UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POST GRADO PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POST GRADO PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS EFECTO ADYUVANTE DE LAS SAPONINAS DE Sapindus saponaria L. PARA ANTÍGENOS DE Leishmania braziliensis EN MÚSCULO ESTRIADO DE Rattus rattus var albinus” TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS Autor: M.Sc. Segundo Manuel Miranda Leyva
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
ESCUELA DE POST GRADO
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS
EFECTO ADYUVANTE DE LAS SAPONINAS DE Sapindus saponaria L. PARA
ANTÍGENOS DE Leishmania braziliensis EN MÚSCULO ESTRIADO DE Rattus
rattus var albinus”
TESIS
PARA OPTAR EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS
Autor: M.Sc. Segundo Manuel Miranda Leyva
Asesor: Dr. Ramón Piminchumo Carranza
TRUJILLO - PERÚ
2013
INDICE
Página
INDICE i
RESUMEN ii
SUMMARY iii
I. INTRODUCCIÓN 1
II. MATERIAL Y MÉTODOS 37
III. RESULTADOS 40
IV. DISCUSIÓN 42
V. CONCLUSIONES 48
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 49
VII. ANEXOS 52
ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Figura Anexo 1. Corte de pelo del muslo izquierdo para
inyectar 53
Figura Anexo 2. Inyección en el músculo del muslo izquierdo
53
i
Figura Anexo 3. Grupo testigo T. Recibió Solución Salina
Fisiológica 54
Figura Anexo 4. Grupo Experimental C. Recibió Asociación
Saponinas –
Antígenos de L. Braziliensis
54
Figura Anexo 5. Obtención de Sangre Periférica (colas)
55
ii
Resumen
Se llevó a cabo un estudio comparativo en Rattus rattus var. Albinus
para investigar el efecto coadyuvante de las saponinas de
Sapindus saponaria L. (sapindussaponina) para los antígenos de
Leishmania braziliensis. Con tal finalidad se inyectó vía
intramuscular (IM) a 4 grupos de cinco ratas machos cada uno,
en el músculo del muslo izquierdo solución salina fisiológica,
antígenos de Leishmania braziliensis, sapindussaponina, y la
asociación sapindussaponina - antígenos de Leishmania braziliensis
correspondientemente. Para evaluar los cambios en la fórmula
leucocitaria, a las 48 y 192 horas se tomaron muestras de
sangre periférica (cola) de los especímenes de cada grupo. Se
prepararon los frotis y se realizó el conteo de glóbulos
blancos con microscopio óptico con lente de inmersión. Los
resultados porcentuales fueron sometidos al análisis de
varianza ANOVA de un factor con la prueba post hoc t de
Dunnett. Se concluye que la inyección de sapindussaponina y
sapindussaponina - antígenos de Leishmania braziliensis provoca
cambios en la fórmula leucocitaria; y que las variaciones de
porcentaje de leucocitos: neutrófilos, eosinófilos, linfocitos
y monocitos indican la respuesta celular a las saponinas y la
ii
asociación saponinas – fracciones antigénicas de Leishmania
braziliensis.
Palabras clave: Sapindussaponina, antígenos de Leishmania
braziliensis, inyección intramuscular, respuesta
celular.
ii
Summary
They conducted a comparative study in Rattus rattus var. Albinus
to investigate the adjuvant effect of Sapindus saponaria L.
saponins (sapindussaponin) for Leishmania braziliensis antigen. For
this purpose was injected intramuscularly (IM) to 4 groups of
five male rats each in left thigh muscle physiological saline,
Leishmania braziliensis antigen, sapindussaponin and the
association sapindussaponin - Leishmania braziliensis antigen
correspondingly. To assess changes in the leukocyte, 48 and
192 hours, peripheral blood samples (tail) of the specimens of
each group. Smears were prepared and performed the white blood
cell count with microscope immersion lens. The percentage
results were subjected to analysis of variance one-way ANOVA
with post hoc Dunnett t. We conclude that injection of
sapindussaponin and sapindussaponin - Leishmania braziliensis
antigen causes changes in the leukocyte, and that variations
in percentage of leukocytes: neutrophils, eosinophils,
lymphocytes and monocytes indicate the cellular response to
ii
the saponins and the association saponins - fractions
antigenic Leishmania braziliensis.
Keywords: Sapindussaponin, Leishmania braziliensis antigens,
intramuscular injection, cellular response.
ii
I. INTRODUCCION
El hombre siempre ha estado interesado por conocer la
naturaleza y aprovecharla para la solución de diferentes
problemas (Boege, n.d.) tales como la necesidad de a)
alimentación para una población humana cada día mayor, b)
nuevos medicamentos para las enfermedades que en la
actualidad son incurables, y c) nuevas materias primas
industriales; motivo por el cual, se ha empeñado en
investigar científicamente las sustancias presentes en los
seres vivos que le rodean, tanto plantas (Fitoquímica) como
animales (Zooquímica).
