Teknologi Sel

Biologi Sel

Semester Gasal 2011/2012

Esti Widowati,S.Si.,M.P

Gen

Unit dasar perwarisan sifat adalah gen. Gen : serangkaian urutan nukleotida yang mengkode

satu molekul protein Setiap gen bertanggungjawab untuk satu rantai asam

amino dan sifat lain. Gen merupakan bagian dari DNA.

Gen bertanggungjawab untuk membuat protein dan DNA menginstruksikan untuk membuat protein melalui mekanisme sintesis protein.

Urutan nukleotida suatu gen dapat diubah sehingga protein dan fungsi yang dihasilkannya berbeda.

Teknik ini disebut rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan yang prosesnya disebut kloning gen.

Kloning : proses insersi fragmen nukleotida kedalam vektor dan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang berbeda-beda.

Molekul DNA rekombinan dalam sel inang akan bereplikasi dan menghasilkan kopi yang identik.

Ketika sel lisis, kopi molekul DNA akan diturunkan dan terjadilah proses replikasi kembali.

Hasil proses ini adalah klon yang mengandung satu atau lebih molekul DNA rekombinan.

Struktur sederhana : empat subunit nukleotida yang diikatkan bersama dalam urutan yang sangat spesifik untuk membentuk suatu rantai.

Urutan nukleotida ini menjadi sandi yang menyampaikan seluruh informasi bagi suatu sel selama kehidupannya.

Setiap nukleotida terdiri atas gula deoksiribosa, fosfat dan basa nitrogen (adenine, timin, sitosin dan guanin).

Bentuk : helix ganda dengan dua rantai nukleotida berputar mengelilingi satu sama lain dalam bentu helix atau spiral. Subunit pada setiap rantai diikat bersamaan. Basa pada masing-masing rantai berhadapan satu sama lain di tengah helix dan basa berpasangan secara spesifik.

Adenin dengan Timin dan Sitosin dengan Guanin. Cara ini berperan untuk membuat salinan DNA.

DNA

Pembelahan sel membuat setiap organisme menerima separuh kromosom dari setiap induknya sehingga organisme menjadi lebih kompleks.

DNA akan bereplikasi sebelum terjadi pembelahan. Pesan ditranskripsi menjadi mRNA yang secara kimiawi serupa dengan DNA.

Urutan basa pada mRNA menentukan urutan asam amino pada protein disebut kodon. Setiap kodon memberi perintah untuk mensintesis protein

Proses pembentukan protein mempengaruhi kemampuan organisme bertahan hidup.

Kultur Sel

Kultur sel adalah menumbuhkan sel atau jaringan pada medium tertentu dalam kondisi aseptis

Perbanyakan tumbuhan/hewan dapat dilakukan secara cepat, jumlahnya terbatas, hemat tempat dan waktu, serta memiliki sifat identik. Perbanyakan itu melalui teknik kloning.

Kultur sel tumbuhan dapat ditumbuhkan menjadi individu baru, sedangkan kultur sel hewan tidak bisa.(Kemampuan totipotensi)

Kultur Sel

Sel Attach atau Suspensi

Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika merupakan upaya untuk mengubah sifat makhluk hidup dengan mengubah materi genetik yang ada di dalam selnya, cara mengubah materi genetik (DNA) dengan melalui persilangan, mutasi, transplantasi inti, fusi, rekombinasi DNA.

Fusi sel untuk pembentukan generasi baru dengan kombinasi gen yang baru dalam sel mikroorganisme dengan menggabungkan dua sel bersamaan.

Fusi sel diawali oleh peleburan membran sel, diikuti oleh peleburan sitoplasma (plasmogami) dan selanjutnya peleburan inti (kariogami). Waktu inti melebur, terjadi penyusunan kembali kromosom secara acak.

Fusi sel membentuk hibrid atau rekombinan yang mengandung materi genetik dua sel atau lebih. Cara ini menghasilkan kombinasi gen.

Fusi sel dapat menghasilkan antibiotik baru dengan mengaktifkan gen yang inaktif.

Fusi sel menjadi cara untuk menyatukan bersama-sama gen yang biasanya tidak berdekatan yaitu gen penyandi protein dan gen daerah pengendali.

Fusi Sel

Fusi sel1. sel wadah : memiliki sifat cepat membelah(sel kanker,mieloma).2. sel sumber gen : memiliki sifat yang diinginkan.3. fusigen : zat-zat yang mempercepat terjadinya fusi sel. zat yang tergolong fusigen misalnya NaNO3, CsCl, pH tinggi, PEG, medan listrik dan virus

Manfaat fusi sel yakni untuk pemetaan kromosom, menghasilkan antibodi monoklonal dan membentuk spesies baru.Beberapa alasan melakukan rekombinasi DNA yakni1. struktur DNA sama, darimanapun sumbernya2. DNA dapat disambung-sambung3. ditemukannya enzim-enzim pemotong dan penyambung4. gen dapat mengekspresikan diri di dalam sel mana saja.

