Intracellular and Extracellular Redox Status and Free Radical Generation in Primary

Immune Cells from Children with Autism

1. Pendahuluan

Autisme adalah gangguan perkembangan saraf perilaku yang biasanya tampak pada

anak usia dini dan ditandai oleh gangguan yang signifikan dalam interaksi sosial, komunikasi,

dan perilaku abnormal berulang yang selalu terfokus. Prevalensi gangguan autisme telah

meningkat lebih dari 10 kali lipat dalam dua dekade terakhir, mempengaruhi satu dari 110

anak-anak di AS, namun etiologi dari gangguan ini masih sulit dipahami [1]. Deplesi

glutathione dan stres oksidatif telah terlibat dalam patologi berbagai gangguan

neurobehavioral termasuk skizofrenia [2], gangguan bipolar [3], dan penyakit Alzheimer [4].

Bukti-bukti yang ada menunjukkan bahwa ketidakseimbangan redoks dan stres oksidatif juga

dapat berperan dalam patofisiologi autisme. Beberapa biomarker stres oksidatif telah

diidentifikasi pada sampel darah dari anak autis [5-12]. Kelompok kami telah melaporkan

penurunan konsentrasi glutation (GSH) dan beberapa prekursor metabolik, peningkatan

glutation disulfida teroksidasi (GSSG), dan penurunan rasio glutation redoks (GSH / GSSG)

dalam evaluasi plasma pada penelitian case-control dan jalur sel lymfoblastoid yang berasal

dari anak autis [13-16]. Baru-baru ini, beberapa polimorfisme interaktif enzim yang mengatur

sintesis glutation ditemukan menjadi lebih banyak pada anak dengan autisme menunjukkan

bahwa defisit glutation dan kecenderungan untuk mengalami stres oksidatif mungkin

didapatkan secara genetik pada beberapa anak [17].

Stres oksidatif terjadi ketika mekanisme pertahanan antioksidan seluler gagal untuk

mempertahankan keseimbangan produksi ROS endogen dan / atau eksposur prooksidan

eksogen lingkungan. Glutation (γ-L-glutamil-L-cysteinylglycine) merupakan tripeptida yang

berfungsi sebagai antioksidan intraseluler utama dan buffer redoks terhadap kerusakan

oksidatif makromolekul. Pasangan glutation tiol / disulfida redoks (GSH / GSSG) adalah

mekanisme utama untuk menjaga lingkungan mikro intraseluler dalam keadaan yang sangat

minim yang penting bagi kapasitas antioksidan / detoksifikasi, pengaturan enzim redoks,

progresi siklus sel, dan transkripsi elemen respon antioksidan (ADALAH) [18-23]. Variasi

halus dalam konsentrasi relatif dari glutation berkurang dan teroksidasi menyediakan

mekanisme sinyal dinamis redoks yang mengatur proses-proses vital selular [24-27].

Misalnya, dalam prekursor sel SSP dan sel imun yang naive, keadaan glutathione intraseluler

redoks adalah penentu utama pengaturan sel untuk menjalani penahanan siklus sel,

diferensiasi, atau proliferasi [27]. Sebuah lingkungan intraseluler yang berkurang diperlukan

untuk proliferasi, sementara lingkungan mikro yang lebih teroksidasi membantu penahanan

siklus sel dan diferensiasi sel. Defisit kronis dalam rasio GSH / GSSG redoks dianggap

sebagai indikator yang dapat diandalkan dari stres oksidatif dan meningkatkan kerentanan

terhadap kerusakan oksidatif dari paparan prooksidan lingkungan [28, 29].

Dalam kompartemen plasma ekstraseluler, pasangan redoks sistein / sistin (tiol /

disulfida) pasangan redoks secara independen memberikan lingkungan redoks ambient untuk

sel imun di dalam sirkulasi. Sistein ekstrasel / sistin redoks potensial ekstraseluler telah

terbukti lebih teroksidasi daripada GSH intrasel / GSSG potensial redoks dan secara

independen diatur [30]. Pergeseran dinamis dalam plasma sistein / sistin potensial redoks

mengubah status redoks dari gugus sistein dalam protein permukaan sel untuk menginduksi

perubahan struktur protein yang secara reversibel dapat mengubah fungsi [31, 32]. Sebagai

contoh, di bawah kondisi ekstraseluler teroksidasi, residu sistein sensitif-redoks dalam inti

katalitik dari tirosin protein fosfatase menjadi teroksidasi dan secara reversibel

menonaktifkan aktivitas enzim tergantung pada sistein ambien / sistin potensial redoks [31,

