeia III describes an HPLC methodfor the determination of the enantiomericpurity of dexchlorpheniramine maleate (S-

CPM), allowing the presence of 2% (m/m) ofR-enantiomer in the tested sample. Pharmaco-kinetic studies have revealed that plasmachlorpheniramine concentrations in humansare low, for example, the maximum levels of6.2 and 7.0-8.2 ng/ml after a single oraladministration of 2 and 4 mg [2]; and 5.8-11.3and 3.9 ng/ml after a 4 and 2.67 mgadministration, respectively. Some devisedmethods have been reported to determinehuman plasma RS-chlorpheniramine byusing gas chromatography (GC), gaschromatography-mass spectrometry (GC-MS)and high-performance liquid chromatography(HPLC) [3-9].

This paper describes development and

*Corresponding author: Aravindaraj joghee Raju, Senior ResearchAssociate, CADRAT, JSS College of Pharmacy, Rocklands,Ootacamund - 643 001, India. Tel (+91)423-2447135; Fax (+91)423-2447135Email: dr_aravindraju@yahoo.co.in

www.SID.ir

Archi

ve o

f SID

AJ Raju et al./ IJPS Summer 2007; 3(3): 161-170

162

validation of a simple, specific, rapid andsensitive liquid chromatography-massspectrometry (LC-MS) method for thedetermination of S-CPM in human plasmawith a limit of quantification (LOQ) of 1.0ng/ml for S-CPM during a 5.0 min. run time,using simvastatin (STA) (Figure 1) as aninternal standard. In addition, this methodwas applied to S-CPM quantification of asingle dose administration of tabletscontaining 6 mg of S-CPM in a crossoverbioequivalency study of S-CPM in healthymale human subjects.

2. Materials and methods2.1. Chemicals and reagents

The reference standards of S-CPM (purity:99.67%) and STA (purity: 98.44%) wereobtained from M/s, Orchid pharmaceuticals(Chennai, India) and Cadila Pharma(Ahmedabad, India). Highly purified waterwas prepared in-house using a Milli-Q waterpurification system obtained from Millipore(India) Pvt. Ltd. (Bangalore, India). Gradientgrade methanol and acetonitrile were

purchased from E. Merck Ltd. (Mumbai,India). Ammonium acetate and formic acidwere purchased from Qualigens FineChemicals (Mumbai). Drug free (blank)heparinized human plasma was obtained fromthe local Nursing hospital (Ootacamund,India) and was stored at (-) 20 °C prior to use.

2.2. Calibration curvesThe stock solutions of S-CPM and internal

standard were prepared in acetonitrile at freebase concentration of 1000 μg.ml-1.Secondary and working standard solutionswere prepared from stock solutions by dilutionby water:acetonitrile (50:50, v/v). Thesediluted working standard solutions were usedto prepare the calibration curve and qualitycontrol samples. Blank human plasma wasscreened prior to spiking to ensure it was freefrom endogenous interference at retentiontimes of S-CPM and internal standard of S-CPM (Figure 2). An eight point standardcurve of S-CPM was prepared by spiking theblank plasma with appropriate amount of S-CPM. The calibration curve ranged from 1.0to 150.0 ng.ml-1. Quality control samples,prepared at three concentration levels of 5.0,25.0, 75.0 and 125.0 ng.ml-1 for S-CPM weremade with blank plasma. The samples werevortexed and stored at (-) 70±2 °C for furtherprocessing.

2.3. Sample preparationA 0.5 ml aliquot of human plasma sample

was mixed with 0.1 ml of the internal standardworking solution (2500.0 ng.ml-1 of STA)and 1.0 ml of borate buffer of pH 9.00 wereadded and mixed. The resulting solution wasvortexed and extracted by ethyl acetate (3×2ml). The upper organic layer was separated,evaporated and the drug was reconstitutedusing 0.5 ml of the mobile phase andanalyzed.

