Review Bioanalisis

Slide 1

Indri Kusharyanti, M.Sc., AptREVIEW BIOANALISISSebuah metode bioanalitis terdiri dari dua komponen utama:Persiapan sampel ekstraksi obat dari cairan biologis biasanya termasuk langkah konsentrasi untuk meningkatkan sensitivitas metodeDeteksi senyawa biasanya setelah pemisahan kromatografi dari komponen lain yang hadir dalam ekstrak biologis. Detektor pilihan adalah spektrometer massa.BIOANALISISSecara umum proses analisis minimal mempunyai 5 langkah :1. sampling (pengambilan sampel), 2. preservasi sampel (penyimpanan sampel),3. preparasi sampel (penyiapan sampel),4. analisis (pengukuran), 5. interpretasi data (analisis data), dan6. pembuatan laporan analisis.

SAMPEL BIOLOGISDARAHWhole BloodPlasmaSerumURINESALIVASPUTUMSPERMACAIRAN SEREBROSPINAL

FESESJARINGANLIVERPANKREASBRAINRAMBUTPLACENTA

METHOD VALIDATIONAny method is valid as long as it is validatedProcedures that demonstrate that a method is reliable and reproducible for the intended use.Types:Full validation: first time, new drug, or addition of metabolitesPartial validation: modifications of a validated methodCross-validation: comparison between methodsPRE-STUDY VALIDATIONFundamental parameters for validationMethod used for the determination of drugs and/or metabolites should be:SelectiveSensitiveAccuratePreciseStableAnalysis of drugs and their metabolites in a biological matrix is carried out using samples spiked with calibration (reference) standards and using quality control (QC) samples

The purity of the reference standard used to prepare spiked samples can affect study data

For this reason, an authenticated analytical reference standard of known identity and purity should be used to prepare solutions of known concentrationsReference standardThe source and lot number, expiration date, certificates of analyses when available, and/or internally or externally generated evidence of identity and purity should be furnished for each reference standard

If possible, the reference standard should be identical to the analyte

When this is not possible, an established chemical form (free base or acid, salt or ester) of known purity can be usedReference standardThree types of reference standards are usually used:(1) certified reference standards (e.g., USP compendial standards);(2) commercially supplied reference standards obtained from a reputable commercial source;(3) other materials of documented purity custom-synthesized by an analytical laboratory or other noncommercial establishmentReference standardproses yang harus dilakukan untuk menyiapkan sampel sehingga siap untuk dianalisis menggunakan instrumentasi yang sesuai. Preparasi Sampel

Sample preparation for DNA ExtractionPotential interfering substances in a biological matrix include endogenous matrix components, metabolites, decomposition products, and in the actual study, concomitant medication and other exogenous xenobiotics

AnFar.S2-0814

Metode yang paling umum digunakan :- Pengendapan protein sebagai garam yang tidak larut

Deproteinisasi Protein

pH rendah ( asam kuat ) pH tinggi ( basa kuat ) muatan positif muatan negatif

AnFar.S2-0816Pengaturan pHSampel (protein)Sampel (protein)pH larutan titik isoelektriktitik isoelektrikprotein sbg kationprotein sbg anionbereaksi dng anion ttt. membentuk garam tak larutbereaksi dng kation ttt. membentuk garam tak larutPrecipitating AgentsAnionikKationikpikratIon-ion logam berat spt. :molibdattungstatsulfosalisilatmetafosfatperklorattrikloroasetat-------seng merkuri Kadmiumuraniumbesitembagatimbal(Zn)(Hg)(Cd)(U)(Fe)(Cu)(Pb)--ZnSO4ZnSO4/Ba(OH)2Bila sejumlah tertentu air

dihilangkan dari protein

Protein akan mengendapAnFar.S2-08Deproteinisasi dgn dehidrasiSENTRIFUGASIDeproteinisasi dgn cara dehidrasi Solvent ( suhu rendah )AsetonitrilAsetonMetanolEtanol

Salting out ( protein pada titik isoelektrik )+Garam( Na sulfat, Na sulfit )