33, 34]. Sistein ekstraseluler / status sistin redoks muncul sebagai transduksi penting sinyal

baru mekanisme yang dapat menginduksi perubahan posttranslational pada aliran protein

sensitif redoks termasuk berbagai enzim, faktor transkripsi, reseptor, adesi molekul, dan

protein penanda membran yang berpengaruh pada pengaturan kedinamisan aktivitas dan

fungsi mereka [32, 35, 36].

Penelitian terbaru telah mengungkapkan kelainan imunologi di antara anak autis

termasuk perubahan dalam proporsi sel imun [37-40] dan pergeseran populasi sel T-helper

setelah stimulasi mitogenik [41, 42]. Sel mononuklear darah perifer (PBMC) dari individu

dengan autisme telah terbukti menghasilkan sitokin proinflamasi lebih tinggi dan terdapat

level abnormal sitokin yang beredar dibandingkan dengan kontrol PBMC pada awal dan pada

stimulasi mitogenik [43-46]. Secara keseluruhan, studi imunologi menunjukkan peran untuk

sistem kekebalan yang tidak teregulasi dalam autisme yang berpotensi terkait dengan defisit

antioksidan dimediasi-glutation dan sel imun mikro teroksidasi dalam lingkungan mikro.

Untuk menyelidiki kemungkinan ini, kami memeriksa apakah sel-sel imun primer (PBMC)

dari anak-anak dengan autisme menunjukkan penurunan kapasitas glutathione intraseluler

redoks dibandingkan dengan PBMC dari anak-anak dengan usia-kontrol dan apakah

lingkungan mikro intraseluler dan ekstraseluler lebih teroksidasi dikaitkan dengan

peningkatan produksi radikal bebas intraseluler yang beroksidasi. Karena sel-sel imun dari

anak autis telah terbukti memiliki respon abnormal terhadap stimulasi, kami juga memilih

untuk menantang PBMC dengan aktivator sel imun yang dikenal untuk memberikan stres

oksidatif dan mengukur status glutation redoks intraseluler dalam monosit terisolasi yang

diaktifkan dan sel T.

2. Subjek dan Metode

2.1. Peserta. Penelitian ini dilakukan pada anak-anak autis IMAGE (Integrated

Metabolic and Genomic Endeavor) di Arkansas Childrens’ Hospital Research Institute

(ACHRI) yang telah merekrut lebih dari 162 kasus dan kontrol keluarga sampai saat ini.

Kohort IMAGE untuk penelitian ini terdiri dari 43 anak didiagnosis dengan gangguan autis

dan 41 anak-anak kontrol yang tidak terpengaruh (16 di antaranya adalah saudara kandung

terpengaruh). Keluarga autisme ini direkrut secara lokal setelah dirujuk ke University of

Arkansas for Medical Sciences (UAMS), Dennis Developmental Center dan didiagnosa oleh

dokter anak terlatih. Anak-anak berusia 3 sampai 10 tahun dengan diagnosis gangguan

autistik seperti yang didefinisikan oleh DSM-IV 299.0, Autism Diagnostic Observation

Schedule (ADOS), dan / atau Childhood Autism Rating Scales (CARS > 30) yang terdaftar.

Anak yang didiagnosis dengan kondisi lain pada spektrum autisme atau penyakit genetik

yang langka dikaitkan dengan gejala autisme tidak dimasukkan dalam penelitian. Anak-anak

dengan gangguan kejang kronis, infeksi baru, dan dengan suplemen vitamin atau mineral

dosis tinggi melebihi RDA juga dikeluarkan karena kondisi ini merupakan pembaur potensial

yang dapat mempengaruhi status redoks. Saudara tidak terpengaruh dan tidak terkait, anak-

anak neurotypical berusia 3 sampai 10 tahun yang tidak memiliki riwayat medis kelainan

perilaku atau neurologis berdasarkan laporan orang tua menjadi kelompok pembanding.

Protokol ini telah disetujui oleh Institutional Review Board di UAMS, dan semua orangtua

menandatangani informed consent.

