ACARA II

PENGECATAN BAKTERI

A. Tujuan

Mempelajari morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri.

B. Tinjauan Pustaka

Escherichia coli merupakan bakteri indikator kualitas air minum

karena keberadaannya di dalam air mengindikasikan bahwa air tersebut

terkontaminasi oleh feses, yang kemungkinan mengandung mikroorganisme

enterik patogen lainnya. Beberapa galur Escherichia coli digolongan sebagai

penyebab diare, yaitu ntherophatogenic Escherichia coli (EPEC),

Enteroaggregative Escherichia coli (ETEC), Enteroinvative Escherichia coli

(EIEC) dan Escherichia coli yang memproduksi shiga-toxin (STEC).

Bakteri Escherichia coli yang ada di dalam air atau makanan biasanya galur

Escherichia coli non-patogen walaupun beberapa kasus terdapat galur yang

patogen seperti enterotoksigenik dan galur Escherichia coli yang

memproduksi Escherichia coli (Radji dkk, 2010).

Bakteri asam laktat. Istilah bakteri asam laktat (BAL) mulanya

ditujukan hanya untuk sekelompok bakteri yang menyebabkan keasaman

pada susu. Secara umum BAL didefinisikan sebagai suatu kelompok bakteri

gram positif, tidak menghasilkan spora, berbentuk bulat atau batang yang

memproduksi asam laktat sebagai produk akhir metabolic utama selama

fermentasi karbohidrat. BAL dikelompokkan ke beberapa jenis genus antara

lain Sterptococcus (Lactococcus), Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus

(Pato, 2003).

Mikobakteri diklasifikasikan sebagai asam-cepat karena kemampuan

mereka untuk melawan decolourisation dengan asam mineral setelah

pewarnaan dengan pewarna arymethane. Sebelum mikroskop elektron asam

ini tahan luntur disebabkan hipotetis luar 'lilin kemudian', tetapi sekarang

diketahui tergantung pada residu asam mycolic dari peptidoglycolipids dari

outers pewarnaan kompleks terbentuk antara residu asam dan pewarna

(misalnya carbol fuchsin) yang menjebak noda intraseluler (Allen, 1992).

Di dalam semua ruangan akan selalu didapati mikroorganisme yang

tersuspensi dengan udara dan dapat mengendap bersama debu pada berbagai

macam permukaan seperti pakaian, meja, lantai dan benda-benda lain.

Ukuran sel mikroorganisme yang sedemikian kecil dan ringan menyebabkan

mudah terhembuskan oleh aliran udara. Keberadaan mikroorganisme dapat

menyebabkan kontaminasi, hal ini sangat berpengaruh pada ruangan yang

seharusnya terjaga keseterelilannya missal ruang operasi, laboratorium dan

lainnya. Dalam ruangan laboratorium sering ditemukan mikroorganisme

kontaminan yang ikut tumbuh dalam suatu media nutrient agar. Bakteri

kontaminan yang sering ditemukan antara lain Bacillus sp, Sterptococcus sp,

staphylococcus, Pseudomonas dan Sarcina. Dari mikroorganisme tersebut,

yang paling menyebabnkan kontaminasi adalah Bacillus subtilis

(Ariyadi, 2009).

Seperti jelas tercermin dari namanya, metode ini bukan untuk

mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.

Metode ini meliputi pencampuran mikroorganisme di dalam setetes tinta

India atau nigrosin lalu menyebarkannya dia atas sebuah kaca obyek yang

bersih. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus

pandang) dan tampak jelas di antara medan yang gelap karena pewarna –

pewarna tersebut tidak menembus mikroorganisme. Teknik ini berguna

untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Berbeda dengan metode -

metode pewarnaan yang lain, pada pewarnaan negatif olesan tidak

mengalami pemanasan ataupun perlakuan keras dengan bahan – bahan

kimia, maka terjadinya penyusutan sel dan salah satu bentuk agak kurang

sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih cepat

(Hadioetomo, 1990).

