i

GAMBARAN POLIMORFISME GEN CYP A * A

RS (T>C) SEBAGAI FAKTOR RISIKO

KANKER KOLOREKTAL PADA MAHASISWA

KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER

ANGKATAN - UIN SYARIF

HIDAYATULLAH JAKARTA

Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN

OLEH:

Nurul Fathimah

NIM:

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

H/ M

ii

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KAYA

Dengan ini saya menyatakan bahwa:

. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan

untuk memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar Strata di

Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya

cantumkan sesuai dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

. Jika dikemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau

merupakan hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia

menerima sanksi yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Ciputat, Agustus

Nurul Fathimah

ii

iii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING

GAMBARAN POLIMORFISME GEN CYP A * A RS (T>C)

SEBAGAI FAKTOR RISIKO KANKER KOLOREKTAL PADA MAHASISWA

KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER ANGKATAN - UIN

SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Laporan Penelitian

Diajukan kepada Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan untuk Memenuhi Persyaratan

Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S. Ked)

Oleh

Nurul Fathimah

NIM:

Menyetujui,

Dosen Pembimbing I Dosen Pembimbing II

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

H/ M

Dosen Pembimbing I

Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD

NIP.

Dosen Pembimbing II

dr. Hari Hendarto, SpPD-KEMD, PhD, FINASIM

NIP.

iii

iv

LEMBAR PENGESAHAN

Laporan Penelitian berjudul GAMBARAN POLIMORFISME GEN

CYP A * A RS (T>C) SEBAGAI FAKTOR RISIKO KANKER

KOLOREKTAL PADA MAHASISWA KEDOKTERAN DAN PROFESI

DOKTER ANGKATAN - UIN SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA yang diajukan oleh Nurul Fathimah (NIM ), telah

diujikan dalam sidang di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan pada tanggal

Agustus . Laporan penelitian ini telah diperbaiki sesuai dengan masukan

dan saran penguji, serta telah diterima sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran (S. Ked) pada Program Studi Pendidikan Dokter.

Ciputat, Agustus

DEWAN PENGUJI KETUA SIDANG

Chris Adhiyanto, M.Biomed, PhD

NIP.

Pembimbing I Pembimbing II

Chris Adhiyanto, M.Biomed, PhD dr. Hari Hendarto, Sp.PD-KEMD, Ph.D, FINASIM

NIP. NIP.

Penguji I Penguji II

dr. Achmad Lutfi SpB-KBD Dr. Zeti Harriyati, S. Si, M. Biomed

NIP.

Pimpinan Fakultas

Dekan FKIK UIN Kaprodi PSKPD FKIK UIN

Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS, FACS

NIP. NIP.

Pembimbing I

Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD

NIP.

Pembimbing II

dr. Hari Hendarto, SpPD-KEMD, PhD, FINASIM

NIP.

DEWAN PENGUJI

Ketua Sidang

Chris Adhiyanto, M.Biomed, PhD

NIP.

Dekan FKIK UIN Jakarta

Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes

NIP.

Kaprodi PSKPD UIN Jakarta

dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS, FACS

NIP.

Penguji I

dr. Achmad Lutfi, SpB-KBD

NIP.

Penguji II

Dr. Zeti Harriyati, S.Si, M. Biomed

iv

v

KATA PENGANTAR

Penulis mengucapkan terima kasih kepada:

. Puji syukur kepada Allah SWT atas rahmat dan hidayahNya, saya telah

diberikan kesabaran, kekuatan dan kemudahan sampai saya dapat

menyelesaikan riset ini dengan lancar. Sekaligus Nabi besar Muhammad

SAW yang telah membimbing umat islam hingga akhir hayatnya.

. Orang tua penulis, Muhajir dan Nikmatul Fauriyah yang selalu memberi

doa, bantuan moril dan materiil dari hati yang tulus hingga penulis dapat

menyelesaikan riset ini dengan lancar. Terima kasih juga kepada saudara

penulis dek Dina, dek Iqbal, dek Fiqi yang menyemangati penulis dan

pengingat sampai saat ini.

. Tim peneliti kanker kolorektal FKIK UIN Syarif Hidayatullah dan RSUP

Fatmawati atas kerjasama penelitian pemetaan kanker kolorektal dan

kesempatan serta ilmu yang sudah diberikan kepada penulis.

. Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta

. dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS, FACS selaku Ketua Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

. Pembimbing dan penguji skripsi yaitu Chris Adhiyanto S.Si, M.Biomed,

PhD, dr. Hari Hendarto, SpPD-KEMD, PhD, FINASIM, dr. Achmad Lutfi,

SpB-KBD, Dr. Zeti Harriyati, S.Si, M. Biomed yang telah membimbing

dengan penuh kesabaran dan keikhlasan serta ketulusan dan atas seluruh

pengalaman yang diberikan sehingga saya dapat menyelesaikan riset ini.

. Tim Fantastic Four sebagai kelompok riset di PSKPD

. Seluruh Civitas Akademik PSKPD UIN Jakarta, seluruh dokter, dosen, dan

staff.

. Laboran yang telah membantu riset penulis mbak Suryani S.Si, mbak Ayu

Latifa A.Md, yang setia menemani dan membantu serta mengingatkan

penulis

v

vi

. Kak Amatilah Raifah, Kak Hipni Solehudin, Kak Adamilzary Fikri sebagai

kakak kelas yang telah membantu penulis dalam penelitian, tahap penulisan

dan ilmu lain yang telah diajarkan kepada penulis

. Carotis selaku sejawat yang menjadi penyemangat dan mendukung

penulis.

. Sahabat penulis yaitu Dhia Fairus yang telah membantu memperoleh jurnal

yang berguna dalam penulisan skripsi ini.

. Sahabat penulis yaitu Taqiyya Maryam, Masruroh, Kak Zaima Dzatul Ilma,

Kak Mahdiah Maemunah, Kak Aliefa Syifa, Kak Yofara M Muslihah yang

tetap memberi dukungan serta penyemangat penulis selama di PSKPD UIN

Jakarta.

. Keluarga pohon PSKPD UIN Jakarta Juragan’s Family yang turut

membantu menyemangati, memberi kritik dan saran kepada penulis

sehingga dapat menjadi lebih baik.

. MERCY , , yang telah memberi dukungan dan kesempatan

untuk aktif organisasi disertai menyelesaikan riset.

. BPH MERCY periode - , Ciwi-Ciwi Mercy yang telah memberi

saya pelajaran berorganisasi, mendukung dalam partisipasi dalam

pembuatan karya ilmiah dalam lomba nasional, disertai mengatur prioritas

untuk menyelesaikan riset.

Penulis sadar atas ketidaksempurnaan riset ini dan berharap semua kekurangan

bisa dimaklumi karena kesalahan adalah proses dari pembelajaran. Penulis juga

memohon kritik-kritik membangun yang dapat membantu dalam kesuksesan riset

ini. Terima kasih.

Ciputat, Agustus

Peneliti

vi

vii

ABSTRAK

Nurul Fathimah. Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter. Gambaran

Polimorfisme Gen CYP A * A rs (T>C) Sebagai Faktor Risiko Kanker

Kolorektal Pada Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter

Angkatan - UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Latar Belakang: Kanker kolorektal merupakan penyebab kematian ketiga dari

seluruh kasus kanker di Indonesia. Dari penelitian sebelumnya telah diketahui

bahwa terdapat hubungan antara polimorfisme genetik sitokrom P (CYP)

dengan kejadian kanker kolorektal. Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan

antara FKIK UIN dengan RSUP Fatmawati dalam menentukan alel SNP

CYP A * A rs (T>C), maka dilakukan identifikasi alel SNP

CYP A * A rs (T>C) pada mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta. Metode: Pengambilan darah diambil dari mahasiswa Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang sehat.

Pemeriksaan genotip dilakukan dengan metode PCR-RFLP. Hasil dan

Kesimpulan: Dengan demikian didapatkan hasil penapisan SNP CYP A * A

rs (T>C), sebagian besar merupakan heterozigot varian dan sebagian

kecil merupakan homozigot murni dan homozigot varian. Sehingga sebagian

besar mahasiswa memiliki polimorfisme SNP CYP A * A rs (T>C)

Kata Kunci : Kanker Kolorektal, CYP A * A, single nucleotide polymorphism

Nurul Fathimah. Medical Study Program and Doctor Profession. The Distribution

of CYP A * A rs (T>C) Polymorphism as Colorectal Cancer Risk

Factor among Students in Medical Study Programs and Doctor Profession -

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Background: Colorectal cancer is the third leading cause of death from all cancer

cases in Indonesia. From previous research it is known that there is a relationship

between genetic polymorphism of cytochrome P (CYP) with the incidence of

colorectal cancer. Therefore, research team of FKIK UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta and Fatmawati General Hospital work together to evaluate the frequency

of SNP CYP A * A rs (T> C) allele in Medical Study Program and

Doctor Profession of FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Methods: Blood

sampling was taken from healthy student of Medical Study Program and Doctor

Profession of FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Genotype examination was

performed by PCR-RFLP method. Results and Conclusions: Based on screening

results, most of genotype is a variant heterozygot, while pure homozygote and

homozygote variant are minority. So most of the students has polymorphism SNP

CYP A * A rs (T> C)

Keywords: Colorectal Cancer, CYP A * A rs , single nucleotide

polymorphism

vii

viii

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL .......................................................................................... i

LEMBAR PERNYATAAN ........................................................................... ii

LEMBAR PERSETUJUAN ......................................................................... iii

LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................... iv

KATA PENGANTAR .....................................................................................v

ABSTRAK .................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ................................................................................................ viii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................x

DAFTAR TABEL ......................................................................................... xi

DAFTAR SINGKATAN .............................................................................. xii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiii

BAB PENDAHULUAN ...............................................................................

Latar Belakang ............................................................................................

Rumusan Masalah .......................................................................................

Hipotesis ......................................................................................................

Tujuan .........................................................................................................

Manfaat Penelitian ......................................................................................

BAB TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................

Landasan Teori ............................................................................................

Genomik ............................................................................................

Area Intergenik .....................................................................

Single Nucleotide Polymophysm ..........................................

Ekspresi Gen .....................................................................................

Kanker ...............................................................................................

Kanker Kolorektal ...........................................................................

Anatomi Kolorektal ............................................................

Pengertian Kanker Kolorektal ............................................

Faktor Resiko Kanker Kolorektal .......................................

Patogenesis Kanker Kolorektal ..........................................

Deteksi Dini Kanker Kolorektal .........................................

Diagnosis Kanker Kolorektal .............................................

Tatalaksana Kanker Kolorektal ..........................................

Komplikasi Kanker Kolorektal ...........................................

CYP A * A T>C(rs ) ..............................................

Isolasi Genom .................................................................................

Persiapan untuk Human Genomic DNA .............................

Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA ......................

Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................

Komponen dalam PCR .......................................................

Tahapan PCR ......................................................................

. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .....................

. Restriksi Endonuklease ......................................................

Prinsip deteksi RFLP ..........................................................

Analisis hasil RFLP ............................................................

Elektroforesis ..................................................................................

viii

ix

Gel Agarose ........................................................................

Kerangka Teori..........................................................................................

Kerangka Konsep ......................................................................................

Definisi Operasional..................................................................................

BAB METODE PENELITIAN .................................................................

Desain Penelitian .......................................................................................

. Lokasi dan Waktu Penelitian ....................................................................

Populasi Penelitian dan Sampel ................................................................

Populasi Target ...............................................................................

Populasi Terjangkau ........................................................................

Kriteria Pemilihan ...........................................................................

Perkiraan Besar Sampel ..................................................................

Teknik Pemilihan Sampel ...............................................................

Alat dan Bahan Uji ....................................................................................

Cara Kerja Penelitian ................................................................................

Pengumpulan Sampel ......................................................................

Isolasi DNA ....................................................................................

Optimalisasi Primer.........................................................................

Isolasi DNA ....................................................................................

Tata Kerja PCR ..............................................................................

Tata Kerja RFLP .............................................................................

Analisis Data ...................................................................................

Etika Penelitian ...............................................................................

Alur Penelitian ................................................................................

BAB HASIL DAN PEMBAHASAN .........................................................

Hasil .........................................................................................................

Data Karakteristik responden ..........................................................

Hasil Isolasi DNA Genom dan PCR dari Sel Darah .......................

Hasil analisis Genotyping PCR RFLP ............................................

Hasil PCR ...........................................................................

Hasil RFLP .........................................................................

Hasil Skrining gen CYP A * A rs (T>C) .......

. Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotyping (Homozigot murni,

Heterozigot varian, Homozigot varian) ..........................................

Pembahasan ...............................................................................................

Kelebihan Penelitian .................................................................................

Keterbatasan Penelitian .............................................................................

BAB SIMPULAN DAN SARAN ...............................................................

Simpulan ...................................................................................................

Saran ..........................................................................................................

BAB ACKNOWLEDGMENT ..................................................................

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................

LAMPIRAN ...................................................................................................

ix

x

DAFTAR GAMBAR

Gambar Struktur umum gen manusia ........................................................

Gambar Mutasi pada area splicing ............................................................

Gambar Struktur DNA eukariot dan proses splicing. Area intergenik

berada diantara gen, area exon lebih pendek daripada intron .....

Gambar Proses transkripsi dan translasi ....................................................

Gambar Tahapan perubahan sel normal menjadi sel kanker ...................

Gambar Anatomi sistem pencernaan manusia ........................................

Gambar Letak gen CYP A * A di kromosom q -qter ..................

Gambar Gambar tahapan PCR ................................................................

Gambar Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A

pada sekuens GAATTC ............................................................

Gambar Genotipe marker alel pada hasil RFLP di sebuah keluarga ......

Gambar Perbandingan hasil isolasi DNA dengan pita DNA yang baik

(a); dan pita DNA yang kabur/ smear (b) .................................

Gambar Hasil PCR ..................................................................................

Gambar Hasil RFLP ................................................................................

Gambar Hasil Skrining rs DNA Genom ..................................

Gambar Hasil Distribusi Alel ..................................................................

x

xi

DAFTAR TABEL

Tabel Konsentrasi Larutan Buffer yang Dapat Dibuat ...................................

Tabel Definisi operasional ..............................................................................

Tabel Alat dan bahan penelitian .....................................................................

Tabel Tahapan isolasi genom DNA ...............................................................

Tabel Prosedur PCR ......................................................................................

Tabel Prosedur Restriksi Enzim .....................................................................

Tabel Karakteristik jenis kelamin responden .................................................

Tabel Karakteristik usia responden ................................................................

Tabel Kategori Kemurnian DNA ...................................................................

Tabel Kategori Konsentrasi DNA Genom .....................................................

Tabel Analisis Genotyping PCR RFLP ..........................................................

Tabel Distribusi Frekuensi kategori genotyping menurut jenis kelamin .......

xi

xii

DAFTAR SINGKATAN

PCR Polymerase Chain Reaction

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SNP Single Nucleotide Polymorphysm

WHO World Health Organization

xii

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran . Lembar Persetujuan Responden ........................................................

Lampiran . Lembar Tanda Terima Komisi Etik Penelitian ..................................

Lampiran . Fragmen Primer .................................................................................

Lampiran . Alat dan Bahan Penelitian .................................................................

Lampiran . Optimalisasi Primer ...........................................................................

Lampiran . Gel Documentation Hasil Elektroforesis Agarose.............................

Lampiran . Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel ..............................

Lampiran . Hasil RFLP ........................................................................................

Lampiran . Hasil Analisis Statistik ......................................................................