ADYUVANTES VACUNALES: ESTADO ACTUAL Y NUEVAS TENDENCIAS
Aguilar J. y Leal M. (1999) presentaron un trabajo de
revisión sobre el estado de desarrollo y los principales
resultados obtenidos con los adyuvantes; ellos exponen que:
“La meta principal de la vacunación contra enfermedades
infecciosas, es el establecimiento de una resistencia de
larga duración contra la infección luego de una o pocas
inmunizaciones. En el caso de las vacunas vivas atenuadas
como las que se emplean contra la varicela y la
1
poliomielitis, esta meta se ha alcanzado con éxito,
mientras que las vacunas que contienen microorganismos
inactivados o sus subunidades son menos inmunogénicas y,
con frecuencia, se administran con un adyuvante.
Los adyuvantes son sustancias o procedimientos que
aceleran, prolongan o potencian la respuesta inmune
específica contra los antígenos inoculados. La palabra
adyuvante proviene del latín adjuvare, que significa ayudar,
asistir.
Los adyuvantes inmunológicos se comenzaron a desarrollar a
partir de la segunda década del siglo xx, cuando Ramon y
colaboradores observaron que los caballos que desarrollaban
abscesos en el sitio de inyección del toxoide diftérico,
generaban mayores títulos de anticuerpos específicos que
aquellos que no los tenían. Posteriormente, se reportó que
los abscesos generados por la inyección de sustancias
extrañas junto con el toxoide, aumentaban la respuesta
antitoxina en caballos.
En 1926, Glenny demostró la actividad adyuvante de los
compuestos de aluminio mediante el uso de una vacuna de
2
toxoide diftérico precipitado en alúmina. En la actualidad,
los adyuvantes de aluminio (fosfato e hidróxido de
aluminio) continúan siendo los adyuvantes inmunológicos más
ampliamente usados y los únicos presentes en las vacunas
licenciadas en los Estados Unidos.
En 1936, Freund desarrolló una emulsión de agua en aceite
mineral que contiene micobacterias muertas, lo que
actualmente se conoce como adyuvante completo de Freund
(ACF). El ACF es uno de los adyuvantes más poderosos, pero
es muy reactogénico para ser usado con fines clínicos. Aun
así, el adyuvante incompleto de Freund (AIF) —la emulsión
sin la adición de la micobacteria muerta— ha sido empleado
en formulaciones vacunales en humanos.
En 1956, Johnson demostró la actividad adyuvante de la
endotoxina lipopolisacarídica (LPS) proveniente de una
bacteria gramnegativa. Estos estudios son la base del uso
actual del LPS detoxificado o de sus componentes como
candidatos de adyuvantes para uso en humanos.
En 1974, Lederer y colaboradores identificaron el
muramildipéptido (MDP) como un componente con actividad
3
adyuvante de la micobacteria presente en el ACF. Más
recientemente, otros compuestos de origen bacteriano han
sido identificados y caracterizados, y se ha comprobado su
función inmunomoduladora e inmunopotenciadora como parte
del ACF.
Se conoce que cientos de compuestos naturales y sintéticos
poseen actividad adyuvante. Estos adyuvantes, que pueden
ser usados para adicionar o reemplazar a la alúmina en
vacunas humanas, han estado en desarrollo y evaluación
preclínica durante décadas. Varios de ellos han demostrado
ser más efectivos que la alúmina y potencian respuestas
inmunes mediadas por anticuerpos, así como respuestas
celulares intensas.
En la actualidad, se consolidan estrategias más racionales
en el diseño de vacunas. Éstas requieren la identificación
de epítopos apropiados y el desarrollo de formulaciones que
permitan generar una respuesta inmune protectora con esos
epítopos. La función de los adyuvantes inmunológicos en el
diseño racional de vacunas, es dirigir y optimizar
respuestas inmunes apropiadas hacia epítopos vacunales
protectores (…). 4
Adyuvantes vacunales
Ventajas de su uso
Entre las ventajas del uso de adyuvantes se hallan: (i) su
capacidad de potenciar la inmunogenicidad de antígenos con
un grado de pureza elevado o recombinantes; (ii) la
reducción de la cantidad de antígeno y del número de
reinmunizaciones requeridas para proveer una inmunidad
protectora; (iii) el aumento de la eficacia de las vacunas
en los recién nacidos, los ancianos y las personas
inmunocomprometidas, y (iv) permitir el envío mucosal de
vacunas dirigidas a incrementar la respuesta inmune a nivel
de mucosas.
