MIKROBIOLOGI KESEHATAN

Dosen pengampu: Dr. Dwi Suryanto, M.Sc

Dipresentasikanoleh

Wijiyono/ 077030026

Mikrobiologi PascasarjanaUniversitas Sumatera Utara

2008

Pengaruh Ekstrak daun Sirih Terhadap Streptococcus mutans

T. Nalina and Z.H.A. RahimDepartement of Oral Biology, Faculty of Dentistry, University of Malaya, 50603

Kuala Lumpur, Malaysia

American Journal of Biotechnology and Biocheistry 3(1) : 10-15,2007

MIKROBIOLOGI KESEHATAN

Abstrak

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun sirih terhadap Streptococcus mutans. Peneliti memfokuskan pada pengaruh ekstrak daun sirih terhadap struktur sel dan produksi asam yang dihasilkan oleh Streptococcus mutans.TEM digunakan untuk menentukan pengaruh ekstrak daun sirih terhadap ultra struktur bakteri. Untuk mengetahui produksi asam yang dihasilkan oleh bakteri dengan menggunakan analisis pH drop assay. Selanjutnya menentukan komponen senyawa kimia yang ada pada ekstrak daun sirih dengan menggunakan ( gas chromatographs mass spectrometry (GCMS). Dengan menggunakan micrographs elektron transmisi menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih menyebabkan kerusakan pada membran plasma dan mengakibatkan terjadinya koagulan pada nuceoid. Ekstrak daun sirih secara nyata mampu menurunkan produksi asam . Analisis secara kimia menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih mengandung senyawa : hydroxichavicol, Asam lemak ( stearic, palmatic) dan ester asam lemak hydroxi ( Stearic, palmitic dan myristic )

MIKROBIOLOGI KESEHATAN

Dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun sirih memiliki sifat anti kariogenik yang menyebabkan penurunan produksi asam dan perubahan struktur bakteri. Penelitian lebih lanjut akan dilakukan mengenai keberadaan senyawa hydroxichavicol, asam lemak dan asam lemak hydroxy ester pada ekstrakdaun.

Kata Kunci : S. mutans, Pipere beatle L., bioautography, acid production

MIKROBIOLOGI KESEHATAN

PENDAHULUAN

Asia : daun sirih digunakan sebagai obat penyakit Periodental dan caries

Menurut fatahillah et al: Ekstrak daun sirih memiliki sifat anti bakteri terhadap streptococcus mutans, Streptococcus saquis dan Actinomycetes viscosus

Sifat anti bakteri daun sirih : Menurunkan pertumbuhan Menurunkan kemampuan pelekatan plague Menurunkan aktivitas glukosil transferase

Razak dan halim : adanya ekstrak daun sirih mampu mengurangi pelekatan plague yang secara tidak langsung menghambat pelekatan bakteri dengan cara menbuat lingkungan tidak kondosif.

Ekstrak daun sirih berpotensi menghambat pertumbuhan bakteri dan aktivitas dari glucosiltransferase (GTF)

Ketidakberadaan GTF : mempengaruhi formasi glukosa yang menyebabkan lingkungan kurang kondusif untuk pertumbuhan bakteri.

BAHAN DAN METODE

Bahan : Piper beatle L. dari Mentakab Pahang

Preparat suspensi bakteri : Streptococus mutans ATCC 25175 dari

kultur USA. Biakan bakteri disimpan di dalam glycerol

pada suhu -70oc.

Menyiapkan preparat ekstrak daun sirih

Analisis terhadap produksi asam :1. cairan ekstrak yang steril :

2. 1, 2,5,10 mgmL-1 masing-masing dimasukan ke dalam tabung ukuran 13 x 150 mm yang berisi 20 m l BHI broth dan 1% glukosa.

3. 100 ul biakan kultur dari bakteri Streptococcus diinokulasika ke dalam media broth.

4. Inkubasikan pada suhu 37 oc

Penelitian Ultra struktur sel : TEM ( transmission elctron microscoopy )

Pertumbuhan dan kultur bakteri :Streptococcus mutans ATCC 25175 sebagai kultur primer. kultur bakteri yang telah ditumbuhkan pada media kaldu otak jantung mengalami keterlambatan pertumbuhan pada fase log ( kerapatan optis 1.20 pada 550 nm ).

Sebelum diujikan ,butiran sel dicuci 3 kali dalam air suling dingin seperti air es dan dilarutkan dalam kaldu dengan kerapatan optis 0.144 pada 550 nm

Perlakukan bakteri dengan ekstrak tanaman

1. Suspensi sel (10) ml di preinkubasikan pada suhu 37oc selama 1 jam dan kemudian diuji cobakan pada konsentrasi 1 mg ml/l dan 2 mg ml/l .