Lampiran . Curiculum Vitae Peneliti .................................................................

xiii

BAB I

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kanker merupakan penyakit yang menyebabkan morbiditas dan mortalitas

di dunia, dengan perkiraan juta kasus di tahun . WHO menyatakan terjadi

juta kematian pada tahun . Jumlah kasus baru diperkirakan akan terus

meningkat sekitar selama dekade mendatang. Berdasarkan Riset

Kesehatan Dasar (Riskesdas) , prevalensi kanker di Indonesia penduduk

semua umur di Indonesia tahun sebesar atau diperkirakan sekitar

.

Kanker kolorektal (KKR) adalah keganasan ketiga yang paling sering

didiagnosa dan penyebab utama kematian keempat akibat kanker di dunia,

terdapat sekitar juta kasus baru dan hampir kematian di tahun .

Sementara itu secara jens kelamin, karsinoma kolorektal merupakan keganasan

ketiga terbanyak laki-laki ( kasus, dari total) dan kedua terbanyak

perempuan ( kasus, dari total) di dunia.

Insiden kanker kolorektal di Indonesia adalah per penduduk

usia dewasa ( per tahun, ) dan merupakan penyebab kematian nomor

dengan mortalitas , % ( pertahun) dari seluruh kasus kanker.

Kanker

kolorektal menempati urutan nomor , setelah kanker payudara dan kanker paru

di Indonesia.

Peningkatan ini diakibatkan oleh perubahan pada diet masyarakat

Indonesia, baik sebagai konsekuensi peningkatan kemakmuran serta pergeseran

ke arah pola makan orang Barat (westernisasi) yang lebih tinggi lemak serta

rendah serat.

Meskipun perkembangan pengobatan berkembang secara cepat dan sangat

maju, akan tetapi hanya sedikit saja meningkatkan harapan hidup pasien

karsinoma kolorektal bila sudah ditemukan dalam stadium lanjut. Kunci utama

keberhasilan penanganan karsinoma kolorektal adalah ditemukannya karsinoma

dalam stadium dini, sehingga terapi dapat dilaksanakan secara bedah kuratif.

Pada tindakan kuratif seperti kemoterapi, angka keberhasilannya bergantung pada

stadium kanker. Selain itu, operasi yang juga merupakan tindakan kuratif,

membutuhkan biaya pengobatan yang cukup tinggi. Oleh karena itu usaha

preventif penting dilakukan untuk mengurangi resiko terjadinya pembentukan sel

kanker, salah satunya adalah dengan melakukan skrining genetik. Hal ini penting

dilakukan mengingat perkembangan kanker kolon yang cukup cepat. Dengan

tekhnologi yang semakin modern, metode pencegahan pada tingkat genetik ini

sudah banyak digunakan para peneliti di barat maupun di Indonesia.

Sitokrom P (CYP) berperan dalam metabolisme xenobiotik, dimana

terdapat enzim metebolit fase I dan II yang berperan dalam proses detoksifikasi

dan apabila regulasinya terganggu dapat memicu karsinogenesis. -

CYP A * A

adalah variasi alel yang cukup banyak dimiliki oleh penduduk di wilayah Asia

(Jepang) daripada Kaukasia, dengan frekuensi variasi alel adalah pada

Kaukasia, pada Asia, and pada Afrika. ,

Penelitian di Jepang

ditemukan bahwa alel heterozigot dan homozigot varian untuk CYP A * A

memiliki resiko untuk terjadi kanker koloretal.

Oleh sebab itu pada penelitian ini

ingin melihat presentasi dan frekuensi gen CYP A * A rs (T>C) yang

memiliki hubungan dengan faktor resiko terjadinya kanker kolorektal.

Berdasarkan hal tersebut, peneliti ingin melakukan penelitian yang berjudul

“Gambaran Polimorfisme Gen CYP A * A rs (T>C) sebagai Faktor

Resiko Kanker Kolorektal Pada Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan

Profesi Dokter Angkatan - UIN Syarif Hidayatullah Jakarta” yang

diharapkan mampu menurunkan kejadian kanker kolon di masa yang akan datang.

Dengan melakukan penapisan gen ini, diharapkan mahasiswa dapat mengetahui

dan memperkirakan apakah berpotensi menderita kanker atau tidak dimasa akan

datang, sehingga pola makan dan kebiasaan buruk dapat diubah secara dini.

Rumusuan Masalah

Berdasarkan uraian diatas maka dapat dirumuskan masalah

- Apakah Single Nucleotide Polymorphysm (SNP) CYP A * A

rs (T>C) terdapat pada mahasiswa Program Studi Kedokteran

dan Profesi Dokter (PSKPD) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta angkatan -

Hipotesis

Didapatkan alel gen CYP A * A rs (T>C) pada mahasiswa

Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) Universitas Islam

Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan - .

Tujuan Penelitian

Tujuan Umum

Untuk melakukan screening polimorfisme gen CYP A * A rs

(T>C) menggunakan teknik PCR RFLP pada mahasiswa Program Studi

Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan - .

Tujuan Khusus

Mengidentifikasi dan mengetahui jumlah variasi gen CYP A * A

rs (T>C) sebagai salah satu faktor resiko untuk terjadinya kanker

kolorektal pada mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter

(PSKPD) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

angkatan - menggunakan teknik PCR RFLP

Manfaat Penulisan

Manfaat untuk peneliti:

- Memiliki ketrampilan dalam molekuler untuk mengetahui adanya

mutasi gen dengan teknik PCR RFLP

- Meningkatkan dan mengembangkan kemampuan berpikir dalam

menganalisis masalah-masalah pada kanker kolorektal.

- Menambah pengetahuan mengenai mutasi genotyping pada Gen

CYP A * A rs (T>C)

- Menambah wawasan mengenai pentingnya pencegahan dini

terutama pencegahan dini terhadap munculnya kanker melalui

skrining.

- Dapat memberikan edukasi tenaga kesehatan dalam menanggapi

masalah kanker kolorektal yang disebabkan mutasi gen

CYP A * A rs (T>C).

Manfaat untuk Civitas Akademika

- Sebagai sumber pengetahuan dan bahan referensi bagi peneliti

selanjutnya yang akan melakukan penelitian yang berkaitan dengan

penelitian ini.

- Bagi masyarakat, sebagai sumber informasi dalam mengatur pola

makan yang sehat dan bergizi cukup.

- Bagi mahasiswa, menambah wawasan mengenai persentase

mahasiswa yang memilki polimorfisme gen CYP A * A

rs atau tidak di masa akan datang.

- Meningkatkan kewaspadaan yang memilki faktor resiko kanker

kolorektal sehingga dapat dilakukan tindakan pencegahan berupa

melakukan pola hidup sehat pada mahasiswa.

- Memberikan informasi tentang hubungan gen dengan kemungkinan

munculnya kanker kolorektal.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Landasan Teori

Genomik

Menurut National Human Genome Research Institute, genomik merupakan

istilah yang banyak digunakan untuk menggambarkan studi tentang seluruh gen

manusia (genom), termasuk interaksi antar gen dan dengan lingkungannya.

Genomik mempelajari studi ilmiah mengenai berbagai macam penyakit yang

kmpleks, seperti penyakit jantung, asma, diabetes, dan kanker.

Menurut WHO,

genomik didefinisikan sebagai studi tentang gen dan fungsi mereka, dan teknik

terkait.

Sementara itu kedokteran genomik adalah salah satu disiplin ilmu

kedokteran yang menyediakan informasi genomik tentang individu sebagai bagian

dari perawatan medis (misalnya, untuk menentukan diagnostik atau terapeutik

yang akan dipilih) dan hasil keluarannya dan kebijakan yang diambil berguna

dalam klinis. Pengobatan genomik memiliki dampak di bidang onkologi,

farmakologi, penyakit yang langka dan tidak terdiagnosis serta penyakit

menular.

Gambar Struktur umum gen manusia

Pada sel eukariot, gen terdiri dari:

. Domain regulasi inisiasi transkripsi,

Inisiasi transkripsi adalah area yang mengatur awal mula dari transkripsi

yang terdiri antara lain dari deret GCCACACCC, ATGCAAAT, kotak GC,

kotak CCAAT dan kotak TATA.

. Intron (intragenic)

Pada genom manusia terdapat banyak gen yang mengkode berbagai macam

protein dan juga area non-koding. Area non-koding tersebut disebut dengan

intron. Intron awalnya ditrasnkripsi menjadi iRNA di dalam inti tetapi tidak

hadir dalam mRNA matang di sitoplasma.

Intron merupakan mRNA yang

akan tetap berada di dalam nukleus karena kemungkinan mRNA tersebut

akan membentuk protein yang tidak fungsional (tidak berguna) jika

ditranslasikan. Intron kemudian akan terurai kembali untuk membentuk rantai

mRNA baru. Dengan demikian, informasi dari urutan intron tidak terwakili

dalam produk protein akhir.

. Ekson

Ekson merupakan area koding yang mengkode produk akhir protein.

Ekson merupakan mRNA yang akan dikirim keluar nukleus untuk

ditranslasikan. Mutasi pada area ekson maupun intron dapat mempengaruhi

hasil akhir dari mutasi tersebut, karena area ekson dan intron berpengaruh

secara langsung terhadap pembentukan protein.

Contoh pada kelainan

tersebut adalah β-talasemia.

Gambar Mutasi pada area splicing

. Domain regulasi akhir transkripsi

Area Intergenik

Area intergenik adalah urutan DNA yang berada di antara gen.

Daerah

intergenik adalah area noncoding DNA. Terkadang beberapa DNA intergenik

berfungsi untuk mengontrol gen di dekatnya, namun sebagian besar fungsinya

belum yang diketahui, sehingga kadang-kadang disebut sebagai DNA sampah

(junk DNA). fragmen DNA di daerah intergenik juga disebut sebagai "dark

matter" atau "dark matter transcripts".

Pada area ini mengandung bagian yang

penting seperti promoters dan enhancers. Regio intergenik mengandung gen yang

belum bisa diidentifikasi seperti noncoding RNA. ,

Pada manusia area

intergenik terdiri dari sekitar genom, sedangkan pada bakteri hanya sekitar

dan pada ragi sekitar . Mutasi pada daerah intergenik embC-embA

berkontribusi terhadap resistensi Mycobacterium tuberculosis terhadap

ethambutol.

Gambar Struktur DNA eukariot dan proses splicing. Area intergenik berada

diantara gen, area exon lebih pendek daripada intron

Single Nucleotide Polymophysm

Polimorfisme nukleotida tunggal atau Single Nucleotide Polymophysm,

sering disebut SNP (diucapkan “snips”) adalah sebuah perubahan komposisi

nukelotida di sekuens DNA pada satu posisi tertentu, dimana ini adalah jenis yang

paling umum dari variasi genetik pada seorang individu. Setiap SNP merupakan

perbedaan dalam sebuah blok bangunan DNA tunggal, yang disebut nukleotida.

Misalnya, SNP dapat menggantikan sitosin nukleotida (C) dengan timin

nukleotida (T) di hamparan tertentu DNA. SNP terjadi secara normal di seluruh

DNA seseorang.

SNP terjadi sekali dalam setiap nukleotida, yang berarti ada sekitar

juta SNP dalam genom manusia. Paling umum, variasi ini ditemukan dalam DNA

antar gen. Mereka dapat bertindak sebagai penanda biologis, membantu para

ilmuan menemukan gen yang berhubungan dengan penyakit. Ketika SNP terjadi

dalam gen atau intragenic region, mereka dapat memainkan peran lebih langsung

dalam penyakit dengan mempengaruhi fungsi gen.

Kebanyakan SNP tidak berpengaruh pada kesehatan atau perkembangan.

Namun polimorfisme genetik ini, telah terbukti sangat penting dalam studi

kesehatan manusia. Para peneliti telah menemukan SNP yang dapat membantu

memprediksi respon seseorang terhadap obat tertentu, kerentanan terhadap faktor

lingkungan seperti racun dan resiko perkembangan penyakit tertentu. SNP juga

dapat digunakan untuk melacak pola pewarisan gen penyakit dalam keluarga.

Pada penelitian selanjutnya merupakan identifikasi SNP yang berkaitan dengan

penyakit kompleks seperti penyakit jantung, diabetes, dan kanker.

Ekspresi Gen

Informasi genetik akan mengkode pembentukan protein sehingga terbentuk

polipeptida melalui beberapa tahapan. Awal mula transkripsi sebuah gen

dipengaruhi promoter dan regulator lainnya. Faktor transkripsi yang merupakan

protein spesifik, akan berinteraksi dengan urutan area spesifik di dalam wilayah

tersebut dan menentukan pola ekspresi gen.

Transkripsi gen dimulai pada area awal transkripsi pada DNA kromosom

yang disebut transcribed but untranslated region ( UTR). Kemudian

terbentuklah beberapa pasang basa termasuk melalui intron dan ekson, serta

berujung pada akhir rangkaian pengkodean. Setelah ujung RNA primer 'dan

'dimodifikasi , bagian intron dikeluarkan dan bagian ekson disambung menjadi

satu. Setelah penyambungan RNA, maka terbentuklah mRNA (mengandung

segmen inti yang saling terkait dengan pengkodean gen) lalu dipindahkan dari

nukleus ke sitoplasma, di mana mRNA akhirnya diterjemahkan ke dalam urutan

asam amino sehingga membentuk polipeptida. Setiap langkah dalam jalur

kompleks tersebut dapat terganggu. Hal tersebut dapat berupa mutasi yang bisa

berakibat pada beberapa kelainan genetik yang diwariskan.

Gambar Proses transkripsi dan translasi

Kanker

Kanker adalah salah satu penyakit genetik yang disebabkan oleh

perubahan/ mutasi genetik yang mengontrol fungsi sel, terutama pertumbuhan dan

pembelahan. Mutasi tersebut akan mengakibatkan perubahan sifat dasar sel yang

disertai dengan kerusakan gen regulator sel normal dalam tubuh.

Kerusakan/

mutasi genetik non lethal pada sel normal ini dapat diakibatkan oleh pengaruh

lingkungan, seperti: zat kimia, radiasi, virus atau sel germinal yang kemudian

diwariskan.

Gen regulator sel normal adalah gen yang menjadi sasaran

kerusakan sehingga menimbulkan perubahan sifat dasar sel, diantaranya:

. Gen Proto-oncogen yakni gen yang berfungsi dalam mendorong

pertumbuhan.

. Gen supresi tumor yakni gen yang menghambat pertumbuhan

(anti-onkogen).

. Gen Apoptosis yakni gen yang mengatur kematian sel secara

terencana (programmed cell death).

. Repairing Gene yakni gen yang mengatur perbaikan DNA yang

rusak, biasanya berkaitan dengan karsinogenesis.

Kerusakan gen tersebut menyebabkan aktivasi onkogen pendorong

pertumbuhan, perubahan gen yang mengendalikan pertumbuhan, dan

penonaktifan gen supressor kanker. Sehingga mengakibatkan ekspresi gen yang

mengalami perubahan dan hilangnya produk gen regulatorik yang berujung pada

peningkatan mutasi sehingga terbentuk sel baru yang abnormal.

Tidak semua sel baru tersebut membentuk kanker. Namun jaringan

abnormal yang terbentuk dapat berubah menjadi hiperplasia dan displasia.

Hiperplasia adalah sel normal yang mengalami pertumbuhan yang cepat.

Sementara displasia adalah tingkat lanjut dari hiperplasia, dimana sel dalam

jaringan tersebut mengalami perubahan yang abnormal. Pada kondisi lebih lanjut

sel ini berpotensi berkembang menjadi kanker.