A diferencia de la presentación del antígeno en su entorno
microbiano natural, el uso de adyuvantes permite una forma
menos tóxica y más segura de inoculación. Su utilización
desborda el universo de las vacunas preventivas y se
introduce en las formulaciones vacunales con objetivos
terapéuticos.
Selección
5
Entre los factores involucrados en la selección de un
adyuvante se encuentran: el tipo de respuesta deseada o que
se quiere evitar, la especie vacunada, la ruta de
administración y los efectos colaterales inducidos por el
adyuvante.
La disponibilidad clínica de adyuvantes adecuados, seguros
y efectivos es decisiva en el desarrollo de las nuevas
vacunas. De forma ideal, los adyuvantes deben ser
materiales baratos, no tóxicos y poco inmunogénicos.
Además, deben ser estables, biodegradables y,
preferiblemente, deben promover inmunidad tanto humoral
como mediada por células, en dependencia del requerimiento
de protección del patógeno.
La generación de una respuesta inmune protectora a nivel de
mucosas, es de gran interés para quienes estudian las
enfermedades que afectan las mucosas o que tienen en ellas
su puerta de entrada. Existen diferencias en la efectividad
de los adyuvantes por las diferentes rutas, debido a que
las vías mucosales tienen características fisiológicas que
las diferencian entre sí y de las rutas sistémicas. De ahí
que el desarrollo de vectores, sistemas de envío de6
antígenos y otros compuestos con actividad adyuvante tiene
en cuenta las características de la ruta por la cual ha de
ser inoculado.
Seguridad
Los beneficios de la incorporación de adyuvantes en
formulaciones vacunales para potenciar su inmunogenicidad,
deben ser sopesados con el riesgo de reacciones adversas
que estos compuestos pueden inducir.
El marcado efecto inmunopotenciador de la mayoría de los
adyuvantes está relacionado directamente con su toxicidad.
La introducción de adyuvantes potentes en los ensayos
clínicos, comenzó en relación con las vacunas preventivas y
terapéuticas en las que los adyuvantes de aluminio son
inefectivos. Uno de los objetivos del desarrollo actual en
materia de adyuvantes, consiste en disminuir al máximo su
toxicidad sin afectar el efecto inmunopotenciador.
Las regulaciones establecidas para el uso de los adyuvantes
novedosos en humanos son rigurosas, comparado con las que
se aplican para las vacunas veterinarias. Los animales
afectivos son diferenciados de los demás.
7
Las reacciones adversas asociadas a los adyuvantes se
clasifican en locales y sistémicas. Las reacciones adversas
locales incluyen dolor, inflamación local, necrosis en el
sitio de la inyección o en zonas adyacentes,
linfadenopatías regionales y, en raras ocasiones, la
inducción de granulomas y la formación de abscesos
estériles. Las reacciones sistémicas observadas incluyen
náuseas, fiebre, artritis por adyuvante y uveítis,
anafilaxis, toxicidad específica de órgano e
inmunotoxicidad, como por ejemplo, liberación de citocinas,
inmunosupresión y enfermedades autoinmunes.
La evaluación toxicológica sistemática, como la requerida
para productos farmacéuticos, no es rutinaria en el caso de
vacunas que tienen compuestos de aluminio como adyuvante.
Aunque el uso de estos compuestos ha sido asociado con
algunas reacciones locales, la vasta experiencia con este
tipo de adyuvantes en vacunas indica que la observación del
animal posinyección y del sitio de inyección es
generalmente adecuada desde un punto de vista de la
seguridad preclínica, sin la necesidad de una toxicología
formal, a menos que exista algún problema especial con el
8
antígeno. A diferencia de los compuestos de aluminio,
muchos de los adyuvantes en investigación deben ser objeto
de un estudio toxicológico más intensivo. Para algunos
adyuvantes, existen datos históricos que constituyen
pruebas de seguridad adicionales previas a la evaluación de
la formulación antígeno-adyuvante en humanos.
Como parte de la evaluación inicial, se deben realizar
estudios preclínicos con el adyuvante por separado, como
los estudios toxicológicos de dosis únicas y repetidas,
incluida la ruta de inoculación que se pretende para el uso
clínico. Usualmente, se dispone de información sobre
estudios toxicológicos con el adyuvante solo, incluso en
más de una especie, realizados por los fabricantes del
adyuvante. Además de los estudios preclínicos realizados
con el adyuvante solo, el producto combinado antígeno-
adyuvante debe ser caracterizado en un estudio de seguridad
que cuente con buenas prácticas de laboratorio y obtenga
datos relevantes, como mínimo, para apoyar la iniciación de
los estudios de fase I en humanos.
