DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume ... · PENDAHULUAN ... sel di daerah...

DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) SEBAGAI

AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)

MELALUI REGULASI Bcl-2

SKRIPSI

Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Disusun Oleh :

Fira Elsa Septiana

138114001

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

HALAMAN JUDUL

DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) SEBAGAI

AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)

MELALUI REGULASI Bcl-2

SKRIPSI

Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Disusun Oleh :

Fira Elsa Septiana

138114001

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017


ii

PERSETUJUAN PEMBIMBING

Persetujuan Pembimbing


iii

HALAMAN PENGESAHAN


iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA


v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI


vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ini ku persembahkan kepada :

Kemuliaan Tuhan Yesus Kristus

Kedua orang tuaku

Sahabat dan teman-teman

Farmasi angkatan 2013

Dan Almamaterku, Universitas Sanatha Dharma


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala

berkat, rahmat, dan kurnia-Nya yang telah dilimpahkan, sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi dengan judul “Daun Keladi Tikus (Typhonium flagelliforme

(Lodd.) Blume) sebagai Agen Kemopreventif terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa)

Melalui Regulasi Bcl-2”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam

memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta. Penyusunan skripsi telah banyak melibatkan berbagai pihak

baik langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, pada kesempatan ini, penulis

ingin menyampaikan terimakasih kepada :

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Dr. Riris I. Jenie, M.Si., Apt., selaku pembimbing atas segala motivasi dan

kesabaran dalam membimbing, mendukung, dan membantu penulisan dari awal

hingga skripsi ini dapat terselesaikan.

3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun.

4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun.

5. Staf laboratorium Fakultas Farmasi USD, Bapak Yohanes Wagiran, Mas Bimo

Widura, Staf laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM, Ibu Suprihatin,

serta laboran lainnya yang telah membimbing dan membantu penulis dalam

penelitian di laboratorium.

6. Orang tua saya, Ibu Ester Dyah Retnowati, Bapak Mariyoto, dan Bapak Hadi

Prayitno. Nenek saya Inhartatiningsih dan saudara-saudara saya Deny Julian

Adela, Octa Wisnu Wardana, Allysa Sukma Maharani yang selalu memberi doa,

dukungan, motivasi, dan kasih sayang. Hal tersebut memicu saya menjadi

semangat dan kuat sehingga penulis bisa menyelesaikan skripsi ini.


viii

7. Orang tua rohani saya, Shari dan Beni Nugroho. Saudara saya Nathania Devina,

Vanessa Lyora, Angelo Adi Gempar Persada, Srikah, Ezra Septian yang senantiasa

memberikan doa, bimbingan, motivasi, kasih sayang dan semangat kepada penulis

untuk menyelesaikan skripsi ini.

8. Saudara saya, Melantina Maria dan Agnes Marhilo serta semua saudara-saudara

komsel USD yang telah memberikan doa, motivasi, kasih sayang dan semangat

kepada penulis.

9. Teman-teman seperjuangan dan sahabat dalam penelitian Maria Nareswari dan

Lela Francisca Adi Liana atas kerja sama, kebersamaan, bantuan, dan perjuangan

selama penelitian ini berlangsung.

10. Sahabat saya, Liana Yudhomulyono, Amanda Anggraini, Maria Atika Sukmana,

dan semua teman-teman FSM A dan FKK A angkatan 2013 atas kebersamaan

selama ini.

11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu yang turut membantu

penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan dan jauh dari

sempurna, maka penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua

pihak yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Mohon maaf atas segala

kesalahan dan kekurangan penulis yang terdapat dalam laporan akhir skripsi ini.

Akhir kata, penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak dan

bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang kefarmasian.

Yogyakarta, 31 Januari 2017

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ...................................................................................................... i

PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................................... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................................... iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... v

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................................. vi

DAFTAR ISI ................................................................................................................ ix

DAFTAR TABEL ........................................................................................................ xi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. xii

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................. xiii

ABSTRAK ................................................................................................................. xiv

ABSTRACT .................................................................................................................. xv

PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1

METODOLOGI PENELITIAN .................................................................................... 2

Bahan Penelitian ........................................................................................................ 2

Alat Penelitian ........................................................................................................... 3

Determinasi dan Ekstraksi ......................................................................................... 3

Pembuatan Larutan Uji .............................................................................................. 3

Panen Sel ................................................................................................................... 4

Uji Sitotoksik dengan MTT ....................................................................................... 4

Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ....................................................................... 4

Uji Imunositokimia .................................................................................................... 5

Analisis Hasil ............................................................................................................ 6

Analisis Nilai IC50 .................................................................................................. 6

Analisis Uji Apoptosis ........................................................................................... 6

Analisis Uji Imunositokimia .................................................................................. 6

HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................................... 7


x

Determinasi dan Ekstraksi Daun Keladi Tikus ......................................................... 7

Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa ........................................... 8

Uji Apoptosis menggunakan Flowcytometry dengan Anexin V ............................. 10

Uji Imunositokimia .................................................................................................. 13

KESIMPULAN ........................................................................................................... 15

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 16

LAMPIRAN ................................................................................................................ 20

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................................ 31


xi

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Hasil uji apoptosis menggunakan flowcytometry ...................................... 11

Tabel 2. Distribusi ekspresi Bcl-2 pada sel Hela ..................................................... 13


xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi secara mikroskopis ............................... 8

Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ....... 9

Gambar 3. Induksi apoptosis ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ... 11

Gambar 4. Ekspresi Bcl-2 ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ....... 13


xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar tanaman keladi tikus dan proses ekstraksi .......................... 21

Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay ........................................................ 22

Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis ............................................................... 23

Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia ...................................................... 27

Lampiran 5. Surat Keterangan hasil determinasi tanaman keladi tikus ................ 29

Lampiran 6. Surat Ethical Clearance .................................................................... 30


xiv

ABSTRAK

Kemopreventif merupakan suatu upaya untuk mencegah, menunda, ataupun

melawan perkembangan sel kanker dengan menggunakan bahan alam, sintesis, atau

kombinasi dari keduanya. Salah satu bahan alam yang memiliki potensi antikanker

adalah tanaman keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) yang

dimanfaatkan sebagai terapi alternatif pada kanker. Pada penelitian sebelumnya, daun

keladi tikus memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa dan kanker

kolon WiDr. Tujuan. Mengetahui potensi ekstrak etil asetat daun keladi tikus

terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan

pengaruh terhadap protein Bcl-2 yang berperan sebagai antiapoptosis. Metode. Uji

sitotoksik dengan metode MTT, uji induksi apoptosis menggunakan metode

flocytometry dan uji imunositokimia untuk observasi aktivitas ekstrak etil asetat daun

keladi tikus dalam meregulasi protein Bcl-2. Hasil. Hasil yang diperoleh, ekstrak etil

asetat daun keladi tikus memiliki aktivitas sitotoksik lemah dengan nilai IC50 640

µg/mL. Hasil uji apoptosis pada konsentrasi ½ IC50 dengan waktu inkubasi 24 jam

menunjukkan bahwa sampel menginduksi kematian (apoptosis 12% dan nekrosis

sekunder yang merupakan lanjutan dari apoptosis 86%) sehingga perlu observasi

lebih lanjut pada waktu inkubasi kurang dari 24 jam. Hasil uji imunositokimia

menunjukkan sampel menekan kuat ekspresi protein Bcl-2, sehingga kemungkinan

induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2. Bedasarkan hasil

tersebut, potensi esktrak etil asetat daun keladi tikus sebagai agen kemopreventif

masih perlu ditelusuri lebih lanjut terutama induksi kematian sel.

Kata kunci: kanker serviks, Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, sel HeLa,

protein Bcl-2


xv

ABSTRACT

Chemopreventive an attempt to prevent, delay, or against the development of

cancer cells using natural product, synthetic, or combination of both. Natural product

that has the potential anticancer is rodent tuber (Typhonium flagelliforme (Lodd.)