Figure 1. Structure of dexchlorpheniramine and simvastatin.

www.SID.ir

Archi

ve o

f SID

Determination of dexchlorpheniramine

2.4. InstrumentationChromatographic separation was carried

out on a Shimadzu HPLC (ShimadzuCorporation, Japan) with phenomenex (Luna)- ODS (100x4.6 mm i.d., 5 μm). The mobilephase consisting of a mixture of methanol(10 mM) and ammonium acetate (90:10 v/v)was delivered with a flow rate of 0.5 ml/min.under ambient temperature. The total runningtime for each sample analysis was 6.0 min.Mass spectra were obtained using a SingleQuadrupole mass spectrometer (Shimadzu,Japan) equipped with Atmospheric PressureChemical Ionization (APCI) source andElectrospray ionization (ESI). The massspectrometer was operating in the selectedion-monitoring (SIM) mode. Sampleintroduction and ionization was done in thepositive ion mode. The spray voltage andcapillary temperature were 1.3 KV and 400°C, respectively. The mass transition ion-pairwas selected as m/z 274.9 for S-CPM (Figure3) and m/z 302.9 for STA. The data acquisitionwas ascertained by LC-MS solution datastation. For quantification, the peak area ratiosof the target ions of the drugs to those of theinternal standard were compared withweighted (1/c) least squares calibration curvesin which the peak area ratios of the calibrationstandards were plotted versus theirconcentrations.

2.5.ValidationThe method was validated according to

FDA guidelines [10, 11] and was validated forselectivity, sensitivity, linearity, precision,accuracy, and stability. The selectivity of themethod was evaluated by comparing the

chromatograms obtained from the samplescontaining S-CPM and the internal standardSTA with those obtained from blank samples.Sensitivity was determined in terms of LLOQ“lower limit of quantification” where theresponse of LLOQ should be at least fivetimes greater than the response of interferencein blank matrix at the retention time or masstransitions of the analyte. The linearity ofdifferent concentrations of standard solutionswas prepared to contain 1 to 150 ng.ml-1 of S-CPM containing 2500.0 ng.ml-1 of STA.These solutions were analysed and the peakareas and response factors were calculated.The calibration curve was plotted usingresponse factor against concentration of thestandard solutions. The standard curve fittingwas determined by applying the simplestmodel that adequately describes theconcentration-response relationship usingappropriate weighing and statistical tests forgoodness of fitting. The precision of themethod was determined by intraday precisionand interday precision. The intraday precisionwas evaluated by analysis of blank plasmasample containing S-CPM at three differentconcentrations namely low, medium and highquality control concentrations using ninereplicate determinations for three occasions.The interday precision was similarly evaluatedover a two-week period.

The accuracy of the developed methodwas determined by relative and absoluterecovery experiments. The relative recoveryof the drug was calculated by comparing theconcentration obtained from the drugsupplemented plasma to the actually addedconcentration. Recovery studies were carried

163

Table 1. Precision studies of dexchlorpheniramine maleate samples (ng.ml-1).Intra-assay Inter -assay

Quality control Nominal Mean concentration Mean concentration sample concentration (ng.mL-1) SD % CV N (ng.mL-1) SD % CV N

LLOQ 5.00 4.519 0.330 7.28 5 4.573 0.385 8.42 5LQC 25.00 24.472 0.383 1.57 5 24.661 0.402 1.63 5MQC 75.00 73.686 1.370 1.86 5 73.902 1.530 2.07 5HQC 125.00 123.221 1.433 1.16 5 123.225 1.434 1.16 5S.D: Standard deviation; CV: Coefficient of variance; N: Total number of observations for each concentration; LLOQ: Lower limit ofquantification; LQC: Lower quality control; MQC: Middle quality control; HQC: High quality control.

www.SID.ir

Archi

ve o

f SID

AJ Raju et al./ IJPS Summer 2007; 3(3): 161-170

164

out six times for three levels and thepercentage recovery, mean, standard deviationand coefficients of variation were calculated.

