69

6

PROTEIN REKOMBINAN

6.1 PENDAHULUAN

Protein adalah bahan yang paling penting dari semua bahan yang membentuk organisme

hidup. Protein terkandung dalam setiap sel hidup pada semua organisme, tanpa pengecualian,

dan di dalam sel, protein berada dalam jumlah yang sangat banyak dengan berbagai bentuk

atau jenis. Semua karakteristik dari organisme ditentukan oleh aktivitas protein.

6.2 LATAR BELAKANG

Dalam biologi molekuler, yang disebut “Central Dogma”, menyatakan bahwa informasi gen

yang tersimpan di dalam DNA dipindahkan ke RNA dan kemudian dipindahkan ke protein.

Proses transfer dari DNA ke RNA disebut proses transkripsi, sedangkan proses transfer dari

RNA ke protein disebut proses translasi. Kode-kode gen dalam protein disebut gen struktural

karena mereka bertanggung jawab untuk mengekspresikan informasi gen ke dalam unit

struktural pada manusia, seperti warna mata, kulit dan rambut.

6.3 DEFINISI

Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam

berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dan

memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Pembentukan protein rekombinan

dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai vector. Teknologi rekombinan

adalah proses yang terlibat dalam pembentukan protein rekombinan.

70

6.3.1 Rekombinasi

Rekombinasi adalah suatu proses dimana suatu progeny (keturunan) dikembangkan menjadi

kombinasi gen-gen yang berbeda dari gen-gen kedua orang tua nya, yang menghasilkan satu

set DNA baru.

Gambar 6.1. Penyilangan molekul DNA untuk menghasilkan protein rekombinan

Ditunjukkan pada gambar 6.1 adalah proses dari rekombinasi protein, diadaptasi dari

artikel dari Pusat Informasi Nasional Bioteknologi (NCBI).

Istilah “protein” digunakan karena protein adalah struktur yang mendukung DNA dan

merupakan blok bangunan materi hidup. Digunakan istilah “DNA rekombinan” untuk

menggambarkan urutan DNA baru yang telah dihasilkan dari rekombinasi gen dari kedua

orang tuanya. Proses rekombinan tersebut menjadi landasan terhadap kejadian evolusi dari

makhluk hidup.

6.4 PROTEIN REKOMBINAN

Teknologi DNA rekombinan adalah salah satu cara mempelajari fungsi dan interaksi dari

protein. Hal ini dilakukan dengan mengisolasi urutan DNA target dan kemudian

memindahkannya ke vektor kloning yang memiliki kemampuan untuk mereproduksi diri.

Urutan DNA dari vektor kloning berinteraksi dengan DNA target dan menghasilkan cetak

biru informasi gen baru yang disebut DNA rekombinan. DNA rekombinan tersebut

ditransfer ke RNA, yang pada proses berikutnya menghasilkan protein rekombinan.

6.4.1 Produksi protein rekombinan

Rekombinan DNA merupakan bidang ilmu pengetahuan yang hangat diperbincangkan yang

berhubungan dengan pembuatan organisme – mulai dari bakteri hingga kambing --

memproduksi protein yang biasanya tidak dihasilkan oleh suatu organisme. Penelitian di

bidang ini telah menghasilkan berbagai macam aplikasi dimana pada beberapa tahun yang

lalu masih belum memungkinkan. Penderita diabetes yang biasanya bergantung pada insulin

71

dari babi, dimana mirip dengan manusia tetapi tidak persis sama, sekarang dapat memiliki

insulin dari manusia yang pada saat ini telah dapat diproduksi oleh bakteri. Penderita

hemophilia dapat menggunakan faktor pembekuan yang telah diproduksi dalam susu

kambing. Sementara ilmu pengetahuan yang kompleks, dapat diuraikan ke dalam konsep

yang lebih sederhana.

Gambar 6.2. Skema rekombinasi protein

Dalam rangka untuk memahami bagaimana protein rekombinan dibuat, sebelumnya

kita perlu memahami bagaimana semua protein dibentuk. DNA berada didalam inti sel, DNA

memegang semua petunjuk yang diperlukan untuk membentuk suatu organisme. Seiring

dengan itu rangkaian helai panjang dari DNA adalah suatu instruksi untuk terbentuknya

berbagai protein.