Blume) which is used as an alternative therapy in cancer. Previous research represent

that rodent tuber leaves have a cytotoxic effect on HeLa cervical cancer cells and

WiDr colon cancer cells. Objective. To determine the potential of ethyl acetate

extract of rodent tuber leaves against HeLa cervical cancer cell related cytotoxic

activity, induction of apoptosis and effect on protein Bcl-2 as regulator antiapoptosis.

Method. Cytotoxic test was conducted using MTT assay, induction of apoptosis test

using flocytometry, immunocytochemistry test to observe the activity extracts in

regulating protein Bcl-2. Results. The results, ethyl acetate extract of rodent tuber

leaves have a weak cytotoxic activity with IC50 values of 640 µg/mL. The result of

apoptosis assay in concentration ½ IC50 with 24 hours incubation period showing that

samples induce death (12% apoptosis and secondary necrosis which is the

continuation of apoptosis 86%), need further observation on incubation period of less

than 24 hours. The result of immunocytochemistry assay showed sampel suppresses

powerfully expression of Bcl-2 protein, the possibility induction of apoptosis

mediated by suppresses the expression of Bcl-2 protein. Therefore, potential of the

ethyl acetate extract of rodent tuber leaves as kemopreventif agent need further

exploration, especially the induction of cell death.

Keywords: cervical cancer, Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, HeLa cells, Bcl-

2 protein


1

PENDAHULUAN

Kanker merupakan keadaan sel-sel dalam tubuh mulai tumbuh tidak kendali dan

dapat menyebar ke seluruh tubuh. Kanker serviks merupakan kanker yang berkembang dari

sel di daerah serviks atau mulut rahim sampai bagian bawah uterus (American Cancer Society,

2016). Menurut data dari IARC 2015, prevalensi kanker serviks memiliki tingkat mortalitas

dan morbiditas yang tinggi dan menduduki peringkat keempat di belahan benua Australia,

Eropa, Afrika dan Asia setelah kanker payudara dan kanker kolon. Di Indonesia, prevalensi

kanker serviks menduduki peringkat ketiga setelah kanker payudara (Ferlay, dkk., 2015).

Sebagian besar penderita kanker serviks berobat dengan keadaan stadium lanjut

sehingga mengakibatkan rendahnya angka survival (DeSantis, dkk., 2014). Penemuan obat-

obat kemopreventif dan alternatif banyak dilakukan untuk penelitian kanker. Kemopreventif

merupakan suatu upaya untuk mencegah, menunda, ataupun melawan perkembangan sel

kanker dengan menggunakan bahan alam, sintesis, atau kombinasi dari keduanya (Sharma,

2012). Beberapa obat herbal dilaporkan efektif untuk menghambat pertumbuhan sel kanker

serviks dan berpotensi untuk digunakan pada terapi kanker serviks (Galluzzi, dkk., 2014).

Oleh sebab itu, upaya penemuan agen kemopreventif dengan target yang spesifik perlu

ditingkatkan.

Kanker serviks sebagian besar disebabkan karena adanya infeksi Human Papiloma

Virus (HPV). Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui mengekspresikan dua

onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 berikatan dengan tumor suppressor protein p53 dan

mempercepat degradasi p53, serta menekan aktivitas p53. Pada keadaan ini mediator

antiapoptosis (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w) terinduksi, sehingga jumlahnya berlebih. Jumlah

mediator antiapoptosis yang berlebih mengakibatkan proses apoptosis atau kematian sel

terhambat (You, dkk., 2010). Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) berperan dalam proses apoptosis pada

sel karena Bcl-2 dapat menghambat pelepasan sitokrom C sehingga proses apoptosis

terhambat (de Bruin & Medema, 2008). Dengan demikian, salah satu target molekuler dari

perkembangan terapi kanker serviks adalah yang potensial adalah Bcl-2.

Daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) diketahui memiliki

aktivitas antikanker, detoksifikasi, antiinflamasi, antivirus dan antibakteri. Dari beberapa

penelitian disebutkan bahwa daun keladi tikus dimanfaatkan sebagai terapi alternatif pada

kanker payudara, kolon, paru-paru, serviks dan leukemia (Masood, dkk., 2011). Ada beberapa


2

kandungan kimia dalam daun keladi tikus antara lain alkaloid, flavonoid, terpenoid dan

steroid. Alkaloid dan flavonoid merupakan kandungan kimia terbesar dalam daun keladi tikus

(Mankaran, dkk. 2013). Dari penelitian Da’i, dkk. (2007) dilakukan uji sitotoksik dari ekstrak

diklorometan, etil asetat dan etanol 98% daun keladi tikus terhadap sel HeLa. Ekstrak etil

asetat daun keladi tikus memiliki nilai IC50 147,77 µg/mL. Ekstrak etil asetat daun keladi tikus

memiliki efek sitotoksik paling baik dibandingkan dengan ekstrak diklorometan dan etanol

98%. Secara in vitro ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki nilai IC50 yang baik

dibandingkan n-hexan dan etanol pada sel leukemia yaitu 11,81 µg/mL (Katrin, dkk., 2012).

Sedangkan ekstrak etanol 80% keladi tikus memiliki nilai IC50 30,19 µg/mL terhadap sel

HeLa (Purwaningsih, dkk., 2014). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui

mekanisme molekuler yang spesifik pada kanker serviks.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi ekstrak etil asetat daun keladi tikus

terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan pengaruh

terhadap regulasi protein Bcl-2 yang merupakan regulator antiapoptosis. Sel kanker serviks

yang digunakan untuk penelitian ini adalah sel kanker serviks HeLa yang merupakan sel epitel

kanker serviks. Sel kanker serviks HeLa digunakan karena sel bersifat imortal dan dapat

membelah secara tidak terbatas selama memenuhi kondisi dasar bagi sel untuk tetap hidup,

selain itu sel kanker serviks HeLa dipilih karena cukup aman dan umum digunakan (Landry,

dkk., 2013). Uji MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) dilakukan

untuk mengetahui aktivitas sitotoksik, uji apoptosis menggunakan metode flowcytometry

untuk mengetahui induksi apoptosis dan uji imunositokimia untuk mengetahui regulasi protein

Bcl-2.

METODOLOGI PENELITIAN

Bahan Penelitian

Ekstrak etil asetat daun keladi tikus, cisplatin 10mg/10mL dari Kalbe Farma, sel

kanker serviks HeLa didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas

Gadjah Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etil asetat teknis, media kultur DMEM

(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 10% (Gibco), Tripsin 0,025%, PBS (Phosphat Buffer

Saline), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0,01 N, DMSO (dimethylsulfoxide)

(Merck) dengan konsentrasi tertinggi 0,35%, akuades, reagen Annexin V Fluos staining kit


3

(Roche) mengandung 100 mL binding buffer 2 mL Anexin V : 2mL propidium iodida (PI) ,

reagen MTT (sigma) 5 mg/mL, etanol, primary monoclonal antibody mouse anti-human Bcl-2

Oncoprotein (Dako), secondary antibody (Biocare), streptavidin, larutan DAB

(diaminobenzidin), Mayerhematoxilin.

Alat Penelitian

Alat–alat gelas steril (Pyrex), timbangan analitik, blender, waterbath (Memmert),

rotary evaporator (buchi Labortechnik AG CH-99230), oven, 96 well-plate (Iwaki), 6 well-

plate (Iwaki), sentrifuge tube, inkubator CO2 (Thermo Heraeus HeraCell 150), Laminar air

flow cabinet (Labconco), mikropipet, hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad),

kamera digital (Canon 550D), mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus),

flowcytometry (FACS Calibur).