As a part of the method validation, stabilityand partial volume analysis were evaluated.The room temperature stock solution stability,refrigerated stock solution stability, freezethaw stability, short term stability and longterm stability were determined. The roomtemperature stock solution stability wascarried out at 0, 3 and 8 h by injecting fourreplicates of prepared stock dilutions of S-CPM equivalent to middle quality controlsample concentration and the stock dilutionof the internal standard equivalent to theworking concentration. Comparison of themean area response of S-CPM and internalstandard at 3 and 8 h was carried out againstthe 0 h value. Refrigerated stock solutionstability was determined at 7, 14 and 27 daysby injecting four replicates of prepared stockdilutions of the analyte equivalent to themiddle quality control sample concentrationand the stock dilution of internal standardequivalent to the working concentration. Thestability studies of plasma samples spikedwith S-CPM were subjected to three freeze-thaw cycles, short term stability at the roomtemperature for 3 h and long term stability at

(-)70 °C over 4 weeks. In addition, stabilityof standard solutions was performed at roomtemperature for 6 h and freeze condition forfour weeks. The stability of triplicate spikedhuman plasma samples following three freezethaw cycles was analysed. The meanconcentrations of the stability samples werecompared to the theoretical concentrations.The stability of triplicate short term samplesspiked with S-CPM was kept at the roomtemperature for 1.00 to 3.00 h beforeextraction. The plasma samples of the longterm stability were stored in the freezer at(-) 70 °C until the time of analysis.

3. Results and discussion3.1. Method development

The goal of this work was to develop andvalidate a simple, rapid and sensitive assaymethod for the quantification of S-CPM,suitable to determine the pharmacokinetics ofthis compound in clinical studies. To achievethis goal, during method developmentdifferent options were evaluated to optimizesample extraction, detection parameters andchromatography. The standard solutions of S-CPM were analysed by LC-MS system usingdirect injection probed with ESI and APCIinterfaces. From the mass spectrum recorded,

Table 2. Stability of dexchlorpheniramine maleate in human plasma samples.Sample concentration Concentration found % CV(ng.ml-1) (n = 6) (mean±S.D.) (ng.ml-1)Short-term stability (1, 2, 3 h)

25 24.3937±0.46660 1.9175 73.3997±0.60909 0.83

125 124.4027±1.95214 1.58Long-term stability (4 weeks)

25 24.7066±0.51219 2.0775 73.7361±1.18283 1.60

125 124.7353±0.63385 0.51Stock solution stability (7, 14, 21 Days)

25 25.0503±0.10986 0.4475 74.9663±0.11445 0.15

125 124.0693±0.92361 0.74Freeze thaw stability (3 Cycle)

25 24.7416±0.3771 1.5275 73.1361±1.06265 1.49

125 124.7513±0.58869 0.47

www.SID.ir

Archi

ve o

f SID

Determination of dexchlorpheniramine

the detection molecular ion selected was 274.9for S-CPM (Figure 4).

3.2. Optimization of the chromatographicconditions

The chromatographic conditions,especially the composition of mobile phase,were optimized through several trials toachieve good resolution and symmetricalpeak shapes for the analyte and the IS, aswell as a short run time. Modifiers, such asammonium acetate and acetic acid alone or incombination with different concentrationswere added. It was found that a mixture ofacetonitrile-water (containing 10 mmammonium acetate and 0.5% acetic acid)(90:10, v/v) could achieve this purpose andwas finally adopted as the mobile phase. Thepercentage of acetic acid was optimized tomaintain this peak shape while beingconsistent with good ionization andfragmentation in the mass spectrometer. Aftercareful comparison of several columns, aPhenomenex (Luna)-ODS column (100×4.6mm, i.d., 5μm) was finally used with a flowrate of 0.5 ml/min. to produce good peakshapes and permit a run time of 2.0 min. Inorder to produce a spectroscopically cleansample and avoid the introduction of non-volatile materials onto the column and MSsystem, LLE was used for the samplepreparation in this work. Clean samples areessential for minimizing ion suppression andmatrix effect in LC-MS analyses.

Different reversed phase stationary phases(C4, C8, and C18) were used and the

chromatograms were recorded. Based on theretention and peak shape, Phenomenex LunaODS column was selected for S-CPM.

Liquid-liquid extraction (LLE) was usedfor the sample preparation in this work. LLEcan be helpful in producing a spectroscopical-ly clean sample and avoiding the introductionof non-volatile materials onto the columnand MS system. Clean samples are essentialfor minimizing ion suppression and matrixeffect in LC-MS analyses. Six organicsolvents, diethyl ether, ethyl acetate, hexane,dichloromethane, chloroform and butyl tert-methyl ether, and their mixtures in differentcombinations and ratios were evaluated.Finally, an ethyl acetate was found to beoptimal, which can produce a cleanchromatogram for a blank plasma sampleand yield the highest recovery for the analytefrom the plasma.