Gambar . Tahapan perubahan sel normal menjadi sel kanker

Kanker ganas ini berbeda dengan sel normal pada umumnya karena

memiliki sifat:

. Self-sufficiency (menghasilkan sendiri sinyal pertumbuhan),

. Tidak sensitf terhadap sinyal penghambat pertumbuhan

. Menghindari apoptosis

. Potensi replikasi tanpa batas (proliferasi tanpa batas yang berkaitan

dengan dipertahankannya panjang dan fungsi telomer)

. Angiogenesis berkepanjangan (pertumbuhan pembuluh darah yang

diinduksi oleh berbagai faktor seperti VEGF, faktor pertumbuhan

endotel vaskuler)

. Kemampuan menginvasi dan metastasis meningkat.

Selama ini untuk penatalaksanaan dari kanker adalah dengan memberikan

suatu zat yang dapat menginduksi kematian dari sel kanker sendiri. Tetapi tak

dapat dipungkiri, dengan memberikan zat pemicu kematian sel kanker ini bukan

hanya sel kanker saja yang mengalami kematian tetapi sel-sel normal ditubuh juga

ikut mendapatkan dampaknya, hal ini dikarenakan zat yang digunakan tidak

memiliki sifat selektif dalam membunuh sel kanker.

Kanker Kolorektal

Anatomi Kolorektal

Usus besar adalah bagian dari sistem pencernaan. Sebagaimana kita ketahui

sistem pencernaan dimulai dari mulut lalu esofagus, gaster, usus halus yang terdiri

dari duodenum, yeyunum, ileum, dilanjutkan dengan usus besar yang terdiri dari

sekum, apendiks, rektum dan dubur. Sekum membentuk kantong buntu dibawah

pertemuan antara usus halus dan usus besar di katup iliosekum. Tonjolan kecil

seperti jari di dasar sekum adalah apendiks, suatu jaringan limfoid yang

mengandung limfosit. Kolon membentuk sebagian besar usus besar. Kolon terdiri

dari kolon asenden, kolon transversum, kolon desenden. Bagian terakhir kolon

desenden berbentuk huruf S dan membentuk kolon sigmoid dan kemudian

melurus untuk membentuk rektum.

Gambar Anatomi sistem pencernaan manusia

Pengertian Kanker Kolorektal

Kanker kolon dan rektum (KKR) adalah keganasan yang berasal dari

jaringan usus besar, terdiri dari kolon (bagian terpanjang dari usus besar) dan/atau

rektum (bagian kecil terakhir dari usus besar sebelum anus). Tumor berupa massa

polipoid, besar, tumbuh ke dalam lumen, dan dengan cepat meluas ke sekitar usus

sebagai striktura anular (mirip cincin). Lesi anular lebih sering terjadi pada bagian

rektosigmoid, sedangkan lesi polipoid yang datar sering terjadi pada sekum dan

kolon ascendeen. Secara histologis, hampir semua kanker usus besar adalah

adenokarsinoma (terdiri atas epitel kelenjar) dan dapat menyekresi mukus yang

jumlahnya berbeda-beda.

Faktor Resiko Kanker Kolorektal

Kanker kolorektal timbul melalui interaksi yang kompleks antara faktor

genetik dan faktor lingkungan. Faktor lingkungan multipel beraksi terhadap

predisposisi genetik atau defek yang didapat dan berkembang menjadi KKR.

Faktor tidak dapat dimodifikasi:

. genetik

. riwayat kanker kolorektal atau polip adenoma individual dan keluarga.

. riwayat individual penyakit kronis inflamatori pada usus (kolitis

ulserative.

Faktor risiko yang dapat dimodifikasi, yang berhubungan dengan peningkatan

insiden kanker kolorektal:

. inaktivitas

. obesitas

. diet tinggi lemak, protein, kalori, dan daging merah, rendah serat

. merokok

. konsumsi alkohol moderat-sering.

Selain itu terdapat pula faktor protektif yang dapat mengurangi resiko terjadinya

kanker kolorektal

. aktivitas fisik

. diet tinggi serat

. asupan vitamin D, E dan asam folat.

. kalsium

. NSAID (piroksikam, sulindak dan aspirin dapat mencegah

terbentuknya adenoma atau menyebabkan regresi polip adenoma pada

FAP sehingga dapat menekan kekambuhan)

. ERT (estrogen replacement therapy) menurunkan risiko KKR dan

fraktur pelvis, akan tetapi manfaat ini diikuti efek yang tidak baik

yaitu meningkatnya penyakit jantung koroner, stroke, emboli paru dan

kanker payudara invasif

. kolonoskopi (pengangkatan polip adenomatosa dapat mengurangi

risiko kejadian kanker kolorektal)

Patogenesis Kanker Kolorektal

Interaksi faktor genetik dan lingkungan yang cukup kompleks akan dapat

memicu terjadinya kanker kolorektal. Berkurangnya kandungan serat

menyebabkan berkurangnya massa tinja, meningkatnya waktu transit di usus, dan

berubahnya fora bakteri usus. Oleh karena itu, konsentrasi produk-produk

sampingan penguraian oksidatif karbohidrat oleh bakteri berpotensi toksik

meningkat di tinja dan berkontak lebih lama dengan mukosa kolon. Selain itu,

asupan kolesterol yang tinggi dalam daging merah meningkatkan sintesis asam

empedu oleh hati, yang pada gilirannya mungkin diubah menjadi karsinogen oleh

bakteri usus.

Terdapat kelompok KKR berdasarkan perkembangannya yaitu:

. kelompok yang diturunkan (inherited) yang mencakup kurang dari dari

kasus KKR;

. kelompok sporadik, yang mencakup sekitar ;

. kelompok familial, mencakup .

Kelompok diturunkan adalah mereka yang dilahirkan sudah dengan mutasi

germline (germline mutation) pada salah satu alel dan terjadi mutasi somatik pada

alel yang lain. Contohnya adalah FAP (Familial Adenomatous Polyposis) dan

HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer). HNPCC terdapat pada

sekitar dari kanker kolorektal. Kelompok sporadik membutuhkan dua mutasi

somatik, satu pada masing masing alelnya. Kelompok familial tidak sesuai

kedalam salah satu dari dominantly inherited syndromes diatas (FAP & HNPCC)

dan lebih dari terjadi pada umur muda. Meskipun kelompok familial dari

KKR dapat terjadi karena kebetulan saja, akan tetapi faktor lingkungan, penetrant

mutations yang lemah atau currently germline mutations dapat berperan.

Terdapat model perjalanan perkembangan KKR (karsinogenesis) yaitu

LOH (Loss of Heterozygocity) dan RER (Replication Error). Model LOH

mencakup mutasi tumor gen supresor meliputi gen APC, DCC dan p- serta

aktifasi onkogen yaitu K-ras. Model ini contohnya adalah perkembangan polip

adenoma menjadi karsinoma. Sementara model RER karena adanya mutasi gen

hMSH , hMLH , hPMS , hPMS . Model terakhir ini contohnya adalah

perkembangan HNPCC. Pada bentuk sporadik, berkembang lewat model

LOH dan berkembang lewat model RER.

Mutasi Pada Gen K-RAS

Perubahan genetik dan epigenetika sangat berperan penting dalam

perubahan sel epitel normal hingga terjadinya metastasis. Perubahan genetika ini

biasanya terjadi melalui dua jalur: Chromosomal instability (CIN), dan

Microsatellite instability (MIN), sedangkan perubahan epigenetika terlihat degan

ditemukannya CIMP (CpG Island Methylator Phenotype). Chromosomal

instability yang salah satunya disebabkan oleh mutasi pada gen-gen tertentu

seperti APC, K-RAS, dan p berperan dalam kasus kanker kolorektal yang

bersifat sporadis. Salah satu mutasi yang sering ditemui pada jaringan kanker

kolorektal adalah mutasi pada gen K-RAS terutama pada kodon dan .

Gen RAS terdiri dari famili yaitu H-RAS, K-RAS, dan N-RAS. Yang

menghasilkan macam protein serupa yang memiliki ukuran berkisar Kd. Gen

RAS ini pada dasarnya berperan dalam menghasilkan protein yang mengikat dan

menghidrolisis GTP. Protein-protein yang dihasilkan ini bekerja debagai mediator

dalam transduksi signal ekstraseluler seperti growth factor, sitokin, dan hormon

menuju sitoplasma dan nukleus. Dalam hal ini, protein tersebut berperan penting

dalam proses pertumbuhan, diferensiasi, dan apoptosis sel. Mutasi yang spesisfik

pada gen RAS akan menyebabkan perubahan formasi dari protein yang dihasilkan

sehingga membuat protein RAS (GTPase) selalu aktif. Hal ini menyebabkan

trasnduksi signal ekastraseluler terganggu sehingga akan mengganggu proliferasi

sel yang terjadi.

Pada kanker kolon, lebih dari mutasi yang terjadi pada gen RAS adalah

gen K-RAS. Mutasi K-RAS umumnya dijumpai pada kodon , dan .

Namun mutasi pada kodon lebih jarang ditemui. Mutasi gen K-RAS terjadi

pada - kasus kanker kolorektal.

Mutasi gen KRAS kodon pada

adenocarcinoma colorectal di Rumah Sakit Dr. Soetomo Surabaya sebanyak

.

Konsekuensi mutasi pada gen K-RAS adalah penyandian protein K-RAS

yang akan selalu aktif, terlepas ada tidaknya hambatan pada EGFR. Dengan kata

lain, sel kanker yang memiliki mutasi pada K-RAS akan tetap mampu

berproliferasi dan akan resisten dengan terapi antibodi monoklonal anti-EGFR.

Mutasi pada gen K-RAS dapat dideteksi menggunakan PCR yang diikuti oleh

sekuensing DNA, atau dengan menggunakan Alelle Spesific Real Time PCR

maupun Restriction Fragment Lengh Polymorphisme (RFLP) PCR.

Deteksi Dini Kanker Kolorektal

Tujuan skrining kanker kolorektal adalah deteksi dini, membuang lesi pre-

kanker dan mendeteksi penyakit pada stadium dini sehingga dapat dilakukan

terapi kuratif. Indikasi pemeriksaan dini atau skrining kanker kolorektal adalah

individu dengan risiko sedang dan risiko tinggi. Yang termasuk risiko sedang

adalah:

. Individu berusia tahun atau lebih;

. Individu yang tidak mempunyai riwayat kanker kolorektal atau

inflammatory bowel disease

. Individu tanpa riwayat keluarga kanker kolorektal;

. Individu yang terdiagnosis adenoma atau kanker kolorektal setelah berusia

tahun.

Yang termasuk risiko meningkat atau risiko tinggi adalah:

. Individu dengan riwayat polip adenomatosa;

. Individu dengan riwayat reseksi kuratif kanker kolorektal;

. Individu dengan riwayat keluarga tingkat pertama kanker kolorektal atau

adenoma kolorektal (rekomendasi berbeda berdasarkan umur keluarga saat

diagnosis);

. Individu dengan riwayat inflammatory bowel disease yang lama;

. Individu dengan diagnosis atau kecurigaan sindrom hereditary

nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) atau sindrom Lynch atau

familial adenomatous polyposis (FAP).

Selain itu dapat pula dilakukan pemeriksaan dini pada populasi. Pilihan

pemeriksaan skrining ditentukan berdasarkan risiko individual, pilihan individual

dan akses. Pada orang dewasa dengan risiko sedang, skrining harus dimulai pada

individu berusia tahun dengan pilihan berikut:

. Colok dubur

. FOBT atau FIT setiap tahun

. Sigmoidoskopi fleksibel setiap tahun

. Kolonoskopi setiap tahun

. Barium enema dengan kontras ganda setiap tahun

. CT kolonografi setiap tahun

Deteksi dini pada individual dengan risiko meningkat dan risiko tinggi

Rekomendasi skrining pada individual dengan risiko meningkat dibagi

menjadi :

. Pasien dengan riwayat polip pada kolonoskopi sebelumnya,

. Pasien dengan kanker kolorektal,

. Pasien dengan riwayat keluarga.

. Diagnosis Kanker Kolorektal

Berikut ini adalah gejala dan tanda yang menunjukkan nilai prediksi tinggi

akan adanya KKR. Keluhan utama dan pemeriksaan klinis:

- Perdarahan per-anum disertai peningkatan frekuensi defekasi dan/atau

diare selama minimal minggu (semua umur)

- Perdarahan per-anum tanpa gejala anal (di atas tahun)

- Peningkatan frekuensi defekasi atau diare selama minimal minggu (di

atas tahun)

- Massa teraba pada fossa iliaka dekstra (semua umur)

- Massa intra-luminal di dalam rectum

- Tanda-tanda obstruksi mekanik usus.

- Setiap pasien dengan anemia defisiensi Fe (Hb < g% untuk laki-laki atau

< g% untuk perempuan pascamenopause)

Pemeriksaan colok dubur

Pemeriksaan colok dubur dilakukan pada setiap pasien dengan gejala ano-

rektal. Pemeriksaan ini bertujuan untuk menetapkan keutuhan sfingter ani dan

menetapkan ukuran dan derajat fiksasi tumor pada rektum tengah dan distal.

Pada pemeriksaan colok dubur ini yang harus dinilai adalah:

- Keadaan tumor: Ekstensi lesi pada dinding rektum serta letak bagian

terendah terhadap cincin anorektal, cervix uteri, bagian atas kelenjar

prostat atau ujung os coccygis.

- Mobilitas tumor: untuk mengetahui prospek terapi pembedahan.

- Ekstensi dan ukuran tumor dengan menilai batas atas, bawah, dan sirkuler.

Pemeriksaan penunjang

. Endoskopi

Endoskopi merupakan prosedur diagnostik utama dan dapat dilakukan

dengan sigmoidoskopi (> tumor terletak di rektosigmoid) atau dengan

kolonoskopi total.

. Enema barium dengan kontras ganda

. CT colonography (Pneumocolon CT)

Modalitas CT yang dapat melakukan CT kolonografi dengan baik

adalah modalitas CT scan yang memiliki kemampuan rekonstruksi

multiplanar dan D volume rendering. Kolonoskopi virtual juga

memerlukan software khusus.

Tatalaksana Kanker Kolorektal

Penatalaksanaan kanker kolorektal bersifat multidisiplin. Pilihan dan

rekomendasi terapi tergantung pada beberapa faktor Terapi bedah merupakan

modalitas utama untuk kanker stadium dini dengan tujuan kuratif. Kemoterapi

adalah pilihan pertama pada kanker stadium lanjut dengan tujuan paliatif.

Radioterapi merupakan salah satu modalitas utama terapi kanker rektum. Saat ini,

terapi biologis (targeted therapy) dengan antibodi monoklonal telah berkembang

pesat dan dapat diberikan dalam berbagai situasi klinis, baik sebagai obat tunggal

maupun kombinasi dengan modalitas terapi lainnya.

. Komplikasi dan Prognosis Kanker Kolorektal

Tumor dapat menyebar ( ) melalui inflitrasi langsung ke struktur

berdekatan, seperti ke dalam kandung kemih, ( ) melalui pembuluh limfe ke

kelenjar limfe perikolon dan mesokolon; dan ( ) melalui aliran darah, biasanya ke

hati karena kolon mengalirkan darah ke sistem portal.

Kanker kolon memiliki sifat seperti kanker yang lain yakni: dapat tumbuh

dengan relatif cepat, dapat menginfiltrasi ke jaringan di sekitarnya kemudian

merusaknya, yang pada akhirnya dapat menyebabkan kematian bila tidak

ditangani dengan baik. Namun prognosis relatif baik bila lesi terbatas pada

mukosa dan submukosa pada saat reseksi, dan jauh lebih buruk bila telah terjadi

metastasis ke kelenjar limfe.