Determinasi dan Ekstraksi

Tanaman keladi tikus didapatkan dari Malang, Jawa Timur dengan usia 2-6 bulan.

Sebelumnya tanaman dideterminasi menggunakan buku acuan menurut Backer, 1963

dilakukan di Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada (lampiran 5). Daun yang dipilih adalah

daun tua yang berwarna hijau pekat (Nobakht, dkk., 2014) kemudian daun dipetik dan

dikeringkan dalam oven dengan suhu 40-500C. Daun yang telah kering dihaluskan

menggunakan blender untuk menjadi simplisia serbuk daun keladi tikus. Serbuk daun keladi

tikus ditimbang sebanyak 10 gram kemudian direndam dalam 100 ml etil asetat dalam

erlenmeyer bertutup dan digojok menggunakan shaker selama 24 jam. Dilakukan remaserasi

dengan etil asetat seperti proses sebelumnya hingga pelarut tidak berwarna. Kemudian

hasilnya ditampung dan dipekatkan menggunakan rotary vaccum evaporator (Setiawati, dkk.,

2016).

Pembuatan Larutan Uji

Ekstrak etil asetat daun keladi tikus ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan

kedalam 100 μl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000 μg/

mL, selanjutnya dibuat seri kadar pengenceran untuk melakukan optimasi dengan konsentrasi

1.500 μg/ mL, 750 μg/ mL, 375 μg/ mL, 187,5 μg/ mL, 94 μg/ mL, 47 μg/ mL, dan 23 μg/ mL.

Cisplatin konsentrasi 10 mg/10 mL, kemudian diambil 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi

1mg/mL atau setara dengan 1000 μg/mL. Kemudian dibuat seri kadar pengenceran untuk


4

melakukan optimasi dengan konsentrasi 160 μg/ mL, 80 μg/ mL, 40 μg/ mL, 20 μg/ mL, 10

μg/ mL, 5 μg/ mL dan 2,5 μg/ mL.

Panen Sel

Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen yang terlihat monolayer dibawah

mikroskop, sel yang telah diinkubasi diambil dari inkubator CO2 dan diamati kondisi sel.

Media kultur DMEM 10% dibuang, kemudian sel dicuci tiga kali menggunakan PBS.

Selanjutnya tambahkan 2 ml tripsin 0,025% secara merata dan diinkubasi dalam inkubator

selama 3 menit. Sel dipindahkan ke dalam conical tube sampai semua sel terlepas dari plate,

kemudian PBS ditambahkan sampai 10 ml untuk deaktivasi tripsin. Selanjutnya disentrifuge

selama 10 menit, kemudian PBS dibuang dan ditambahkan media DMEM 10% sebanyak 1-2

ml. Sel diresuspensi menggunakan pipet, kemudian diambil sebanyak 10 μl dan dipindahkan

ke hemacytometer untuk dihitung di bawah mikroskop (Nobakht, dkk., 2014; CCRCa, 2009).

Uji Sitotoksik dengan MTT

Uji sitotoksik dilakukan dengan cara memberi perlakuan pada sel (dengan populasi

1x106/mL) yang telah ditanam dalam 96 well-plate. Pertama, media kultur dibuang terlebih

dahulu kemudian ke dalam tiap lubang diberi 100 μl seri konsentrasi sampel (1.500 μg/ mL,

750 μg/ mL, 375 μg/ mL, 187,5 μg/ mL, 94 μg/ mL, 47 μg/ mL, dan 23 μg/ mL yang telah

diencerkan dalam media dan 100 μl seri konsentrasi cisplatin (160 μg/ mL, 80 μg/ mL, 40 μg/

mL, 20 μg/ mL, 10 μg/ mL, 5 μg/ mL dan 2,5 μg/ mL), pada kolom kontrol sel diberi media

kultur sedangkan pada kolom kontrol media dikosongkan, lalu diinkubasi selama 24 jam

dalam inkubator CO2. Setelah inkubasi 24 jam, media kultur dalam well-plate dibuang lalu ke

dalam tiap lubang diberi 100 μl larutan MTT dalam media kultur dan diinkubasi selama 4 jam.

Setelah 4 jam ke dalam tiap lubang diberi 100 μl reagen stopper SDS kemudian plate

dibungkus dengan alumunium foil dan diinkubasi di ruang selama 24 jam. Setelah inkubasi,

dilakukan pembacaan absorbansi menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 595

nm (Xu, dkk., 2014; CCRCd, 2009).

Uji Apoptosis dengan Flowcytometry

Sel ditanam (dengan populasi 1x106/mL) dalam 2 mL media DMEM 10% di dalam 6

well-plate, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, sampel dengan konsentrasi ½

IC50 yang telah diencerkan dengan media 2 mL dimasukkan ke dalam tiap sumuran dan

diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dalam tiap lubang diambil dengan mikropipet


5

dipindahkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL PBS, kemudian diambil lagi dan

dimasukkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL tripsin 0,025% dan ditampung lagi

ke dalam conical tube sampai semua sel terlepas dari plate. Setelah semua sel dipanen

ditambahkan PBS sampai 10 ml dan conical tube disentrifugasi selama 10 menit. Supernatan

dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi campuran dan

dipindahkan ke dalam micro tube sebanyak 1 mL. Campuran dalam micro tube disentrifugasi

(5 menit, 5000 rpm). Micro tube yang berisi sampel dibuang supernatannya kemudian diberi

reagen 100 μl Annexin V lalu diinkubasi 10 menit. Setelah inkubasi 10 menit diberi 300 μl

buffer, dan sampel dianalisis mengunakan flowcytometer FACS Calibur (Huang, dkk., 2015;

CCRCc, 2009).

Uji Imunositokimia

Sel ditanam dalam 6 well-plate diberi cover slip sebanyak 2x105 sel/mL. Setelah

inkubasi 24 jam media kultur dibuang. Sel diberi perlakuan dengan memberikan 1 mL sampel

dengan konsentrasi ½ IC50 yang dilarutkan dalam media dan diinkubasi 24 jam, setelah

inkubasi media dibuang dan diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian difiksasi

menggunakan metanol yang bertujuan untuk mempertahankan morfologi sel. Methanol

dibuang dan diberi PBS 1 ml selama 5 menit. Cover slip diberi hidrogen peroksida 100 μl

selama 10 menit untuk menghambat peroxidase endogen, lalu dibuang dan dicuci dengan

akuades 1 ml. Selanjutnya cover slip diangkat dan dipindahkan ke kaca preparat. Cover slip

diberi larutan blocking 20 μl selama 10 menit lalu dibuang untuk mencegah ikatan tidak

spesifik dari antibody sekuder, diberi antibodi primer 50 μl selama 1 jam setelah itu dicuci

dengan PBS tergenang selama 2 menit diulang 2 kali. Cover slip diberi antibodi sekunder 30

μl selama 20 menit dan dicuci PBS tergenang selama 2 menit diulang 2 kali. Cover slip diberi

streptavidin sebanyak 30 μl selama 10 menit untuk memperjelas pewarnaan kemudian dicuci

dengan PBS selama 2 menit diulang 2 kali. Lalu diberi larutan DAB 50 μl selama 7 menit

sebagai pewarna coklat pada sel yang mengekspresikan protein dan dicuci menggunakan

aquadest lalu dibuang. Cover slip diberi 1 tetes Mayerhematoxilin selama 3 menit untuk

memberikan kontras warna atau membedakan warna sel, kemudian dicuci dengan akuades lalu

dibuang. Cover slip digenangi etanol absolut dan segera dibuang, preparat dikeringkan terlebih

dahulu lalu diawetkan. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali

(Guimaraes, dkk., 2005; CCRCb, 2009).