3.3. ValidationEstimation of the S-CPM in plasma

samples from the volunteers was carried outusing optimized chromatographic conditions.The validation parameters such as accuracy,precision (repeatability and reproducibility),linearity and range, sensitivity (limit ofdetection and limit of quantitation),robustness/ruggedness, stability, selectivity/specificity and system suitability studies wereevaluated. The validation results are given

165

Figure 2. LC-MS chromatogram of blank plasma sample. Figure 3. LC-MS chromatogram of dexchlorpheniraminemaleate and internal standard sample.

www.SID.ir

Archi

ve o

f SID

AJ Raju et al./ IJPS Summer 2007; 3(3): 161-170

166

in Table 1.The reference standard solution with

internal standard, matrix blank without theinternal standard, zero sample [Matrix blankwith internal standard], spiked calibrationstandards, quality control samples wereanalysed and chromatograms were recorded.The mobile phase used for the assay provideda well defined separation between the drug,the internal standard and endogenouscomponents. The blank plasma samplesshowed no interference at retention time of thedrugs and their internal standards (Figure 2).

3.4. AccuracyThe accuracy of the optimised methods

was determined by relative and absoluterecovery experiments (Table 1). Thepercentage recovery values for S-CPMranged from 89.06 to 91.32% and theirrelative recovery values ranged from 88.07 to91.33 %. The coefficient of variation (%) of

these values was less than 10.00%. It isconcluded that the developed methods areaccurate and reliable.

3.5. PrecisionThe optimized method for the estimation

of S-CPM was found to be precise (Table 2).This was evident from the coefficieny ofvariation values, which were less than 10.00%in all concentrations.

3.6. SpecificitySpecificity of the method was analysed

by six blank plasma samples and the recordedchromatograms. These chromatograms werecompared with the chromatograms obtainedfrom standard solutions. Each chromatogramwas tested for interference. The combinationof the sample preparation procedure andchromatography provided an assay which isfree from significant interfering endogenousplasma components at the retention times ofthe S-CPM and the internal standard. Theseobservations show that the developed assaymethod is specific and selective.

3.7. LinearityIt was observed that the optimised methods

were linear within a specific range of S-CPMconcentration. The calibration curves wereplotted between response factor andconcentration of the standard solutions. Thelinearity range were found to be 1 to 150ng.ml-1. The calibration curves were

Table 3. Mean pharmacokinetic properties of dexchlorpheniramine maleate obtained from studied subjects (N=24) afteradministration of a single 6-mg dose of reference and test dexchlorpheniramine maleate formulations.Pharmacokinetic parameters* Test Reference

(N=24) (N=24)Cmax, ng.ml-1 25.3421 (2.0605) 22.1150 (4.4148)

tmax, h 3.2708 (1.1514) 6.7500 (0.9891)

AUC0-t (ng.h.ml-1) 234.1008 (22.8974) 241.5723 (33.8520)

keli 0.1000 (0.0135) 0.1177 (0.0225)

AUC0-Q (ng.h.ml-1) 262.8429 (23.6587) 270.3695 (35.5413)

t1/2 (h) 7.0192 (0.9464) 6.0855 (1.0840)Tmax: Time of maximum concentration; Cmax: Maximum concentration; AUC: Area under the concentration time curve; T1/2: Half-life; keli:Elimination rate constant; AUC0-t: Area under the plasma concentration-time curve, last available measurement; AUC0-α: Area under the plasmaconcentration-time curve from time 0 to infinity. *Values in the parenthesis indicate standard deviation.

Figure 4. Mass spectrum of dexchlorpheniramine maleate inpositive mode Scan.

www.SID.ir

Archi

ve o

f SID

Determination of dexchlorpheniramine

constructed on 11 different days over a periodof four weeks to determine the variability ofthe slopes and intercepts. The results indicatedno significant interday variability of slopesand intercepts over the optimisedconcentration range.