Dimodifikasi Ziehl - Neelsen Pewarnaan yang klasik dilakukan

dengan pewarnaan metanol smear tipis tetap dengan bahan tinja murni solusi

carbol-fuchshin selama minimal 15 menit. Selanjutnya, slide dibilas dalam

air keran dan ditempatkan dalam larutan asam-alkohol untuk menghilangkan

noda, sementara struktur asam cepat akan menolak dengan tindakan asam-

alkohol destaining. Setelah membilas lagi, slide ditempatkan untuk jangka

waktu yang singkat dalam produk kontra-pewarnaan, seperti biru metilen,

memberikan kontras antara materi latar belakang dan struktur asam cepat.

Slide dibilas sekali lagi dan sesudah slide telah dikeringkan, dapat diperiksa

dengan menggunakan x 10 eyepieces dan tujuan minyak imersi x

pembesaran 100 (Potters and Marjan, 2010).

Mula- mula dibuat film tipis seperti pada pewarnaan gram,

dikeringkan di udara, dan difiksasi di atas nyala api kecil. Pewarna hijau

malasit (malachit green) diteteskan di atas film tersebut, dan dibiarkan

selama 20 menit tanpa penangas, atau 5 menit di atas penangas air. Setiap

kali pewarna menjadi kering, ditetesi lagi pewarna yang baru. Kemudian

dicuci secara hati – hati dengan air selama 20 -30 detik, atau sampai warna

hijau tidak luntur. Film ditetesi dengan safranin (untuk mewarnai sel) selama

30 detik, dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap. Obyek

diperiksa dibawah mikroskop menggunakan lensa obyektif minyak imersi.

Endospora bakteri akan berwarna hijau- hijau muda, sedangkan sel vegetatif

berwarna merah-merah muda. Diamati bentuk dan besar spora, letak spora di

dalam sel, pembengkakan sel vegetatif, atau spora mungkin telah

dikeluarkan dari sel jika kultur yang diamati sudah terlalu tua

(Fardiaz, 1993).

Hanya sekelompok bakteri yang dapat membentuk endospora. Makna

yang amat besar dari sekelompok endospora ini terletak dari ketahanannya

terhadap pemanasan. Meskipun semua bakteri lain dan juga sel – sel

vegetative dari bakteri – bekteri pembentuk spora dapat dimatikan dengan

pemanasan pada suhu 800 C selama 10 menit, endospora termosisten dapat

bertahan pada pemanasan yang jauh lebih kuat, beberapa spora bahkan tahap

dimasak untuk beberapa jam. Teknik sterilisasi (tindakan pensucihamaan)

yang memerlukan tenaga dan biaya yang bertujuan untuk mematikan

endospora ini. Di lain pihak sifat termoresisten spora menyediakan

kemungkinan yang tidak ada bandingnya untuk membiakkan secara selektif

pembentuk-pembentuk spora,tanah atau bahan huni lain dipanasi pada suhu

800 C atau 1000 C selama 10 menit, sehingga semua sel vegetative dimatikan,

hanya spora termoresisten saja yang dapat mempertahankan kemampuan

hidup dan dapat berkecambah apabila kemudian diinkubasi dalam media

biak yang cocok (Schmidt, 1994).

Fiksasi adalah suatu usaha manusia untuk mempertahankan elemen-

elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami

perubahan bentuk maupun ukuran. Untuk mencapai tujuan tersebut maka

para ahli sitologi berusaha keras mencari suatu media yang terdiri dari

unsure – unsure kimia, yang kemudian dibuat suatu larutan atau dalam

bentuk gas. Media ini kemudian disebut fiksatif (Suntoro, 1980).

