Immunoassay Februari 2015 Compatibility Mode

download Immunoassay Februari 2015 Compatibility Mode

of 41

  • date post

    18-Feb-2016
  • Category

    Documents

  • view

    14
  • download

    0

Embed Size (px)

description

enzym immunoassay adalah tahnik analisa berdasarkan reaksi antara anibodi dan antigen yang membentuk kompleks Ab-Ag

Transcript of Immunoassay Februari 2015 Compatibility Mode

  • 1Pemeriksaan Penunjang Imunologi(immunoassay)

    Putu Oky

  • Definisi Immunoassay

    Immunoassay adalah tes atau uji yang digunakan untuk mengukur adanya antigen atau antibodi pada sampel (spesimen bilogikal)

    Immunoassay dapat digunakan mendeteksi analyte yang ingin diukur

    Analyte sesuatu yg diukur dengan tes laboratorium dapat berupa Ag atau Ab dalam serum

    Tujuan immunoassay ini adalah untuk mendiagnosa suatu penyakit, mengukur aktivitas komponen imun dalam tubuh (komplemen, fagositosis, dst)

    2

  • Prinsip Immunoassay

    Prinsip immunoassay reaksi ikatan spesifikAb-Ag membentuk kompleks Ag-Ab

    Utk deteksi Antigen : digunakan Antibodi(monoklonal ataupun polikonal ) sehinggamembentuk kompleks Imun (Ag-Ab) kompleks imun dapat diukur secara kualitatif ataukuantitatif

    Serology : metode utk mendeteksi dan mengukurtiter antibodi dalam serum darah denganmenambahkan Ag spesifiknya

    2 tipe Antibodi yang digunakan dlmimmunoassay: poliklonal dan monoklonal

    3

  • 4Pembuatan Antibodi monoklonal

    Sel B

    spesifik

  • Antibodi Poliklonal

    Jika hewan coba diimunisasi dengan protein X (Ag) yg memiliki banyak epitop terhadap antibodi klon sel B memproduksi antibodi thd protein XAntibodi mungkin akan membentuk

    sejumlah paratop protein yang berbedaCampuran Ab yg diproduksi oleh respon

    terhadap antigen merupakan antibodi poliklonal

    5

  • Sampel yang diuji dapat berasal dari : Antigen sample

    Cairan tubuh yang mengandung mikrobapenginfeksi dan toksin mikroba (mengandung Ag)

    Cth : Urine, feces, blood, skin, pus, swab, cairanamnion, mucous, etc.

    Blood antiserum sample Antiserum/ antisera darah mengandung Ab

    terhadap infeksi tertentu jika pasien terinfeksioleh patogen yang dicurigai maka pada serumnyaakan mengandung Ab terhadap patogen tsb.

    Pengujian Ab pada darah setidaknya terdeteksi 2 minggu seteah imfeksi awal

    6

  • Titer

    Titer : sejumlah Ab yang terdapat pada antiserum Dapat digunakan untuk menentukan sejauh mana

    suatu penyakit mengalami peningkatan padainfeksinya

    Tes Aglutinasi Direct dapat digunakan untukmendeteksi titer Ab pada seseorang

    Kondisi dimana seseorang tidak memiliki Ab samasekali lalu Ab meningkat

    seroconversion

    7

  • Komponen Penting Dalam Immunoassay

    a. Spesifisitas Antibodi

    b. Valensi Antibodi

    c. Aviditas Antibodi

    d. Ukuran Kuantitas reaksi Ag-Ab

    8

  • a. Spesifisitas Antibodi

    Ikatan Ag-Ab spesifik key-lock Namun terkadang terjadi reaksi silang Ab

    berikatan dengan Ag lain yg memiliki struktur mirip terjadi jika kemurnian Ag rendah

    Ab yang sangat spesifik : yang memiliki binding siteyang hanya dimiliki oleh Ag dg struktur molekulyang unik

    Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi :1. Spesifisitas Ab yang ditambahkan pd sampel2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg

    mengkontaminasi)9

  • b. Valensi Antibodi

    Jumlah binding site yang potensial dari Ab terhadap Ag yg spesifik

    Valensi Ab minimal 2 umumnya

    10

  • c. Aviditas Antibodi

    Ukuran kekuatan Ab untuk mengikat Ag Ab dg Aviditas besar kecenderungan

    mengikat Ag yang banyak

    Aviditas refleksi afinitas (besarnya daya ikat) dan jumlah binding site (valensi)

    11

  • d. Ukuran Kuantitas Reaksi Ag-Ab

    Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahantertentu dalam serum harus dapat diukurdinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu

    Beberapa cara penentuan :1. Kualitatif : ada atau tidak adanya suatu

    bahan, baik Ab atau Ag dalam serum (uji + atau - )cth : presipitasi pada uji VDRL, perubahanwarna pada penentuan Hbs Ag

    12

  • 2. Semikuantitatif : kadar Ab atau Ag pada serum dengan cara pengenceran serum secara progresif

    Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer Cth : uji Widal

    3. Kuantitatif : kadar Ab ditentukan dengan membuat kurva baku standar terlebih dahulu terhadap kekeruhan (OD) didapat nilai korelasi

    Contoh : ELISA13

  • Macam Immunoassay

    Terdapat beberapa metode yang digunakan utkmendeteksi Ag-Ab, antara lain :

    Immunoassay tak berlabel :a. Uji Presipitasi

    b. Uji Aglutinasi

    c. Uji Hemaglutinasi

    d. Lisis Imun

    e. Uji Netralisasi

    14

  • Immunoassay berlabel :

    a. Berlabel Flouresens

    b. Berlabel Radioisotop

    c. Luminescent Assay (LIA)

    d. Berlabel Enzim

    15

  • Immunoasay tak berlabela. Uji presipitasi Bila suatu Ag terlarut bereaksi dg Abnya Beberapa macam cara/ uji presipitas yg sering dipakai :