2.2. Bahan. Termos, piring, dan pipet setempat diperoleh dari Corning Life Sciences

(Lowell, Mass, USA). RPMI 1640, penisilin / streptomisin, garam phosphatebuffered

Dulbecco (PBS), serum janin sapi (FBS), dan glutamin yang dibeli dari Life Technologies

(Carlsbad, California, USA). Karboksi-H2DCFDA (6-karboksi-2_, 7_-

dichlorodihydrofluorescein diasetat, ester diacetoxymethyl) diperoleh dari Molecular Probes

(Carlsbad, California, USA). Human Monocyte Isolation Kit II dan Human CD4 T Cell

Isolation Kit II yang dibeli dari Miltenyi Biotec (Bergisch-Gladbach, Jerman). Histopaque-

1077 dan semua bahan kimia lainnya diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, Mo, USA).

2.3 Isolasi PBMC dan Stimulasi Monosit dan Sel T CD4

Sampel darah puasa diambil sebelum jam 09.00 dan dimasukkan ke tabung EDTA-

Vacutainer dan segera didinginkan di dalam es sebelum disentrifugasi pada 1300xg selama

10 menit pada suhu 40C. Alikuot plasma disimpan pada suhu -800C di dalam tabung cryostat

sampai ekstraksi dan kuantifikasi HPLC. PBMC diisolasi dengan sentrifugasi pada

Histopaque-1077. Sel darah merah dilisis menggunakan inkubasi singkat (15 detik) dengan 1

mL air es. Sekitar 30x106 PBMC diresuspensi dalam medium RPMI 1640 (ditambah dengan

10% FBS, 1% penisillin/streptomysin, dan 2mM glutamin) dengan kepadatan 106 sel/mL.

Mengingat bahwa sulit untuk memperoleh 20mL volume darah dari setiap anak, maka isolasi

dan analisa monosit dan sel-T CD4 tidak mungkin dilakukan pada semua peserta. Untuk

stimulasi monosit, PBMC ditambahkan dengan 0.1 μg/mL lipopolisakarida (LPS); untuk

stimulasi sel-T, PBMC ditambahkan dengan 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate

(PMA) dan 1 μg/mL ionomysin. Sel ditempatkan di dalam inkubator 5% CO2 pada suhu 370C

selama 4 jam. Monosit yang sudah distimulasi dan sel-T CD4 kemudian diisolasi oleh

seleksi negatif menggunakan pelabelan sel magnetik seperti yang dijelaskan oleh pabrik

(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany). Dengan menggunakan flowsitometri, dapat

ditentukan bahwa ≥75% monosit isolasi positif untuk CD14 dan ≥87% sel-T CD4 positif

untuk CD4. Untuk kuantifikasi HPLC dari GSH and GSSG, sekitar 2x106 PBMC yang belum

distimulasi, monosit stimulasi, atau sel-T CD4 stimulasi digabung, dibekukan di es kering,

dan disimpan pada suhu -800C.

2.4. Ekstraksi Sel dan Kuantifikasi HPLC Glutathione Intraseluler dan Plasma Sistein Redox

Status.

Interval penyimpanan pada -800C sebelum ekstraksi secara konsisten antara 1-

2 minggu setelah pengambilan darah dan isolasi sel untuk meminimalisir potensi

interkonversi metabolit. Rincian metodologis untuk intraseluler dan ekstraseluler ekstraksi

GSH dan elusi HPLC dan deteksi elektrokemikal sudah dijelaskan sebelumnya [15, 16], dan

deteksi metabolit tidak memerlukan derivatisasi. Meskipun kebanyakan GSSG merupakan

disulfida campuran dengan thiol termasuk cysteine, pengukuran kami hanya mendeteksi

GSSG bebas dalam plasma. Konsentrasi glutathione dan cysteine dikalkulasi dari daerah

puncak kurva standar kalibrasi menggunakan software HPLC. Hasil intraseluler dinyatakan

sebagai nanomoles per milligram protein menggunakan BCA Protein Assay Kit (Pierce,

Rockford, Ill, USA), dan hasil plasma dinyatakan sebagai micromoles per liter.