Protein mengendapAnFar.S2-0820

Untuk menghasilkan supernatan yang jernih dan berisi komponen yang diinginkan.Pemisahan dilakukan berdasar sifat partikel dalam medan gaya senrifugal.Tingkat pemisahan biasanya: Sel utuh dan pengotorInti sel, kloroplas, mitokondria, lisosomMikrosom, ribosomSENTRIFUGASIAnFar.S2-0822

Concentrate analyte(s) to improve limits of detection and/or quantitationExchange analyte from a non-compatible environment into one that is compatible with chromatography and mass spectrometric and/or other instrumental analytical techniquesRemove unwanted matrix components that may interfere with the analysis of the desired compoundPerform selective separation of individual components from complex mixtures, if desiredDetect toxins in human system or in environment (air, drinking water, soil)Identify stereochemical effects in drug activity and/or potencyFollow drug binding to proteinsDetermine stability and/or absorption of drugs and follow their metabolism in human body

tujuannya

Liquid-Liquid Extraction (LLE)Partitioning of analytes between water phase and organic phase

Kurang cocok untuk : - sampel komplek (sampel biologis)- presisinya rendah

Cocok untuk :- water insoluble compound dalam water-soluble matrix

25SPE retains analyte from a flowing liquid sample on solid sorbent, analyte is recovered via elution from the sorbentPhase types:Reverse phaseNormal phaseIon exchangeAdsorption

Solid Phase Extraction (SPE)

26

AnFar.S2-0827The Four Basic Steps of A Solid-Phase ExtractionNonpolar:Reverse phase C18 (octadecyl bonded silica) and C8 (octyl bonded silica) are most commonly used for hydrophobic analytesPolar:Normal phase SPE uses cyanopropyl bonded, diol bonded, or amino propyl bonded silica (used for polar analytes such as cationic compounds and organic acids)Electrostatic:Ionic Exchange SPE is based on electrostatics uses quaternary amine, sulfonic acid, or carboxylic acid bonded silicaAdsorption type SPE uses unmodified materials such as alumina, Florosil, resins


28SPE uses a cartridge or discMay be performed a one time use syringe or a multiple cartridge unit


29SPE uses a cartridge or discMay be performed a one time use syringe or a multiple cartridge unit


30

AnFar.S2-0831Various SPE Phases and ConditionsMekn.pmshTipe faseStrukturEluting solv.Tipe analitLoading solv.AnFar.S2-0832

A 5 step processAdvantages over L-L include: smaller volume solvent used, no emulsions, automation results in reduced time and costBased on a solvent-free sorption-desorption processSPME is a fused silica fiber coated with solid adsorbentOrganic analytes absorb to the fiber, released by heating in GC portCombines extraction, concentration, and injection in one process

Solid Phase Microextraction (SPME)

33AnFar.S2-0834

AnFar.S2-0835

AnFar.S2-0836

AnFar.S2-0837

KhromatografiHPLC, GC, TLCSpektroskopiUV-Vis, Spektrofluorometri, IR, NMR, MS, AASElektroforesisImmunoassayEIA, ELISA, Western Blot, Soutern Blot, Instrumen BioanalisisMerupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)

Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase gerak (mobile phase)

Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerakDKS-0939HPLC39Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

Untuk analisis kualitatif digunakan informasi tR, sedangkan untuk analisis kuantitatif digunakan informasi luas area/tinggi puncak kromatogramDKS-0940HPLC40Metode hplc dipilih bila akan menganalisis senyawa dalam sampel:- yang tercampur dengan matriks yang sangat komplek- dengan kadar sangat kecil

Metode hplc dipilih bila akan menganalisis beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)DKS-0941HPLC41 Senyawa polar:- terelusi belakangan (tR panjang)semakin non-polar fase gerak, tR senyawa polar makin panjang

Solven: - campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

Eluent strength: - dimodifikasi dengan n-heksan

DKS-0942Normal-Phase HPLC[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]42 Senyawa polar: - terelusi lebih dahulu Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar lebih kuat tertahan

Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra- hidrofuran Eluent strength: - dimodifikasi dengan air(Kellner dkk., 1998)DKS-0943Reversed-Phase HPLCReversed-Phase HPLC[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]43DKS-0944HPLC