6

Analisis Hasil

Analisis Nilai IC50

Dari data yang diperoleh melalui uji MTT, dihitung % viabilitas sel dengan

menggunakan rumus:

sor ansi perlakuan sor ansi kontrol media

sor ansi kontrol sel sor ansi kontrol media

Setelah data % viabilitas didapatkan, dilanjutkan dengan membuat grafik antara % viabilitas

sel dengan konsentrasi untuk mendapatkan nilai IC50 menggunakan program Microsoft Excel

(Nobakht, dkk., 2014; CCRCc, 2009).

Analisis Uji Apoptosis

Pengamatan kuantitatif dilakukan dengan mengolah data menggunakan metode

cellquest dan dibaca menggunakan alat flowcytometry FACS Calibur yang terhubung dengan

software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan, kemudian dikonversikan dalam

diagram warna sel. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna hijau (Annexin-/PI

-), warna

kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis (Annexin+/PI

-), dan merah muda

menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI

+) (Li, dkk., 2009).

Analisis Uji Imunositokimia

Pengamatan secara kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2.

Adanya ekspresi protein Bcl-2 akan ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma (bukan

inti sel). Sedangkan warna biru menunjukkan tidak adanya protein Bcl-2. Pembacaan data

dilakukan dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah

sel yang mengekspresikan Bcl-2 pada preparat. Hasil yang didapatkan berupa % rata-rata ±

SD.

Sel er arna oklat

otal sel satu lapang pandang

Level skoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan: 0: kurang dari 5% (sangat kuat), 1+:

6% - 25% (kuat), 2+: 26% - 50% (sedang), 3+: 51% - 75% (lemah), 4+: 76% - 100% (sangat

lemah) (Zhang, dkk., 2002).

x 100%

% Ekspresi Bcl-2:

X 100%


7

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi dan Ekstraksi Daun Keladi Tikus

Determinasi tanaman dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran dari

tanaman yang digunakan untuk diuji. Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa daun

yang digunakan dalam penelitian ini benar berasal dari tanaman keladi tikus (Typhonium

Flagelliforme (Lodd.) Blume). Daun dipetik dari tanaman, kemudian dicuci dan dikeringkan di

dalam oven dengan suhu 40-500C. Pengeringan bertujuan untuk mengurangi kadar air di

dalam daun karena air dapat menyebabkan adanya penjamuran dan mengaktifkan enzim yang

dapat merusak zat aktif dalam simplisia.

Simplisia ditimbang sebanyak 10 gram kemudian dilakukan maserasi menggunakan

pelarut etil asetat untuk mengambil zat-zat aktif dari simplisia. Prinsip dari maserasi adalah

memindahkan masa dari sel simplisia menuju cairan penyari berdasarkan derajat konsentrasi.

Setiap 24 jam pelarut diganti menggunakan pelarut baru dan pelarut sebelumnya ditampung

dengan tujuan menghindari kejenuhan senyawa dalam pelarut. Hasil maserasi yang sudah

ditampung disaring dan dilakukan pemekatan menggunakan rotary evaporator dengan suhu

600C dilanjutkan dengan diuapkan di atas water bath dengan suhu 55-60

0C sampai semua

pelarut menguap atau sampai bobot tetap. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa sel yang

mati disebabkan oleh ekstrak bukan pelarut yang tersisa. Hasil ekstraksi yang dilakukan

dengan metode maserasi menggunakan pelarut etil asetat didapatkan rendemen 5,6%.

Maserasi bertujuan untuk mendapatkan zat-zat aktif dari simplisia daun keladi tikus.

Zat-zat aktif atau kandungan fitokimia dalam ekstrak daun keladi tikus yang diharapkan dapat

tersari adalah alkaloid, flavonoid, terpenoid dan steroid sebagai kandungan terbesar dalam

tanaman keladi tikus (Mankaran, dkk., 2013). Senyawa lainnya yang ada dalam keladi tikus

adalah senyawa flavonoid yang diidentifikasi secara kualitatif dari ekstrak diklorometan, etil

asetat dan etanol daun keladi tikus (Da’i, dkk., 2007). Per edaan usia tanaman, tempat

tumbuh, waktu panen dan kondisi lingkungan dan perbedaan cara ekstraksi menyebabkan

kandungan atau senyawa fitokimia dalam daun keladi tikus berbeda-beda. Dalam penelitian ini

tidak dilakukan identifikasi senyawa yang ada dalam ekstrak etil asetat daun keladi tikus. Oleh

karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi kandungan kimia

dalam ekstrak etil asetat daun keladi tikus.


8

Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa

Metode MTT digunakan untuk menentukan viabilitas sel yang berdasarkan pada

perubahan garam tetrazolium (MTT) menjadi formazan dalam mitokondria yang aktif pada sel

hidup (Jo, dkk., 2015). MTT diabsorbsi ke dalam sel hidup dan dipecah melalui reaksi reduksi

oleh enzim reduktase dalam rantai respirasi mitokondria menjadi formazan yang berwarna

ungu. Formazan dapat dibaca absorbansinya secara spektrofotometri dengan ELISA reader

pada panjang gelombang 595 nm yang merupakan panjang gelombang maksimal untuk

mengamati fomazan (Ho, dkk, 2012). Uji sitotoksik dengan metode MTT dilakukan untuk

mengetahui efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel HeLa.

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis. Sel HeLa (1x106 sel/mL) yang ditanam

pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun keladi

tikus dan seri konsentrasi cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam. Selanjutnya diamati dibawah mikroskop

dengan perbesaran 100 kali. (A) Kontrol sel HeLa, (B) Perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 µg/mL, (C)

Perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus konsentrasi 750 µg/mL.

Keterangan gambar: sel yang ditunjuk tanda panah ( ) menunjukkan sel mengkerut, sel yang ditunjuk tanda

panah putus-putus ( ) menunjukkan sel hidup.

Aktivitas sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel HeLa juga

berpengaruh pada morfologi sel setelah diberi perlakuan selama 24 jam. Pada kelompok

kontrol sel menunjukkan kepadatan sel tinggi, sel berbentuk polygonal dan menempel pada

plate. Morfologi sel dengan perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 µg/mL beberapa sel

mengkerut yang ditandai dengan bentuk bulat tidak menempel pada plate dan kepadatan sel

berkurang. Sedangkan morfologi sel dengan perlakuan etil asetat daun keladi tikus sel dengan

konsentrasi 750 µg/mL banyak sel mengkerut yang ditandai dengan bentuk bulat tidak

menempel pada plate serta kepadatan sel berkurang.

Uji sitotoksik dilakukan untuk menentukan IC50 atau konsentrasi sampel yang mampu

menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50% yang digunakan sebagai parameter uji sitotoksik.

Hasil uji sitotoksik dapat dilihat pada Gambar 2 yang menyatakan kurva hubungan antara

A C B


9

0

20

40

60

80

100

120

0 500 1000 1500 2000

via

bil

ita

s se

l (%

)

Ekstrak Daun Keladi Tikus (µg/mL)

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

via

bil

ita

s se

l (%

)

Cisplatin (µg/mL)

konsentrasi dan persen viabilitas sel. Cisplatin digunakan sebagai kontrol positif karena

cisplatin merupakan salah satu obat yang digunakan dalam terapi kanker serviks. Hasil uji

sitotoksik menggunakan metode MTT menunjukkan cisplatin memiliki nilai IC50 36 µg/mL

sedangkan ekstrak etil asetat daun keladi tikus nilai IC50 640 µg/mL terhadap sel HeLa. Efek

sitotoksik pada umumnya menunjukkan pola dose dependent yang dapat dilihat dari

menurunnya viabilitas sel seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Pada penelitian

sebelumnya menyebutkan bahwa ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki efek sitotoksik

terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 147,77 µg/mL (Da’i, dkk., 2007). Hal ini dapat

diakibatkan karena perbedaan cara ekstraksi dan juga perbedaan sumber tanaman yang

digunakan.

Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (1x106 sel/mL)

yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat

daun keladi tikus dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel

setelah diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun keladi tikus selama 24 jam. (B) Viabilitas sel setelah diberi

seri konsentrasi cisplatin selama 24 jam.

Potensi ekstrak sebagai agen sitotoksik digolongkan menjadi tiga kategori yaitu kuat

(IC50 < 20 µg/mL), sedang (IC50 < 50 µg/mL) dan lemah (IC50 > 50 µg/mL) (Ellithey, dkk.,

A

B


10

2014). Pada uji sitotoksik ekstrak daun keladi tikus menunjukkan niai IC50 yang cukup tinggi,

dapat diartikan bahwa ekstrak daun keladi tikus tidak cukup toksik namun memiliki potensi

untuk dikembangkan sebagai agen kemopreventif. Efek toksik yang kuat dari cisplatin sebagai

obat kemoterapi mengakibatkan efek toksik terhadap sel atau jaringan normal karena tidak

selektif terhadap sel kanker (Dasari & Bernard, 2014). Ekstrak etil asetat daun keladi tikus

berpotensi sebagai agen kemopreventif karena tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks

HeLa sehingga diharapkan ekstrak etil asetat daun keladi tikus tidak bersifat toksik terhadap

sel normal. Namun perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk memastikan selektivitas ekstrak

etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker.

Efek toksik yang rendah terhadap sel kanker serviks HeLa mengakibatkan ekstrak etil

asetat daun keladi tikus memiliki efikasi pengobatan yang rendah. Untuk meningkatkan efikasi

penggobatan, ekstrak etil asetat daun keladi tikus dapat dikombinasikan dengan agen

kemoterapi. Penggunaan kombinasi kemoterapi dapat diberikan dengan senyawa yang bersifat

non-toksik atau senyawa yang memiliki efek toksik rendah dikombinasikan dengan agen

kemoterapi untuk meningkatkan efikasi dengan cara mengurangi efek toksik agen kemoterapi

pada sel atau jaringan normal (Hemaiswarya & Doble, 2006). Penelitian lebih lanjut perlu

dilakukan untuk mengetahui efek sinergis dari kombinasi ekstrak etil asetat daun keladi tikus

dan agen kemoterapi terhadap sel kanker dan selektivitas terhadap sel normal.

Uji Apoptosis menggunakan Flowcytometry dengan Anexin V

Mekanisme kematian sel dibedakan menjadi dua yaitu apoptosis dan nekrosis.

Apoptosis atau kematian sel yang terprogram secara genetik memiliki mekanisme regulasi

pergantian sel karena adanya perkembangan dan penuaan sel (Akl, dkk., 2014). Nekrosis

didefinisikan sebagai kematian sel yang tidak terkontrol yang merupakan kematian sel yang

secara patologik dapat mengakibatkan adanya inflamasi atau peradangan (de Bruin &

Medema, 2008). Uji apoptosis dilakukan untuk mengetahui aktivitas ekstrak etil asetat daun

keladi tikus dalam menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis terhadap sel HeLa.

Uji apoptosis pada penelitian ini menggunakan flowcytometry dengan reagen Anexin

V yang akan berikatan secara spesifik terhadap fosfolipid seperti fosfatidilserine yang keluar

dari dalam membran sel ketika sel mengalami apoptosis (Hingorani, dkk., 2011). Secara

umum, flowcytometry merupakan suatu teknik yang digunakan untuk menganalisis jenis-jenis


11

kematian sel yang terdapat dalam suatu populasi sel. Sel ditandai dengan reagen fluoresen

kemudian dilewatkan celah sempit dan ditembak sinar UV atau laser. Sel yang telah ditandai

dengan fluoresen akan memancarkan fluoresensi yang akan ditangkap oleh detektor.

Fluoresensi yang ditangkap oleh detektor akan dikonversikan menjadi sebuah grafik dengan

suatu program yang ada pada flowcytometry (Hayrabedyan, dkk., 2012).

Gambar 3. Induksi apoptosis ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (1x 106/mL)

yang ditanam pada 6 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi ekstrak etil asetat daun keladi tikus

320 µg/mL dan cisplatin 18 µg/mL diinkubasi selama 24 jam, dan diwarnai dengan reagen annexin V dan

propidium iodida (PI). Hasil dibaca menggunakan flowcytometer. (A) Kontrol sel. (B) Sel kanker serviks HeLa

yang diberi cisplatin (18 µg/mL). (C) Sel kanker serviks HeLa yang diberi ekstrak etil asetat daun keladi tikus

(320 µg/mL).

Tabel 1. Hasil uji apoptosis menggunakan flowcytometry

Total Sel (%)

Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4

Sel Hidup Early Apoptosis Late Apoptosis Nekrosis

Kontrol Sel 88,28 % 3,55 % 2,58 % 5,67 %

Cisplatin 61,80 % 25,44 % 10,62 % 2,69 %

Ekstrak etil asetat daun

keladi tikus 2,38 % 0,01 % 11,79 % 86,03 %

Hasil uji apoptosis dapat dilihat pada Gambar 3 dan Tabel 1. Pada kontrol sel, sel

yang masih hidup sebesar 88,28%, total sel yang mengalami apoptosis 6,13% dan yang

mengalami nekrosis 5,67%. Sel dengan perlakuan cisplatin menunjukkan sel yang masih

File: KS HeLa.001

Gate: No Gate

Tota l Events: 20000

Region % Gated % Total

R1 88.28 88.28

R2 3.55 3.55

R3 2.58 2.58

R4 5.67 5.67

File: KS HeLa.001

Gate: No Gate


Quad % Gated % Total

UL 5.05 5.05

UR 2.50 2.50

LL 88.72 88.72

LR 3.74 3.74

R2

R3R4

R1

File: cisplatin HeLa.006

Gate: No Gate



R1 61.80 61.80

R2 25.44 25.44

R3 10.62 10.62

R4 2.69 2.69


Gate: No Gate



UL 2.54 2.54

UR 10.54 10.54

LL 61.02 61.02

LR 25.91 25.91

R2

R4

R1

A B

C

File: KELADI TIKUS I HeLa APOPT.006

Gate: No Gate



R1 2.38 2.38

R2 0.01 0.01

R3 11.79 11.79

R4 86.03 86.03


Gate: No Gate



UL 86.01 86.01

UR 11.58 11.58

LL 2.40 2.40

LR 0.01 0.01

R2

R1


12

hidup 61,80%, total sel yang mengalami apoptosis 36,06% dan yang mengalami nekrosis

sebesar 2,69%. Cisplatin dapat menyebabkan kematian sel dengan cara menghentikan siklus

sel dan menginduksi apoptosis jika ada kerusakan sel. Cisplatin dapat menginduksi apoptosis

pada sel kanker HeLa dengan cara meregulasi proses apoptosis melalui jalur dependent p53

(Kutuk, dkk., 2009). Sedangkan sel dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus

menunjukkan sel yang masih hidup 2,38%, total sel yang mengalami apoptosis 11,80% dan

yang mengalami nekrosis sebesar 86,03%.

