1

Pemeriksaan Penunjang Imunologi(immunoassay)

Putu Oky

Definisi Immunoassay

• Immunoassay adalah tes atau uji yang digunakan untuk mengukur adanya antigen atau antibodi pada sampel (spesimen bilogikal)

• Immunoassay dapat digunakan mendeteksi analyte yang ingin diukur

• Analyte sesuatu yg diukur dengan tes laboratorium dapat berupa Ag atau Ab dalam serum

• Tujuan immunoassay ini adalah untuk mendiagnosa suatu penyakit, mengukur aktivitas komponen imun dalam tubuh (komplemen, fagositosis, dst)

2

Prinsip Immunoassay

• Prinsip immunoassay reaksi ikatan spesifikAb-Ag membentuk kompleks Ag-Ab

• Utk deteksi Antigen : digunakan Antibodi(monoklonal ataupun polikonal ) sehinggamembentuk kompleks Imun (Ag-Ab) kompleks imun dapat diukur secara kualitatif ataukuantitatif

• Serology : metode utk mendeteksi dan mengukurtiter antibodi dalam serum darah denganmenambahkan Ag spesifiknya

• 2 tipe Antibodi yang digunakan dlmimmunoassay: poliklonal dan monoklonal

3

4

Pembuatan Antibodi monoklonal

Sel B

spesifik

Antibodi Poliklonal

Jika hewan coba diimunisasi dengan protein X (Ag) yg memiliki banyak epitop terhadap antibodi klon sel B memproduksi antibodi thd protein XAntibodi mungkin akan membentuk

sejumlah paratop protein yang berbedaCampuran Ab yg diproduksi oleh respon

terhadap antigen merupakan antibodi poliklonal

5

• Sampel yang diuji dapat berasal dari :

– Antigen sample

• Cairan tubuh yang mengandung mikrobapenginfeksi dan toksin mikroba (mengandung Ag)

Cth : Urine, feces, blood, skin, pus, swab, cairanamnion, mucous, etc.

– Blood antiserum sample

• Antiserum/ antisera darah mengandung Abterhadap infeksi tertentu jika pasien terinfeksioleh patogen yang dicurigai maka pada serumnyaakan mengandung Ab terhadap patogen tsb.

• Pengujian Ab pada darah setidaknya terdeteksi 2 minggu seteah imfeksi awal

6

Titer

• Titer : sejumlah Ab yang terdapat pada antiserum

Dapat digunakan untuk menentukan sejauh manasuatu penyakit mengalami peningkatan padainfeksinya

• Tes Aglutinasi Direct dapat digunakan untukmendeteksi titer Ab pada seseorang

• Kondisi dimana seseorang tidak memiliki Ab samasekali lalu Ab meningkat

“seroconversion”

7

Komponen Penting Dalam Immunoassay

a. Spesifisitas Antibodi

b. Valensi Antibodi

c. Aviditas Antibodi

d. Ukuran Kuantitas reaksi Ag-Ab

8

a. Spesifisitas Antibodi

• Ikatan Ag-Ab spesifik key-lock• Namun terkadang terjadi reaksi silang Ab

berikatan dengan Ag lain yg memiliki struktur mirip terjadi jika kemurnian Ag rendah

Ab yang sangat spesifik : yang memiliki binding siteyang hanya dimiliki oleh Ag dg struktur molekulyang unik

Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi :1. Spesifisitas Ab yang ditambahkan pd sampel2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg

mengkontaminasi)9

b. Valensi Antibodi

• Jumlah binding site yang potensial dari Ab terhadap Ag yg spesifik

• Valensi Ab minimal 2 umumnya

10

c. Aviditas Antibodi

• Ukuran kekuatan Ab untuk mengikat Ag

• Ab dg Aviditas besar kecenderungan mengikat Ag yang banyak

• Aviditas refleksi afinitas (besarnya daya ikat) dan jumlah binding site (valensi)

11

d. Ukuran Kuantitas Reaksi Ag-Ab

• Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahantertentu dalam serum harus dapat diukurdinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu

• Beberapa cara penentuan :1. Kualitatif : ada atau tidak adanya suatu

bahan, baik Ab atau Ag dalam serum (uji + atau - )cth : presipitasi pada uji VDRL, perubahanwarna pada penentuan Hbs Ag

12

2. Semikuantitatif : kadar Ab atau Ag pada serum dengan cara pengenceran serum secara progresif

• Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer• Cth : uji Widal

3. Kuantitatif : kadar Ab ditentukan dengan membuat kurva baku standar terlebih dahulu terhadap kekeruhan (OD) didapat nilai korelasi