Esta evaluación debe ser conducida en una especie animal
pequeña en que el antígeno sea inmunogénico, y que pueda9
ser inmunizada por la misma ruta anticipada para uso en
humanos. La dosis o frecuencia de inmunizaciones con el
candidato vacunal, debe ser igual o mayor que aquellas que
van a ensayo clínico en cuanto a cantidad, y similar en
cuanto a frecuencia e intervalos. Lo expuesto anteriormente
es un mandato de la Administración de Alimentos y Fármacos
(FDA, por sus siglas en inglés) de los Estados Unidos, con
el objetivo de ofrecer la mejor oportunidad para
identificar problemas potenciales de seguridad.
Los puntos de mayor interés para avalar la seguridad, donde
no se incluyen todos los aspectos de rutina de un estudio
toxicológico, se muestran en la Tabla. Hay que destacar que
los estudios preclínicos pueden ser usados para seleccionar
dosis apropiadas e identificar situaciones donde se deben
garantizar con cuidado rangos de dosis para los estudios de
fase I. Además, estos estudios pueden avalar nuevas dosis y
esquemas, o detectar situaciones especiales durante el
desarrollo del producto.
Tabla. Puntos de mayor interés en los análisis de seguridad
preclínica de un adyuvante.
10
Valores delaboratorio
Panel de ensayos séricos pre yposvacunación. Pruebas de funcionamientohepático y renal, creatina-kinasa y hematología (conteo completo de célulasde la sangre). La inmunogenicidad se puededeterminar para correlacionarla con otroshallazgos, aunque no sea definitoria.
Observaciones
Observación del sitio de la inyecciónanterior y durante tres días después decada inyección. Observación del funcionamiento del miembro vacunadodurante tres días al menos.
Patología
Evaluación por cuantificación de lasreacciones inflamatorias. Además, se deberealizar una necropsia completa condescripción de los órganos, peso ehistopatología si se considera necesariopara un estudio en particular. Considerar los datosdisponibles en la literatura.*
Otros
Evaluación especial de ciertos parámetrosespecíficos del producto o clase, porejemplo, análisis de inducción de uveítis—si fuese aplicable. Los estudiospreclínicos pueden ser usados para laselección de rangos de dosis o pararesolver problemas de desarrollo delproducto.
*Si se dispone en la literatura de datos clínicos favorables y de un
estudio toxicológico bien fundamentado con el mismo adyuvante —solo o
combinado con otros antígenos—, y si el antígeno en cuestión no posee
ningún riesgo adicional, es menos crítica la necesidad de un estudio
toxicológico preclínico que incluya la necropsia completa antes de la
fase I. En el desarrollo clínico inicial del producto, se recomienda
11
la inclusión de grupos controles con el antígeno solo y/o adyuvado con
alúmina.
Ya se han evaluado diversos adyuvantes en humanos, tanto en
voluntarios sanos como enfermos. Estos adyuvantes se han
relacionado con el desarrollo de vacunas, tanto preventivas
como terapéuticas, contra diferentes enfermedades y
microorganismos. Una información más detallada acerca de la
toxicidad de los distintos adyuvantes, se puede encontrar
más adelante junto a la descripción de los tipos de
adyuvantes y sus mecanismos de acción.
Clasificación
Los adyuvantes inmunológicos pueden ser clasificados
atendiendo a su fuente de origen, mecanismos de acción y
propiedades físicoquímicas.
(…), los adyuvantes pueden ser separados en tres clases
amplias: (i) inmunoestimulantes activos, que son agentes
que aumentan la respuesta inmune específica contra el
antígeno; (ii) portadores, que son proteínas inmunogénicas
que proporcionan ayuda de células T; y (iii) adyuvantes
tipo vehículo, como las emulsiones oleosas y los liposomas,
12
que sirven como matriz para el antígeno y para la
inmunoestimulación. Esta clasificación tiende a confundir
por la propia forma en que se dividen.
También se han dividido en adyuvantes mucosales y
sistémicos, teniendo en cuenta que las características
fisiológicas en cuanto a la toma y procesamiento del
antígeno para ambas vías de inoculación generan procederes
diferentes de adyuvación.
Otra clasificación aceptada los divide en: sales de
aluminio y otros adyuvantes minerales; agentes
tensoactivos; derivados de bacterias; vehículos y
materiales de liberación lenta, y citocinas.
Una clasificación reciente de los adyuvantes considera su
separación en los grupos siguientes: adyuvantes de tipo
gel, agentes tensoactivos, productos bacterianos, productos
basados en aceites y emulsiones, adyuvantes particulados,
proteínas de fusión y lipopéptidos. De acuerdo con la
definición general de adyuvantes, a esta lista se pudieran
adicionar los inmunomoduladores e inmunoestimulantes como
las citocinas y otros compuestos naturales que activan el
13
sistema inmune innato y que no están incluidos en ninguno
de los grupos destacados.