CYP A * A T>C(rs )

Sitokrom P (CYP) merupakan keluarga besar enzim berjenis

hemeprotein yang berfungsi sebagai katalis oksidator pada lintasan metabolisme

steroid, asam lemak, xenobiotik, termasuk obat, racun dan karsinogen.

CYP

adalah enzim metabolit fase I dimana substrat teroksidasi.

Enzim metabolit fase

II sering menggunakan oksigen dalam metabolismenya, sehingga produk dapat

dibuang, dengan demikian terjadilah proses detoksifikasi, misal: Glutathinone S-

transferase dan N-acetyltransferase.

Oleh karena itu, dalam situasi ini,

regulasi gen CYP mungkin sangat protektif terhadap karsinogenesis.

Polimorfisme genetik yang cukup tinggi pada sitokrom P dapat

mempengaruhi kemampuan metabolik sehingga dapat menyebabkan perbedaan

kerentanan terhadap kanker kolorektal.

Salah satu polimorfisme CYP adalah CYP A yang terletak pada lengan

panjang kromosom q -qter.

CYP A diaktivasi dengan cara mengoksidasi

polutan seperti PAH menjadi karsinogen.

CYP A adalah salah satu gen yang

paling banyak diteliti karena perannya yang sangat penting dalam bioaktivasi

berbagai jenis zat eksogen terhadap turunan karsinogeniknya.

Selain itu

CYP A banyak terdapat di usus besar.

Gambar . Letak gen CYP A * A (rs ) di kromosom q -qter

Polimorfisme CYP A * A telah dikaitkan dengan peningkatan aktivitas

katalitik. Sehingga dengan demikian, individu yang memiliki variasi alel

CYP A * A diduga menunjukkan tingkat aktivasi karsinogen yang tinggi.

CYP A * A adalah variasi alel yang cukup banyak dimiliki oleh penduduk di

wilayah Asia (Jepang) daripada Kaukasia.

Variasi genetik CYP A * A sekitar

kali lebih sering di Jepang daripada di Kaukasia.

Frekuensi variasi alel

adalah pada Kaukasia, pada Asia, and pada Afrika.

Penelitian pada populasi Saudi Arabia menunjukkan bahwa varisi alel

CYP A * A secara signifikan dikaitkan dengan dengan kejadian kanker

kolorektal. Penelitian ini menunjukkan bahwa tingkat ekspresi gen CYP A

empat kali lebih tinggi pada kanker kolorektal dibandingkan dengan jaringan

normal yang menjadi kontrol yang diukur dengan qPCR. Hal tersebut

menunjukkan bahwa tingkat mRNA yang tinggi pada CYP A di jaringan tumor

dibandingkan dengan jaringan normal. Temuan tersebut dikonfirmasi oleh studi

imunohistokimia dengan menggunakan antibodi anti-sitokrom P A

sehingga dapat dilihat bahwa jaringan kanker usus besar mengekspresikan protein

CYP A lebih banyak.

Pada penelitian di Turki dapat diketahi bahwa CYP A * A T/C

(rs ) secara signifikan diikuti dengan faktor resiko kanker kolorektal

dimana pasien yang memiliki alel C memiliki resiko yang lebih tinggi untuk

terkena penyakit kanker kolorektal dibandingkan alel T.

Pada penelitian di

Jepang, seseorang yang tidak merokok maka genotip CYP A * A T/C

dibandingkan dengan T/T maka memiliki peningkatan resiko sebesar x untuk

terjadinya kanker kolorektal, sementara untuk C/C tidak ada peningkatan yang

cukup signifikan. Pada penelitian ini juga ditemukan bahwa alel heterozigot untuk

CYP A * A memiliki resiko yang paling besar untuk terjadi kanker koloretal.

CYP A * A T/C dan NAT memiliki efek yang signifikan untuk terjadinya

kanker kolorektal pada seseorang yang tidak merokok dibandingkan polimorfisme

gen yang lainnya (CYP A * C, CYP A * C, CYP A * F, GTSM ).

Sehingga CYP A * A T/C dan NAT berpotensi sebagai biomarker genetik.

Penelitian di Turki dan Jepang menunjukkan tidak ada perbedaan yang

signifikan antara seseorang yang menderita kanker kolorektal dan seseorang yang

sehat jika dilihat dari usia dan jenis kelamin.

Empat penelitian yang dilakukan

di populasi Asia diketahui bahwa pembawa alel C dari CYP A * A memiliki

kali peningkatan risiko kanker kolorektal dibandingkan dengan pembawa

alel T.

Pada studi variasi genetik, genetik yang berhubungan dengan

polimorfisme CYP A * A dan CYP A * C memberikan kali lipat

peningkatan aktivitas katalitiknya.

Namun, tidak semua penelitian menunjukkan bahwa terdapat hubungan

yang signifikan antara polimorfisme CYP A * A dengan kejadian kanker

kolorektal. CYP A * A tidak terkait dengan perkembangan kanker kolorektal di

Inggris, Kaukasia, Lebanon, Skotlandia dan kulit putih non-Hispanik lainnya. -

Polimorfisme genetik individu dalam metabolisme karsinogen mungkin tidak

secara signifikan terkait dengan kanker kolorektal. Namun, mereka mungkin

memiliki peran penting pada individu yang terpapar dengan karsinogen, seperti

. polutan pada lingkungan

. hormon steroid.

. geografis.

. pola makan.

Isolasi Genom

. Persiapan untuk Human Genomic DNA

Secara umum, sekitar % DNA terdapat di dalam nukleus (kromosom).

Pada studi genetika, isolasi DNA lebih banyak berasal dari sel darah tepi. Namun

karena prosedurnya yang invasif, sulit untuk memperoleh sampel dari teknik

tersebut. Sumber DNA lain dapat berasal dari sel mukosa pipi yang diperoleh

dengan pencucian mulut menggunakan salin (teknik yang non invasif dan tidak

menyebabkan perdarahan). Isolasi DNA dari sel bucal lebih murah dan

membutuhkan jumlah yang sedikit, dan dapat disimpan dalam waktu yang lama.

Teknik lain menggunakan folikel rambut dan biasa digunakan sebagai teknik

investigasi pada kasus kriminal. Sampel yang berasal dari urin bermanfaat dalam

mendeteksi kasus doping dan drug screening test. Tujuan dari isolasi DNA adalah

mengisolasi dan mempurifikasi berat DNA dalam jumlah yang banyak. Berikut

ini beberapa tahapan dalam purifikasi DNA.

a. Cell breakage (pemecahan sel)

Pemecahan sel merupakan langkah awal dalam purifikasi DNA.

Teknik ini dapat membuka sel dan memperoleh DNA yang intak

menggunakan bahan kimia berupa detergen dan / prosedur enzmatis.

Detergen dapat melarutkan asam lemak membran sel dan mengakibatkan sel

lisis. Detergen juga memiliki efek inhibitor terhadap seluruh DNAse enzim

selular dan dapat mendenaturasi peotein, dengan demikian membantu dalam

membersihkan protein dari larutan tersebut.

b. Removal of protein ( Membuang protein)

Langkah kedua dalam purifikasi adalah membuang kontaminan

berupa protein dari sel lisis. Prosedur ini disebut dengan deproteinisasi.

Prinsip kerja prosedur ini bergantung pada perbedaan bentuk fisik antara

asam nukleat dan protein. Perbedaan ini terletak pada kelarutan, volume

spesifik parsial, sensitivitas terhadap enzim pencernaan.

Deproteinisasi menggunakan pelrut orgenik merupakan cara yang

umum digunakan. Asam nukleat merupakan molekul hidrofilik yang sangat

mudah larut di dalam air. Sedangkan protein, mengandung banyak residu

hidrofobik yang menyebabkan protein secara parsial larut di dalam pelarut

organik. Pelarut organik biasanya mengandung fenol dan kloroform.

Metode yang menggunakan fenol sebagai agen deproteinisasi dikenalkan

oleh Kirby ( ), sehingga dikenal sebagai Metode Kirby. Penggunaan

campuran kloroform isoamil alkohol dikenalkan oleh Marmur, sehingga

dikenal Metode Marmur. Metode ini mendasari banyak modifikasi dan

pengembangan dari waktu ke waktu.

Penggunaan fenol pada metode Kirby memiliki beberapa prinsip.

Fenol pada suhu ruang akan membentuk suspensi yang mengandung

butiran-butiran fenol tersebar di dalam molekul air. Molekul protein secara

umum mengandung banyak residu hidrofobik, yang mana terkonsentrasi di

bagian tengah molekul. Ketika protein bercampur dengan fenol dalam

volume yang sama, beberapa molekul fenol akan terlarut dalam fase cair

(kurang lebih air dan fenol). Sehingga fenol dapat menembus

masuk ke dalam protein, menyebabkan protein membengkak dan rusak.

Protein yang telah terdenaturasi akan larut di dalam fenol. Sehingga tersisa

asam nukleat. Asam nukleat tidak memiliki molekul yang bersifat

hidrofobik sehingga tidak larut di dalam fenol.

Kekurangan metode Kirby adalah produk oksidasi dari fenol dapat

bereaksi secara kimia dengan molekul DNA (dan RNA). Fenol juga sangat

toksik dan membutuhkan prosedur pembuangan. Untuk mengurangi efek

tersebut, beberapa modifikasi yang dapat dilakukan sebagai berikut:

- Menggunakan detergen ionik

- Menggunakan reaksi enzimatis untuk membuang protein sebelum

ekstraksi fenol. Hal tersebut menurunkan kebutuhan fenol yang akan

digunakan. Sehingga kemungkinan hilangnya molekul DNA dapat

diturunkan.

- Menambahkan -hydroxyquinoline ( HQ) ke dalam fenol. HQ

meningkatkan kelarutan fenol di dalam air. Dengan adanya senyawa

ini, fenol dapat diencerkan pada suhu ruang dengan air. HQ juga

mudah teroksidasi sehingga memegang peranan penting dalam anti-

oksidan, menjaga fenol mengalami oksidasi. Bentuk dari HQ

berwana kuning dan saat teroksidasi menjadi tidak berwarna, hal ini

merupakan indikator yang baik yang dapat terlihat.

Penggunaan dari metode Marmur berdasarkan pada karakteristik dari

pelarut organik. Kloroform tidak larut dalam air dan meskipun banyak

ekstraksi tidak mengakibatkan hilangnya DNA ke dalam fase organik.

c. Removal of RNA (Membuang RNA)

Prinsip pembersihan RNA dari DNA menggunakan rekasi enzimatik.

Konsekuensi dari prosedur ini tidak dapat membuang semua RNA secara

bersih. Prosedur ini menggunakan dua ribonuklease, yaitu ribonuklease A

dan ribonuklease TI.

Ribonuklease A (RNase A) merupakan endoribonuklease yang dapat

memotong RNA setelah residu C dan U. Reaksi tersebut menghasilkan

oligonukleotida yang diakhiri dengan ’-phosphorylated pyrimidine

nucleotide. Ribonuklease TI (RNase TI) memotong dsRNA dan ssRNA

setelah residu G, menghasilkan oligonukleotida yang diakhiri dengan ’-

phosphorilated guanosine nucleotide. Karena kedua enzim tersebut spesifik

terhadap RNA, penggunaan kedua enzim tersebut dalam RNA removal pada

sampel DNA sangat direkomendasikan. Penggunaan hanya salah satu enzim

akan menghasilkan DNA yan terkontaminasi dengan oligonukleotida dalam

jumlah yang banyak. Sehingga dapat mengganggu pembacaan

spektrofotometri.

d. Concentrating the DNA (pemekatan DNA)

DNA didapatkan dengan cara pengendapan menggunakan alkohol.

Dalam prosedur ini digunakan dua macam alkohol yakni ethanol dan

isopropanol. Pengendapan menggunakan alcohol berdasarkan pada

fenomena penurunan kelarutan asam nukleat di dalam air. Kutub positif air

berinteraksi secara kuat dengan kutub negatif kelompok fosfodiester DNA.

Interaksi ini menyebabkan DNA larut dalam air. Sedangkan ethanol tidak

dapat berinterkasi dengan kutub negatif DNA seperti air. Sehingga asam

nukleat tidak larut dalam ethanol.

Penggantian molekul air di dalam DNA dapat menyebabkan

DNA mengendap. Untuk mengendapkan DNA dengan konsentrasi ethanol

yang rendah, aktivitas dari molekul air harus diturunkan. Hal ini dapat

dilakukan dengan cara menambahkan garam di dalam larutan DNA.

e. Determination of the Purity and quantity of DNA (Pengukuran kemurnian dan

jumlah konsentrasi DNA)

Untuk mengukur kemurnia DNA hasil isolasi, dapat dilakukan

pembacaan dengan alat spektofotometer menggunakan cahaya ultraviolet

(UV). Keberadaan kontaminan berupa protein dapat diketahui dari rasio nilai

optical density (OD) hasil isolasi pada panjang gelombang nm dan

nm. Hasil isolasi dinyatakan murni bila nilai rasio A : A adalah .

Jika rasio kurang dari , maka konsentrasi DNA dapat dihiung dengan

menggunakan rumus sebagai berikut.

N(μg ml-

) = A – A

A dan A merupakan daya serap DNA pada panjang gelombang

nm dan nm. Indikator yang lebih baik untuk kemurnian sampel DNA

adalah rasio A : A . DNA memiliki daya serap minimum pada nm

dan daya serap protein tinggi pada nm. Rasio A : A merupakan

indikator yang sangat sensitif untuk menentukan kontaminasi protein. Rasio

antara - menunjukkan asam nukleat yang murni. A dan A

merupakan daya serap sampel DNA pada panjang gelombang nm dan

nm. Dengan menggunakan kedua panjang gelombang tersebut, konsentrasi

DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut.

N(μg ml-

) = A – A

Identifikasi kontaminasi memiliki makna tertentu. Jika rasion

rendah, maka terdapat kontaminan yang diserap pada gelombang . Hal

tersebut bisa disebabkan oleh fenol atau reagen lain pada protokol dan

konsentrasi asam nukleat yang sangat rendah sekali (< ng/uL). Meskipun

kualitas DNA merupakan hal penting, namun bergantung kembali pada teknik

apa yang digunakan.

. Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA

Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain

dengan cara diekstraksi atau dilisiskan, biasanya dilakukan dengan homogenisasi

dengan penambahan bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak.

Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang

murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform dan isoamil alkohol. Proses

selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan

yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain, termasuk

debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi.

Kontaminan yang umum ditemukan diantaranya adalah polisakarida yang

dapat mengganggu proses lanjutan seperti PCR, dimana terjadi hambatan aktivitas

Taq polimerase, atau kontaminan lainnya yaitu polifenol yang dalam bentuk

teroksidasi akan mengikat DNA secara kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal

ini, maka jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelum dan selama proses

ekstraksi.

Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi

DNA dengan menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Selain DNA, semua

bahan yang lain akan larut dalam etanol dingin. Dengan demikian, saat dilakukan

sentrifugasi, maka DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa atau

bahan lain. Pada sampel darah, presipitasi dilakukan dengan salting-out yaitu

supernatan dipisahkan dari protein atau debris sel dengan pemberian larutan

garam berkonsentrasi tinggi. Biasanya akan diperoleh supernatan DNA yang

kental pada saat dimasukkan ke etanol absolut. Bila hal ini terjadi, siapkan tabung

yang berisi etanol, dan segera ambil DNA tadi dengan mikropipet μL,

dan pindahkan ke tabung yang berisi etanol.