C. Metodologi

1. Alat

a. Gelas objek

b. Batang gelas

c. Mikroskop

d. Tabung reaksi

e. Bunsen

f. Jarum oase

g. Pipet tetes

2. Bahan

a. Biakan murni Lactococcus lactis

b. Biakan murni Escherichia coli

c. Biakan murni Lactococcus subtilis

d. Larutan cat Nigrosin atau tinta cina

e. Aquades steril

f. Larutan cat Ziehl Neelsen carbol fuchsinb (ZN.A)

g. Larutan peluntur alkohol asam (ZN B)

h. Larutan penutup Loeffler methlyne blue (ZN C)

i. Larutan malakit hijau

j. Larutan safranin

3. Cara kerja

a. Pengecatan Negatif

Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, panggang diatas lampu spritus

Diambil suspensi biakan murni Lactococcus lactis dengan ose secara aseptik

Diambil sedikit larutan tinta cina dengan batang gelas, campur dengan suspensi

Diamati preparat dengan mikroskop,

Diletakkan diatas gelas objek

Di ratakan dengan batang gelas hingga merupakan lapisan tipis, preparat dikeringkan

Digambar preparat dengan latar belakang diarsir

Diulangi untuk biakan murni E.coli

b. Pengecatan Acid Fast

Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, panggang diatas lampu spritus

Diambil suspensi biakan murni Lactococcus lactis dengan ose secara aseptik, letakkan diatas gelas objek

Diletakkan diatas gelas objek

Dikeringkan dianginkan dan difiksasi diatas lampu spritus

Diletakkan preparat diatas suatu rak, bubuihkan larutan cat utama (ZN A), panasi dengan lampu spritus selama 5 menit

Preparat didinginkan, dicuci dengan air, dikering anginkan, dicuci dengan larutan peluntur (ZN B), dicuci lagi dengan

air, dikering anginkan

Dibubuhkan zat penutup (ZN C), cuci dengan air mengalir, kering anginkan, amati dalam mikroskop

Digambar hasil pengamatan

Diulangi langkah diatas untuk biakan E. coli

Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, panggang diatas lampu spritus

c. Pengecatan Endospora

Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, panggang diatas lampu spritus

Diambil suspensi biakan murni Lactococcus lactis dengan ose dan biakan Bacillus subtilis secara aseptik, letakkan

diatas gelas objek

Dikering dianginkan dan difiksasi diatas lampu spritus

Dibubuhkan pewarna hijau (malachit green) diatas gelas obyek

Diletakkan diatas penangas air selama 5 menit

Diamati dalam mikroskop, ulang untuk biakan Bacillus subtilis

Dicuci secara hati-hati dengan air yang mengalir sampai warna hijau tidak luntur

Dibubuhi dengan safranin, kemudian dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap

Digambar hasil pengamatan

C. Hasil dan Pembahasan

Tabel 2.1 Pengecatan Bakteri

Kelompok Sampel Gambar Hasil Praktikum Keterangan

1 dan 7 E. Coli Bakterinya

transparan

dengan latar

gelap dan

berbentuk agak

lonjong (basil)

2 dan 8 Lactococcus

lactis

Bakterinya

transparan

dengan latar

gelap

9 dan 15 E. Coli Latar belakang

gelap (hitam)

Bentuk bakteri

lonjong

10 dan 16 Lactococcus

lactis

Bakterinya

transparan

Latarnya gelap

Sumber : Laporan Sementara

Pengecatan negatif sesuai dengan namanya, metode ini bukan

untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi

hitam/gelap. Metode ini meliputi pencampuran mikroorganisme di

dalam setetes tinta cina/nigrosin lalu menyebarkannya di atas sebuah

kaca obyek yang bersih. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan

transparan dan tampak jelas di antara medan yang gelap karena

pewarna-pewarna tersebut tidak menembus mikroorganisme.