Limitaciones
A pesar del progreso actual en la definición y comprensión
de la naturaleza y mecanismos de acción de los adyuvantes,
aún existen limitaciones con respecto a su uso.
Entre las limitaciones más frecuentes se encuentran su
grado de toxicidad, pirogenicidad, estabilidad, degradación
in vivo y rápida excreción. Se han encontrado restricciones
de tamaño, carga e hidrofobicidad en la incorporación de
proteínas y péptidos. Además, se conoce que ocurren
modificaciones epitópicas durante la formulación o
conjugación. En el caso de las proteínas transportadoras,
una inmunidad preexistente contra ellas es una limitante
para su uso repetido y eficiente. Aún está por demostrar
para muchos adyuvantes si estos problemas se pueden
superar.
Cada adyuvante posee un perfil de respuesta inmunológica
característico. La ineficiencia de los adyuvantes de
aluminio para inducir ciertos isotipos y subclases, así
14
como su incapacidad para generar células T citotóxicas y
proveer una buena respuesta inmune contra antígenos
polisacarídicos u otros antígenos T-independientes, limita
su aplicabilidad, especialmente en aquellos casos donde
estas características sean un requisito indispensable para
una buena protección.
Principales tipos de adyuvantes y sus mecanismos de acción
De acuerdo con las clasificaciones existentes sobre
adyuvantes, a continuación se expone una descripción de las
características físicoquímicas e inmunológicas de los
principales grupos de adyuvantes, y al mismo tiempo se
describen sus mecanismos de acción.
Adyuvantes de uso sistémico
Adyuvantes de tipo gel. (…) las sales de aluminio —principalmente
aquellas de fosfato o hidróxido— han sido ampliamente
utilizadas para inmunizar humanos y animales. Estos
compuestos son los únicos adyuvantes de aprobación general
para su uso clínico.
15
Los compuestos basados en aluminio, a pesar de ser
considerados seguros, son adyuvantes débiles y muy poco
consistentes en su capacidad de estimular respuestas
inmunes mediadas por células, especialmente respuestas de
células T citotóxicas.
Los primeros estudios acerca del modo de acción de los
adyuvantes de aluminio, evidenciaron la formación de un
depósito en el sitio de la inyección, donde el antígeno es
liberado lentamente. Investigaciones más recientes sugieren
que el antígeno soluble atrapado en el gel permite
prolongar el tiempo de interacción entre él, las células
presentadoras de antígenos (CPA) y los linfocitos. El
mecanismo de adyuvación también abarca la estimulación de
células inmunocompetentes a través de la activación del
complemento, la inducción de eosinofilia en el sitio de
inyección, la activación de macrófagos y la toma eficiente
de partículas de antígeno por las CPA —dada su naturaleza
particulada y su tamaño inferior a 10 mm.
Aunque los efectos colaterales son relativamente pocos, se
han observado mucho más granulomas en el sitio de inyección
16
por vía subcutánea o intradérmica que por la ruta
intramuscular.
Entre otras limitaciones se encuentran: la generación de
reacciones locales, la producción de anticuerpos de tipo
IgE y la inefectividad para algunos antígenos. También hay
reportes de la neurotoxicidad del aluminio y se plantea que
pudiera desempeñar algún papel en la enfermedad de
Alzheimer y el síndrome de encefalopatía asociado a
diálisis. Se conoce, además, que la alúmina no es
biodegradable y se detecta en el sitio de la inoculación al
año de haber sido inyectada.
En vacunas para uso en humanos, los adyuvantes de aluminio
fueron usados inicialmente contra tétanos, difteria,
pertusis y poliomielitis. Aunque algunos componentes de
Bordetella pertussis pueden ocasionar efectos colaterales, se ha
demostrado una reducción significativa de dichos efectos
con la adsorción a adyuvantes de aluminio.
En vacunas veterinarias, estos adyuvantes han sido
utilizados ampliamente contra agentes virales y
bacterianos, así como en vacunas antiparasitarias. Existen
17
algunas similitudes entre la respuesta inmune —estimulación
de IgE y eosinofilia— inducida por algunos helmintos y la
provocada al inmunizar con adyuvantes de aluminio. Dichas
similitudes hacen que estos adyuvantes sean candidatos
interesantes para vacunas antiparasitarias.
