STATUS PERKEMBANGAN PERBAIKAN SIFAT GENETIK PADI MENGGUNAKAN TRANSFORMASI

AGROBACTERIUM

Syamsidah RahmawatiPusat Penelitian LIPI, jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong

Dipresentasikan :

WIJIYONOMikrobiologi

Mahasiswa Sekolah Pasca SarjanaUniversitas Sumatera Utara

Latar belakangLatar belakang

Produktivitas beras Produktivitas beras rendahrendah

Tidak seimbang antara Tidak seimbang antara

produksi beras denganproduksi beras dengan konsumenkonsumen

Tehnik transfer gen langsung

Tehnik transfer gen Secara tak langsung

Perbaikan genetik padiDengan menggunakan

Agrobacterium tumifacien

Terobosan baru

Peran mikrobatanah

Produks gen:-nutrisi padi(golden rice)-tahan kering

Bakteri Agrobacterium tumifacien

• Kemampuan menstranfer potongan DNA (T-DNA) ke genom tanaman

• Komponen genetik Gen virulen kromosom (kromosomal virulence (chv) Kelompok gen virulen (vir) yang terdapat pada plasmid Ti• Daerah T-DNA dibatasi : LB (left border), RB (right border yang

merupakan gen Bakteri• Gen T-DNA : Gen ia aH, gen ia aM, dan ipt enzim

Mekanisme integrasi T-DNA dalam genom Tanaman(Inland (1996), Sheng dan Citovsky (1996), de la Riva et al.(1998)

Hoekema et al (1984) T-DNA dapat ditransfer meskipun terletak pada plasmid yang berbeda (plasmid ganda) binnary vektor.

Faktor yang mempengaruhi transformasi Agrobacterium

• Genotip dan jaringan tanaman/eksplan (Azhakanandam et al (2000) : keberhasilan

transformasi agrobacterium sangat tergantung pada genotip tanaman.

Jaringan yang baik : jaringan yang memberikan respon yang baik terhadap kultur jaringan.

Strain Agrobacterium dan Plasmid/vektor

Adanya penggunaan A. tumifaciens strain biasa (LBA) 4404) dikombinasikan dengan vektor super biner dengan gen ekstra gen virB, C dan G sangat efektif untuk menstranfer padi.

• Strain Agrobacterium dan Plasmid/vektor

- Adanya penggunaan A. tumifaciens strain biassa (LBA) 4404) dikombinasikan dengan vektor super biner dengan gen ekstra gen virB, C dan G sangat efektif untuk menstranfer padi.

- Berpengaruh terhadap efisiensi transformasi

- Kelemahannya terbatas pada inang yang diinfeksi

Asetosiringon dan Ph

• Senyawa fenolik yang berperanan dalam mekanisme transfer gen

• Kondisi Ph berpengaruh terhadap gen vir. Gen vir dapat diekspresiksn pada pH 5 -8 .

• Ph 5,2 adalah Ph yang paling baik untuk digunakan dalam transfer genetik.

• Setelah diko-kultivasi kalus direndam dalam larutan antibiotik : untuk menghindari berkembangnya bakteri Agrobakterium

• Dilanjutkan penggunaan antibiotik pada media regenerasi ( Yara et al.2001 )

Antibiotik untuk eliminasi Agrobakterium

Kondisi infeksi dan kokultur

• Bakteri yang digunakan untuk infeksi sel tanaman adalah

bakteri yang sedang tumbuh aktif ( fase logaritma ) • Sebelum inokulasi bakteri ditumbuhkan pada media yang

mengandung asetosiringon

Media induksi, Ko-kultivasi, regenerasi

• Media induksi N6 sedangkan media regenerasi adalah MS ( hiei et al.1994;Rashid et al.1996;Toki 1997; Yara et al. 2001; cao et al.2004).

• Toki 1997 : Penambahan casamino acids dan prolin dapat meningkatkan kemampuan regenerasi tanaman dan dapat menghasilkan tanaman trasgenik dalam waktu 2 bulan sejak induksi.

Bahan Penyeleksi

• Higromisin(hpt), fostinotrisin (bar) (Hiei et al.1994;rashid et al. 2003; Saharan et al. 2004; Jin et al, 2004).