6.4.2 Struktur DNA

DNA adalah dasar genetik untuk semua makhluk hidup dan seluruh kehidupan pada dasarnya

mempunyai struktur DNA yang sama. Untai panjang dari DNA pada dasarnya terdiri dari

jutaan unit berulang yang disebut nukleotida. Setiap nukleotida memiliki tiga bagian: gula,

gugus fosfat dan basa nitrogen. Struktur akhir DNA adalah dua helai yang terhubung di

bagian tengah, mirip sebuah tangga atau tangga spiral. Masing-masing sisi terdiri dari fosfat

dan gula yang berulang-ulang terus dan penghubung diantaranya terdiri dari dua basa

nitrogen yang bergabung bersama-sama. Hanya ada empat basa nitrogen dan mereka

direpresentasikan dengan kode-kode TCAG. Sebuah DNA dari organisme merupakan jutaan

72

basa-basa panjang tetapi urutan dari Ts, Cs, As dan Gs yang membuat kita mempunyai

perbedaan satu dengan yang lainnya.

6.4.3 Struktur dan Fungsi protein

DNA yang kita miliki menentukan dengan tepat bagaimana kita akan terlihat dan bagaimana

setiap sifat yang kita miliki, tetapi semua DNA hanya merupakan kode-kode sederhana untuk

protein-protein yang berbeda. Sebenarnya protein tersebut yang membuat kita menjadi

bentuk seperti sekarang ini. Protein merupakan rangkaian rantai panjang dari asam amino

sama seperti DNA yang juga merupakan rantai panjang dari nukleotida. Terdapat 20 asam

amino pada keberadaan protein dan setiap organisme menggunakan 20 asam amino tersebut

dalam kombinasi yang berbeda-beda untuk membentuk setiap protein .

Urutan asam amino ini sangat penting karena urutan tersebut memberikan bentuk

akhir dari protein. Bentuk dari protein sangat penting, hal tersebut memberikan karakteristik

dari protein. Inilah sebabnya mengapa protein rekombinan sangat penting. Menggunakan

insulin babi, yang memiliki struktur sedikit berbeda dengan insulin manusia, selalu berisiko

karena beberapa orang akan menolaknya. Namun, insulin rekombinan mempunyai urutan

asam amino yang persis sama seperti insulin manusia, kecuali yang dihasilkan oleh bakteri.

Hanya karena bakteri memiliki kode genetik didalamnya tidak berarti bahwa bakteri

akan segera memulai membuat suatu protein rekombinan. Para ilmuwan harus merekayasa

bagian promotor untuk melampirkan kode yang diinginkan sebelumnya dan kemudian

mereka dapat mengaktifkannya. Setelah semua ini ditambahkan ke dalam bakteri atau

organisme lain, sel-sel mulai membuat protein baru, karena urutan dari asam amino yang

sama maka produk protein akan 100% identik dengan sumbernya dank arena itu lebih aman

untuk digunakan.

6.4.4 Pilihan host untuk amplifikasi protein

Sistem host tersedia dalam beberapa bentuk termasuk fag, bakteri, ragi, tumbuhan, jamur

berserabut, serangga atau sel mamalia yang tumbuh dalam kultur dan hewan transgenik.

Pilihan terakhir dari host akan bergantung pada persyaratan yang spesifik dan aplikasi untuk

protein rekombinan. Pemilihan host tidak hanya mempengaruhi amplifikasi dan isolasi dari

protein, tetapi juga cara dimana produk kemudian dapat dimurnikan. Dalam rangka untuk

memutuskan host mana yang paling cocok dalam jumlah dan tingkat kemurnian produk serta

integritas biologis dan potensi toksisitas sebaiknya dipertimbangkan. Sebagai contoh, sistem

73

ekspresi bakteri tidak cocok jika modifikasi pasca-translasi diperlukan untuk menghasilkan

produk rekombinan yang dapat berfungsi penuh.

Lokasi produk dalam host akan mempengaruhi pilihan metode untuk isolasi dan

pemurnian dari produk. Sebagai contoh, sebuah host bakteri dapat mensekresikan protein ke

dalam media pertumbuhan, mentransportnya ke dalam ruang periplasmik atau menyimpannya

sebagai badan inklusi yang tidak dapat larut dalam sitoplasma.