Las sales de otros metales como el calcio, el hierro y el
circonio, también han sido utilizadas para adsorber
antígenos, pero no han tenido el amplio uso de las sales de
aluminio. No obstante, el fosfato de calcio ha sido
empleado durante décadas para las vacunas del grupo de
difteria-tétanos-pertusis. Aunque tiene propiedades
similares a las de los compuestos de aluminio, esta sal
presenta varias ventajas potenciales sobre ellos como: es
un constituyente normal del cuerpo y, como tal, es bien
tolerado; adsorbe eficientemente a los antígenos y permite
su liberación lenta; genera niveles elevados de anticuerpos
IgG; y no incrementa la producción de IgE. En varias
pruebas se ha encontrado que el uso de vacunas adyuvadas
con calcio es eficiente y seguro contra reacciones adversas
a largo plazo que sólo pueden ser reconocidas después de
muchos años. Vale la pena destacar que se han observado
18
reacciones neurológicas esporádicas en el caso de vacunas
de pertusis adsorbidas a fosfato de calcio, y que algunos
componentes de B. pertussis tienen propiedades
inmunomoduladoras que contribuyen al efecto adyuvante de la
preparación vacunal.
Agentes tensoactivos. La saponina Quil A —extracto acuoso de la
corteza de Quillaja saponaria Molina—, y fracciones purificadas
de ésta —principalmente QS-21—, constituyen alternativas a
la alúmina con potencial para inducir respuestas celulares
intensas.
Las saponinas son glicósidos tensoactivos que contienen un
núcleo hidrofóbico de estructura triterpenoide, y cadenas
de carbohidratos enlazadas al triterpeno que conforman
regiones hidrofílicas. Entre las propiedades asociadas a
las saponinas de Q. saponaria Molina, se incluyen: un
excelente efecto adyuvante para antígenos tanto T-
dependientes como T-independientes, y la estimulación de
isotipos asociados a respuestas de células T auxiliadoras
de tipo 1 (Th1). Esta clase de adyuvantes induce, además,
respuestas de linfocitos T citotóxicos (-CTL) CD8+,
propiedad asociada usualmente con vectores virales. Las19
saponinas también potencian vacunas administradas por las
vías mucosales.
La saponina Quil A ha sido empleada en varias vacunas
veterinarias. Es un producto heterogéneo compuesto por 23
picos diferentes de saponinas detectables por cromatografía
líquida de alta presión, que se une al colesterol de la
membrana de los eritrocitos y los rompe provocando efectos
colaterales indeseables.
Estudios clínicos preliminares han demostrado la
viabilidad, con un patrón toxicológico aceptable, de usar
la saponina QS-21 en vacunas humanas, como alternativa a
los adyuvantes tradicionales de aluminio.
Derivados de bacterias. Las estructuras bacterianas constituyen
la principal fuente de inmunoadyuvantes. Incluso, se conoce
que copias sintéticas de bajo peso molecular como el
péptidoglicano de la pared celular o el lípido A de
bacterias gramnegativas, son capaces de alterar el sistema
inmune sin ser ellas mismas inmunogénicas. Esto se puede
deber a que imitan las estructuras microbianas que
proporcionan la señal de peligro para el inicio de las
20
defensas del hospedero. (…) la base para el efecto
adyuvante podría ser el reconocimiento de componentes
microbianos definidos por receptores presentes en las
células accesorias. Este reconocimiento induce a dichas
células a producir citocinas que determinan la activación
de las subpoblaciones de linfocitos Th1 o Th2. Las
estructuras microbianas conservadas también pueden inducir
la activación directa de células B o macrófagos que
expresan una potente actividad coestimulatoria de la
expansión clonal de las células T CD4+.
Entre las bacterias usadas como adyuvantes se incluyen:
Mycobacterium spp., Corynebacterium parvum o C. granulosum, y B.
pertussis. Lamentablemente, estos microorganismos o sus
productos son considerados muy tóxicos para ser usados como
adyuvantes en humanos. Se ha trabajado mucho en la
purificación de los componentes activos de Mycobacterium
spp., B. pertussis y C. granulosum. En la actualidad, se presta
atención a la purificación de los componentes con poder
adyuvante presentes en la micobacteria.
El poder adyuvante del N-acetilmuramil-l-alanil-d-
isoglutamina o el muramildipéptido (MDP) —el componente con21
actividad inmunopotenciadora más estudiado del ACF— depende
de la forma en que se administre. En solución salina
aumenta principalmente la inmunidad humoral contra un
número de antígenos naturales y sintéticos de bacterias,
virus y parásitos, mientras que incorporado a liposomas o
mezclado con micolato de glicerol induce inmunidad mediada
por células. Se ha demostrado que el MDP activa varios
tipos celulares (macrófagos, leucocitos polimorfonucleares,
mastocitos, plaquetas, células endoteliales y fibroblastos,
entre otros) e induce la secreción de una variedad de
citocinas, incluidos la interleuquina 1 (IL-1), el factor
de crecimiento de células B y el factor de activación de
fibroblastos. El MDP provoca, además, un incremento en la
producción de superóxidos, prostaglandinas y colagenasa. Se
han obtenido algunos derivados del MDP para retener el
poder adyuvante con un mínimo de toxicidad. De ellos, uno
de los más prometedores es el treonil-MDP, un adyuvante
potente y apirogénico.