2.5. Pengukuran Radikal Bebas Intraseluler.

Carboxy-H2DCFDA (DCF) adalah sebuah membran permeabel ROS/RNS-sensitif

probe yang tetap nonfluoresen sampai dioksidasi oleh intraseluler radikal bebas. Intensitas

fluoresen DCF berbanding lurus dengan tingkat oksidasi radikal bebas. Sekitar 106 PBMC

diresuspensi dalam 1 mL RPMI 1640 medium ditambahkan dengan 10% FBS, 1%

penisilin/streptomysin, and 2mM glutamin dan diwarnai di tempat gelap selama 20 menit

dengan 1 μM DCF pada suhu 370C. Sel yang diwarnai, dicuci dan diresuspensi dalam PBS

segera dianalisa dengan flowsitometer Partec CyFlow (G¨orlitz, Germany) menggunakan

panjang gelombang eksitasi 488 nm dan dengan emisi penyaring (FL1) 530/30 nm. Untuk

setiap analisa, fluoresensi dari 10000 sel dikumpulkan, dan data dianalisa menggunakan

software FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, Calif, USA). Radikal bebas

intraseluler dinyatakan sebagai median fluorescence intensity (MFI) dari sampel subjek

fluoresensi DCF normalisasi untuk fluoresensi DCF dari standar persiapan PBMC. Sebagai

kontrol internal, standar persiapan PBMC diisolasi dari 100 mL sampel darah dari

sukarelawan dewasa sehat yang tidak terpengaruh, dialikuosi dan dibekukan pada -1800C

dalam 90% FBS/10% DMSO. Alikuot dari standar persiapan PBMC diwarnai dan dianalisa

dengan setiap sampel subjek. Evaluasi oksidasi produksi radikal bebas hanya mungkin

dilakukan pada kasus tersebut dan diperoleh sampel kontrol yang tidak berhubungan pada

(~20 mL) volume darah.

Tabel 1: Demografi Populasi Penelitian.

Anak Kasusn = 43

Anak Kontroln = 41

Umur; rata-rata (SD) 5.42 (1.98) 6.16 (2.29)Laki-laki; n (%) 36 (84) 20 (49)Putih; n (%) 38 (88.4) 31 (75.6)Asia; n (%) 2 (4.65) 0 (0)Afrika Amerika; n (%) 2 (4.65) 8 (19.5)Hispanic; n (%) 1 (2.3) 2 (4.9)Penggunaan multivitaminOTC; n (%)

17 (39.5) 8 (19.5)

2.6. Analisa Statistik.

Dalam kelompok kontrol, 16 dari 41 anak-anak tidak terpengaruh

kontrol adalah saudara kandung kelompok kasus. Ada 27 orang tambahan anak kelompok

kasus tanpa saudara dan 25 orang tambahan anak yang tidak berhubungan dengan anak

kelompok kontrol sehingga total 84 orang anak kohort kontrol kasus. Untuk menurunkan

dampak asing, tiga observasi metabolit dibatasi pada ekstrim dari distribusi PBMC GSH,

PBMC GSSG, and Monocytes GSH/GSSG (lihat Tabel 2). Data saudara berkorelasi sehingga

menghasilkan kombinasi sampel data berkorelasi dan data tidak berkorelasi.; dengan

demikian, asumsi semua data independen tidak memuaskan untuk standar dua sampel tes-t.

Untuk memanfaatkan semua data dari observasi dependen dan independen, kami

menggunakan koreksi tes-Z oleh Looney and Jones [47]. Pendekatan statistik ini memberikan

kontrol yang memadai dari kesalahan Tipe 1 dan memiliki kekuatan lebih dari standar

Student’s t-test. Karena data DCF dibandingkan kasus dan control yang tidak berhubungan

(tanpa saudara kandung) standar Student’s t-test digunakan dengan set signifikansi pada 0.05.

Interkorelasi nonparametrik (Spearman correlation coefficients) antara umur dan gender dan

7 variabel hasil, GSH, GSSG, GSH/GSSG, % glutathione oksidasi, cysteine, cystine, and

cysteine/cystine ditentukan dengan set tingkat signifikansi di 0.05. Data dianalisa

menggunakan software SAS 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).

3.1. Demografi Populasi Penelitian

Table 1 menunjukkan demografi populasi penelitian. Satu-satunya perbedaan utama

antara kasus dan kontrol adalah bahwa kelompok kontrol terdiri dari proporsi perempuan dan

Afrika-Amerika yang lebih besar, sedangkan kelompok kasus mempunyai proporsi Asia yang

lebih besar. Penggunaan suplemen multivitamin lebih tinggi pada kalompok kasus (39.5%)

dibandingkan kelompok kontrol (19.5%); namun, status redoks glutathione secara statistik

tidak terpengaruh oleh penggunaan vitamin (data tidak ditampilkan).