Teknik ini bertujuan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang

sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran sel serta melihat dan

membedakan bakteri yang hidup dan yang mati. Berbeda dengan

metode-metode pewarnaan lain, pada pengecatan negatif olesan tidak

mengalami pemanasan ataupun perlakuan keras dengan bahan-bahan

kimia, maka terjadinya penyusutan sel dan salah bentuk agak kurang

sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Akan tetapi,

harus diperhatikan bahwa selama mengeringnya pewarna, sel-sel

tersebut dapat saja mengalami penyusutan atau salah bentuk. Metode ini

biasa digunakan untuk bakteri yang sulit diwarnai.

Faktor yang mempengaruhi berhasilnya metode ini adalah kaca

obyek harus benar-benar bersih (bila terdapat sisa-sisa lemak atau debu

pada kaca obyek, olesan mikroorganisme tidak akan merata). Jumlah

nigrosin yang digunakan campuran mikroorganisme dan pewarna harus

diseret di atas kaca obyek, bukan sekedar di dorong.

Pada praktikum ini mula-mula mensterilkan gelas benda dengan

alkohol hingga bebas lemak kemudian panggang di atas nyala lampu

spiritus, setelah dingin ambil suspensi biakan murni secara aseptik di

atas gelas benda, kemudian ambil larutan cat nigrosin/tinta cina dan

campurkan lalu ratakan hingga merupakan lapisan yang tipis sekali,

kemudian keringkan. Amati dengan mikroskop perbesaran kuat dengan

minyak imersi yang berfungsi sebagai indikator. Sel-sel bakteri yang

hidup akan tampak transparan dengan latar belakang hitam/gelap. Sel

bakteri yang mati akan terlihat gelap.

Biakan murni yang digunakan adalah Lactococcus lactis dan

Escherichia coli dalam medium nutrien cair 24 jam. Larutan yang

digunakan adalah nigrosin/tinta cina, larutan congo-red, dan larutan

alkohol asam (alkohol yang mengandung 1 – 2 % HCl). Dalam hasil

pengamatan yang dilakukan didapatkan bentuk bakteri dengan bentuk

agak lonjong dan transparan. Hal disebabkan masih banyak terdapat

bakteri yang hidup. Dimana sel-sel bakteri yang hidup akan tampak

transparan dengan latar belakang hitam atau gelap. Sel bakteri yang mati

akan terlihat gelap.

Pewarnaan ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai

latar belakangnya menjadi gelap. Caranya secara umum dengan

mencampur mikroba dalam setetes tinta bak/ tinta cina/ tinta india

(negrosin) lalu meyebarkan diatas kace objek yang bersih. Pewarnaan

negatif menyebabkan mikroba kelihatan transparan (tembus pandang)

dan tampak jelas pisah diatara medan yang gelap karenapewarnaan ini

berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Berbeda dengan

metode pewarnaan yang lain, pada pewarnaan negative tidak mengalami

pemanasan atau perlakuan lain dengan dengan bahan kimia

(Waluyo, 2008).

Tabel 2.2 Pengecatan Acid Fast (Pengecatan Ziehl Neelsen)

Kelompok Sampel Gambar Hasil

Praktikum

Keterangan

3 E. Coli Tidak tahan

asam, berwarna

biru

Latar biru muda

4 Lactococcus

lactis

Tahan asam

Berwarna merah

Latar merah

muda

11 E. Coli Bakterinya

berwarna biru

ungu

Tidak tahan asam

12 Lactococcus

lactis

Bakterinya

berwarna merah

Tahan asam

Latarnya

berwarna merah

muda

Sumber : Laporan Sementara

Tujuan pengecatan acid fast adalah untuk membedakan bakteri

yang bersifat acid fast (tahan terhadap pencucian asam) dan bakteri yang

bersifat non acid fast (tidak tahan terhadap pencurian asam). Biakan

murni yang digunakan lactococcus lactis dalam medium nutrien agar

miring umur 48 jam dan Escherichia coli dalam medium nutrien agar

miring umur 24 – 48 jam. Larutan yang digunakan adalah larutan Ziehl

Neelsen carbol fuchsin (ZN A), peluntur alkohol asam (ZN B), dan

penutup Loeffler methylene blue (ZN C).