Los LPS y sus derivados son componentes de la pared celular
de bacterias gramnegativas. Sus derivados son compuestos
mitogénicos para las células B, estimulan a las células T
22
para que produzcan interferón gamma (IFN-g) y median las
respuestas de hipersensibilidad tardía (DTH, según sus
siglas en inglés). La estructura de estos compuestos
consiste en un polisacárido hidrofílico unido a una porción
hidrofóbica de naturaleza lipídica: el lípido A, que es el
responsable de la toxicidad y el efecto adyuvante de los
LPS. Por hidrólisis del lípido A en condiciones de mediana
acidez, se puede obtener el lípido A monofosforilado,
compuesto que retiene la actividad adyuvante pero muestra
una menor letalidad y pirogenicidad que el lípido A.
Otros compuestos derivados de bacterias son los dimicolatos
de trehalosa (TDM, por sus siglas en inglés). Procedentes
de la pared celular, son insolubles en agua, de naturaleza
anfipática, y capaces de potenciar la actividad
presentadora de antígenos por mediación de respuestas DTH,
y un incremento en los títulos de anticuerpos específicos
contra el antígeno coinoculado.
(…), se demostró el efecto adyuvante del ADN micobacteriano
—compuesto presente en el lisado de micobacterias mezclado
con aceite de parafina que Freund ensayó hace 60 años. Se
demostró que la actividad adyuvante estaba relacionada a la23
existencia de motivos CpG en el ADN presente en las
bacterias. Este efecto inmunoestimulatorio sólo era
desarrollado por el ADN bacteriano y no por el de
vertebrados, hecho que se relacionó con la baja metilación
de aquél. En los últimos años, se ha incrementado la
cantidad de datos referidos al efecto inmunoestimulatorio
del ADN bacteriano y de los oligodesoxinucleótidos que
contienen dichas secuencias inmunoestimuladoras. Ambos han
demostrado que pueden inducir la proliferación de células B
y la producción de inmunoglobulinas. Además, estimulan la
secreción de IL-6, IFN-g, IL-12 e IL-18, que a su vez
induce la producción de IFN-g por las células asesinas
profesionales (NK, por sus siglas en inglés).
Se ha reportado que los oligodesoxinucleótidos sintéticos
que contienen motivos CpG en los que se ha introducido un
átomo de azufre en el enlace fosfodiéster, muestran una
actividad inmunoestimulatoria mucho mayor que los
naturales.
Vehículos y materiales de liberación lenta.
• Emulsiones
24
Se encuentran en esta categoría las emulsiones de aceite
como el AIF, Montanide, Adyuvante 65 y Lipovant. El
mecanismo de acción del AIF se atribuye a la formación de
un depósito en el sitio de inyección que posibilita la
liberación lenta del antígeno, con lo que se estimulan las
células productoras de anticuerpos. Este adyuvante no se
emplea actualmente en humanos debido a que ocasiona
reacciones locales colaterales como la formación de
granulomas e inflamación local. Se han evaluado varios
tipos de emulsiones con diferentes tipos de aceite, con el
propósito de encontrar un adyuvante mejor, estable y no
tóxico. Una alternativa es el Adyuvante 65, que, a
diferencia del aceite mineral del ACF y el AIF, tiene un
componente aceitoso que es metabolizado por el organismo y
ha demostrado ser seguro y potente en humanos. También se
han probado emulsiones diferentes como aceite en agua y
agua en aceite. Esta última es tan potente como el AIF,
menos viscosa, más estable, fácil de administrar, y produce
menos nódulos en el sitio de inyección.
La familia de adyuvantes oleosos conocida como Montanide,
ha probado ser potente en numerosas vacunas experimentales
25
en ratones, ratas, gatos, perros y cerdos, tanto con
péptidos sintéticos como con antígenos virales. Se han
conducido algunos estudios preliminares con Montanide ISA
720, con la finalidad de diseñar vacunas en humanos contra
el VIH y la malaria.
• Liposomas
Los liposomas son glóbulos sintéticos formados por capas de
lípidos que encapsulan las sustancias terapéuticas, y
constituyen uno de los vehículos más utilizados para las
investigaciones en vacunas. Ya se ha descrito su uso en
formulaciones vacunales complejas como vehículo de otros
adyuvantes e inmunomoduladores (vea los subacápites
Formulaciones adyuvantes, Derivados de bacterias y Sistemas sintéticos o
inactivados de envío de antígenos). Su adyuvanticidad depende del
número de capas, la carga, la composición y el método de
preparación. Su uso potencia tanto la inmunidad humoral
como la mediada por células para antígenos de naturaleza
proteíca y polisacarídica. El tiempo de vida medio de los
antígenos incorporados en liposomas en la sangre es
notablemente prolongado, lo que asegura una mayor
exposición de antígeno a las CPA luego de su inyección. 26
• Microesferas copoliméricas
Entre la multitud de sistemas particulados y poliméricos
que se han desarrollado, el de las microesferas
copoliméricas de ácido láctico y glicólico (DL-PLG) es uno
de los que más se destaca. Estas microesferas son
partículas biocompatibles y biodegradables capaces de
incorporar en su seno diferentes antígenos, entre ellos
proteínas. Con el empleo de por cientos adecuados de sus
componentes, es posible controlar el tiempo de liberación
de los antígenos atrapados. Su uso abarca tanto rutas
sistémicas como mucosales.