Contoh : ELISA13

Macam Immunoassay

• Terdapat beberapa metode yang digunakan utkmendeteksi Ag-Ab, antara lain :

• Immunoassay tak berlabel :

a. Uji Presipitasi

b. Uji Aglutinasi

c. Uji Hemaglutinasi

d. Lisis Imun

e. Uji Netralisasi

14

• Immunoassay berlabel :

a. Berlabel Flouresens

b. Berlabel Radioisotop

c. Luminescent Assay (LIA)

d. Berlabel Enzim

15

Immunoasay tak berlabela. Uji presipitasi Bila suatu Ag terlarut bereaksi dg Abnya

Beberapa macam cara/ uji presipitas yg sering dipakai :

1. Uji presipitasi lempeng/ slide

cth : uji VDRL mikro

2. Uji presipitasi tabung

3. Uji presipitasi tabung kapiler

cth : uji CRP

4. Uji presipitasi cincin

terbentuk cincin presipitasi (uji +)

5. Imunoelektroforesis

prinsip sama dengan elektroforesis16

Liquid Precipitation

b. Uji Aglutinasi

• Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel• Macam-macam uji Aglutinasi :

1. Uji Aglutinasi lempengcth : uji Widal Lempeng deteksi Ab thd S. Paratyphi

2. Uji Aglutinasi tabung- Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat

3. Uji Hambatan Aglutinasi utk menentukan Ag larut yg tdk diketahuiidentitasnyacth : uji konfirmasi RPHA (Reverse Passive Hemagglutination Test) utk penentuanHBs Ag

18

Uji aglutinasi : keberadaan Staphylococcus (antigen) direaksikan dengan IgG thd Staphylococcus

Reaksi + jika ada kompleks imun19

c. Uji Hemaglutinasi

• Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah

• Sel darah diaglutinasikan karena antigen yang ada pada darah

• Mendeteksi Ab thd antigen sel darah merah

• Sel darah merah yag diuji merupakan Ag pada tes agutinasi

Cth : uji penentuan golongan darah

• Jika darah memiliki Ag bergolongan A aglutinasi jika dengan keberadaan Ab thd Ag gol A

20

d. Lisis imun dan Fiksasi Komponen

Kompleks imun tidak selalu terjadi antara Abx terhadap Ag pada permukaan sel

Kompleks imun baru terbentuk jika ditambahkan anti-imunoglobulin/ Ab thd Abx

Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemen lisis sel

Macam uji lisis imun :

Uji Fiksasi Komplemen

cth : deteksi Ab thd Virus, bakteri, fungi, parasit

Interpretasi : + jika tidak hemolisis

- hemolisis 21

22

Immunoassay berlabel

1. Berlabel flourescent• Uji immunoflourescent (IFA) ikatan/ kompleks

Ag-Ab divisualisasikan dg adanya perpendaranflouresen dibawah mikroskop

• Immunoflourecent :1. Direct immunoflourescent :

• Ab dilabel dg marker flourescent Ab secaralangsung diberikan pada jaringan yg diinginkan

2. In-direct immunoflourescent• Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji

dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dg Ab pertama)

• Semakin banyak ikatan Ab sekunder sinyalfloresen semakin meningkat

23

• Immunocytochemistry/ Immunofluorescence - Anti-alpha smooth muscle Actin antibody [1A4] (ab7817) staining alpha smooth muscle Actin (green) in Mouse primary colon myofibroblasts 24

antigenFrozen tissue

section

Fluorescent markerantibody

Direct Immunoflourescent

25

Indirect immunofluorescece

2nd antibody with label

1st antibodyantigen

26

2. Berlabel radioisotop

• uji laboratoris yg sensitif utk penentuankadar beberapa bahan (hormon)

• Diperlukan sampel dg bahan yg sedikitsudah dpt terdeteksi

• Cth : Uji RIA (Radioimmunoassay)

• Pelabelan dengan Radioisotop yg dipakaipada uji RIA : 3H, 14C, 57Co, 75Se, 125I, 131I

• Keberadaan ik Ag-Ab yang berlabeldiukur dengan gamma counter

27

3. Berlabel luminescent

uji immunoluminescent (LIA) prinsip sama dg RIA dan IFA, hanya pada LIA label pada reaksiAg-Ab menggunakan luminescent luminescent : a. bioluminescent : kunang2

b. chemiluninescent4. Berlabel enzim pemberian label enzim pada Ag (ELISA)

• Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produkreaksi berwarna (chromogen) – intensitas warnamenunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel

• Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase28

ELISA• Enzyme Linked Immunosorbent Assay• Prinsip menggunakan reaksi perubahan warna

(Colorimetric assay)• Enzim yg ditambahkan akan bereaksi dengan substrat

memproduksi produk yg berubah warna• Direct

- cth. Pada test kehamilan / test pack (hormon hCG)

• Indirect– Test HIV (rapid test)

ELISA

Micro-plate reader

96-well micro-plate

Positive result

iMark Microplate Absorbance Reader

Imunohistokimia

• Immunohistochemistry (IHC) mengkombinasikanteknik histologi, imunologi dan biokimiaidentifikasi komponen jaringan tertentu dg reaksispesifik Ag atau Ab yang dapat divisualisasikan dg penempelan label

• Label : flourescent, enzym, hapten, radioaktif• Ab mengikat Ag secara spesifik• Menunjukkan lokasi tertentu sel atau protein pada

jaringan/ organ di preparat/ slide• Dapat digunakan untuk mengidentifikasi proses2

selular dalam jaringan/ organ, cth : apoptosis32

Human ovarian Tumor, HE staining

33

Apoptotic cell

Sediaan tumor ovariumpada obyek glass

Pada sediaan, ingindilihat sel yg apoptosis

Pada sel yg apoptosis trdpt protein Fas L(sebagai Ag)

Di inkubasi dengan anti protein FasL (sebagai Ab)

label

Label akan tervisualisasijika ada kompleks Ag-Ab

Aplikasi immunoassay

1. Deteksi hormon polipeptida ; cth : insulin and glucagon, hCG

2. Deteksi hormon steroid3. Deteksi agen therapeutic pada pemantauan

terapi obat; dan penyalahgunaan obat4. Pengukuran enzim , protein dan komponen

terlarut dalam darah lainnya; cth : pengukuran protein plasma, komplemen

5. Penggunaan penanda penyakit (disease marker)34

Keuntungan menggunakan imunoasay :

• sensitif untuk jumlah sampel yg rendah (ug/L (ppb)• pemeriksaan cepat• pemeriksaan relatif mudah dilakukan• Pemeriksaan dapat dilakukan dimana saja (dg alat

penunjang)

Kelemahan menggunakan imunoasay :

• reaksi silang /cross reaction – Ab mungkin dapatberikatan silang dg struktur Ag yg serupa

• Relatif susah untuk menganalisa larutan yang bermacam-macam

Vaksinasi • Vaksinasi adalah aplikasi dari pirinsip imunoassay yang

populer mengandung antigen dari suatu mikroorganism (patogen)

• Adanya paparan 1st Ag menginduksi sel B dan Sel T : respon adaptif

• Paparan 2nd Ag menimbulkan respon yg lebih efektif dan cepat dibanding respon primer

• Pada beberapa infeksi, respon primer terlalu lambat utk merespon

Vaksin 36

• Jika indvidu belum pernah terpapar Ag dari patogen X lalu diberikan vaksin (X) terjadi ekspansi sel memory dan peningkatan Ab spesifik thd patogen X mampu melindungi dari bahaya Ag serupa (X) pada paparan berikutnya

• Vaksin : berisi organisme hidup/ organisme yg telah mati sama2 bersifat antigenik

• Antigen pd vaksin dapat dibuat secara sintetik atau kloning gen dr organisme terkait

• Imunitas ths penyakit infeksi dapat dicapai dg imunisasi/ imunoterapi

37

Treatment of the disease by Inducing, Enhancing or Suppressing the Immune System.

Active Immunotherapy: -

It stimulates the body’s own immune system to fight the disease.

Passive Immunotherapy: -

It does not rely on the body to attack the disease, instead they use the immune system components ( such as antibodies) created outside the body.

Imunoterapi

39

imunitas

ImunitasAdaptif

Natural

Artificial / buatan

Imunitasinnate

Pasif(maternal)

Aktif(infeksi)

Pasif(antiboditransfer)

Aktif(imunisasi)

Pustaka

• Baratawijaya, 29, Imunologi dasar, edisi 9, UI Press.

• Bush, RK., Diagnostic Test and Allergy-Chapter 1

• Handojo, I., 2003, Pengantar Imunoasai Dasar, Airlangga University Press, Surabaya

• Zabriskie, JB., 2009, Essential Clinical : Immunological Techniques, Cambridge University Press

40

Thank You41