2. Campuran larutan ( volume : 100 mL) diinkubasikan selama 2 jam.

3. Moutrinse yang berisi chlorhexidine (0.12%) dan air deionised steril berturut turut digunakan sebagai hal positif dan kontrol ( negatif)

4. Setelah 2 jam masa diinkubasikan, sel diendapkan dengan sentrifuge dan diamati dengan miskroskop elektron.

TEM ( Transmission Electron microscopy )

1. Kontrol dan perlakukan yang telah dicampur dalam 4% glutaraldehyde dan 15 osmium tetraoksida (0.1 )cacodylate larutan buffer pH 7.4 ) pada suhu kamar.

2. Penghilangan sisa senyawa osmium tetraoksida, sampel dikeringkan pada ethanol dingin ( 35 -100%).

3. Tiap tahap dilakukan selama 10 -15 menit pada suhu kamar.

4. Sampel sel ditempelkan pada blok-blok kecil dari bakteri yang kemudian dipotong dengan ultramicrotom ( Ultracut , reichert )

5. Lapisan tipis ultra, kemudian dianalisa dengan menggunakan TEM ( Libra 120,Leo)

Analisis kimia

Ekstrak daun sirih (10mg) dianalisi dengan TLC pad agel silika G plate Ukuran (20x 10 cm) ( Macherey-Nagel) menggunakan larutan cloroform ( Mallinckrotdt)- Metanol ( Fisher scientific ) ( 90 ;10)

Siapkan Tiga sets dari puring TLC ( A,B,C)

Piring A sebagai acuan kromatogram digunakan noda noda yang ditunjukkan oleh radiasi UV ( 254 dan 366 nm )

cawan B digunakan bioautografi

cawan C digunakan untuk mengidentifikasi noda nda pada senyawa fenolik

• 25% reagen Ciocalteu fenol ( sigma Chemical Co) digunakan untuk mengidentifikasi noda senyawa penolik.

• Piring C, Asam tannic ( signa Chemical Co) yang telah ditambahkan dan dugunakan sebagai petunjuk untuk senyawa penolik.

• Nilai Rf dapat ditentukan dengan pemisahan noda pada plate TLC.

• Nilai Rf dari suatu senyawa adalah perbandingan jarak subtansi dengan jarak larutan pada cawan

Bioautografi

• Chromatogram dikembangakan sebagai gambaran yang ditempatkan pada pteridish bioesay steril ( NUNC) dan inokulum bakteri yang berisi 10 6 CFU mL-1 di dalam media Agar Molten BHI (OXOID) yang telah di tempatkan pada cawan.

• Stelah media beku, petridish bioesay steril diinkubasikan pada suhu 37oc selama 24 jam.

Analisis kimia ekstrak daun dengan Gas Chromatography-Mass spectrometry (GCMS)

Setitik noda yang merupakan aktivitas antibakteri kemudian diuraikan dengan etanol dan sentrifuge.supernatant dikumpulkan kemudian disaring dengan ukuran 0.45 um dan diuapkan sampai kering . Derivat Trimethisilyl (TMS) dari ekstrak disiapkan dengan menggunakan N, O-bis ( trimethylsilyl ) trifluoroacetamide ( BSTFA, Aldrich, St Louis, MO ). Kira-kira 3 mg dari ekstrak dimurnikan dalam 300 uL BSTFA yang dipanaskan pada suhu 60oC selama 60 menit dan dianalisis dengan menggunakan GCMS. Dari analisis diperoleh gas chromatography ( Agilent GC 5973N) yang dilengkapi dengan masa detektor selektif ( Agilent G2589A) di dalam electron impact ionization mode, ukuran pipa SGE BPX5 ( 30m x0.25mmx0.25 um ). Prosedur instrumen menurut cara yang digambarkan oleh Uzel et al.

Persentasi tiap senyawa dihitung sebagai ratio antara ujung area dengan total area chromatograhic. Ujung area GCMS diidentifikasi dengan membandingkan beberapa data dari penelitian seperti dari Wiley 7n dan NIst 98 libraries.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Gambar 1; menunjukkan pengaruh ekstrak daun sirih terhadap S.mutans. Kadar 1 mg mL-1 menunjukkan mampu menurunkan laju produksi asam sampai 93,53%. Peningkatan konsentrasi dari 2, 5 dan 10 mg mL-1 mampu menurunkan laju produksi asam dari 88,20 , 40,51 dan 23,56%.