3.8. Limit of detectionThe limit of detection (LOD) values was

found to be 0.25 ng.ml-1 for S-CPM and theirlimit of quantification (LOQ) values were1.00 ng.ml-1. These observations indicate thatthe developed methods have adequatesensitivity. These values, however, may beaffected by the separation conditions (eg.column, reagents, and instrumentation anddata systems), instrumental changes (eg.pumping systems and detectors) and use ofnon HPLC grade solvents may results inchanges in signal-to-noise ratios.

3.9. Ruggedness and robustnessThe ruggedness and robustness of the

methods were studied by changing theexperimental conditions. No significantchanges in the chromatographic parameterswere observed when the experimental(operators, instruments, source of reagentsand column of similar type) and optimisedconditions (pH, mobile phase ratio and flowrate) were changed.

3.10. Stability studiesThe stability of plasma samples which had

been spiked with selected drugs were studiedby subjecting the samples to three freeze-thaw cycles; short and long term stabilities atroom temperature were measured within 3 hand within 4 weeks at (-)70 °C, respectively(Table 2). In addition, stability of standardsolutions was measured at the room

temperature and freeze condition within 6 hand within 4 weeks, respectively. The meanconcentrations of samples were compared tothe theoretical concentrations. The resultsindicated that selected drugs in plasmasamples can be stored in freezing condition for1 month without degradation. The results ofstability studies of short term storage ofplasma and also sample solution at roomtemperature and freeze thaw cycles show thatno S-CPM degradation happened andtherefore, plasma samples could be handledwithout special precautions.

3.11. System suitability studiesSystem suitability parameters such as

column efficiency (theoretical plates),resolution factor and peak asymmetry factorof the optimised methods were found to besatisfactory. Theoretical plates of the columnsranged from 18432 to 22987 and theirresolution factor was 2.46. Similarly, the peakasymmetry factors ranged from 1.01 to 1.09.All these observations supported the systemsuitability for the evaluation of selected drugs.

In conclusion, this is an accurate, precise,selective and linear method for S-CPMestimation in plasma and hence can be usedfor bioavailability and bioequivalency studies.

3.12. Application of the developed methodThe proposed method was applied to the

determination of S-CPM in plasma samplesfrom an on going project bioequivalencestudies of sustained release formulation. Openlabel, balanced, randomized, two-treatment,two sequence, two-period, single dose,crossover bioequivalence study of marketedrepetabs containing 6 mg of S-CPM (referencesample) against SR tablets containing 6 mg ofS-CPM (test sample) manufactured by Sipali

167

Table 4. Results of statistical analysis of the bioequivalency study of test and reference dexchlorpheniramine maleateformulations.

AUC0-t (ng.h/ml-1) AUC0- α (ng.h/ml-1) Cmax, (ng ml-1)Ratio (%) 105.8 104.7 111.00Geometric CI (%) 92.36-107.06 95.51-107.06 93.69-107.74

www.SID.ir

Archi

ve o

f SID

AJ Raju et al./ IJPS Summer 2007; 3(3): 161-170

168

Chemicals, India in healthy, adult, male,human subjects under fasting conditions wasconducted in accordance with the currentgood clinical practice (GCP) and FDAguidelines. The study was performed onhealthy, willing, 24 male volunteers 18-45years of age, after they had been informed ofthe purpose, protocol and risk involved inthe study. All subjects gave written informedconsent and the protocol was approved bylocal ethics committee. The venous bloodsamples 6 ml including (1 ml discardedheparinised blood) were withdrawn via anindwelling cannula at pre-dose and at 0.5, 1.0,1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12.0, 18.0 and 24h following drug administration in each periodof the study. The samples were collected inpre-labeled vacutainers containing sodiumcitrate as the anti coagulant and centrifugedat 3000 rpm for 15 min. at 15 °C and plasmawas collected in pre-labeled sample collectiontube. A wash out period of 7 days wasobserved between the two phases of the study.The samples were stored in the deep freezerat (-)70±5 °C until analyzed by a validatedLC-MS method.