Tabel 6.1. Keuntungan dan kerugian dalam pemilihan host

Host Advantages Disadvantages

Bacteria

e.g.Escherichia coli

Many references and much experience

available

No post-translational modification

Wide choice of cloning vectors

Gene expression easily controlled Biological activity and immunogenicity may differ

from natural protein

Easy to grow with high yields (product can

form up to 50% of total cell protein)

High endotoxin content in gram negative bacteria

Product can be designed for secretion into the

growth media

Bacteria e.g.

Staphylococcus aureus

Secretes fusion proteins into the growth media Does not express such high levels as E. coli

Pathogenic

Mammalian cells Same biological activity as native proteins Cells can be difficult and expensive to grow

Mammalian expression vectors available Cells grow slowly

Can be grown in large scale cultures Manipulated cells can be genetically unstable

Low productivity as compared to micro-organisms

Yeasts Lacks detectable endotoxins Gene expression less easily controlled

Generally Regarded As Safe (GRAS) Glycosylation not identical to mammalian systems

Fermentation relatively inexpensive

Facilitates glycosylation and formation of

disulphide bonds

Only 0.5% native proteins are secreted so

isolation of secreted product is simplified

Well established large scale production and

downstream processing

Cultured insect cells

Baculovirus vector

Many processing mechanisms similar to

eukaryotic cells

Lack of information on glycosylation mechanisms

Safe, since few arthropods are adequate hosts

for baculovirus

Product not always fully functional

Baculovirus vector received FDA approval for

a clinical trial

Few differences in functional and antigenic properties

between product and native protein

Virus stops host protein amplification. High

level expression of product

74

Tabel 6.1. (Lanjutan) Keuntungan dan kerugian pemilihan host

Host Advantages Disadvantages

Fungi Well established systems for

fermentation High level of expression not yet achieved

e.g.Aspergillus sp. of filamentous fungi

Growth inexpensive Genetics not well characterized

A.niger is GRAS No cloning vectors available

Can secrete large quantities of product into growth

media, source of many industrial enzymes

Plants Low transformation efficiency

Long generation time

6.4.5 Pilihan Vektor

Dalam rangka untuk mengkloning gen yang diinginkan semua vector yang telah direkayasa

memiliki pilihan situs hilir restriksi unik dari urutan promotor transkripsi. Pilihan keluarga

vector diatur oleh host/inang nya. Setelah host telah dipilih, berbagai macam vector yang

berbeda dapat dipertimbangkan, dari ekspresi vector yang sederhana hingga vector yang

mengeluarkan/mensekresikan protein fusi.

Namun, seperti untuk pemilihan dari system host yang sesuai, pilihan terakhir dari

vector harus mempertimbangkan persyaratan khusus dari aplikasi dan tentu saja akan

dipengaruhi oleh perilaku dari protein target. Salah satu faktor kunci yang telah menyebabkan

meningkatnya penggunaan vector protein fusi adalah amplifikasi dari protein fusi yang berisi

tag dengan ukuran yang telah diketahui dan fungsi biologis sangat mudah untuk

menyederhanakan isolasi, pemurnian dan selanjutnya deteksi. Dalam beberapa kasus hasil

protein juga dapat ditingkatkan.

Pemeliharaan dan protokol kloning sangat spesifik untuk setiap vector dan petunjuk

yang diberikan oleh pemasok harus diikuti dengan hati-hati.

Table 6.2. Memberikan tinjauan beberapa fitur amplifikasi fusi protein yang dapat

mempengaruhi pilihan terakhir dari vektor.

Advantages Disadvantages

Fusion proteins

Cell compartments can be targeted Tag may interfere with protein structure and

affect folding and biological activity

Provide a marker for expression Cleavage site is not always 100% specific if tag

needs to be removed

Simple purification using affinity chromatography

under denaturing or non-denaturing conditions

Easy detection

75

Refolding achievable on a chromatography column

Ideal for secreted proteins as the product is easily

isolated from the growth media

Non- fusion proteins

No cleavage steps necessary Purification and detection not as simple

Problems with solubility may be difficult to overcome,

reducing potential yield

6.4.6 Vektor untuk protein non-fusion

Tabel 6.3. Menunjukkan contoh vektor non-fusion

Vector

family Comments

pTrc 99 A Prokaryotic vector for expression of proteins encoded by inserts lacking a start codon, inducible

by IPTG

pKK223-3 For over-expression of proteins under the control of the strong tac promotor in prokaryotes

pSVK 3 For in vivo expression in mammalian cell lines

PSVL SV40 For high level transient expression in eukaryotic cells

pMSG For inducible expression in mammalian cells

6.4.7 Vektor untuk protein fusi

Tabel 6.4. Menunjukkan contoh dari vector untuk protein fusi bersama dengan produk

pemurnian yang diperlukan.