Gambar 2A; Micrograph elektron menunjukan pengaruh

terhadap sitologi dari ekstrak daun sirih terhadap S.mtans. Gambar 2A adalah micrograph elektron yang meunjukkan kontrol, yang sel-sel luarnya baik dan diantara dinding selnya tebal dan membran plasma sel utuh.

Kontrol ( 2A)

Chlor hexidine 0.12 1 mg L-1

1 mg L-1 2 mgL-1

2 mg L-1

Gambar 2B : menunujukkan bahwa micrograph elektron pada perlakuan terhadap S.mutans dengan cara beerkumur yang berisi chlorhexidine (0,12). Perlakuan berikutnya sebagai kontrol. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa nuleoid dan membran plasma mengalami disintegrasi dan sitoplasma rusak pada bagian luar sementara sel masih utuh. Ini menunjukkan bahwa terjadi lisis pada awal.

Chlor hexidine 0.12

Pengaruh ekstrak terhadap struktur ultra S.mutans (gambar 2c-2f). Pengaruh dengankadar 1 mg ml-1 ditunjukkan pada gambar 2c dan

2 D dan kadar 2 mg ml-1 ditunjukkan pada gambar 2E dan 2F. Semua micrograph menunjukkan bahwa sel mengalami koagulasi yang terlihat pada elektron filamen yan g tipis dan terjadi kerusakan pada membran plasma sel dan diantara dinding sel. Pengaruhnya akan lebih nyata lagi bila konsentrasi di naikan.

1 mg L-1

1 mg L-1 2 mg L-1

2 mg L-1

Gambar 3. menunjukkan bahwa komponen kimia dari ekstrak daun sirih yang dianalisi dengan TLC. Cawan A adalah Chromatograph yang menunjukkan pemisahan komponen dengan TLC. Komponen ekstrak dipisahkan ke dalan satu atau 2 lebih noda. Cawan B adalah perlakuan kromatogram dengan bakteri inokulum untuk menentukan noda zona antibakteri pada sejumlah noda yang diamati, noda yang tebal besar memiliki aktivitas antibakteri dengan diameter hambatan 30 + 0,86 mm ( mean + standar deviasi dari 9 determinan). Cawan C adalah chromatogram yang disemprot dengan 25% reagent folin ciocalteu phenol . Noda yang lebih besar memiliki nilai Rf antara 0.82 sd. 0.91 yang berhubungan dengan zona hambatan . Pada cawan B, tidak adanya zona yang diamati ,hal ini disebabkan karena nila Rf di bawah 0.82

Gambar 4. Chromatogram (GCMS) pada ekstrak daun sirih dan kadar senyawa yang diidentifikasi ditunjukkan sebagai berikut . Senyawa yang terdapat pada ekstrak daun sirih sebagai berikut :

senyawa hidroxychavicol (39,31 %) Asam lemak ( stearik 3,77 % ) Palmatik (1,60%) Asam Hidroxy benzeneacetic ( 31,96%) Hydroxy esters dari asam lemak ( stearik (24,49%) Palmatik ( 14,71%) Miristik ( 1,58%)

Tabel 1: GCMS data ( Rl mode) for TMS derivaties of some komponen pada ekstrak daun sirih

Ekstrak daun sirih mengandung senyawa :Hexadecanoic acid---- palmatic acidOctadecanoid---- stearic acidHexadecanoid acid,2,3-bis (hydroxy) propil ester-palmitic acid,2,3-bis(hydroxy) propyl esterOctadecanoid acid,2,3-bis(hydroxy) propyl ester—stearic acid,2,3-bis(hydroxi)propyl ester*Jumlah massan.d.- tidak terdeterminan

Senyawa ekstrak daun sirih memiliki sifat anti bakteri, sebagai surfaktan anionik dan antifungi .

Penambahan senyawa ekstrak daun sirih bersifat selektif terhadap gram positif yang mempengaruhi tgerhadap struktur , fungsi dinding sel dan membran sel.

Senyawa ekstrak daun sirih berpengaruh terhadap penurunan aktivitas produksi asam dan struktur ultra dinding sel bakteri .

KESIMPULAN

Senyawa ekstrak daun sirih berfungsi sebagai enzim glikolitik yang merupakan faktor yang mempengaruhi adanya aktivitas antibakteri.

Adanya senyawa ekstrak daun sirih menyebabkan membran sel bersifat lebih permiable, sehingga menyebabkan senyawa ekstrak daun sirih masuk ke dalam sel bakteri yang menyebabkan koagulasi pada nukleus walaupun selnya masih utuh.

SEKIAN

Terima kasih

MIKROBIOLOGI KESEHATAN