The pharmacokinetic parameters namelymaximum plasma concentration (Cmax), timepoint of maximum plasma concentration(Tmax), area under the plasma concentration-time curve from 0 h to the last measurableconcentration (AUC0-t), area under the plasmaconcentration time curve from 0 h to infinity(AUC0-Q), elimination rate constant (λZ) andhalf-life of drug elimination during theterminal phase (t1/2) were calculated usingPK solution software statistical analysis ofpharmacokinetic parameters was carried outusing SPSS 12.0.1 for un-transformed andln-transformed pharmacokinetic parametersCmax, AUC0-t and AUC0-Q (Tables 3 and 4).Based on the statistical results of 90.0%confidenct intervals for the ratios of the meansof ln-transformed pharmacokinetic parametersCmax, AUC0-t and AUC0-Q conclusion was

drawn as to whether the test product wasbioequivalent to the reference product.Bioequivalence was to be concluded if the90.0% confidence interval fell within thebioequivalency range 80.0-125.0 % forCmax, AUC0 - t and AUC0- Q.

The mean (±S.D.) plasma maximumconcentration obtained for S-CPM inreference and test formulation is 22.1150(4.4148) ng.ml-1 and 25.3421 (2.0605)ng.ml-1 (Table 3), respectively.

4. ConclusionsA simple, specific, rapid and sensitive

analytical method for the determination ofS-CPM in human plasma has been developed.The developed LC-MS method wassuccessfully applied for the bioequivalencystudies. The method provided excellentspecificity and linearity with a ofquantification limit of 1.00 ng.ml-1 for S-CPM.

References[1] Marin A, Barbas C. LC-MS for the degradation

profiling of cough-cold products under forcedconditions. J Pharm Biomed Anal 2004, 35: 1035-45.

[2] Suntornsuk L, Pipitharome O, Prapin Wilairat P.Simultaneous determination of paracetamol andchlorpheniramine maleate by micellarelectrokinetic chromatography. J Pharm BiomedAnaly 2003; 33: 441-9.

[3] Takagaki T, Matsuda M, Mizuki Y, Terauchi Y. Asimple and sensitive method for the determinationof chlorpheniramine maleate in human plasmausing liquid chromatography-mass spectrometry.J Chromatogr B 2002; 776: 169-76.

[4] van Eeckhaut A, Detaevernier MR, Michotte Y.Development of a validated capillary elec-trophoresis method for enantiomeric purity testingof dexchlorpheniramine maleate. J ChromatogrA 2002; 958: 291-7.

[5] Indrayanto G, Sunartob A, Adriani Y.Simultaneous assay of phenylpropanolaminehydrochloride, caffeine, paracetamol, glycerylgua-iacolate and chlorpheniramine maleate in SilabatTM tablet using HPLC with diode array detection.J Pharm Biomed Anal 1995; 13: 1555-9.

www.SID.ir

Archi

ve o

f SID

Determination of dexchlorpheniramine

169

[6] Yamato S, Nakajima M, Shimada K.Simultaneous determination of chlorpheniramineand maleate by high-performance liquidchromatography using tetra-nbutylammoniumphosphate as an ion-pair reagent. J ChromatogrA 1996 731: 346-50.

[7] Hood DJ, Cheung HY. A chromatographic methodfor rapid and simultaneous analysis of codeinephosphate, ephedrine HCl and chlorpheniraminemaleate in cough-cold syrup formulation. J PharmBiomed Anal 2003; 30: 1595-601.

[8] Celma C, Allue JA, Prunonosa J, Peraire C, ObachR. Simultaneous determination of paracetamol andchlorpheniramine in human plasma by liquidchromatography-tandem mass spectrometry. JChromatogr A 2000 870: 77-86.

[9] Andronis V, Mesiha MS, Plakogiannis FM.Design and evaluation of transdermal chlorpheni-

ramine maleate drug delivery system. PharmActa Helvet 1995; 70: 301-6.

[10] FDA guidance for industry, bioavailability studiesfor orally administered drug: Products-generalconsiderations. US Department of Health andHuman Services, Food and Drug Administration,Centre for Drug Evaluation and Research(CDER), 2000, website: http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.

[11] FDA guidance for industry, statistical approachesto establishing bioequivalence. US Department ofHealth and Human Services, Food and DrugAdministration, Centre for Drug Evaluation andResearch (CDER), 2001, Website: http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.

www.SID.ir