44DKS-0945

wadah untuk sampel yang siap diinjeksikan[ jumlah kecil ]45Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-kromofor senyawa berkromofor)

Meningkatkan daya deteksinya (senyawa berkromofor UV senyawa berkromofor fluorescensi)DKS-0946Tujuan Derivatisasi46metode pemisahan yang mendasarkan partisi cuplikan antara fase gerak dan fase diammempunyai kecepatan yang tetap dan aliran fase gerak ( gas ) sangat terkontrol, sangat mudah terjadi pencampuran uap sampel ke dalam aliran fase gerak, pemisahan fisik terjadi di dalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang dan temperaturnya dapat diatur. mempunyai banyak macam detektor yang dapat dipakai dan tanggap detektor (proporsional dengan jumlah tiap komponen yang keluar dari kolom), kemudahan kromatografi gas yang digabungkan dengan instrumen fisiko kimia yang lainnya seperti GC-MS, GC-FTIR.Gas Chromatography48DKS-09DERIVATISASI

MHumKes-44849DKS-09

DERIVATISASIMHumKes-449JenisDasarPenggunaan UtamaSpektrofotometri UV-VisPerpindahan energi dari elektron luar yg terikat maupun tidak dlm molekulAnalisa biokimiawi kualitatif & kuantitatif secara rutin lewat uji kolorimetri, uji enzim dari kinetika reaksiSpektrofluorometriRadiasi yang terserap dipancarkan lagi dalam gelombang yg lebih panjangAnalisis kuntitatif rutin, analisa enzim dan kinetika dan perubahan konformasi protein. Lebih peka dr Spek.UV-VisSpektrofotometri infra-merah (IR)Vibrasi Atom karena perbedaan gerak dua kutubAnalisa kualitatif pengenalan molekul murni dengan ukuran sedang. Dipakai dlm penelitian.TEKNIK-TEKNIK SPEKTROSKOPIJenisDasarPenggunaan UtamaSpektrofotometri Nyala (pancaran & serapan, AAS)Perubahan energi dari elektron terluar suatu atom setelah penguapan menjadi nyalaAnalisa kualitatif & kuantitatif untuk metal, biasanya dlm biokimiawi klinis.Spektrometri magnet intiPenentuan tenaga magnetis yang berhubungan dengan proton ganjil pada inti atomPenelitian struktur molekul organik dengan berat molekul kurang dari 20.000 daltonSpektrometri massa (MS)Penentuan jumlah molekul dan pecahannya yang terionisasi bermuatan positifAnalisa kualitatif denagn bahan sedikit (10-4 10-6 g), dapat dihubungkan dengan GC.TEKNIK-TEKNIK SPEKTROSKOPI

ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay)antigens are immobilized on a solid support, either coated directly or through specific capture antibodies. Primary detection antibodies are then applied, forming a complex with the antigen. If conjugated with an enzyme, the detection antibody can directly be used to quantify the antigen, or can itself be quantified by another enzyme-conjugated secondary antibody

Blotting

Terminologies..A Southern blot is a method routinely used in molecular biology for detection of a specific DNA sequence in DNA samples.The northern blot is a technique used in molecular biology research to study gene expression by detection of RNA.The Western blot (alternatively, protein immunoblot) is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Southwestern blotting, based along the lines of Southern blotting (which was created by Edwin Southern) and first described by B. Bowen and colleagues in 1980, is a lab technique which involves identifying and characterizing DNA-binding proteins (proteins that bind to DNA)...Western Blot

Kebutuhan metode yang cepat & biaya ekonomis.Pengetahuan dasar komposisi bahan yang akan dianalisis sehingga dpt dipilih metode dan cara penyiapan yg tepat.Tingkat ketelitian yang dikehendakiJika metode yg singkat dan biaya rendah sdh cukup memadai, tidak perlu melakukan metode yg rumit dg tingkat ketelitian yg tinggi.Berapa banyak sampel yang tersediaJika sampel sedikit, sulit didapat & mahal, maka perlu dipilih metode yg mampu mendeteksi sampel yg sedikitPEMILIHAN METODE BIOANALISIS

etBon COURAGE

Review Bioanalisis

Documents

Transcript of Review Bioanalisis