Transfer Inti (Nuclear Transfer)

DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan : upaya perbanyakan gen tertentu dalam sel inang nonalami (kloning gen), mengisolasi, memotong, mengkombinasi dan menginsersi

Teknologi DNA rekombinan : pembentukan kombinasi materi genetik baru dengan penyisipan molekul DNA ke dalam vektor sehingga terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel inang.

Manfaat. Diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Produk pangan, vaksin, kapas, bioinsektisida, agen bioremediasi dan hormon insulin

Tahapan-tahapan tersebut adalah 1. isolasi DNA genomik/kromosom yang akan

diklon2. pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah

fragmen dengan berbagai ukuran3. isolasi DNA vektor4. penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor

untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan5. transformasi sel inang menggunakan molekul

DNA rekombinan6. reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel

inang7. analisis DNA rekombinan.

Perangkat yang diperlukan adalah1. Enzim restriksi : memotong DNA2. Enzim DNA ligase : menyambung DNA3. Plasmid : vektor4. Transposon : alat untuk melakukan mutagenesis

dan untuk menyisipkan penanda5. Pustaka Genom : Menyimpan gen atau fragmen

DNA yang telah diklonkan6. Enzim Reverse Transcription : membuat DNA

berdasarkan RNA7. Pelacak DNA/RNA : deteksi gen atau fragmen DNA

yang diinginkan atau deteksi klon yang benar

Sumber DNA sisipan

1. DNA genomik dari DNA library

2. Produk PCR

3. mRNA menjadi cDNA (eukariot)

Vektor DNA yang dapat mereplikasi diri didalam sel inang.

Vektor DNA adalah wahana tempat terjadinya kloning.

Vektor berupa molekul DNA yang diinsersi oleh suatu gen untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat membawa masuk gen kedalam sel inang.

Vektor

Vektor tersebut antara lain

Plasmid Molekul DNA untai ganda berbentuk melingkar dan

terletak diluar kromosom. Plasmid memiliki ukuran yang lebih kecil daripada vektor

kloning lain sehingga fragmen DNA yang disisipkan juga berukuran kecil yaitu kurang dari 10 kb.

Molekul DNA plasmid dapat diisolasi, dimanipulasi dan dimasukkan kembali kedalam sel inang. Didalam sel inang molekul DNA plasmid dapat berjumlah lebih dari satu dan mampu mereplikasi diri dan diturunkan ke generasi berikutnya

Plasmid dipilih karena mudah memasuki sel E.coli dan proses ini dibantu sutu senyawa kimia.

Plasmid dapat mereplikasi dirinya termasuk jika telah mengandung gen rekombinan manusia.

Bakteriofag : salah satu contohnya adalah lambda yaitu virus E.coli memiliki ukuran 49 kb berupa molekul DNA yang berukuran lebih besar daripada plasmid yang dibungkus protein. Fragmen DNA yang disisipkan juga memiliki ukuran lebih besar yaitu 20 kb

Phagemid : plasmid rekombinan yaitu gabungan antara plasmid dan bakteriofag serta dapat disisipi molekul DNA antara 10-20 kb

Kosmid : molekul DNA yang memiliki nukleotida dengan ukuran lebih besar daripada bakteriofag sehingga fragmen yang disisipkan sekitar 45kb

Ragi atau yeast : vektor kloning yang disisipi oleh framen DNA ukuran 50-100 kb

Bacteriophage

Syarat Inang (Hospes)

Tumbuh cepat Nutrisi murah Tidak banyak persyaratan Bukan patogen/tidak menghasilkan toksin

Informasi genetiknya sudah sangat dipahami

Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami

Dapat menerima berbagai vektor, mudah ditransformasi,

Fragmen DNA asing pembawa sifat yang diinginkan. Pada proses kloning fragmen DNA pembawa sifat yang diinginkan dapat diperoleh dengan beberapa cara yaitu

a. sintesis DNA secara kimia dengan DNA synthesizer karena alat ini dapat mensintesis urutan nukleotida sepanjang 80 kb tetapi dengan biaya mahal.

b. sintesis DNA dari RNA. Proses ini diawali dengan isolasi dan pemurnian RNA. RNA bersifat tidak stabil dan mudah terdegradasi. Dengan penambahan enzim reverse transkriptase RNA akan ditranskripsi menjadi DNA. Cara ini memerlukan biaya relatif mahal.

Fragmen DNA asing

c. fragmentasi DNA secara mekanik. Cara ini diawali dengan isolasi dan pemurnian DNA (DNA kromosom) kemudian dipotong secara acak. Biaya relatif murah tetapi fragmen yang terpotong akan sulit disambung kembali ke vektor kloning.

d. pemotongan DNA dengan enzim restriksi. Cara ini diawali dengan isolasi dan pemurnian DNA kemudian dilakukan pemotongan secara terarah dengan enzim restriksi. Enzim restriksi merupakan endonuklease yang memiliki sisi pengenalan tertentu. Penyambungan kembali fragmen dengan vektor dapat direncanakan dan biaya dapat dikalkulasikan.