Vector family Tag Purification Products

pGEX Glutathione S-transferase GST MicroSpin™ Purification Module

GSTrap™

Glutathione Sepharose™ Fast Flow

PQE 6 x Histidine His MicroSpin Purification Module

HisTrap™

HiTrap™ Chelating

Chelating Sepharose Fast Flow

pET 6 x Histidine His MicroSpin Purification Module

HisTrap

HiTrap Chelating

Chelating Sepharose Fast Flow

pEZZ 18 (non-inducible

expression) IgG binding domain of protein A IgG Sepharose 6 Fast Flow

pRIT2T(expression inducible IgG binding domain of protein A IgG Sepharose 6 Fast Flow

by temperature change)

76

6.4.8 Pilihan tag fusi

Dua tag yang paling sering digunakan adalah glutathione S-transferase (GST tag) dan 6 x

residu histidine (His)6 tag. Adapun pemilihan dari host dan vector, keputusan untuk

menggunakan baik GST atau (His)6 tag harus dibuat sesuai dengan kebutuhan aplikasi

spesifik

Tabel 6.5. Menyoroti beberapa fitur kunci dari tag yang harus dipertimbangkan.

GST tag (His)6 tag

Can be used in any expression system Can be used in any expression system

Purification procedure gives high yields of pure product Purification procedure gives high yields of pure

product

Selection of purification products available for any scale Selection of purification products available for any

scale

pGEX6P PreScission™ protease vectors enable cleavage

and

Small tag may not need to be removed e.g. tag is

poorly

purification in a single step immunogenic so fusion partner can be used directly as

an antigen in antibody production

Site-specific proteases enable cleavage of tag if required Site-specific proteases enable cleavage of tag if

required.

N.B. Enterokinase sites that enable tag cleavage

without leaving behind extra amino acids are

preferable

GST tag easily detected using an enzyme assay or (His)6 tag easily detected using an immunoassay

an immunoassay

Simple purification. Very mild elution conditions Simple purification, but elution conditions are not as

minimize risk of damage to functionality and mild as for GST fusion proteins. Purification can be

antigenicity of target protein performed under denaturing conditions if required.

N.B. Neutral pH but imidazole may cause

precipitation

Desalting to remove imidazole may be necessary

GST tag can help stabilize folding of recombinant

proteins (His)6 - dihydrofolate reductase tag stabilizes small

peptides during expression

Fusion proteins form dimers Small tag is less likely to interfere with structure and

function of fusion partner

Mass determination by mass spectrometry not always

accurate for some (His)6 fusion proteins*

77

6.4.9 Penanganan badan inklusi

Amplifikasi sering dapat dikendalikan sehingga protein rekombinan terakumulasi dalam

ruang intraseluler atau disekresikan ke dalam ruang periplasmik. Sedangkan sekresi

menguntungkan dari segi protein folding, kelarutan dan oksidasi sistein, hasilnya umumnya

jauh lebih tinggi bila menggunakan ekspresi intraseluler.

Namun demikian, protein rekombinan yang terakumulasi intrasel sering diatur dalam

bentuk badan inklusi, agregat terlarut dari protein yang berkurang aktivitas biologisnya. Jadi,

sementara kehadiran badan inklusi dapat membuat langkah awal dari isolasi menjadi sangat

sederhana, isolasi protein dari badan inklusi sering menyebabkan kesulitan dengan lipat-

ulang dari protein, mengembalikan reformasi yang benar dari ikatan disulfide dan dengan

demikian terjadi pemulihan penuh aktivitas biologis.

Tabel 6.6. Merangkum keuntungan dan kerugian dari bekerja dengan produk rekombinan

yang dinyatakan sebagai badan inklusi.