• Kanamisin (nptII) atau G418 tapi penggunaannya sangat terbatas karena dapat menghambat pertumbuhan sel ( Azhakanandam et al. 2000)

Ekspresi dan Stabilitas Gen

• Penyisipan gen ke genom tanaman harus dapat diekspresikan.

• Espresikan gen dapat ditingkatkan dengan penambahan enhancer dikombinasikan dengan penggunaan promoter yang kuat atau promoter spesifik.

Stabilitas Gen

• Gen yang telah terintegrasi pada genom tanaman, maka gen tersebut akan stabil diwariskan ke generasi berikutnya.

• Hiei dan Komari (1996) melaporkan trasgen stabil diwariskan hingga generasi ke 4.

• Wu et al.(2002) melaporkan trasgen stabil diwariskan hingga generasi ke 6.

• Rashid et al (1996) melaporkan kegagalan mengekspresikan gen disebabkan karena ada pebungkaman gen.

Prospek

• Tanaman padi yang mengandung gen :

Tahan penggerek batang

Penyakit blas

Hawar daun

Kekeringan, salinitas dan herbisida

• Tanaman padi dengan daya hasil tinggi, kandungan zat besi dan vitamin A yang tinggi

Tabel1. Beberapa gen yang telah diintroduksi ke dalam tanaman menggunakan transformasi Agrobacterium

Gen Asal Promotor S.Sasaran Varitas Pustaka

crylAb,crylAc B. Thuriengiensis Ubi,CaMV35S,BrassicaBp10

Tahan PBK dan PBP

Nipponbare(Japonica)’

Cheng et al.(1998)

Ferritin Kedelai GluB-1 Padi mengandung zat besi dan zink

Indica (IR68144) Goto et al (1999); Vasconcelos et al.(2003)

Psy,lyc,crt1 Bunga daffodil

Bakteri Erwinia

uredovora

Gt1,35s CaMV Padi mengandung Pro Vitamin A

Japonica(TP309) Yeetal (2000)

rhLF(lactoferrin) Manusia Ubiquitin jagung Padi mengandungg lactoferin

Javanica(rojolele) Rahmawati dan slamet ledin (2004)

Ech42, nag 70,glue48 Trichoderma atriviride Act1 Tahan Rhizoctonia solani dan magnaphore grisea

Ishikari-shiroge(japonica)

Mei et al.9200020

Crylb-crylaa hybrid Bt Ubiquiin jagung Tahan pbk Japonica(rojolele0 Rahmawati dan slamet Loedin (2004)

VHb dan EPsps Bakteri vitreoscilla dan slmonella typhimurium

Pistilspesifik dari kentang da CaMV35S

Hasil tinggi dan tahan herbisida

Japonica(Xius 11,Qiufeng,youfeng, dan Hanfeng)

Cao et al.(2004)

Chitinasel Padi CaMV Tahan jamur penyebab blas Magnaporthe grisea dan Rhizoctonia Solani

Indica(vaidehi,tulsi) Nishizawa et al.(2002)

Hva1 Barley Promtor terinduksi ABA, promotor konstitutive actin 1 padi

Osmoprotektan Indica(Basmati0 Rohila et al.(2002)

otsA-otsB Bakteri E coli Promotor terinduksi ABA dan stres,rbcS

Tahan salinitas dan kekeringan

indica9PB-1) Gang et al.(2002)

Kesimpulan

• Transformasi agrobacterium telah berhasl dilakukan pada berbagai kultivar padi japonica, indica dan javanica

• Keberhasilan trasformasi ditentukan oleh :pemilihan genotip, jaringan tanaman, umur eksplan, strain agrobacterium, vektor, konsentrasi asetosiringon dan Ph, kerapatan sel bakteri, lama dan suhu kokultivasi, antibiotik, bahan penyeleksi, komposisi media kultur .

• Peningkatan efisiensi transformasi disebabkan : penggunaan asetosiringon dan bahan pemadat yang tinggi, pengeringan kalus secara perlahan atau penambahan antinekrotik pasca ko kultivasi .

• Peningkatan ekspresi gen : pemilihan promoter, penggunaan kodon yang sesuai, penambahan enhancer

• Gen tunggal dan poligenik telah berhasil diintroduksikan ke dalam tanaman padi dalam upaya perbaikan mutu genetik padi

• Kemampuan transformasi Agrobakterium menghasilkan tanaman transgenik dengan salinan tunggal.