3.2 Penurunan Status Intraselular Glutathione Redoks dalam AutismeTabel 2 menyajikan konsentrasi intraseluler relatif dari GSH, GSSG, rasio redoks glutathione, dan persentase dari glutation teroksidasi seimbang dalam keadaan istirahat (tidak distimulasi) PBMC dan stimulasi monosit terisolasi dan sel T CD4 dari anak autis dan anak usia kontrol yang cocok. Persentase glutathione teroksidasi dinyatakan dalam absolut glutathione ekuivalen sebagai 2GSSG / (GSH +2 GSSG). Sehubungan dengan kontrol, konsentrasi intraselular GSSG dan persen glutation teroksidasi meningkat secara signifikan (~ 40%), dan rasio GSH / GSSG menurun (~ 21%) di PBMC dari anak autis (P <0,001). Setelah stimulasi dengan LPS, monosit dari anak autis juga menunjukkan penurunan yang signifikan GSH / GSSG (~ 31%, P = 0,003), konsentrasi GSSG meningkat (~ 32%, P = 0,01), dan 40% persen lebih tinggi glutation teroksidasi (P <0,001). Dalam rangsangan mitogen sel T CD4 dari anak autis, konsentrasi GSH intraseluler adalah ~ 33% lebih rendah, GSH / GSSG adalah ~ 40% lebih rendah (P <0,001), dan persen glutathione teroksidasi adalah ~ 55% lebih tinggi dari pada rangsangan sel T CD4 dari anak-anak kontrol (<0,001). Seperti yang diharapkan, aktivasi dengan LPS dan PMA menunjukkan penurunan kadar GSH intraseluler dan GSH / GSSG di monosit terisolasi dan sel T CD4 dibandingkan dengan beristirahat (tidak distimulasi) PBMC.Setelah stimulasi, terjadi penurunan yang lebih besar dalam GSH intraseluler dan GSH / GSSG di kedua sel T CD4 dan monosit dari anak autis dibandingkan dengan anak-anak

kontrol. Baik umur atau jenis kelamin secara signifikan berkorelasi dengan ukuran hasil. Kandungan protein per 106 sel tidak berbeda antara kasus dan kontrol (data tidak ditunjukkan).

3.3. Penurunan Glutathione Ekstraselular dan Status Sistein Redoks dalam Autisme.Tabel 3 menyajikan konsentrasi relatif GSH, GSSG G SH / GSSG,% teroksidasi GSH, sistein, sistin, dan sistein / sistin rasio redoks di kompartemen plasma ekstraseluler. Anak autis menunjukkan penurunan yang signifikan konsentrasi ekstraseluler GSH (~ 21%) dan GSH/GSSG (~ 54%) dan peningkatan konsentrasi GSSG dan persentase glutation teroksidasi (52% dan 82%, resp, P <0,001. ). Gambar 1 (a) dan 1 (b) membandingkan GSH/GSSG dan % ekuivalen glutation teroksidasi , masing-masing, dalam plasma, sel T, dan monosit dari kasus dan anak-anak kontrol dan grafis menunjukkan penurunan yang konsisten di kedua ekstraseluler dan intraseluler Status redoks antara glutation anak-anak kasus.

Konsentrasi sistin, bentuk teroksidasi dari sistein, secara signifikan meningkat 52%, sedangkan

perbandingansistein / sistin redoks secara signifikan menurun 31%dalam plasma dari anak autis.

nilai Ehuntuk sistein juga dapat dihitung dari persamaan Nernst (lihat di atas) dimanaE0untuk sistein

sama dengan -250 mV .Nilai Eh yang terhitunguntuk sistein pada anak dengan autisme adalah -106

mV, atau 5 mV lebih teroksidasi daripada nilaiEhkontrolyakni – 111Mv.

3.4 Peningkatan produksi radikal bebas pada anak dengan autisme

Jumlah radikal bebas intraseluler anakautisdiukur dari PBMC yang terdapatpada anak autis (n-=15)

dananak control yang tidakterpengaruh (n=16)menggunakan DCF, sebuah ROS / RNS-sensitif probe

neon.Monosit dan limfosit terpisahkankarenasifat menghamburkan cahayanya(ukuran dan densitas)

dan dapatdianalisis secara terpisah.