Sebagai bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning

atau sekuensing, maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan

(mempunyai kemurnian tinggi) dan memiliki berat molekul yang tinggi. Selama

proses ekstraksi DNA, beberapa hal yang dapat terjadi antara lain:

- DNA patah-patah selama proses isolasi

- DNA terdegradase oleh enzim nuklease

- Terjadi kontaminasi oleh polisakarida

- Metabolit sekunder ikut terisolasi.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Teknologi PCR (Polymerase chain reaction) merupakan suatu proses

sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi fragmen DNA secara in vitro. ,

Teknik PCR dapat meningkatkan jumlah fragmen DNA hingga mencapai -

kali dalam waktu singkat. Pada setiap n siklus PCR, akan diperoleh sebanyak

n kali DNA target. Keberhasilan PCR sangat tergantung pada kemampuannya

untuk hanya memperbanyak (amplifikasi) DNA target dan tidak memperbanyak

DNA non target.

Salah satu keuntungan PCR adalah teknik ini lebih baik dari

teknik kloning biasa, karena tidak perlu pemurnian bahan. Teknik PCR ideal

untuk menganalisis campuran DNA kompleks dari jaringan atau cairan biologi.

. Komponen dalam PCR

. Deoksiribonuklease trifosfat (dNTP)

dNTP digunakan sebagai sumber nukleotida pada proses PCR. Sintesis

DNA menggunakan dNTP yang mengandung deoksiguanosin trifosfat (dGTP),

dan deoksitimin trifosfat (dTTP). dNTP dihubungkan dengan primer melalui

ikatan kovalen dimana gugus hidroksil bebas (OH) dari primer berikatan dengan

gugus fosfat dari nukleotida. Konsentrasi dNTP yang digunakan berkisar -

mM untuk setiap rekasi, dan masing-masing dNTP harus memiliki konsentrasi

yang ekuivalen.

Pola hasil amplifikasi ditentukan oleh DNA cetakan dan kespesifikan

primer yang digunakan. DNA yang digunakan sebagai cetakan pada PCR tidak

harus memiliki BM yang tinggi, karena jumlah DNA yang dibutuhkan sangat

sedikit, yaitu sekitar μM. Akan tetapi, bila konsentrasi DNA telah diketahui,

maka jumlah yang biasa digunakan pada setiap perbanyakan DNA adalah -

ng untuk setiap reaksi. Bila DNA terlalu banyak digunakan, maka pada proses

PCR selain menyebabkan pita DNA pada gel agarosa menjadi kabur, juga

menyebabkan rantai DNA akan bergabung kembali membentuk ikatan ganda

terpilin (double helix).

. Primer

Primer adalah rantai DNA pendek dari ssDNA yang terdiri atas beberapa

nukleotida. Polymerase dimulai dengan mensintesis DNA baru dari ujung primer.

Nukleotida (dNTP atau trifosfat deoksinukleotida) - unit tunggal dari A, T, G, dan

C, yang pada merupakan membentuk DNA baru. Primer yang umum digunakan

terdiri atas atau lebih nukleotida (oligonukleotida). Primer berfungsi sebagai

pemula pada proses sintesis DNA dengan PCR. Contoh primer oligonukleotida

yang digunakan misalnya TGAGCGGACA.

Konsentrasi primer PCR berkisar - μM. Konsentrasi primer yang

tinggi (≥ μM) dapat meningkatkan kesalahan penempelan primer pada DNA

cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan primer yang tidak spesifik dan akan

mengganggu analisis. Namun, penggunaan konsentrasi yang terlalu rendah akan

memberikan hasil amplifikasi yang tidak jelas. Primer yang biasa digunakan

adalah primer spesifik dan primer acak (tersusun atas nukleotida sembarang yang

belum diketahui dengan jelas susunan nukleotidanya).

. Enzim Taq DNA polimerase

Enzim ini pertama kali diisolasi oleh Kary Mullis ( ) dari bakteri

Thermus aquaticus YT yang hidup di sumber air panas Yellowstone Nasional

Park California. Enzim ini dikenal sebagai Taq DNA polimerase yang sekarang

telah beredar secara komersial. Enzim ini mampu mempertahankan aktivisnya

pada suhu tinggi (sampai ˚C) walaupun dilakukan pemanasan beberapa kali

Enzim pertama dan paling umum digunakan enzim ini adalah Taq DNA

polymerase (dari Thermis aquaticus), sedangkan Pfu DNA polimerase (dari

Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena keakuratan yang lebih tinggi

saat menyalin untaian DNA. Meskipun kedua enzim ini berbeda, namun tetap

memiliki kemampuan yang baik untuk digunakan PCR, yakni: dapat

menghasilkan untaian baru DNA menggunakan template DNA dan primer, tahan

panas.

Konsentrasi Taq DNA polimerase berkisar - unit untuk setiap

reaksi. Konsentrasi yang terlalu tinggi dapat menyebabkan hasil yang diperoleh

menjadi tidak spesifik, dan pita DNA pada gel agarosa menjadi menyebar,

sedangkan konsentrasi yang terlalu rendah akan menghasilka pita yang terlalu

tipis sehingga sulit diidentifikasi.

. Ion Mg +

dan Bufer

Faktor lain yang penting dalam PCR adalah bufer dan ion Mg +

.

Konsentrasi ion Mg +

sangat berpengaruh pada proses PCR, karena menentukan

aktivitas enzim Taq DNA polimerase. Ion ini berfungsi sebagai kofaktor bagi

enzim Taq DNA polimerase dengan konsentrasi maksimum sebesar mM.

Konsentrasi yang terlalu tinggi bersifat menghambat dan menyebabkan

penempelan primer terganggu, dan menghasilkan pita-pita yang kompleks.

Komposisi bufer PCR terdiri dari Tris-HCl dan Triton X- yang kondisi

optimumnya tergantung pada enzim yang digunakan. Biasanya pH bufer yang

digunakan berkisar - .

. . Tahapan PCR

. Denaturasi

Denaturasi awal dilakukan sebelum enzim Taq polimerase ditambahkan di

dalam tabung reaksi. Proses ini berlangsung sekitar menit untuk memastikan

bahwa molekul DNA target yang akan dilipatgandakan telah terdenaturasi

menjadi DNA untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya, waktu yang diperlukan

hanya detik pada suhu ˚C atau detik pada suhu ˚C Apabila DNA

target mengandung banyak nukleotida G/C, suhu denaturasi dapat juga dinaikkan.

Denaturasi yang tidak sempurna mengakibatkan DNA mengalami renaturasi

(membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat. Dan akan mengakibatkan

gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat

mengurangi aktivitas enzim Taq polymerase. Aktivitas enzim tersebut mempunyai

waktu paruh lebih dari jam, menit, menit masing-masing pada suhu ;

; dan ˚C

Gambar . Gambar tahapan PCR

. Penempelan Primer (Annealing)

Kriteria yang umum digunakan untuk merangcang primer yang baik

adalah bahwa primer sebaiknya berukuran - basa, mengandung -

G+C dan Tm (˚C) terhitung untuk kedua primer sebaiknya sama Selain itu

sekuens DNA kedua primer tidak saling berkomplemen karena akan

memungkinkan terjadinya penempelan antar primer yang kemudian membentuk

primer-dimer. Sekuens DNA di dalam masing-masing primer itu sendiri juga

sebaliknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan

terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi

PCR.

Temperatur penempelan yang digunakan biasanya ˚C dibawah Tm

dimana formula untuk menghitung Tm= (G+C) + (A+T). Semakin panjang

ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan

yang digunakan antara ˚C sampai dengan ˚C; namun suhu yang biasa

digunakan antara - ˚C

. Pemanjangan Primer (Extension)

Selama tahap ini, Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang

DNA primer dari ujung ’ Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut

pada suhu ˚C diperkirakan antara - nukleotida per detik, bergantung

pada bufer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian,

untuk produk PCR sepanjang pasang basa, waktu menit sudah lebih dari

cukup untuk tahap pemanjangan primer ini. Biasanya, di akhir siklus PCR, waktu

yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai menit, sehingga seluruh

produk PCR diharapkan berbentuk DNA untai ganda.

. Amplifikasi (Amplification)

Campuran yang dipanaskan lagi pada suhu - ˚C untuk denaturasi

molekul dan memisahkan helai dan siklus diulang. Setiap helai baru kemudian

bertindak sebagai template untuk siklus sintesis berikutnya. Jadi amplifikasi hasil

pada eksponensial (logaritmik) tingkat, yaitu jumlah DNA yang dihasilkan ganda

pada tiap siklus. Produk diperkuat pada akhir PCR yang disebut amplikon.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) adalah salah satu

teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat

sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk

membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan

dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Enzim

restriksi ini diperoleh dari spesies bakteri yakni: EcoRI adalah enzim RE yang

dihasilkan dari bakteri Escherichia coli strain RI, BamHIII diperoleh dari

bakteri Bacillus americanus strain HIII.

Pada RFLP, sampel DNA akan dipotong oleh enzim restriksi, dimana

enzim restriksi ini mengenali lokasi spesifik yang disebut “lokasi restriksi”

Dengan adanya berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisme, hal ini mampu

mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan fragmen-

fragmen dengan panjang yang berbeda ketika dilakukan pemotongan oleh enzim

restriksi. Perbedaan panjang fragmen ini dapat dilihat setelah dilakukan

elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi. Aplikasi teknik RFLP biasa

digunakan untuk pengujian sebuah pola dan memiliki aplikasi forensik, uji

paternitas RFLP juga dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi dan menentukan

status penyakit individu. ,

. . Restriksi Endonuklease

Kloning gen didasarkan atas peran enzim-enzim modifikasi tersebut dalam

memotong vektor, DNA target, memasukkan DNA target maupun

menggandakannya. Salah satu enzim restriksi endonuklease yang berperan

penting dalam kloning gen adalah ER tipe II (RE). Ciri utama ER ini adalah setiap

enzim mengenal urutan spesifik pada molekul DNA yang akan dipotong. RE

tertentu akan memotong pada urutan pengenal dan tidak memotong daerah urutan

lainnya.

Gambar . Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A pada

sekuens GAATTC

Beberapa enzim mengenali urutan heksanukleotida BanHI yaitu

GGATCC-, tetranukleotida Alul yaitu AGTC-, atau pentanukleotida dengan basa

pengenalan umum misalnya Hinfl yaitu GANTC-.Hasil pemotongan enzim RE ini

menghasilkan ujung tumpul (blunt end) maupun ujung lengket (sticky end). Hal

yang perlu diketahui adalah aktivitas enzim akan maksimal pada komposisi buer

yang spesifik, terkadang bagi enzim yang aktivitasnya rendah bisa dimaksimalkan

dengan menambahkan bovine serum albumin (BSA) sebagai aktivator. Akan

tetap, untuk RE yang mempunyai aktivitas tinggi seperti EcoRI, penambahan

BSA akan menurunkan aktivias enzim ini secara tajam. Enzim EcoRI memotong

DNA pada bagian dari sebuah palindrom dengan kata lain segmen pendek DNA

di mana keduanya, untai dan untai yang berlawanan memiliki urutan yang sama

(masing-masing dibaca dari arah `- `) .

. . Prinsip deteksi RFLP

Pada restriksi dilakukan dengan mencampurkan DNA hasil PCR dengan

enzim restriksi. Kemudian diinkubasi pada suhu tertentu minimal jam. Setelah

restriksi selesai, dilakukan elektroforsis menggunakan gel polyacrylamid.

Keuntungan dari penggunaan PCR RFLP:

. Murah

. Mudah dalam mendesign

. Dapat digunakan untuk menganalisa nukleotida polimorfisme maupun

microindels

. Tidak membutuhkan alat yang mahal

. Tidak menggunakan pelatihan ekstensif bagi staf laboratorium

. Miniaturisable (mudah dipetakan dalam peta genetik)

. Besifat stabil (tidak mudah berubah hasilnya bila diulang)

Kerugian dari penggunaan metode RFLP adalah:

. Membutuhkan variasi yang dapat menghasilkan atau menghapuskan

lokasi pengenalan enzim restriksi

. Beberapa enzim restriksi harganya cukup mahal

. genotip tertentu tidak dapat dikenali ketika terdapat lebih dari variasi

nukleotida dalam pengenalan lokasi enzim restriksi

. Membutuhkan waktu yang lebih banyak dalam pengerjaannya

. Membutuhkan waktu yang lebih lama dari awal dilakukannya PCR

hingga selesai analisis

. Tidak cocok untuk high-throughput analysis

. Membutuhkan DNA dalam jumlah besar.

. . Analisis Hasil RFLP

Satu dari alel RFLP tidak dapat dikenali oleh enzim restriksi sehingga

terjadi hanya satu fragmen (bulat hitam penuh pada pohon kelurga). Di alel yang

lain, enzim restriksi mampu mengenali posisi dan menghasilkan fragmen (kotak

putih pada phon keluarga). Dan pada yang lainnya terdapat fragmen dimana

enzim restriksi hanya mampu mengenali lokasi pada salah satu alel sehingga

hanya satu alel menjadi fragmen dan alel lainnya tetap utuh.

Gambar Hasil Pemotongan DNA dengan enzim restriksi akan menghasilkan

homozigot murni, hetereozigot varian, homozigot varian.

Elektroforesis

DNA dapat bermigrasi di dalam gel dalam bentuk padat yang diletakkan

dalam larutan penyanggah yang dialiri arus listrik. Sedikitnya, ada jenis gel

yang seirng digunakan untuk proses elektroforesis yakni gel agarose dan gel

polyacrilamida.

. Gel Agarose

Secara fisik tampak seperti bubuk putih yang sangat halus. Agarose yang

dijual secara komerisial terkontaminasi dengan polisakarida, garam, dan protein.

Banyak sedikitnya kontaminasi di dalam gel dapat mempengaruhi migrasi DNA

di dalam gel dan kemampuan mengambil DNA dari dalam gel untuk digunakan

sebagai substrat dalam reaksi enzimatis. Gel agarose dapat dicetak dengan

memanaskan agarose yang dilarutkan dalam larutan buffer sampai didapatkan

larutan jernih. Larutan yang masih cair (dengan temperatur sekitar ˚C)

dituangkan ke dalam pencetak gel. Segera setelah itu, sisir ditempatkan di dekat

tepian gel dan gel dibiarkan mengeras. Kepadatan gel bergantung dari presentase

agarose di dalam larutan tersebut. Apabila gel telah mengeras, sisir dicabut

sehingga akan terbentuk sumur-sumur yang digunakan untuk menempatkan

larutan DNA. Jika gel ditempatkan ke dalam tangki elektroforesis yang

mengandung larutan buffer dan tangki tersebut dialiri listrik, molekul DNA yang

bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak (migrasi) ke arah positif

(anode).

Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor diantaranya;

) Ukuran molekul DNA

Ukuran dan stuktur molekul DNA/RNA mempengaruhi mobilitas saat

dielektroforesis. Secara berurutan mobilitas molekul berbeda dalam hal

kecepatan: sirkular > linear, fragmen DNA > genom utuh. Migrasi molekul

DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran

kecil.

) Konsentrasi agarose

Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi rendah lebih cepat

daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi.

Oleh karena itu, penentuan konsentrasi agarose dalam membuat gel harus

memperhatikan ukuran molekul DNA yang dianalisis. Molekul besar seperti

genom utuh dielektroforesis dengan agarose berkonsentrasi , sedangkan

hasil amplifikasi DNA, dielektroforesis dengan konsentrasi yang lebih tinggi

yaitu - %.