Pada penelitian ini uji apoptosis yang dilakukan terbatas karena hanya menggunakan

satu time point yaitu 24 jam untuk waktu inkubasi perlakuan sehingga kemungkinan kematian

sel sudah berlanjut menjadi nekrosis. Nekrosis yang terjadi akibat perlakuan ekstrak etil asetat

daun keladi tikus kemungkinan karena adanya nekrosis sekunder yang merupakan lajutan dari

apoptosis. Nekrosis sekunder terjadi karena karena secara in vitro tidak ada fagositosis badan

apoptosis oleh makrofag. Nekrosis sekunder juga dapat terjadi kerena perubahan morfologi sel

yang semula mengalami apoptosis menjadi nekrosis karena adanya pengaruh waktu inkubasi

(Demoy, dkk., 2000). Morfologi sel yang mengalami apoptosis ditandai dengan penyusutan

sel secara keseluruhan, blebbing atau pembengkakan membran plasma dan pembentukan

badan apoptosis (Akl, dkk., 2014). Sedangkan morfologi sel yang mengalami nekrosis tidak

terkontrol, tiba-tiba sel kehilangan integritas membran dan cairan ekstraseluler keluar dari sel

(Martin & Henry, 2013). Oleh karena itu, perlu diamati kematian sel yang terjadi akibat

perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam.

Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengamati induksi apoptosis pada beberapa time

point sebelum 24 jam.

Kemungkinan yang lain sel menunjukkan hasil nekrosis karena adanya blebing

nekrosis yang meningkatkan permeabilitas terhadap propidium iodida. Salah satu ciri dari

apoptosis adalah blebbing apoptosis dan nekrosis (Fackler & Grosse, 2008) yang

menyebabkan sitoplasma keluar dari sel karena adanya tekanan hidrostatik dalam sel (Charras,

dkk., 2005). Blebing nekrosis menyebabkan membran sel memiliki permeabilitas yang tinggi

terhadap propidium iodida sehingga dapat memberikan data sel mengalami nekrosis karena sel

mengikat reagen propidium iodida (Barros, dkk., 2003). Namun pada penelitian ini tidak

dilakukan pengamatan morfologi sel setelah perlakuan, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan

untuk mengamati morfologi sel setelah perlakuan.


13

Uji Imunositokimia

Proses apoptosis diregulasi oleh faktor ekstrenal dan internal. Salah satu faktor internal

dari proses apoptosis adalah Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) (de Bruin & Medema, 2008). Sel

kanker serviks Hela memiliki karakteristik overekspresi Bcl-2 sehingga menghambat proses

apoptosis (You, dkk., 2010). Imunositokimia merupakan teknik untuk mendeteksi protein,

antigen dalam satu jaringan dengan mendeteksi adanya reaksi antigen antibodi menggunakan

bantuan penanda. Antibodi spesifik akan berikatan dengan antigen yang dideteksi dengan

antibodi sekunder (Chen, dkk., 2010). Pada penelitian ini uji imunositokimia terhadap protein

Bcl-2 dilakukan untuk mengidentifikasi apakah kematian sel diregulasi oleh protein Bcl-2

dengan tujuan mengetahui aktivitas ekstrak daun keladi tikus dalam menghambat protein Bcl-

2. Sel yang mengekspresikan protein Bcl-2 ditandai dengan warna coklat pada sitoplasma

sedangkan sel yang tidak mengekspresikan Bcl-2 berwarna ungu.

Gambar 4. Ekspresi Bcl-2 ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (2x105 sel/mL)

ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi cover slip diinkubasi selama 24 jam. Sel diberi perlakuan dengan

ekstrak etil asetat daun keladi tikus ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi IC50, diinkubasi selama 24 jam. Ekspresi

protein diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B)

Kontrol sel dengan antibodi Bcl-2. (C) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin (36 µg/mL). (D) Sel

kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus (320 µg/mL).

Keterangan gambar: (menunjukkan sel tidak mengekspresikan Bcl-2) dan (menunjukkan sel

mengekspresikan Bcl-2)

A B

C D


14

Tabel 2. Distribusi ekspresi Bcl-2 pada sel Hela

Lapang Pandang Ekspresi Bcl-2 Level

Kontrol sel tanpa antibody

1 (n = 90) 0 (0%) 0

2 (n = 85) 0 (0%) 0

3 (n = 107) 0 (0%) 0

Kontrol sel dengan antibody

1 (n = 105) 105 (100%) 4+

2 (n = 97) 97 (100%) 4+

3 (n = 106) 106 (100%) 4+

Cisplatin

1 (n = 128) 1 (0,78%) 0

2 (n = 125) 3 (2,4%) 0

3 (n = 107) 0 (0%) 0

Ekstrak etil asetat daun keladi tikus

1 (n = 207) 16 (7,73%) 1+

2 (n = 219) 18 (8,22%) 1+

3 (n = 178) 17 (9,55%) 1+

Pada tabel 2 dapat dilihat bahwa pada kontrol sel HeLa tanpa antibodi tidak

mengekspresikan Bcl-2 (0%) level ekspresi 0, dan untuk kontrol sel HeLa dengan antibodi

100% mengekspresikan Bcl-2 level ekspresi +4. Untuk perlakuan sel HeLa dengan cisplatin

mengekspresikan Bcl-2 sebesar 0,78%; 2,4% dan 0% dengan level ekspresi 0 yang

menyatakan cisplatin sangat kuat menekan ekspresi Bcl-2. Cisplatin berinteraksi dengan Bcl-2

sebagai faktor intrinsik dalam apoptosis. Cisplatin menekan Bcl-2 sebagai mediator

antiapoptosis, sehingga cisplatin dapat menginduksi apoptosis (Leisching, dkk., 2015). Oleh

karena itu cisplatin digunakan sebagai pembanding atau kontrol positif dalam skrining

penemuan agen kemopreventif yang selektif pada regulasi ekspresi protein Bcl-2.

Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus mengekspresikan Bcl-

2 sebesar 7,73%; 8,22% dan 9,55% dengan level ekspresi +1 yang menyatakan ekstrak etil

asetat daun keladi tikus kuat menekan ekspresi Bcl-2. Hal tersebut juga menyatakan bahwa

proses apoptosis dari sel HeLa diperantarai melalui penekanan protein Bcl-2. Ketika aktivitas

protein Bcl-2 sebagai agen antiapoptosis dihambat maka proses apoptosis atau kematian sel

akan meningkat (Czabotar, dkk., 2014). Pada penelitian sebelumnya ekstrak etil asetat daun

keladi tikus dapat menekan ekspresi protein siklooksigenase-2 (COX-2) (Setiawati, dkk.,

2016). Protein COX-2 dapat memicu proliferasi sel dengan meningkatkan produksi PGE-2


15

yang dapat menghambat proses apoptosis dan meningkatkan produksi agen antiapoptosis yaitu

Bcl-2. Sehingga dengan adanya penekanan COX-2 dapat menekan produksi Bcl-2 (Shehzad,

dkk., 2015). Pada penelitian ini perhitungan ekspresi Bcl-2 bersifat semikuantitatif, diperlukan

penelitian lebih lanjut untuk mengetahui ekspresi Bcl-2 secara kuantitatif.

Protein Bcl-2 mencegah terlepasnya sitokrom-C sehingga proses apoptosis tidak

terjadi, dengan dihambatnya protein Bcl-2 maka sitokrom C akan terlepas dan proses

apoptosis dapat terjadi (Smedt & Bultynck, 2014). Sitokrom-c berikatan dengan apoptotic

protease-activating factor 1 (Apaf-1), sehingga terbentuk kompleks yang teraktivasi dari

(d)ATP, dan procaspase-9. Aktivasi caspase-9 memicu aktivasi caspase-3 dan caspase-7,

sehingga memicu terjadinya apoptosis (Weyhenmeyer, dkk., 2012). Adanya mediator lainnya

setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2 juga berpengaruh pada proses apoptosis. Penelitian

lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui regulasi mediator lainnya yang berperan dalam

proses apoptosis setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2.