Gambar 2 menyajikan intensitas fluoresensi median (LKM) limfosit dari anak autis dan anak-anak

kontrol tidak terpengaruh (dinormalkan untuk LKM dari persiapan PBMC standar). Limfosit gated

dari anak autis menunjukkan tingkat rata-rata jauh lebih tinggi dari radikal bebas intraseluler

dibandingkan dengan limfosit dari anak-anak kontrol (p< 0,05)

Tidak ada perbedaan dalam produksi radikal bebas yang diamati pada monosit dari anak-anakkasus

autism dan anak-anak kontrol. Dalamhalini, Produksi radikal bebas intraselular tidak berhubungan

dengan usia atau gender.

4.DISKUSI

Stres oksidatif secara umum didefinisikan sebagai ketidakseimbangan antara produksi oksidan dan

mekanisme pertahanan antioksidan endogen dan dapatditemukanpada orang dengan penurunan status

redoks GSH / GSSG dan sistein / sistin tiol / disulfida pasangan redoks. Keseimbangan relatif antara

kelompok sulfhidril kurang dan dengansulfhidrilteroksidasi didefinisikan keadaan redoks ambien.

Rendahnya glutation Status redoks telah dikaitkan dengan patofisiologi gangguan neurobehavioral,

beberapa diantaranyatermasuk skizofrenia,gangguan bipolar, alkoholisme, HIV dan penyakit

Alzheimer. Ini adalah penelitian pertama untuk mengevaluasi antioksidanglutation intraselularyang

dimediasi redoks dalam sel primer dari anak autis serta plasma ekstraseluler sistein / status redoks

sistin. Karena kedua sistem redoks inisudah diatur, makaevaluasi dari kedua pasangan redoks

inidapatmemberikan gambaran lengkap sel imunprimer darikekebalan pada anak

autis.Untukmendukung dan memperluas temuan kami sebelumnya tentangpenurunanplasma dan sel

limfoblastoid GSH / GSSG, kami sekarang melaporkan bahwa kedua sel imun primer GSH / GSSG

dan plasma sistein / sistin pasangan redoks sama-sama dikompromikan menghasilkan lingkungan

mikro sel lebih teroksidasi kekebalan tubuh pada anak dengan autisme dibandingkan untuk

mengendalikan anak-anak

Bukti terbaru mendukung gagasan bahwa fluktuasi halus dalam ambient status

redoks dapat memberikan suatu mekanisme pengaturan penting yang secara dinamis dapat

mengatur fungsi dari sel kekebalan tubuh. Aktivasi dan proliferasi dari sel T membutuhkan

pengurangan lingkungan mikro intraseluler, sedangkan lingkungan yang

teroksidasi mendorong penghentian siklus sel dan menumpulkan respon terhadap

stimulasi kekebalan tubuh. Sebagai contoh, sebuah mekanisme yang

melibatkan modulasi redoks ekstraselular oleh pengaturan sel T (Tregs) yang baru-baru

ini dijelaskan oleh Yan et al. Tregs yang ditampilkan untuk menghambat pelepasan dari

sistein ke dalam imun sinaps diantara sel – sel dendritik dan sel T ¨ na ive , yang secara

efektif mengurangi kadar GSH dalam sel T dengan mengeliminasi kecepatan pembatasan

asam amino untuk sintesis GSH. Rasio yang tinggi dikurangi

menjadi glutasi teroksidasi adalah dibutuhkan untuk perkembangan siklus

sel dari fase G1 ke S dan induksi dari respon sel T proliferasi. Dengan demikian,

semakin teroksidasi GSH / GSSG  redoks dari glutasi intraseluler di PBMC dan diaktifkan sel

T  CD 4 yang diamati pada anak dengan autisme (Tabel 2) akan

menyarankan fenotipe hyporesponsive yang kurang kondusif untuk sel T aktivasi

dan proliferasi. Sejalan dengan hipotesis ini, beberapa studi terbaru telah

mendokumentasikan kelainan pada respon imun adaptif pada anak autis.