Advantages Disadvantages

High expression levels can reduce fermentation costs Re-folding shifts difficulties and costs downstream

Easily monitored by SDS-PAGE or immunoblotting Amplification cannot be monitored directly

by functional assays

Cytoplasmic proteins are easily washed away Minor contaminants are often hydrophobic, poorly

soluble membrane proteins and cell wall fragments

Major contaminants are oligomers and misfolded Can be difficult to separate multiple forms of the

or proteolyzed forms of the protein same protein

pL promoter with T induction often yields protein If the protein does not fold well, another expression

where other systems fail system will be needed

6.5 APLIKASI

Proses rekombinan protein digunakan untuk berbagai tujuan penelitian secara komersial,

medis dan ilmiah. Dapat juga digunakan pada peternakan secara komersial untuk melawan

penyakit pada ternak serta tanaman.

Rekombinan protein mempunyai peran besar dalam penciptaan bahan terapeutik yang

dapat memodifikasi dan memperbaiki kesalahan genetik, menghancurkan sel-sel kanker,

mengobati gangguan system kekebalan tubuh, dan masih banyak fungsi-fungsi lainnya.

78

Sebagai contoh, Erythropoietin, sebuah protein hormone yang diproduksi dengan teknologi

rekombinan dapat digunakan dalam merawat pasien dengan kekurangan/defisiensi eritrosit,

yang merupakan penyebab umum dari komplikasi ginjal.

Ada bidang medis yang disebut farmakologi rekombinan, dimana rekombinan protein

digunakan untuk memproduksi pengobatan DNA yang diturunkan seperti interleukins; yang

mengatur sel T, hormon pertumbuhan; digunakan untuk merangsang pertumbuhan,

eritropoietin; yang merangsang produksi sel darah merah dalam sumsum tulang, dan insulin;

digunakan untuk mengobati diabetes tipe 1. Protein rekombinan juga dapat digunakan di

laboratorium sains untuk penelitian stem cell dan penelitian kloning.

Di masa depan bioteknologi dapat menimbulkan peningkatan perkembangan dari

organ manusia di laboratorium dan produksi dari tanaman yang dapat menghasilkan pestisida

sendiri. Meskipun masih banyak perdebatan etis dan pertanyaan, teknologi rekombinan

memiliki potensi untuk merevolusi produksi pangan, perawatan kesehatan dan proses

penuaan.

Protein Rekombinan di mulai dari pertama kali saat Insulin diproduksi oleh E. coli

oleh Herbert Boyer di San Fransisco Amerika dibawah perusahaan Genentech Inc 1978.

Peristiwa ini begitu mengagetkan dunia karena dengan keberhasilan produksi protein

rekombinan tersebut merubah sebagian besar peta industri di dunia.

Bayangkan sebelum dapat diproduksi oleh E. coli insulin didapatkan dengan cara

membantai sekian ribu sapi dan babi, proses penjagalannya pun harus khusus demi menjamin

kualitas insulin yang akan disolasi dari hewan ternak tersebut. Dengan keberhasilannya

diproduksi pada E. coli maka ini akan mengurangi biaya produksi Insulin menjadi jauh

dibawah prediksi sebelumnya.

Escherichia coli adalah mikroorganisme yang paling terkait dengan berbagai bidang

bioteknologi karena bakteri inilah organisme pertama yang dipelajari secara lengkap baik dari

sisi metabolismenya, fisiologinya, regulasi genetikanya bahkan sampai sequence genomnya.

Bukan hanya karena kemudahannya untuk di manipulasi akibat lengkapnya informasi tentang

E.Coli melainkan juga karena kemudahannya untuk di kulturkan dan cepatnya proses

pertumbuhannya berlangsung dibandingkan dengan berbagai macam organisme yang lain.

Oleh karena itu E. Coli mendapatkan kehormatan menjadi organisme model yang cukup

penting dalam dunia protein rekombinan.

Proses regulasi gen yang telah lengkap dipelajari dan telah banyak dimanipulasi telah

menyebabkan E. coli menjadi organisme model yang paling banyak mempunyai variasi

pilihan untuk dijadikan host dalam proses produksi protein rekombinan

79

6.6 INSULIN REKOMBINAN

Para peneliti membuat insulin manusia rekombinan dengan struktur yang identik

denganinsulin manusia menggunakan vektor bakteri E. coli yang telah dilemahkan.