    1. Uji presipitasi lempeng/ slide

    cth : uji VDRL mikro

    2. Uji presipitasi tabung

    3. Uji presipitasi tabung kapiler

    cth : uji CRP

    4. Uji presipitasi cincin

    terbentuk cincin presipitasi (uji +)5. Imunoelektroforesis

    prinsip sama dengan elektroforesis16

  • Liquid Precipitation

  • b. Uji Aglutinasi

    Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel Macam-macam uji Aglutinasi :

    1. Uji Aglutinasi lempengcth : uji Widal Lempeng deteksi Ab thd S. Paratyphi

    2. Uji Aglutinasi tabung- Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat

    3. Uji Hambatan Aglutinasi utk menentukan Ag larut yg tdk diketahuiidentitasnyacth : uji konfirmasi RPHA (Reverse Passive Hemagglutination Test) utk penentuanHBs Ag

    18

  • Uji aglutinasi : keberadaan Staphylococcus (antigen) direaksikan dengan IgG thd Staphylococcus

    Reaksi + jika ada kompleks imun19

  • c. Uji Hemaglutinasi

    Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah Sel darah diaglutinasikan karena antigen yang ada

    pada darah

    Mendeteksi Ab thd antigen sel darah merah Sel darah merah yag diuji merupakan Ag pada tes

    agutinasi

    Cth : uji penentuan golongan darah

    Jika darah memiliki Ag bergolongan A aglutinasi jika dengan keberadaan Ab thd Ag gol A

    20

  • d. Lisis imun dan Fiksasi Komponen

    Kompleks imun tidak selalu terjadi antara Abx terhadap Ag pada permukaan sel

    Kompleks imun baru terbentuk jika ditambahkan anti-imunoglobulin/ Ab thd Abx

    Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemen lisis sel

    Macam uji lisis imun :Uji Fiksasi Komplemen

    cth : deteksi Ab thd Virus, bakteri, fungi, parasit

    Interpretasi : + jika tidak hemolisis

    - hemolisis 21

  • 22

  • Immunoassay berlabel

    1. Berlabel flourescent Uji immunoflourescent (IFA) ikatan/ kompleks

    Ag-Ab divisualisasikan dg adanya perpendaranflouresen dibawah mikroskop

    Immunoflourecent :1. Direct immunoflourescent :

    Ab dilabel dg marker flourescent Ab secaralangsung diberikan pada jaringan yg diinginkan

    2. In-direct immunoflourescent Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji

    dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dg Ab pertama)

    Semakin banyak ikatan Ab sekunder sinyalfloresen semakin meningkat

    23

  • Immunocytochemistry/ Immunofluorescence - Anti-alpha smooth muscle Actin antibody [1A4] (ab7817) staining alpha smooth muscle Actin (green) in Mouse primary colon myofibroblasts 24

  • antigenFrozen tissue

    section

    Fluorescent markerantibody

    Direct Immunoflourescent

    25

  • Indirect immunofluorescece

    2nd antibody with label

    1st antibodyantigen

    26

  • 2. Berlabel radioisotop

    uji laboratoris yg sensitif utk penentuankadar beberapa bahan (hormon)

    Diperlukan sampel dg bahan yg sedikitsudah dpt terdeteksi

    Cth : Uji RIA (Radioimmunoassay) Pelabelan dengan Radioisotop yg dipakai

    pada uji RIA : 3H, 14C, 57Co, 75Se, 125I, 131I

    Keberadaan ik Ag-Ab yang berlabeldiukur dengan gamma counter

    27

  • 3. Berlabel luminescent

    uji immunoluminescent (LIA) prinsip sama dg RIA dan IFA, hanya pada LIA label pada reaksiAg-Ab menggunakan luminescent luminescent : a. bioluminescent : kunang2

    b. chemiluninescent4. Berlabel enzim pemberian label enzim pada Ag (ELISA)

    Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produkreaksi berwarna (chromogen) intensitas warnamenunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel

    Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase28

  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Prinsip menggunakan reaksi perubahan warna

    (Colorimetric assay) Enzim yg ditambahkan akan bereaksi dengan substrat

    memproduksi produk yg berubah warna Direct

    - cth. Pada test kehamilan / test pack (hormon hCG)

    Indirect Test HIV (rapid test)

  • ELISA

    Micro-plate reader

    96-well micro-plate

    Positive result

    iMark Microplate Absorbance Reader

  • Imunohistokimia

    Immunohistochemistry (IHC) mengkombinasikanteknik histologi, imunologi dan biokimiaidentifikasi komponen jaringan tertentu dg reaksispesifik Ag atau Ab yang dapat divisualisasikan dg penempelan label

    Label : flourescent, enzym, hapten, radioaktif Ab mengikat Ag secara spesifik Menunjukkan lokasi tertentu sel atau protein pada

    jaringan/ organ di preparat/ slide Dapat digunakan untuk mengidentifikasi proses2

    selular dalam jaringan/ organ, cth : apoptosis32

  • Human ovarian Tumor, HE staining

    33

    Apoptotic cell

    Sediaan tumor ovariumpada obyek glass

    Pada sediaan, ingindilihat sel yg apoptosis

    Pada sel yg apoptosis trdpt protein Fas L(sebagai Ag)

    Di inkubasi dengan anti protein FasL (sebagai Ab)

    label

    Label akan tervisualisasijika ada kompleks Ag-Ab

  • Aplikasi immunoassay

    1. Deteksi hormon polipeptida ; cth : insulin and glucagon, hCG

    2. Deteksi hormon steroid3. Deteksi agen therape