) Konformasi DNA

Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan

bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda. Pada beberapa kondisi tertentu

(konsentrasi agarose, aliran listrik, ion di dalam larutan buffer), molekul

DNA yang membelit-belit bermigrasi lebih cepat daripada molekul DNA

linier, tetapi pada kondisi lainnya kecepatannya menjadi terbalik.

) Voltase yang digunakan

Pada voltase rendah, kecepatan migrasi DNA sebanding dengan

tingginya voltase yang digunakan. Akan tetapi, apabila penggunaan voltase

dinaikkan, mobilitas molekul DNA meningkat secara lebih tajam. Hal ini

dapat mengakibatkan pemisahan molekul DNA di dalam gel menurun dengan

meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk

mendapatkan separasi molekul DNA berukuran lebih besar Kb adalah tidak

lebih dari Volt per cm.

DNA/RNA merupakan molekul bermuatan negatif. Voltase V biasa

digunakan untuk analisis rutin, sedangkan bila diperlukan pemisahan yang

sempurna maka digunakan voltase V. Pada voltase V ini, walaupun lebih

lambat tetapi hasil pemisahannya lebih maksimal.

) Adanya ethidium bromide di dalam gel

Pewarna etidium bromida (EtBr) digunakan untuk alat identifikasi dan

mengukur semikualitatif fragmen DNA yang terpisah dalam gel. Etbr ini akan

terikat diantara dua untai ganda DNA, sehingga pita DNA dalam gel agarosa

akan berpendar karena pewarna ini mengandung zat fluoresen. Ikatan DNA-

EtBr ini akan terkspos pada sinar UV level medium, sekitar panjang

gelombang λ nm. Etidium bromida dapat diberikan pada setiap sampel

yang akan dimasukkan ke sumur gel atau dicampurkan ke gel agarosa

sebelum gel dicetak ke dalam cetakan gel. Intesitas fluoresen dapat diukur

dengan menggunakan DNA penanda standar, sehingga kuantitas DNA dapat

diperkirakan, misalnya antara - μg/mL.

Pewarna etidium bromida (EtBr) mengakibatkan pengurangan tingkat

kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar . Larutan ini sangat

berbahaya dan bersifat carcinogenic.

) Komposisi larutan buffer.

Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik

akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara larutan

buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik

menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan gel akan meleleh dan DNA

dapat mengalami denaturasi. Beberapa larutan buffer yang digunakan terdapat

pada tabel dibawah ini.

Tabel . Konsentrasi Larutan Buffer yang Dapat Dibuat

Buffer Konsentrasi yang

digunakan

Konsentrasi yang biasa dibuat

(per liter)

Tris-acetate

(TAE)

X : Tris-acetate

M EDTA

X : g Tris base ml

glacial acetic acid ml M

EDTA (pH. )

Tris-borate

(TBE)

X : M Tris-

borate M EDTA

X : g Tris base g boric

acid mL M EDTA (pH. )

) Suhu

Molekul DNA akan cepat terurai pada suhu tinggi dan akan kembali

menyatu bila suhu ruangan mendingin.

Kerangka Teori

Makanan

(daging merah)

Genetik Zat karsinogenik

(Merokok, polusi)

Geografi

Polimorfisme CYP A * A

rs (T>C)

Peningkatan aktivitas

katalitik kali lipat

Tingkat aktivasi karsinogen

tinggi

Hiperplasia sel

Displasia sel

Kanker kolorektal

Manifestasi Klinis : Perdarahan saluran cerna bawah, peningkatan

frekuensi defekasi, terdapat massa pada usus, tanda obstruksi

mekanik usus

Kerangka Konsep

Polimorfisme gen CYP A * A

(rs ) (T>C)

Identifikasi polimorfisme gen

dengan teknik PCR-RFLP

Didapatkan SNP CYP A * A

(rs ) (T>C) pada

individu

Heterovarian Homo murni Homo varian

Penyebab kanker

(salah satunya kanker

kolorektal)

Modifikasi

lingkungan

Perubahan

gaya hidup

Perubahan

pola makan

Definisi Operasional

Dalam penelitian ini peneliti menggunakan istilah-istilah yang didefinisikan

sebagai berikut.

Tabel . Definisi operasional

No Variabel Definisi Alat

Ukur

Skala Skor

SNP rs

(T > C)

Variasi

sekuensing

DNA pada

gen

CYP A* A

. Homozigot murni

. Heterozigot varian

. Homozigot varian

BAB III

METODE PENELITIAN

Desain penelitian

Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah deskriptif yaitu dengan

melakukan skrining untuk melihat polimorfisme gen CYP A * A (rs )

(T>C) yang menjadi salah satu faktor resiko kanker kolorektal terhadap

mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah angkatan - . Penelitian ini

dilakukan dengan menggunakan metode PCR RFLP.

Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan dari bulan Juli hingga Juli di Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan

melakukan studi deskriptif untuk melihat pola variasi genetik pada mahasiswa

Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter angkatan hingga .

Populasi Penelitian dan Sampel

Populasi Target

Populasi target adalah responden pria dan wanita mahasiswa FKIK UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta

Populasi Terjangkau

Populasi terjangkau penelitian ini adalah responden pria dan wanita

mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter angkatan hingga

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Kriteria Pemilihan

Kriteria pemilihan sampel dalam penelitian ini terdiri dari kriteria inklusi

dan eksklusi. Kriteria inklusi mahasiswa aktif Program Studi Kedokteran dan

Porfesi Dokter angkatan hingga yang telah mengisi lembar informed

consent (lampiran ). Pada penelitian ini kriteria eksklusi tidak ditentukan karena

peneliti ingin melihat hasil skrining seluruh sampel dan melihat hubungan antara

hasil skrining. Kriteria drop out dalam penelitian ini adalah mahasiswa yang

menolak sebagai responden

Perkiraan Besar Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel DNA yang

diambil sebanyak sampel dari total mahasiswa Program Studi Kedokteran

dan Porfesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah angkatan - . Dalam

penentuan jumlah sampel, peneliti menggunakan perhitungan deskriptif kategorik.

Deskriptif kategorik yaitu penelitian yang bertujuan untuk menggambarkan

proporsiatau rerata suatu variabel dan hasil pengukurannya dikelompokkan

dengan klasifikasi tertentu.

Rumus perhitungan adalah:

Keterangan:

N : Besar sampel

Zα : nilai distribusi normal baku pada tabel Z

P : Proporsi dari penelitian sebelumnya

Q : -P

D : Presisi (ditentukan oleh peneliti)

Zα yang dipilih yaitu % karena penelitian kedokteran menggunakan

dan dan arah karena menyatakan ada perbedaan proporsi tanpa menyebutkan

secara spesifik yaitu sebesar . Proporsi penelitian sebelumnya di Indonesia

dari data IARC ( ) prevalensi kanker kolorektal di Indonesia yaitu sebesar

. Presisi yang digunakan oleh peneliti yaitu karena presisi merupakan

kesalahan penelitian yang masih bisa diterimauntuk memprediksi yang akan

diperoleh dengan selisih kurang lebih masih dapat diterima.

Teknik Pemilihan Sampel

Sampel yang dipilih berdasarkan Simple Random Sampling dimana sampel

diambil secara acak dari jumlah yang telah ditentukan. Subjek yang terlibat

terlebih dahulu menyatakan kesediaannya untuk menjadi subjek penelitian dengan

menandatangani lembar inform consent. Selanjutnya subjek yang bersedia

mengisi dan menandatangani inform consent secara sukarela memberikan - mL

darahnya untuk dilakukan screening genetik. Sampel darah dimasukkan ke tabung

EDTA dan diberi nomor, selanjutnya disimpan dalam cold room untuk dilakukan

isolasi DNA, kemudian dilakukan PCR-RFLP dan terakhir dianalisa

menggunakan elektroforesis. Pengambilan sampel ini telah mendapat persetujuan

etik dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta (lampiran )

Alat dan Bahan Uji

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dijelaskan dalam tabel

sebagai berikut

Tabel . Alat dan bahan penelitian

Alat Bahan Keterangan

Pengambilan sampel (darah)

- Spuit cc

- Torniquet

- Tabung berisi EDTA

- Handscoon

- Alcohol Swab

Isolasi Genom DNA dari darah & deteksi gen spesifik

- Penangas air (Water bath) AS ONE

TRW - TP high temperature

Whole Blood μL

version

- Water destilation apparatus

ADVANTEC RFD NA

- Incubator EYELA NDO-

- Biomedical Freezer SANYO

- PCR Applied Biosystem Veritil

Well thermal

- GD column

- ml collection tube

- Tabung mikro untuk PCR

- Microcentrifuge Eppendarf R

- Micropipet BIOHIT ukuran -

μL

- Micropipet Nichipet EX Nichiryo

ukuran - μL dan - μL

- Micropipet BIORAD ukuran -

μL

- Mikrotip biologix ukuran μL,

μL dan μL

- Aluminium foil

RBC Lysis Buffer

GB Buffer

Ethanol Absolut

W Buffer

Wash Buffer

Elution Buffer

μL dan

μL

μL

μL

μL

μL

μL

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil isolasi DNA

- DeNovix DS- Spectrophotometer Genom DNA μL

- Aquadest

- Micropipet BIOHIT ukuran -

μL

- Mikrotip biologix ukuran μL

Elektroforesis genom DNA

- Elektroforesis ATTO My Power II

AE-

Agarose

Ethidium bromide

Loading dye

- Microwave SHARP lowwattage

- Timbangan analitik AdventureTM

- Gel doc system

- Printgraph ATTO AE- CF

CCD camera controller

- Penggaris sumur

- Gelas kimia/ botol pereaksi

- Gelas ukur sibata

Plastic Wrap

Buffer Tris Asetat

EDTA (TAE) x

Gambar alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada

lampiran

Cara Kerja Penelitian

. Pengumpulan Sampel

Sampel yang digunakan adalah whole blood mahasiswa PSKPD UIN

Jakarta angkatan - melalui punksi vena sebanyak - cc satu kali.

Sampel darah diambil dari orang. Subjek sebelumnya telah dimintai

persetujuan (informed consent).

Sampel darah dimasukkan ke tabung EDTA dan diberi nomor, selanjutnya

disimpan dalam cold room untuk dilakukan isolasi DNA, kemudian template

DNA diamplifikasi dengan teknik PCR.

Isolasi DNA

Setelah sampel darah diambil, dilakukan isolasi DNA untuk mendapatkan

genom DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)

Geneaid GB dengan langkah kerja seperti dalam tabel .

Tabel . Tahapan isolasi genom DNA

Persiapan

Sampel

Fresh Blood

. Darah sebanyak μL kedalam ml tabung

mikrosnetrifugasi dimasukkan

. μL RBC Lysis Buffer kemudian ditambahkan dan

dikocok.

. Tabung diinkubasi menit dalam suhu ruangan

. Tabung disentrifugasi selama menit pada kecepatan

rpm selama menit, supernatan dibuang.

. μL RBC Lysis Buffer ditambahkan untuk

mensuspensi endapan leukosit, kocok, kemudian

diproses dengan cell lysis

Langkah

Cell Lysis

. μL GB Buffer ditambahkan ke dalam tabung tadi

. Tabung diinkubasi pada suhu ᵒ C selama menit

untuk memastikan sampel terlisiskan

. Pada saat yang sama tabung lain berisi μL Elution

Buffer untuk tiap satu sampel disiapkan, kemudaian

diinkubasi pada suhu ᵒ C.

. Setelah tabung sampel tadi diinkubasi, tabung

didinginkan di suhu ruangan.

Langkah

DNA binding

. μL ethanol absolute ditambahkan kedalam tabung

tadi, kemudian secara cepat dikocok selama detik.

. Menyiapkan GD Column pada mL Collection Tube.

. Mencampuran ethanol tadi dipindahkan kedalam GD

Column.

. Tabung disentrifugasi pada – x g

selama menit

. Membuang cairan pada ml Collection Tube

. GD Column ditempatkan kembali pada ml Collection

Tube

Langkah

Wash

. Menambahkan μL W Buffer kedalam GD Column

kemudian disentrifugasi pada – x g

selama menit

. Membuang cairan pada ml Collection Tube

. GD Column ditempatkan kembali pada ml Collection

Tube

. Menambahkan μL Wash Buffer ke dalam GD

Column

. Tabung disentrifugasi pada – x g

selama menit

. Cairan pada ml Collection Tube dibuang

. GD Column ditempatkan kembali pada ml Collection

Tube

. Tabung disentrifugasi kembali selama menit untuk

mengeringkan matriks kolum

Langkah

DNA Elution

Standar volume elution buffer untuk sampel adalah μL.

Jika sampel yang digunakan dalam volume yangs edikit,

volume elusi sekitar - μL dapat meningkatkan konsentrasi

DNA

. GD Column yang sudah kering dipindahkan ke dalam

tabung mikrosentrifugasi yang steril

. μL Elution Buffer yang sudah diinkubasi

ditambahkan ke dalam matriks kolom, dibiarkan selama

menit

. Tabug disentrifugasi pada – x g selama

menit untuk mendapatkan hasil

Genom DNA yang telah diisolasi dinilai apakah sudah terisolasi atau tidak dengan

cara elektroforesis dan dibaca menggunakan Gel documentation.

Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA-nya dengan

menggunakan alat DeNovix DS- Spectrophotometer. Memilih dsDNA pada

piliha menu. Meletakkan aquadest sebanyak μL, lalu diletakkan di lensa nano,

ditutup dan di-analized untuk me-reset. Kemudian bersihkan dengan

menggunakan kertas tissue, sebelum mengecek sampel lainnya. Sampel diambil

sebanyak μL, lalu diletakkan di lensa nano, ditutup dan di-analyzed. Hasil

kemurnian dan konsentrasi akan langsung terbaca dilayar dan tersimpan.

Optimalisasi Primer

Pada PCR menggunakan fragmen primer forward ( ’-

TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT- ’) dan fragmen primer reverse ( ’-

CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT- ’

Optimalisasi primer dilakukan untuk

mencari konsentrasi primer yang optimal sehingga didapatkan pita DNA yang

tebal dan dimer yang tidak terlihat (lampiran ).

Konsentrasi primer PCR berkisar - μM. Konsentrasi primer yang

tinggi (≥ μM) dapat meningkatkan kesalahan penempelan primer pada DNA

cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan primer yang tidak spesifik dan akan

mengganggu analisis. Namun, penggunaan konsentrasi yang terlalu rendah akan

memberikan hasil amplifikasi yang tidak jelas.

Dan pada penelitian ini

dilakukan optimalisasi primer yakni dengan mengencerken primer hingga

konsentrasi mencapai μM (lampiran ).

Tata Kerja PCR

Pada proses ini diawali dengan langkah sebagai berikut:

. Membuat primer mix

) Membuat pengenceran primer dan primer dengan konsentrasi

akhir μM

) Menggabungkan primer induk yang telah diencerkan dengan

menambahkan dH O hingga mencapai konsentrasi μM (Primer

Mix)

. Pencampuran bahan

Mencampurkan dH O, PCR mix, primer (mix), primer (mix)

dan template DNA dengan jumlah yang terdapat pada tabel

Tabel . Prosedur PCR

Bahan-Bahan μl

dH O

PCR mix

Primer (mix)

Primer (mix)

Template DNA

. Proses PCR

Pada proses PCR dilakukan dengan inkubasi awal pada suhu ° C

selama menit, detik, diikuti oleh siklus serangkaian proses yang

terdiri dari denaturasi pada suhu C selama detik, annealing pada

C selama detik dan pemanjangan (elongation) pada ° C selama

detik. Proses PCR diakhiri dengan tahap pemanjangan akhir pada suhu

C selama menit. Produk PCR dianalisa menggunakan gel

elektroforesis dengan konsentrasi agarose sehingga didapatkan ukuran

produk PCR pada bp.