Gambar 6.3. Bakteri Escherichia coli yang digunakan sebagai hospes pembuatan protein

rekombinan

6.6.1 Bakteri Gram negatif, E. coli, penghuni alami saluran pencernaan manusia

Sejak Banting dan Best menemukan hormon insulin pada tahun 1921, pasien diabetes

mellitus yang mengalami peningkatan kadar gula darah disebabkan gangguan produksi

insulin, telah diterapi dengan menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas

hewan.

Meskipun insulin sapi dan babi mirip dengan insulin manusia, namun komposisinya

sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah sistem kekebalan tubuh pasien menghasilkan antibodi

terhadap insulin babi dan sapi yang berusaha menetralkan dan mengakibatkan respon

inflamasi pada tempat injeksi. Selain itu efek samping dari insulin sapi dan babi ini adalah

kekhawatiran adanya komplikasi jangka panjang dari injeksi zat asing yang rutin.

Faktor-faktor ini menyebabkan peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin dengan

memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk

memproduksi insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami diproduksi. Hal ini

telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.

80

6.6.2 Struktur insulin

Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari 51 asam amino, 30 di

antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21 lainnya yang membentuk rantai kedua.

Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan disulfida.

Gambar 6.4. Struktur protein insulin manusia

Kode genetik untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas lengan pendek dari

kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63 dalam rantai A dan 90 dalam rantai

B). DNA yang membentuk kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari

rantai nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen. Ada

empat basa nitrogen yang berbeda yaitu adenin, timin, sitosin dan guanin. Sintesis protein

tertentu seperti insulin ditentukan oleh urutan dasar tersebut yang diulang.

6.6.3 Proses produksi

Escherrichia coli (E. coli), penghuni saluran pencernaan manusia, adalah „pabrik‟ yang

digunakan dalam rekayasa genetika insulin. Ketika bakteri berreproduksi, gen insulin

direplikasi bersama dengan plasmid. E. coli seketika memproduksi enzim yang dengan cepat

mendegradasi protein asing seperti insulin. Hal tersebut dapat dicegah dengan cara

menggunakan E. coli strain mutan yang sedikit mengandung enzim ini. Pada E. coli, B-

galaktosidase adalah enzim yang mengontrol transkripsi gen. Untuk membuat bakteri

memproduksi insulin, gen insulin perlu terikat pada enzim ini.

81

Gambar 6.5. Skema pembuatan insulin rekombinan

Enzim restriksi secara alami diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak seperti

pisau bedah biologi, hanya mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misal salah satunya

rangkaian kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan

pasangan basa nitrogen tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode genetik dari

kromosom sebuah organisme sehingga dapat memproduksi insulin. Sedangkan DNA ligase

adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik dan pengelas ujung nukleotida.

Gambar 6.6. Skema kerja enzim restriksi endonuklease

82

Langkah pertama pembuatan humulin adalah mensintesis rantai DNA yang membawa

sekuens nukleotida spesifik yang sesuai karakteristik rantai polipeptida A dan B dari insulin.

Urutan DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua

rantai telah dipetakan. Enam puluh tiga nukleotida yang diperlukan untuk mensintesis rantai

A dan sembilan puluh untuk rantai B, ditambah kodon pada akhir setiap rantai yang

menandakan pengakhiran sintesis protein.

Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian ditempatkan di setiap

awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam amino sel bakteri itu.

„Gen‟ sintetik rantai A dan B kemudian secara terpisah dimasukkan ke dalam gen untuk

enzim bakteri, B-galaktosidase, yang dibawa dalam plasmid vektor tersebut. Pada tahap ini,

sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan B-

galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli.

6.7. Mikroskopis plasmid E. coli dengan mikroskop elektron

Praktis penggunaan teknologi DNA rekombinan dalam sintesis insulin manusia

membutuhkan jutaan salinan plasmid bakteri yang telah digabungkan dengan gen insulin

dalam rangka untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersama dengan sel

mereplikasi galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani mitosis.

83

6.8. Skema pembentukan insulin rekombinan pada kultur E. coli

Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu

rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B-

galaktosidase dan dimurnikan.

Gambar 6.9. Struktur beta galaktosidase rantai A dan rantai B yang telah dimurnikan

Kedua rantai dicampur dan

dihubungkan kembali dalam reaksi yang

membentuk jembatan silang disulfida,

menghasilkan Humulin murni (insulin

manusia sintetis).