Defisit glutasi dalam sel T telah terbukti negatif mempengaruhi adaptasi

respon kekebalan tubuh  dan sel T proliferasi dengan mengurangi pergantian reseptor IL-

2 dan IL-2-bergantung sintesis DNA. Dalam monosit,

lingkungan intraseluler teroksidasi telah terbukti mengubah profil sitokin dan

condong terhadap keseimbangan Th1 dan Th2. Studi pada tikus telah menunjukkan bahwa

kandungan GSH intraseluler dari sel antigen presentasi

(APC)  mengubah pola sitokin respon Th1 dan Th2 secara reversibel. Secara

khusus, defisit GSH mengurangi Th1 terkait produksi IFN-γ  dan  Th2-terkait produksi IL-4

berlebihan. Perbaikan GSH mengembalikan Th1 respon sitokin dan normalisasi respon Th2.

Sejalan dengan pengamatan ini, dua studi telah melaporkan bahwa sel T Helper

subpopulasi di PBMC dari anak autis bergeser ke arah dominasi T Helper 2 (Th2).

Selanjutnya, penurunan ekspresi reseptor sel T IL-2 telah dilaporkan berhubungan dengan

penurunan respon proliferasi setelah rangsangan mitogen pada anak autis.

GSH / GSSG status redox teroksidasi berlebihan dalam plasma dan sel-sel kekebalan

tubuh primer pada anak dengan autisme (Gambar 1) dapat memberikan penjelasan

mekanis untuk adaptasi abnormal dari respon kekebalan tubuh yang sebelumnya

dilaporkan pada anak-anak. Ketika stres oksidatif intraseluler

melebihi kapasitas redoks glutasi, sel – sel  mengeluarkan GSSG ke plasma sebagai

mekanisme untuk memulihkan homeostasis redoks internal. Konsentrasi GSSG meningkat

pada PBMC (Tabel 2) menunjukkan bahwa mekanisme pengeluaran GSSG dan

kapasitas antioksidan intraseluler tidak mencukupi untuk mempertahankan

homeostasis redoks intraseluler dan bahwa ketidakseimbangan redoks adalah kronis pada

anak-anak. Hubungan antara lingkungan mikro sel kekebalan tubuh yang lebih

teroksidasi dan adaptasi yang abnormal menjamin kelanjutan penyelidikan terutama pada

penerangan dari potensi pengembalian dari disfungsi kekebalan tubuh dengan target

penatalaksanaan untuk meperbarui homeostasis redoks. 

Perhitungan nilai Eh untuk GSH ekstraseluler dan kolam sistein (Tabel 3) dalam

populasi kontrol kami agak berbeda dari nilai-nilai yang dipublikasikan sebelumnya. Pada

orang dewasa, glutation plasma Eh lebih berkurang sekitar -137 mV, dan sistein

plasma pasangan redoks lebih teroksidasi di-80 mV. Perbedaan ini mungkin

mencerminkan perbedaan metodologi dalam persiapan

sampel yang kami deteksi elektrokimia tidak memerlukan derivatisasi untuk deteksi. Hal ini

juga mungkin bahwa anak-anak (usia 3-10 tahun) mungkin memiliki

kapasitas kurang pereduksi dari yang dilaporkan sebelumnya pada orang dewasa(usia 25-

35 tahun). Meskipun demikian, kami menghitung nilai Eh yang konsisten dengan laporan

sebelumnya bahwa sistein plasma Eh (-111 mV) lebih teroksidasi daripada GSH(-128 mv).

gambar 2 : Radikal Bebas intraselular yang meningkat pada Limfosit pada Anak-anak dengan

autisme. Radikal bebas intraselular diukur dalam PBMC yang baru diisolasi dari anak autis dan anak-

anak tidak terpengaruh kontrol menggunakan 1 DCF uM. Disajikan

adalah intensitas fluoresen median (MFI) dari populasi limfosit gateddari

sampel subjek dinormalisasi untuk MFI dari persiapan PBMC standar juga diobati dengan 1 DCF uM

dan dianalisis dengan setiap sampel subjek. Limfosit dari anak autis menunjukkan tingkat rata-

rata jauh lebih tinggi dari radikal bebas intraseluler daripada kontrol (P = 0,04). Kontrol rata-

rata (95% CI) = 0,576 (0,551-0,640); kasus rata-rata (95% CI) = 0,689 (0,561-1,086).