KESIMPULAN

Hasil yang diperoleh, ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki aktivitas sitotoksik

lemah dengan nilai IC50 640 µg/mL. Hasil uji apoptosis pada konsentrasi ½ IC50 dengan waktu

inkubasi 24 jam menunjukkan bahwa sampel menginduksi kematian melalui apoptosis sebesar

12% dan nekrosis sekunder yang merupakan lanjutan dari apoptosis sebesar 86%. Hasil uji

imunositokimia menunjukkan sampel menekan kuat ekspresi protein Bcl-2, sehingga

kemungkinan induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2. Bedasarkan

hasil tersebut, ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki potensi sebagai agen

kemopreventif namum masih perlu ditelusuri lebih lanjut terutama induksi kematian sel.

Saran untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan identifikasi kandungan dari ekstrak

etil asetat daun keladi tikus dan mengetahui selektivitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus

terhadap sel kanker. Mekanisme induksi apoptosis perlu dikonfirmasi dengan melakukan time

course assay dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam. Selain itu penelitian lebih lanjut juga

perlu dilakukan uji untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2 secara kuantitatif serta penelitian

lebih lanjut untuk mengetahui regulasi mediator lainnya setelah terjadi penekanan ekspresi

protein Bcl-2.


16

DAFTAR PUSTAKA

Akl, H., Vervloessem, T., Kiviluoto, S., Bittremieux, M., Parys, J. B., De Smedt, H., &

Bultynck, G., 2014. A dual role for the anti-apoptotic Bcl-2 protein in cancer:

Mitochondria versus endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular

Cell Research, 1843(10), 2240–2252.

American Cancer Society. 2016. Cancer Facts & Figures 2016. Cancer Facts & Figures 2016,

1–9.

Barros, L. F., Kanaseki, T., Sabirov, R., & Morishima, S. 2003. Apoptotic and necrotic blebs

in epithelial cells display similar neck diameters but different kinase dependency, d, 687–

697.

Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Panen Sel, Unversitas

Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.005.-

Panen-Sel.pdf diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerb, 2009. Prosedur Tetap: Pengamatan Ekspresi

Protein dengan Metode Immunositokimia, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta,

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf diakses

pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerc, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel untuk

Flowcytometry, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta,

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf diakses

pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Uji Sitotoksik Metode

MTT, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-

content/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf diakses pada tanggal 1 April 2016.

Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., & Mitchison, T. J. (2005). Non-

equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature, 435(7040), 365–9.

Cheever, M. A., Allison, J. P., Ferris, A. S., Finn, O. J., Hastings, B. M., Hecht, T. T.,

Matrisian, L. M. 2009. The prioritization of cancer antigens: A National Cancer Institute

pilot project for the acceleration of translational research, Clinical Cancer Research,

15(17), 5323–5337.

Czabotar, P. E., Lessene, G., Strasser, A., & Adams, J. M. 2014. Control of apoptosis by the

BCL-2 protein family: implications for physiology and therapy. Nature Reviews.

Molecular Cell Biology, 15(1), 49–63.


http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf

17

Da’i M, Five A, Meiyanto E. 2007. Efek Sitotoksik Ekstrak Tanaman Keladi Tikus

(Typhonium divaricatum, L.) terhadap Sel HeLa. J Farm Ind. 3 : 163-7

Dasari, S., & Bernard, P. (2014). Cisplatin in an er therapy : Mole ular me hanisms of

action. European Journal of Pharmacology, 1–15.

De Bruin, E. C., & Medema, J. P. 2008. Apoptosis and non-apoptotic deaths in cancer

development and treatment response. Cancer Treatment Reviews, 34(8), 737–749.

DeSantis, C. E., Lin, C. C., Mariotto, A. B., Siegel, R. L., Stein, K. D., Kramer, J. L., Jemal,

A. 2014. Cancer treatment and survivorship statistics, 2014. CA Cancer J Clin, 64(4),

252–271.

Demoy, M., Minko, T., & Kopeckova, P. 2000. Time- and concentration-dependent apoptosis

and necrosis induced by free and HPMA copolymer-bound doxorubicin in human ovarian

carcinoma cells, 69, 185–196.

Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., & Meyer, D. 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme

inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and Alternative

Medicine, 14, 77.

Fackler, O. T., & Grosse, R. 2008. Cell motility through plasma membrane blebbing, 879–

884.

Ferlay, J., Soerjomataram, I., Dikshit, R., Eser, S., Mathers, C., Rebelo, M., Bray, F. 2015.

Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in

GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer, 136(5), E359–E386.

Galluzzi, L., Vacchelli, E., Bravo-San Pedro, J.-M., Buqué, A., Senovilla, L., Baracco, E. E.,

Kroemer, G., 2014, Classification of current anticancer immunotherapies. Oncotarget,

5(24), 12472–508.

Guimaraes, M.C.M., dkk., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4a

and bcl-2

According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial

Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4), 509–16.

Hayrabedyan, S., Georgiev, B., Kacheva, D., Chervenkov, M., Shumkov, K., Taushanova, P.,

& Kistanova, E. (2012). Flowcytometry as a method for advanced evaluation of boar

semen. Comptes Rendus de L’Academie Bulgare Des Sciences, 65(4), 541–548.

Hemaiswarya, S., & Doble, M. 2006. Potential synergism of natural products in the treatment

of cancer. Phytotherapy Research : PTR, 20(November 2005), 239–249.

Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., & Mittar, D. 2011. Detection of Apoptosis


18

Using the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM

System. BD Biosciences,

August(August), 1–12.

Ho, W. Y., Yeap, S. K., Ho, C. L., Rahim, R. A., & Alitheen, N. B. 2012. Development of

Multicellular Tumor Spheroid, MCTS) Culture from Breast Cancer Cell and a High

Throughput Screening Method Using the MTT Assay. PLoS ONE, 7(9).

Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C., 2015.

Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a p53-

dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–1502.

International Agency for Research on Cancer WHO (IARC), 2015, Estimated Cancer

Incidence, Mortality and Prevalence, tersedia dalam www.http://globocan.iarc.fr/, diakses

tanggal 15 Juli 2016.

Jo, H. Y., Kim, Y., Park, H. W., Moon, H. E., Bae, S., Kim, J., Paek, S. H. 2015. The

Unreliability of MTT Assay in the Cytotoxic Test of Primary Cultured Glioblastoma

Cells, 24(3), 235–245.

Katrin, E., Winarno, H., Susanto, & N., F., 2012, Karakteristika dan Khasiat Daun Keladi

tikus, Typhonium divaricatum, L .) Decne ) Iradiasi. Jurnal Ilmiah Aplikasi Isotop Dan

Radiasi, 8(1), 31–35.

Kutuk, O., Arisan, E. D., Tezil, T., Shoshan, M. C., & Basaga, H. 2009. Cisplatin overcomes

Bcl-2-mediated resistance to apoptosis via preferential engagement of Bak: Critical role

of Noxa-mediated lipid peroxidation. Carcinogenesis, 30(9), 1517–1527.

Landry, J. J. M., Pyl, P. T., Rausch, T., Zichner, T., Tekkedil, M. M., Stütz, A. M., Steinmetz,

L. M., 2013, The genomic and transcriptomic landscape of a HeLa cell line. G3,Bethesda,

Md.), 3(8), 1213–24.

Leisching, G., Loos, B., Botha, M., & Engelbrecht, A.-M. 2015. A Nontoxic Concentration of

Cisplatin Induces Autophagy in Cervical Cancer. International Journal of Gynecological

Cancer, 25(3), 380–388.

Li, ZF., Wang, ZD., Ji, YY., Zhang, S., Huang, C., Li J., Xia, XM. 2009. Induction of

apoptosis and cell cycle arrest in human HCC MHCC97H cells with Chrysanthemum

indicum extract. World J Gastroenterol September 28; 15 (36): 4538-4546.

Mankaran, S., Dinesh, K., Deepak, S., & Gurmeet, S. 2013. Typhonium flagelliforme : A

multipurpose plant. International research journal of pharmacy, 4(3), 45–48.