Tata Kerja RFLP

Produk PCR berupa gen CYP A * A rs (T>C) dipotong dengan

enzim restriksi MspI (batasan = C ^ CGG) pada suhu C selama jam. Setelah

itu produk RFLP dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarose dan

diamati dengan GelDoc.

Tabel . Prosedur Restriksi Enzim

Bahan-Bahan μl

dH O

Buffer

Msp

Template DNA

. Analisis Data

Pengolahan data hasil pemeriksaan genotyping CYP A * A rs

(T>C) dilakukan dengan menggunakan program SPSS versi .

. . Etika Penelitian

Penelitian ini memerlukan ethical clearance (lampiran ) dari panitia Etik

Penelitian PSKPD (Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter) UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta. Semua data yang didapat dari hasil penelitian yang

dipergunakan akan dijaga kerahasiaannya.

. . Alur Penelitian

Penilaian Genotyping (homozigot

murni, heterozigot varian dan

homozigot varian)

Mahasiswa PSPD UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta Angkatan

-

Bersedia menjadi responden dan

mengisi lembar informed consent

Punksi Vena

Isolasi Genom DNA

Tes Kemurnian dan Konsentrasi

genom DNA

Penapisan gen CYP A * A

rs menggunakan teknik

PCR-RFLP

BAB IV

HASIL dan PEMBAHASAN

Hasil

Data Karakteristik Responden

Responden dalam penelitian ini adalah mahasiswa Program Studi

Kedokteran dan Porfesi Dokter angkatan - UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta. Responden terdiri dari laki-laki dan perempuan dengan rentang

usia - tahun (saat dilakukan pengambilan darah)

Tabel . Karakteristik jenis kelamin responden

Frekuensi Presentase (%)

Jenis Kelamin Laki-laki

Perempuan

Total

Berdasarkan tabel diketahui bahwa presentase laki-laki adalah dan

perempuan

Tabel . Karakteristik usia responden

Usia Responden (tahun) Frekuensi Presentase (%)

Total

Berdasarkan tabel diketahui bahwa presentase usia terbanyak dari

responden adalah tahun. Rerata usia responden adalah

Hasil Isolasi DNA Genom dan PCR dari Sel Darah (whole blood)

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah responden

mahasiswa PSPD UIN Jakarta - . Sampel yang dipakai adalah darah

yang selanjutnya diisolasi untuk mendapatkan DNA. Isolasi dan purifikasi DNA

genom dari sampel darah dilakukan berdasarkan protokol Geneaid GB . Hasil

isolasi ini dianalisis secara kualitataif dengan teknik elektroforesis gel agarosa

menggunakan gel doc system untuk memastikan keberadaan dari DNA target.

Hasilnya dapat dilihat pada gambar (lampiran ).

Setelah itu dilakukan pemeriksaan kemurnian dan konsentrasi dari

sampel DNA genom yang dapat dilihat pada tabel (lampiran ). Dari sampel,

memiliki kategori kemurnian rasion A /A ( - ) baik,

tinggi dan rendah. Rasio A digunakan untuk identifikasi

kontaminasi di dalam DNA sampel. Rasio A yang rendah dapat

disebabkan oleh kontaminasi polisakarida, etanol absolut atau reagen lain pada

saat isolasi, namun dapat pula disebabkan oleh konsentrasi yang sangat rendah

(< ng/uL) dari asam nukleat.

Sampel yang memiliki konsentrasi rendah

sebanyak . Meskipun rasio kemurnian menentukan kualitas dari sampel,

indikator kualitas DNA bergantung dari aplikasi jumlah DNA yang digunakan.

Dari hasil pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA dapat disajikan

dalam bentuk tabel dibawah ini:

Tabel . . Kategori Kemurnian DNA

A /A (borderline: - ng/μL)

Kategori Kemurnian Frekuensi (N) Presentase (%)

Baik

Tinggi

Rendah

Total

Tabel . Kategori Konsentrasi DNA Genom

Kategori Konsentrasi Frekuensi (N) Presentase (%)

Baik

< ng/ μL

Total

. Hasil Analisis Genotyping PCR RFLP (Homozigot murni, Heterozigot

varian dan Homozigot varian)

Hasil PCR

Setelah melalui proses isolasi DNA maka dilakukan PCR, sehingga

didapatkan hasil seperti pada gambar .

Gambar . Hasil PCR akan memberikan gambaran pita pada bp

Hasil RFLP

Setelah melalui proses PCR, produk PCR dipotong dengan enzim

restriksi MspI, sehingga didapatkan hasil seperti pada gambar .

Gambar . Hasil RFLP akan memberikan gambaran pita pada bp untuk

homozigot murni, bp dan bp untuk homozigot varian serta gambaran

pita pada bp, bp, bp pada heterozigot varian.

Sampel yang telah dilakukan pemeriksaan mutasi gen dengan metode

PCR-RFLP akan memberikan data genotyping dari sampel seperti dalam tabel

. Berdasarkan tabel diketahui bahwa dari sampel presentase homozigot

murni ( orang), genotip heterozigot varian ( orang), genotip

homozigot varian ( orang).

bp

Tabel . Analisis Genotyping PCR RFLP

Genotyping Frekuensi Persentase (%)

Homozigot murni (TT)

Homozigot varian (CC)

Heterozigot varian (TC)

Total

. . Hasil Skrining gen CYP A * A rs (T>C)

Gambar Hasil Skrining gen CYP A * A rs (T>C) pada Mahasiswa

PSPD UIN Syarif H. Angkatan -

Berdasarkan gambar . menunjukkan bahwa dari sampel didapatkan

presentase genotip homozigot murni TT % ( orang), genotip heterozigot

varian TC ( ), genotip homozigot varian CC ( orang).

Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotyping (Homozigot Murni,

Heterozigot Varian, Homozigot Varian)

Tabel . Distribusi frekuensi kategori genotyping menurut jenis kelamin

Jenis

Kelamin

Kategori Genotyping

Homozigot

murni

Heterozigot

varian

Homozigot

varian Total

N % N % N % N %

Laki-laki

Perempuan

Hasil data yang diperoleh dari responden didapatkan presentase laki-

laki yang memiliki genotyping homozigot murni sebesar , heterozigot

varian , dan homozigot varian . Sedangkan presentase perempuan

yang memiliki genotyping homozigot murni sebesar , heterozigot varian

, dan homozigot varian .

Hasil data yang diperoleh dari responden kemudian dicari hubungan

antara kategori jenis kelamin dan genotyping (homozigot murni, heterozigot

varian dan homozigot varian). Tabel x (lampiran ) layak untuk diuji dengan

Chi Square karena sel yang nilai expected-nya kurang dari sebesar . Oleh

karena itu, digunakan uji alternatifnya yakni uji Mann-Whitney dengan p value =

. Sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan yang signifikan

antara jenis kelamin dengan genotyping (homozigot murni, heterozigot varian,

homozigot varian).

Pembahasan

Hasil screening genotyping Gen CYP A * A rs menggunakan

teknik PCR RFLP pada mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter

(PSKPD) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan

- didapatkan bahwa dari sampel, presentase homozigot murni

( orang), genotip heterozigot varian ( orang), genotip homozigot

varian % ( orang), sehningga frekuensi genotip heterozigot varian paling

dominan. Hal ini diperkuat dengan penelitian sebelumnya bahwa CYP A * A

adalah variasi alel yang cukup banyak dimiliki oleh penduduk di wilayah Asia

(Jepang) daripada Kaukasia.Frekuensi persebaran alel adalah pada

Kaukasia, pada Asia, and pada Afrika.

Pada hasil penelitian ini secara statistik tidak ditemukan adanya hubungan

yang signifikan antara jenis kelamin dan genotyping(homozigot murni, heterozigot

varian, homozigot varian (p value = ). Secara teori, terdapat penelitian di

Turki dan Jepang menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan antara

seseorang yang menderita kanker koloretal dan seseorang yang sehat jika dilihat

dari usia dan jenis kelamin.

Empat penelitian yang dilakukan di populasi Asia diketahui bahwa

pembawa alel C dari CYP A * A memiliki kali peningkatan risiko kanker

kolorektal dibandingkan dengan pembawa alel T.

Pada studi variasi

genetik, genetik yang berhubungan dengan polimorfisme CYP A * A dan

CYP A * C memberikan kali lipat peningkatan aktivitas katalitiknya.

Ditambah lagi pada penelitian di Jepang juga ditemukan bahwa alel heterozigot

untuk CYP A * A memiliki resiko yang paling besar untuk terjadi kanker

koloretal.

Mengingat adanya hubungan antara gen CYP A * A rs

dengan faktor resiko kanker kolorektal maka perlu dilakukan edukasi pada

mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) Universitas

Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

Kelebihan Penelitian

Penelitian skrining CYP A * A rs (T>C) untuk mengetahui

kemungkinan responden memiliki faktor resiko kanker kolorektal dapat dikatakan

penelitian yang baru di Indonesia. Dalam pelaksanaan penelitian ini, cara kerja

penelitian yang dilakukan memiliki tingkat kesulitan yang tinggi karena

membutuhkan waktu dan tenaga yang banyak. Dalam mendeteksi mutasi dari

SNP tersebut, teknik PCR RFLP yang digunakan merupakan salah satu teknik

yang murah.

Keterbatasan penelitian

Selama penelitian berlangsung terdapat beberapa hambatan yang dialami oleh

peneliti, diantaranya:

. Tidak dilakukannya kriteria diagnosis lain seperti pemeriksaan FOB (Fecal

Occult Blood).

. Tidak mencari data mengenai kebiasaan merokok, konsumsi daging

merah, riwayat keluarga yang merupakan beberapa faktor resiko terjadinya

kanker kolon.

. Besar sampel diduga mempengaruhi hasil statistik analitik.

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Pada penelitian ini didapatkan SNP CYP A * A rs (T>C) pada

mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan - , dengan

sebagian besar heterozigot varian dan sebagian kecil homozigot murni dan

homozigot varian. Sehingga sebagian besar mahasiswa mengalami polimorfisme

SNP CYP A * A rs (T>C)

Saran

. Untuk penelitian berikutnya diperlukan jumlah sampel yang lebih besar

supaya hasilnya bermakna.

. Diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk mendiagnosis kanker

kolorektal seperti pemeriksaan FOB, kolonoskopi, dan pemeriksaan

lainnya.

. Diperlukan kuesioner untuk mengetahui faktor lain yang dapat

meningkatkan faktor resiko terjadinya kanker kolorektal seperti kebiasaan

merokok, konsumsi daging merah, riwayat keluarga yang terkena kanker

kolorektal, pola makan.

BAB VI

ACKNOWLEDGMENT

Penulis mengucapkan terimakasih kepada RSUP Fatmawati dan tim

peneliti kanker kolorektal FKIK UIN Syarif Hidayatullah; DIKTIS DEPAG RI;

DitJen Anggaran Kemenkeu, Chris Adhiyanto, S.Si,M.Biomed,PhD, dr. H. Hari

Hendarto, Sp. PD-KEMD, PhD, FINASIM, dr. Ahmad Lutfi SpB-KBD, Dr. Zeti

Harriyati, S.Si, M. Biomed, FKIK UIN-Laboratorium Biomolekuler, dan yang

telah memberikan bantuan dalam ide, pendanaan dan sampel DNA. Penelitian ini

merupakan bagian dari penelitianpemetaan genotip kanker kolorektal di Indonesia

yang diketuai oleh Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed,PhD dari FKIK UIN Syarif

Hidayatullah bekerjasama dengan RSUP Fatmawati

DAFTAR PUSTAKA

. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, editor. Cancer Incidence and Mortality

Worldwide . France: International Agency for Research on Cancer,

. World Health Organization. Fact sheets of cancer. US: World Health

Organization,

. Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan RI. Situasi Penyakit

Kanker . Indonesia: Kementerian Kesehatan RI, . p

. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, editor. Cancer Incidence and Mortality

Worldwide . France: International Agency for Research on Cancer,

.

. Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, editor. Colorectal Cancer Estimated

Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in . France:

International Agency for Research on Cancer, .

. International Agency for Research on Cancer. Fact sheets by population,

incidence, mortality and -year prevalence: both sexes INDONESIA.

Indonesia: World Health Organization, .

. Sharkas GF, Arqoub KH, Khader YS, et al. Colorectal Cancer in Jordan:

Survival Rate and Its Related Factors. J Oncol. Mar; : - .

. Sudoyo AW, Setiohadi B, Alwi I, dkk. Buku ajar ilmu penyakit dalam jilid .

Ed. . Jakarta: Internal Publishing, . h. - .

. Nebert DW, Nelson DR, Coon MJ, et al. The P superfamily: update on

new sequences, gene mapping, and recommended nomenclature. DNA and

Cell Biology. Jan; ( ): - .

. Nebert DW. Role of genetics and drug metabolism in human cancer risk.

Mutat Res. Apr; ( ): – .

. Slattery ML, Samowtiz W, Ma K. et al.CYP A , cigarette smoking, and

colon and rectal cancer. Am. J. Epidemiol. Nov; ( ): – .

. Kury S, Buecher B, Robiou-du-Pont S, et al. Combinations of cytochrome

P gene polymorphisms enhancing the risk for sporadic colorectal cancer

related to red meat consumption. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.

Jul; ( ): – .

. O¨ zhan G, Mutur M, Ercan G, et al. Genetic variations inthe xenobiotic-

metabolizing enzymes CYP A , CYP A ,CYP C , CYP C and

susceptibility to colorectal canceramong Turkish people. Genet Test Mol

Biomarkers. Apr; ( ): – .

. Garte S, Gaspari L, Alexandrie AK, et al. Metabolicgene polymorphism

frequencies in control populations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.

Dec; ( ): -

. Yoshida K, Osawa K, Kasahara M, et al.Association of CYP A , CYP A ,

GSTM and NAT gene polymorphismswith colorectal cancer and smoking.

Asian Pac J Cancer Prev. Jul-Sep; ( ): - .

. National Human Genome Research Institute. What are Genetic and

Genomics. USA: National Human Genome Research Institute,

. World Health Organization. Genomics and World Health, report of the

Advisory Committee on Health Research. Geneva: World Health

Organization, .

. National Human Genome Research Institute. What is Genomic Medicine?

USA: National Human Genome Research Institute, .

. Anthony JFG, Jeffrey HM, David TS, et al. An Introduction to Genetic

Analysis. th ed.New York: W. H. Freeman; , h. - .

. Nussbaum, Robert L. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. th ed.

Philadelphia: Elsevier; . h. - .

. National Cancer Institute. Understanding Cancer Genomics. USA: National

Cancer Institute, .

. Tropp, Burton E. Molecular Biology: Genes to Proteins. th ed. USA: Jones

& Bartlett Learning; . h. - .

. van Bakel H, Nislow C, Blencowe BJ, Hughes TR. Most "dark matter"

transcripts are associated with known genes. PLoS Biol. May ; ( ):

e .

. Birney E, Stamatoyannopoulos JA, Dutta A, et al. Identification and analysis

of functional elements in of the human genome by the ENCODE pilot

project. Nature. June ; ( ): – .