Gambar 6.10. ikatan disulfida yang terbentuk pada dua rantai protein insulin A dan B

84

6.6.4 Implikasi biologis dari rekayasa genetika Humulin rekombinan

Humulin merupakan protein hewani yang dibuat dari bakteri sedemikian rupa sehingga

strukturnya benar-benar identik dengan molekul alami. Hal ini akan mengurangi

kemungkinan komplikasi yang disebabkan produksi antibodi oleh tubuh manusia. Dalam

studi kimia dan farmakologi, insulin rekombinan DNA manusia yang diproduksi secara

komersil telah terbukti bisa dibedakan dari insulin pankreas manusia.

Awalnya, kesulitan utama yang dihadapi adalah kontaminasi produk akhir oleh sel

inang, sehingga meningkatkan resiko kontaminasi dalam kaldu fermentasi. Bahaya ini diatasi

dengan ditemukannya proses pemurnian. Ketika dilakukan tes pada produk akhir insulin,

termasuk teknik terbaik radio-immuno assay, tidak ada „kotoran‟ yang terdeteksi.

Seluruh prosedur, sekarang dilakukan dengan menggunakan sel ragi sebagai media

pertumbuhan, karena sel ragi dapat menghasilkan sebuah molekul insulin manusia yang

hampir lengkap dengan struktur tiga dimensi yang sempurna. Ini meminimalkan kebutuhan

untuk prosedur pemurnian kompleks dan mahal.

6.7. Hormon Pertumbuhan rekombinan untuk memacu pertumbuhan ikan gurame

(Osphronemus gouramy)

Ikan gurame (Osphronemus gouramy) merupakan salah spesies target revitalisasi perikanan

untuk tujuan konsumsi dalam negeri, yang diharapkan produksinya terus meningkat setiap

tahun. Target produksi ikan gurame nasional tahun 2007 belum tercapai (Nurdjana, 2008).

Rendahnya kualitas benih dan pakan yang digunakan petani ikan diduga merupakan faktor

utama penyebab target produksi nasional tersebut tidak terealisasi.

Kualitas benih ikan dapat ditingkatkan melalui aplikasi metode selektif breeding,

hibridisasi, poliploidisasi (triploidisasi), dan transgenesis. Namun demikian, teknik pemijahan

ikan gurame secara terkontrol/buatan sebagai prasyarat bagi teknologi-teknologi tersebut

belum tersedia. Pendekatan lain yang bisa digunakan untuk memacu pertumbuhan ikan

gurame adalah pemberian pakan berkualitas tinggi; kadar protein tinggi. Pakan buatan untuk

memacu pertumbuhan ikan gurame mulai dari benih hingga untuk pembesaran disarankan

menggunakan kadar protein tinggi, 33,9-43,3% (Mokoginta et al., 1994).

Persentase kadar protein yang cukup tinggi tersebut, diduga menjadi salah satu

penyebab petani kurang tertarik untuk menggunakannya, karena pakan yang memiliki protein

tinggi adalah lebih mahal dibandingkan dengan pakan dengan kandungan protein rendah.

Umumnya petani memberi makan ikan gurame berupa pakan buatan yang mengandung

protein <30% atau dengan daun talas saja. Pakan dengan kadar protein rendah, sekitar 28%,

85

yang ditambahkan bahan stimulan pemacu pertumbuhan ikan, atau pemberian pakan alami

diperkaya dengan bahan stimulan tersebut diduga menjadi alternatif untuk mengatasi masalah

rendahnya kecepatan tumbuh ikan gurame.

6.8. REFERENSI

1. Anonim, The Recombinant Protein Handbook, Protein Amplification and Simple Purification,

Edition AA, Amersham Pharmacia Biotech, page 6-8; 57

2. http://www.dnassequencing.com/category/recombinant-protein-images/

3. Kayser, O., dan Muller, R.H. (2004). Pharmaceutical Biotechnology; Drug Discovery and

Clinical Applications. Willey-VCH: German.

4. Production of Recombinant Protein, http://www.ehow.com/about_5366348_production-

recombinant-protein.html

5. Recombinant Protein Definition, http://www.ehow.com/about_5407160_recombinant-protein-

definition.html

6. Sudjadi. (2008). Bioteknologi Kesehatan. Kanisius: Yogyakarta. 151-178.

7. What Are Recombinant Proteins?, http://www.ehow.com/info_8131260_recombinant-

proteins.html