Sekalipun sitoplasma berwarna, sel-sel organisme seperti mikro

bakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak

terpusatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti alkohol asam.

Alkohol asam merupakan pemucat yang sangat intensif. Pada kondisi

ini, organisme yang dapat menahan zat warna dikatakan acid fast (tahan

asam) dan berwarna merah. Pada bakteri biasa yang dinding selnya tidak

bersifat terlampau lipoid pewarna karbol fuchsin yang mewarnai sel

dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol asam sehingga dikatakan

non acid fast (tidak tahan asam). Tercucinya karbol fuchsin dapat

diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan Loeffler methlyne blue

oleh sel, sehingga bakteri tampak biru.

Pada praktikum ini mula-mula mensterilkan gelas benda dengan

alkohol hingga bebas lemak kemudian dipanggang di atas nyala lampu

spiritus. Kemudian ambil secara aseptik aquadest dan letakkan di atas

gelas benda dan suspensikan biakan murni secara aseptik ke dalam

aquadest kemudian ratakan seluas ± 1 cm dan kering-anginkan lalu

fiksasi di atas lampu spiritus. Kemudian bubuhkan larutan zat utama

(ZN A) yang berlebihan dan panasi selama 5 – 10 menit dan cegah agar

cat jangan sampai kering/mendidih. Kemudian dinginkan dan cuci lalu

keringkan. Kemudian cuci lagi dengan larutan peluntur (ZN B) sampai

zat peluntur yang mengalir tampak kemerah-merahan. Setelah kering,

bubuhi larutan zat penutup (ZN C) selama 30 detik, kemudian cuci dan

keringkan. Amati dengan mikroskop perbesaran kuat dan dengan

minyak imersi untuk indikator. Bakteri yang acid fast tampak berwarna

merah sedangkan non acid fast berwarna biru.

Faktor yang mempengaruhi berhasilnya metode ini adalah kaca

obyek harus benar-benar bersih (bila terdapat sisa-sisa lemak atau debu

pada kaca obyek, olesan mikroorganisme tidak akan merata). Jumlah

nigrosin yang digunakan campuran mikroorganisme dan pewarna harus

diseret di atas kaca obyek. Bukan sekedar di dorong.

Berdasarkan hasil percobaan, dapat diketahui bahwa

mikroogranisme pertama yang diamati yaitu E. Coli berwarna biru

dengan warna dasar biru muda yang menandakan bahwa E.Coli todak

tahan terhadap asam. Sedangkan untuk mikroorganisme kedua yang

diamati yaitu Lactococcus lactis berwarna merah dengan bentuk coccus

(bulat) yang menandakan bahwa bakteri ini merupakan bakteri yang

tahan terhadap asam.

Tabel 2.3 Pengecatan Endospora

Kelompok Sampel Gambar Hasil

Praktikum

Keterangan

5 Bacillus

subtilis

Latar berwarna

kuning, tidak ada

endospora.

6 Lactococcus

laktis

Ada endospora

Latar berwarna

kuning

Bakteri seperti

noda garis- garis

hijau tipis

13 Bacillus

subtilis

Latar berwarna

kuning

Tidak terdapat

endospora

14 Lactococcus

laktis

Latar berwarna

kuning. Bakteri

berbentuk garis

hijau dan bercak

Terdapat

endospora

Sumber : Laporan Sementara

Sifat endospora yang demikian menyebabkan dibutuhkan perlakuan

yang keras untuk mewarnainya. Prosedur pewarnaan Gram misalnya, tidak

dapat mewarnainya. Hanya bila diberi perlakuan panas yang cukup,

pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna

memasuki endospora, sukar dihilangkan. Ada dua metode yang umum

dipakai, yaitu metode Shaeffer-Fulton dan metode Dorner. Metode Dorner

menggunakan nogroin dan menghasilkan spora berwarna merah dan

sporangium yang tak berwarna (Hadioetomo, 1990).

Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat

digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal

dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif

yang letaknya tepat ditengah. Tipe terminal memliki pengertian letak sel

vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal

berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir sel vegetatif.

Endospora dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif yang

terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki

resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan malakit

hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan

hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus suntilis

memiliki endospora yang terletak di subtermal (Ncbi, 2008). Perbedaan

antara bakteri yang terdapat endospora dengan bakteri yang tidak terdapat

endospora yaitu, bakteri yang terdapat endospora terdapat garis-garis hijau

tipis seperti bercak. Sedangan yang tidak terdapat endospora terdapat garis-

garis ada yang merah pudar dan abu –abu. Pada praktikum yang kita

lakukan dapat disimpulkan jenis spora yang kita dapatkan adalah tipe

subtermal, dimana letak endosporanya diantara tengah dan pinggir sel

vegetatif.

Malachite green merupakan senyawa organik yang digunakan sebagai

zat warna dan telah muncul sebagai agen kontroversial dalam akuakultur.

Malachite green secara tradisional digunakan sebagai pewarna untuk bahan

seperti sutra, kulit, dan kertas. Meskipun disebut malachite green, senyawa

ini tidak berhubungan dengan perunggu mineral - nama hanya berasal dari

kesamaan warna. Dalam pewarnaan bakteri fungsi Malachite green ini

adalah untuk melihat ada tidaknya endospora pada bakteri.

E. Kesimpulan

Dari praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan sebagai berikut :

1. Bakteri yang hidup berwarna transparan dengan latar belakang

hitam/gelap dan tampak jelas karena pewarna-pewarna tersebut tidak

menembus mikroorganisme.

2. Bakteri yang mati berwarna gelap.

3. Bakteri pada biakan Lactococcus lactis bentuknya lonjong-lonjong.

4. Bakteri pada Escherichia coli bentuknya bulat-bulat.

5. Bakteri acid fast adalah bakteri yang tahan terhadap pencucian/zat warna

dan berwarna merah yaitu pada biakan Lactococcus lactis.

6. Bakteri non acid fast adalah yang tidak tahan terhadap pencucian/zat

warna dan berwarna biru yaitu pada biakan Escherichia coli.

7. Bakteri pada biakan Bacillus subtilis tidak terdapat endospora karena

berwarna merah.

8. Bakteri pada biakan Lactococcus lactis terdapat endospora karena

berwarna hijau.

DAFTAR PUSTAKA

Allen, Janet L. 1992. A Modified Ziels_Neelsen Stain for Mycobakteria. Journal of Medical laboratory 99 – 102. United kingdom.

Ariyadi, T dan Sinto Dewi. 2009. Pengaruh Sinar Ultraviolet Terhadap Pertumbuhan Bakteri Bacillus sp. Sebagai Bakteri Kontaminan. Jurnal Kesehatan Volume 2 No. 2. Semarang.

Fardiaz, Srikandi. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Pato, Usman. 2003. Potensi Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari Dadih untuk Menurunkan Resiko Penyakit Kanker. Jurnal Natur Indonesia Volume 5 No. 2 :162-166. Riau.

Potters, Idzi and Marjan Van Esbroeck. 2010. Negative Staining Technique of Heine for The Detection of Cryptosporidium spp.:A fast and Simple Screening Technique. The open parasitology Journal Volume 4 No 1-4. Belgium.

Radji, Maksum dkk. 2010. Deteksi Cepat Bakteri Escherichia coli Dalam Sampel Air dengan Metode Polymerase Chain Reaction Menggunakan Primer 16E1 dan 16E2. Jurnal Makara, Sains Volume 14 No. 1, April 2010: 39 – 43. Depok.

Schmidt, Karin. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Enam. Gadjah Mada University Press. Yoyakarta

Suntoro, S. Handari. 1980. Metode Pewarnaan. Bhatara Karya Aksara. Jakarta