. Dunham I, Kundaje A, Aldred SF, et al. An integrated encyclopedia of DNA

elements in the human genome. Nature. Sept ; ( ): – .

. Cui Z, Li Y, Cheng S, et al. Mutations in the embC-embA intergenic region

contribute to Mycobacterium tuberculosis resistance to ethambutol.

Antimicrob Agents Chemother. Nov; ( ): - .

. Liu G, Luan Y. Identification of Protein Coding Regions in the Eukaryotic

DNA Sequences Based on Marple Algorithm and Wavelet Packets

Transform. Hindawi Publishing Corporation Abstract and Applied Analysis.

Jul; : - .

. Department of Health & Human Services National Institutes of Health. What

are single nucleotide polymorphism (SNPs)? USA: U.S. National Library

of Medicine; . p.

. Kumar, Vinay. Robins & Cotran Dasar Patologis Penyakit. Ed . Jakarta:

EGC; . h. -

. Winslow T. What Is Cancer? USA: U.S, Department of Health and Human

Services; .

. Sherwood L. Fisiologi Sel: dari Sel ke Sistem ed . Jakarta: EGC; .

h.

. Center for Disease Control and Prevention. What Is Colorectal Cancer? USA:

U.S., Department of Health & Human Services;

. Price SA. Patofisiologi: Konsep Klinis Prose-Proses Penyakit Ed. . Jakarta:

EGC, . h. -

. Nagara FS, Utomo AR, Sandra F. Efek mutasi K-RAS pada Kanker

Kolorektal terhadap terapi Antibodi Monoklonal anti EGFR. Indonesian

Journal of Cancer. ; : -

. Arrington AK, Heinrich EL, Lee W, et al. Prognostic and Predictive Roles of

KRAS Mutation in Colorectal Cancer. Int J Mol Sci. Sep

; ( ): - .

. Mastutik G, et al. The mutation status of KRAS gene codon and in

colorectal adenocarcinoma. Indonesian Journal of Clinical Pathology and

Medical laboratory. Nov; ( ): -

. Basir I, Rudiman R, Lusikoy R, dkk. Pedoman Nasional Pelayanan

Kedokteran Kanker Kolorektal. Indonesia: Kementerian Kesehatan RI,

Komite Penanggulangan Kanker Nasional; . h. - .

. Lu Y, Cederbaum AI. CYP E and Oxidative Liver Injury by Alcohol. Free

Radic Biol Med. Mar ; ( ): - .

. Corchero J, Primprale S, Kimura S, et al. Organization of the CYP A cluster

on human chromosome : implications for gene regulation.

Pharmacogenetics. Feb; ( ): - .

. Bartsch H, Nair U, Risch A, et al. Genetic polymorphismsof CYP genes,

alone or in Combination, as a risk modifier of tobacco-related cancers. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev. Jan; ( ): - .

. Go RE, Hwang KA, Choi KC. Cytochrome P family and cancers. J

Steroid Biochem Mol Biol. Mar; : -

. McKay JA, Murray GI, Weaver RJ, et al. Xenobiotic metabolising enzyme

expression in colonic neoplasia. Gut. Sep; ( ): - .

. Mercurio MG, Shiff SJ, Galbraith RA, et al. Expression of cytochrome P

mRNAs in the colon and the rectum in normal human subjects. Biochem

Biophys Res Commun. May ; ( ): - .

. Genome Reference Consortium. Chromosome (human). USA: NCBI's

Genome Decoration Based on Ensembl's, . GRCh .p

. Landi MT, Bertazzi PA, Shields PG, et al. Association between CYP A

genotype, mRNA expression and enzymatic activity in humans.

Pharmacogenetics. Oct; ( ): - .

. Kawajiri K, Nakachi K, Imai K, et al. The CYP A gene and cancer

susceptibility. Crit Rev Oncol Hematol. Feb; ( ): - .

. Saeed HM, Alanazi MS, Nounou HA, et al. Cytochrome P A , E and

GSTM genepolymorphisms and susceptibility to colorectal cancer in

theSaudi population. Asian Pac J Cancer Prev. ; ( ): - .

. Garte S. The role of ethnicity in cancer susceptibility gene polymorphisms:

The example of CYP A . Carcinogenesis. Aug; ( ): - .

. Sachse C, Smith G, Wilkie MJ, et al. A pharmacogenetic study to investigate

the role of dietary carcinogens in the etiology of colorectal cancer.

Carcinogenesis. Nov; ( ): - .

. Ye Z, Parry JM. Genetic polymorphisms in the cytochrome P A ,

glutathione S-transferase M and T , and susceptibility to colon cancer.

Teratog Carcinog Mutagen. ; ( ): - .

. Slattery ML, Samowtiz W, Ma K, et al. CYP A , cigarette smoking, and

colon and rectal cancer. Am J Epidemiol. Nov ; ( ): - .

. Little J, Sharp L, Masson LF, et al. Colorectal cancer andgenetic

polymorphisms of CYP A , GSTM and GSTT : a case-control study in the

Grampian region of Scotland. Int J Cancer. Nov ; ( ): - .

. Darazy M, Balbaa M, Mugharbil A, et al. CYP A , CYP E , and GSTM

gene polymorphisms and susceptibility to colorectal and gastric cancer

among Lebanese. Genet Test Mol Biomarkers. Jun; ( ): - .

. Firozi PF, Bondy ML, Sahin AA, et al. Aromatic DNA adducts and

polymorphisms of CYP A , NAT and GSTM in breast cancer.

Carcinogenesis. Feb; ( ): - .

. Inoue H, Kiyohara C, Marugame T, et al. Cigarette smoking, CYP A MspI

and GSTM genotypes, and colorectal adenomas. Cancer Res. Jul

; ( ): - .

. Surzycki S. Laboratory manual: human molecular biology. Ed. . Berlin:

Blacwell Publishing; . h. -

. Matlock B. Assessment of nucleic acid purity. USA: MA, Wilmington,

Thermo Fisher Scientific;

. Fatchiyah, dkk. Biologi Molekular: Prinsip Dasar Analisis. Ed. .Jakarta: PT

Penerbit Erlangga; , h. -

. Radji M. Rekayasa Genetika: Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Jakarta:

CV Sagung Seto; . h. -

. Maria B. Biokimia: Teknik Penelitian. Ed. . Jakarta: Erlangga; . h. -

. Muladno. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed. . Bogor: IPB Press; .

h. -

. National Center for Biotechnology Information. Poymerase Chain Reaction

(PCR). USA: U.S. National Library of Medicine; .

. Rasmussen HB. Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of

PCR-Amplified Fragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis–Valuable

Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting. Denmark: Institute of

Biological Psychiatry; .

. Wijanarko E. Teknologi DNA Rekombinan. Indonesia; . h.

. Dahlan S. Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan. Ed. . Jakarta: Salemba

Medika; . h.

Lampiran . Lembar Persetujuan Responden

Lembar Persetujuan Mengikuti Penelitian

Bersama ini saya yang bertandatangan di bawah ini :

Nama :

Umur :

Alamat :

Telepon :

Setelah mendapat keterangan secukupnya dan mengerti manfaat penelitian

tersebut di bawah ini dengan judul :

Gambaran Polimorfisme Gen CYP A * A rs (T>C) sebagai Faktor

Resiko Kanker Kolorektal Pada Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan

Profesi Dokter Angkatan - UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Saya mengerti tujuan penelitian ini dan mengapa diminta untuk berpartisipasi.

Semua pertanyaan yang saya ajukan telah dijawab peneliti.

Saya mengerti bahwa keiikutsertaan dalam penelitian ini bersifat sukarela dan

setiap saat dapat mengundurkan diri dari penelitian.

Ciputat,…… Juli

Yang memberi penjelasan Yang menyetujui

(Nurul Fathimah) ( )

Peneliti Mahasiswa

Lampiran . Lembar tanda terima komisi etik penelitian

Lampiran Fragmen primer

Fragmen primer forward

’-AAGAGGTGTAGCCGCTGCACT-

Fragmen primer reverse

’-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT- ’

Gambar Letak fragmen primer foward dan reverse

Sumber: http://scialert.net/fulltext/?doi=jms. &org= f

Proses PCR RFLP

Pada proses PCR dilakukan dengan inkubasi awal pada suhu C selama

menit, detik, diikuti oleh siklus serangkaian proses yang terdiri dari

denaturasi pada suhu C selama detik, annealing pada C selama

detik dan pemanjangan (elongation) pada C selama detik. Proses PCR

diakhiri dengan tahap pemanjangan akhir pada suhu C selama menit. Produk

PCR dianalisa menggunakan gel elektroforesis dengan konsentrasi agarose

sehingga didapatkan ukuran produk PCR pada bp. (Gambar ).

Gambar Proses PCR

Produk PCR dipotong dengan U enzim restriksi MspI (batasan = C ^ CGG)

pada suhu ° C selama jam. Kemudian hasil restriksi dianalisis dengan

elektroforesis pada gel agarose yang ditambahkan dengan DNA loading dye

dan kemudian diamati dengan GelDoc.

Lampiran . Alat dan bahan penelitian

Gambar . . Darah dari tabung EDTA, Bahan RFLP, Ethanol

Gambar . . PCR mix, Primer PCR

Gambar . . DNA loading dye, Bahan PCR

Gambar . . Sampel Genom DNA, Centrifuge eppendorf

Gambar . . Gel doc system, microcentrifuge

Gambar . . DeNovix DS- Spectrophotometer, GD Collum

Gambar . . Freezer, tabung mikro PCR

Gambar . . Bilogix ukuran μL, μL dan μL

Gambar . . ml collection tube

Gambar . . Tempat sampah medis, Waterbath, Micropipet

Gambar . . Timbangan analitik, TAE x, Gelas ukur

Gambar . . Botol pereaksi, agarose, ethidium bromide

Gambar . . Water destilation, pemanas

Gambar . . Penggaris sumur dan pencetak agar, seperangkat alat elektroforesis

Lampiran . Optimalisasi Primer

Gambar . . Optimalisasi primer

Konsentrasi

Konsentrasi ,

Lampiran . Gel documentation hasil elektroforesis agarose

Gambar . . Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom

DNA sampel

(Lanjutan)

Gambar . . Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari PCR DNA

sampel

Lampiran . Hasil kemurnian dan konsentrasi DNA sampel

Tabel . Kemurnian dan Konsentrasi DNA sampel

No No

Sampel

Konsentrasi

,

Lampiran . Hasil RFLP

Gambar . Hasil Elektroforesis RFLP terdapat hasil homozigot murni,

homozigot varian dan heterozigot varian

(Lanjutan)

Tabel. . Hasil Analisis Penggolongan SNP CYP A * A rs (T>C)

berdasarkan hasil RFLP

No No Sampel Jenis Kelamin Usia Hasi RFLP

Perempuan Heterovarian

Laki-Laki Homomurni

Perempuan Homovarian

Perempuan Homomurni

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Laki-Laki Homomurni

Laki-Laki Heterovarian

Perempuan Homomurni

Perempuan Homomurni

Perempuan Homomurni

Laki-Laki Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Laki-Laki Heterovarian

Laki-Laki Homovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Homovarian

Laki-Laki Heterovarian

Perempuan Homovarian

Laki-Laki Heterovarian

Laki-Laki Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Laki-Laki Homovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Homovarian

Perempuan Homovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Homovarian

Laki-Laki Heterovarian

Laki-Laki Heterovarian

Laki-Laki Homomurni

Laki-Laki Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Laki-Laki Homomurni

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Homovarian

Laki-Laki Heterovarian

Laki-Laki Homovarian

Perempuan Homomurni

Perempuan Heterovarian

Laki-Laki Homovarian

Perempuan Homomurni

Perempuan Heterovarian

Perempuan Homovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Homomurni

Perempuan Heterovarian

Laki-Laki Homomurni

Laki-Laki Heterovarian

Laki-Laki Homomurni

Laki-Laki Homomurni

Perempuan Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Homovarian

Laki-Laki Homomurni

Perempuan Homomurni

Laki-Laki Homomurni

Laki-Laki Heterovarian

Perempuan Heterovarian

Perempuan Homovarian

Perempuan Heterovarian

Laki-Laki Homovarian

Laki-Laki Heterovarian

Lampiran . Hasil analisa statistik

Jenis Kelamin

Jenis Kelamin

Frequency Percent

Valid

Percent

Cumulative

Percent

Valid Laki-Laki

Perempuan

Total

Usia Responden

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid

Total

Kategori Konsentrasi

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid rendah

baik

Total

Kategori Kemurnian ( )

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid rendah

baik

tinggi

Total

Hasil RFLP

Frequency Percent

Valid

Percent

Cumulative

Percent

Valid Homomurni

Homovarian

Heterovarian

Total

Jenis Kelamin * Hasil RFLP Crosstabulation

Ketegori Genotyping

Total

Homo

murni

Homo

varian

Hetero

varian

Jenis

Kelamin

Laki-Laki Count

% within Jenis

Kelamin

Perempuan Count

% within Jenis

Kelamin

Total Count

% within Jenis

Kelamin

Chi-Square Tests

Value df

Asymp. Sig. ( -

sided)

Pearson Chi-Square a ,

Likelihood Ratio ,

Linear-by-Linear Association ,

N of Valid Cases

a. cells ( ) have expected count less than . The minimum expected count

is .

Dari hasil uji Pearson Chi square didapat nilau signifikan (p-value) =

sehingga keputusan yang kita ambil adalah menerima Ho yang berarti bahwa

tidak ada perbedaan yang signifikan proporsi laki-laki dan perempuan

Lampiran . Curiculum vitae

Curiculum Vitae

Nama : Nurul Fathimah

Nama Panggilan : Fathimah

Jenis Kelamin : Perempuan

Tempat dan Tanggal Lahir : Bekasi, Juli

Usia : tahun

Golongan darah : AB

Mobile :

Agama : Islam

E-mail : nurulfathimah @gmail.com

Alamat : Jl. Kenanga RT Gedang, Porong Sidoarjo,

Jawa Timur

Pendidikan

a. Elementary School : SDN Gedang II Porong Sidoarjo

b. Junior High School : SMPN Candi Sidoarjo

c. Senior High School : SMAN Sidoarjo

d. University : Universitas Islam NegeriSyarif Hidayatullah

Pengalaman Organisasi

Ketua MERCY (MedicalReaserch Community)UIN Syarif H. -

Staff Pengembangan Wilayah PTBMMKI (PerhimpunanTim Bantuan

MedisMakasiswa KedokteranIndonesia) -

Staff Logistik USMR (UIN SyahidMedical Rescue) -

Penghargaan

Juara Literatur Review Scientific Work Competition ISMKI wilayah

Juara Esai Ilmiah JIMU FKUI

Karya Tulis

Kombinasi IMT, Usia Ibu, Doppler dan Biomarker Serum NGAL sebagai Deteksi

Dini Preeklampsia

Kombinasi Biomarker Serum (Inhibin A, Activin A, PIGF) dengan Doppler Arteri

Uterina sebagai Deteksi Preeklamsia dalam Upaya Membentuk Generasi

Muslim Tangguh melalui Kesehatan Reproduksi

Potensi Asam Askorbat dan Asam Asetat dalam LawaBuah Gandaria (Bouea

macrophylla) sebagai Kemopreventif pada Kanker Kolorektal dan Kanker

Gaster

Potensi Asam Askorbat dalam Asinan Buah Gandaria (Bouea macrophylla)

sebagai Kemopreventif pada Kanker Kolorektal

Mahasiswa Indonesia Pertama Konser Tunggal di Abu Dhabi

Man Jadda wa Jada, ManShabara Zhafira