Masood, A., Azmi, A. S., & Mohammad, R. M. 2011. Small molecule inhibitors of Bcl-2

family proteins for pancreatic cancer therapy. Cancers, 3(2), 1527–1549.


http://www.http/globocan.iarc.fr/

19

Martin, S.J., & Henry, C.M. 2013. Distinguishing between apoptosis, necrosis, necroptosis

and other cell death modalities. Molecular Cell Biology Laboratory 2013, 87-89.

Nobakht, G. M., Kadir, M. a, Stanslas, J., & Charng, C. W. 2014. Cytotoxic effect of

Typhonium flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31), 1021–

1024.

Purwaningsih E., Widayanti E., Suciati Y. 2014. Cytotoxic Assay of Typhonium flagelliforme

Lodd Against Breast and Cervical Cancer Cell. Universa Medicina Vol. 33.No.2.

Sak, K. 2012. Chemotherapy and dietary phytochemical agents. Chemotherapy Research and

Practice, 2012, 282570.

Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Cancer Science

Therapy, S3:e001.

Shehzad, A., Lee, J., & Lee, Y. S. 2015. Autocrine prostaglandin E 2 signaling promotes

promonocytic leukemia cell survival via COX-2 expression and MAPK pathway, 48(2),

109–114.

Setiawati, A., Immanuel, H., & Utami, M. T. 2016. The inhibitor of (Typhonium flagelliforme

(Lodd.) Blume) leaf extract on COX-2 expression of WiDr colon cancer cells. Asian

Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 6(3), 251–255.

Smedt, H. De, & Bultynck, G. 2014. A dual role for the anti-apoptotic Bcl-2 protein in cancer:

Mitochondria versus endoplasmic reticulum. BBA - Molecular Cell Research.

Xu, T., dkk., 2014. Proteomic Investigation into Betulinic Acid-Induced Apoptosis of Human

Cervical Cancer HeLa Cells. PLoS ONE, 9(8), 1–11.

You, B. R., Moon, H. J., Han, Y. H., & Park, W. H. 2010. Gallic acid inhibits the growth of

HeLa cervical cancer cells via apoptosis and/or necrosis. Food and Chemical

Toxicology : An International Journal Published for the British Industrial Biological

Research Association, 48(5).

Zhang, H., Ph, D., Sun, X., & Ph, D. 2002. Overexpression of Cyclooxygenase-2 Correlates

With Advanced Stages of Colorectal Cancer, Am J Gastroenterol, 97(4), 1–5.

Weyhenmeyer, B., Murphy, A. C., Prehn, J. H. M., & Murphy, B. M., 2012. Targeting the

Anti-apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer. Experimental

Oncology, 34(3), 192–199.


20

LAMPIRAN


21

Lampiran 1. Gambar tanaman keladi tikus dan proses ekstraksi

Gambar A. Tanaman keladi tikus dipetik dan dicuci menggunakan air mengalir kemudian

diangin-anginkan sebelum dimasukkan ke dalam oven

Gambar B. Simplisia daun keladi tikus disari menggunakan pelarut etil asetat dengan proses

maserasi dan diulang sebanyak tiga kali


22

Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay

Data Konsentrasi Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus vs Viabilitas Sel

Kurva Konsentrasi ekstrak vs % Viabilitas Sel

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

via

bil

ita

s se

l (%

)

Ekstrak Daun Keladi Tikus (µg/mL)

No. Konsentrasi

(µg/mL)

viabilitas sel (%)

SD v1 v2 v3 rata – rata

A 0 100,000 100,000 100,000 100,000 0,000

B 47 66,479 71,783 68,849 69,037 2,657

C 94 69,413 73,815 68,623 70,617 2,797

D 188 63,093 71,558 68,736 67,795 4,310

E 375 76,975 77,878 68,284 74,379 5,298

F 750 25,282 27,991 62,077 38,450 20,506

G 1500 7,111 10,835 4,515 7,487 3,177


23

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

via

bil

itas

sel

(%)

Cisplatin (µg/mL)

Data Konsentrasi Cisplatin vs % Viabilitas Sel

Kurva Konsentrasi Cisplatin vs % Viabilitas Sel

No. Konsentrasi

(µg/mL)

viabilitas sel (%)

SD v1 v2 v3 rata - rata

A 0 100,000 100,000 100,000 100,000 0,000

B 5 73,003 90,551 105,062 89,539 16,053

C 10 56,468 78,909 101,181 78,853 22,357

D 20 39,258 49,888 64,398 51,181 12,620

E 39 31,159 31,159 37,402 33,465 3,426

F 78 25,253 9,393 15,804 16,817 7,979


24

Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis

File: KS HeLa.001

Gate: No Gate



R1 88.28 88.28

R2 3.55 3.55

R3 2.58 2.58

R4 5.67 5.67

File: KS HeLa.001

Gate: No Gate



UL 5.05 5.05

UR 2.50 2.50

LL 88.72 88.72

LR 3.74 3.74

R2

R3R4

R1


25


Gate: No Gate



R1 61.80 61.80

R2 25.44 25.44

R3 10.62 10.62

R4 2.69 2.69


Gate: No Gate



UL 2.54 2.54

UR 10.54 10.54

LL 61.02 61.02

LR 25.91 25.91

R2

R4

R1


26


Gate: No Gate



R1 2.38 2.38

R2 0.01 0.01

R3 11.79 11.79

R4 86.03 86.03


Gate: No Gate



UL 86.01 86.01

UR 11.58 11.58

LL 2.40 2.40

LR 0.01 0.01

R2

R1


27

Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia

Pengamatan tiga lapang pandang sel kanker serviks HeLa dalam perhitungan imunositokimia

A. Kontrol sel tanpa antibodi

B. Kontrol sel dengan antibodi

C. Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin


28

D. Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak daun keladi tikus


29

Lampiran 5. Surat keterangan hasil determinasi tanaman keladi tikus


30

Lampiran 6. Ethical Clearance


31

BIOGRAFI PENULIS

Penulis Skripsi berjudul “Daun Keladi Tikus (Typhonium

flagelliforme (Lodd.) Blume) sebagai Agen Kemopreventif

terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) Melalui Regulasi Bcl-2”

memiliki nama lengkap Fira Elsa Septiana, merupakan anak pertama

dari empat bersaudara pasangan Bapak Mariyoto dan Ibu Ester Dyah

Retnowati. Penulis dilahirkan di Jepara, 5 September 1995.

Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai di TK Kartini

Jepara (2000-2001). Pendidikan dilanjutkan ke SD Kanisius Jepara (2001-2007), setelah itu

dilanjutkan ke SMP Negeri 1 Jepara (2007-2010), dan tingkat pendidikan menengah atas di

SMA Negeri 1 Jepara (2010-2013). Pada tahun 2013, penulis melanjutkan pendidikaan pada

jenjang perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat

dalam berbagai kepanitian dan pengurus unit kegiatan fakultas di dalam kampus, antara lain

menjadi anggota seksi acara dalam acara Donor Darah JMKI 2014, anggota seksi publikasi

dekorasi dan dokumentasi dalam Seminar Nasional Interprofesional Health Care JMKI 2014,

anggota seksi konsumsi dalam Pelepasan Wisuda Angkatan XXVIII tahun 2015, sebagai divisi

pendamping kelompok dalam Inisiasi Sanata Dharma (INSADHA) 2015, sebagai seksi doa

dan pemerhati UKF PMK Apostolos Farmasi periode 2014/2015 dan sebagai seksi ibadah dan

pelayanan UKF PMK Apostolos Farmasi periode 2015/2016. Selain itu, penulis juga pernah

menjadi asisten praktikum Biologi Sel dan Molekuler tahun 2015 dan 2016.


DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume ... · PENDAHULUAN ... sel di daerah...

Documents

Transcript of DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume ... · PENDAHULUAN ... sel di daerah...