Metode untuk memotong dan menyambung kembali DNA asing tersebut dengan vektor untuk menghasilkan DNA rekombinan.

Pemotongan dan penyambungan kembali fragmen DNA asing kedalam suatu vektor dilakukan secara enzimatis.

Pemotongan dan Penyambungan Kembali DNA

Beberapa enzim yang terlibat dalam kloning DNA adalah enzim restriksi : endonuklease yang memiliki kemampuan

memotong urutan nukleotida pada basa secara spesifik sehingga pemotongannya dapat terarah. Oleh karena molekul DNA beruntai ganda maka hasil pemotongannya berupa ujung tumpul (blunt ends) atau runcing/kohesif (sticky ends). Pemotongan DNA dengan enzim restriksi ini bersifat palindrom atau arah pengenalan (5`-3`) dari dua untai selalu sama.

DNA ligase untuk menyambung kembali fragmen DNA dengan vektornya sehingga dihasilkan DNA rekombinan.

Pemasukan molekul DNA rekombinan kedalam sel inang dapat dilakukan dengan kejut panas yaitu dengan mencampur DNA rekombinan hasil ligasi dengan sel inang dan dipanaskan pada 42C selama 30 detik kemudian diinkubasi pada es selama 2 jam. Proses tersebut adalah transformasi yaitu sel yang mengalami perubahan.

Transforman ditumbuhkan pada media tertentu untuk dilakukan proses skrining atau identifikasi klon rekombinan. E.coli dapat sebagai inang karena metabolismenya telah banyak dipelajari.

Memasukkan DNA Rekombinan

Skrining diperlukan untuk memperoleh klon hasil yang mengandung gen pengkode protein yang kita inginkan.

Setelah klon yang diduga mengandung fragmen DNA yang diinginkan diperoleh kemudian dilakukan isolasi DNA untuk menentukan urutan nukleotidanya.

Populasi sel dari satu induk asal disebut klon dan seluruh sel dalam satu klon memiliki susunan genetik yang sama.

Identifikasi Klon Rekombinan

1.Isolasi gen2. Memodifikasi gen sehingga fungsi biologisnya lebih baik3. Mentransfer gen tersebut ke organisme baru4. Membentuk produk organisme transgenik

Prosedur pembentukan organisme transgenik 1. Proses introduksi gen

a. membentuk sekuen gen yang diinginkan yang ditandai dengan penanda yang spesifik.b. Mentransformasi sekuen gen yang sudah ditandai ke jaringanc. Mengkultur jaringan yang sudah mengandung gen yang ditransformasikand. Uji coba kultur tersebut di lapangan

2. MutagenesisMemodifikasi gen pada organisme tersebut dengan mengganti sekuen basa nitrogen pada DNA yang ada untuk diganti dengan basa nitrogen lain sehingga terjadi perubahan sifat pada organisme tersebut, contoh: semula sifatnya tidak tahan hama menjadi tahan hama.

Transfer DNA secara alami

1. Konjugasi : perpindahan DNA antara satu sel ke sel lainnya dengan adanya kontak fisik

2. Transformasi : pengambilan DNA dari lingkungan disekitarnya

3. Transduksi : Pemindahan DNA dari satu sel ke sel lainnya dengan bantuan phage

Pembuatan tanaman buah, sayur, bunga, serealia, daun

tembakau yang tahan lama, upaya produksi susu sapi dengan kualitas seperti ASI, wool berkualitas tinggi, padi dengan kandungan vitamin A, sintesis antibiotik baru dan produksi vaksin, insulin dan hormon.

Gen dipindah antar organisme. Rekayasa genetika melibatkan penyisipan informasi genetik baru kedalam organisme biasanya bakteri untuk menghasilkan kemampuan baru.

Gen dapat terekspresi atau tidak tergantung digunakannya dalam sintesis protein.

Aplikasi Rekayasa GenKLONING

Tugas Presentasi

Buat 5 kelompok dan tentukan judul materi yang akan dipresentasikan

Tema presentasi

1. Peran teknologi sel dalam ketahanan pangan

2. Metode pengawetan pangan dan kaitannya dengan selaput plasma

3. Peran rigor mortis dan kaitannya dengan kualitas daging

4. Efek penyimpangan dalam pembelahan sel pada tanaman pangan

5. Stress Management pada sel (stress lingkungan dan nutrisi)

Info dari jurnal atau sumber lain Bisa berupa info terkini, pro-kontra, produk

atau jenis tanaman pangan Efek dapat positif dan negatif Dapat disertai penyataan sikap kelompok

terhadap suatu teknologi atau pernyataan Presentasi sekreatif mungkin dan

mengangkat isu terkini terutama berkaitan dengan ketahanan dan keamanan pangan

Presentasi dilakukan berurutan sesuai tema