Citocinas. Como regla general, en las clasificaciones más
recientes de adyuvantes se incluyen las citocinas. El IFN-g
es una citocina pleiotrópica que puede potenciar respuestas
inmunes mediadas por células T a través de la regulación
positiva de la expresión de los determinantes del complejo
principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en
inglés). Esta citocina incrementa la liberación de IL-1 y
la expresión del MHC clase II en la superficie de las CPA,
propiedades que pueden explicar su actividad adyuvante.
27
El factor estimulante de la formación de colonias de
granulocitos y macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en
inglés), potencia respuestas inmunes primarias mediante la
activación o reclutamiento de CPA profesionales. Sin
embargo, la aplicación práctica de las citocinas como
adyuvantes presenta varias dificultades, ya que es posible
que se requieran múltiples dosis, y si se usa una citocina
de una especie diferente, ésta puede ser inmunogénica en la
especie "blanco".
Carbohidratos como adyuvantes. Muchos carbohidratos complejos de
origen natural estimulan las células de los sistemas inmune
y reticuloendotelial. Entre ellos se encuentran los
polímeros de plantas y hongos como los glucanos, las
dextranas y los lentinanos —todos ellos polímeros de
glucosa—, y los mananos, entre los que se encuentran los
glucomananos y los galactomananos. Los levanos y los
xilanos también han evidenciado actividad potenciadora. La
actividad de muchos de estos poliglicanos sobre los
macrófagos —que tienen receptores de glucanos y mananos—,
incluye la inducción de fagocitosis y la secreción de
citocinas, leucotrienos y prostaglandinas. El lentinano,
28
glucano común de las setas, estimula la respuesta celular y
de anticuerpos contra eritrocitos de carnero, aumenta la
resistencia del huésped a varios tipos de infecciones
bacterianas, virales y parasíticas, y ha restaurado la
disfunción inmunológica en pacientes con neoplasias.
Distintas pruebas in vitro indican que los mananos activan
los monocitos y los macrófagos, con lo que inducen la
producción de IFN-g, factor de necrosis tumoral-a, factor
estimulante de la formación de colonias de monocitos y
granulocitos, IL-1b e IL-6. El acemanano es un polisacárido
compuesto mayoritariamente por manosas con O-acetilaciones
en aproximadamente 8 de cada 10 residuos. Se extrae como
componente mayoritario de la sustancia mucilaginosa o gel
de la hoja de Aloe barbadensis Miller, planta medicinal usada
desde la antigüedad. Este polisacárido potencia la
generación de linfocitos CTL, la actividad citotóxica de
células NK y también, modestamente, la alorrespuesta humana
in vitro.
Recientemente, se ha demostrado la actividad adyuvante del
acemanano sobre el antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B (HBsAg) por vía mucosal, al generarse no sólo29
niveles de anticuerpos en suero de similar intensidad que
los obtenidos con alúmina como adyuvante, sino con la
inducción de además respuestas intensas de IgA secretoria
en mucosas adyacentes y remotas, lo cual no ocurre en las
vacunas inoculadas por vía parenteral. Estos resultados,
así como la reconocida inocuidad del acemanano, avalan al
ensayo clínico de una formulación nasal del HBsAg mezclado
con el acemanano por vía intranasal, (…).
Formulaciones adyuvantes. Las formulaciones adyuvantes han
surgido como resultado del desarrollo en el conocimiento de
los mecanismos de acción de estos compuestos. En ellas se
combinan varios adyuvantes que, por lo general, poseen
diferentes mecanismos de acción, con el propósito de
aumentar la potencia y la calidad de la respuesta inmune
contra los antígenos de interés.
Entre las formulaciones adyuvantes que tienen como base los
compuestos de aluminio, Cooper y colaboradores han
combinado el hidróxido de aluminio con g-inulina —
polisacárido procedente de algas— en un nuevo adyuvante
denominado algamulina. Diversos antígenos comerciales han
sido potenciados por la algamulina, entre los que se30
encuentran los toxoides diftérico y tetánico, el virus
sincitial respiratorio, la proteína E7 del papilomavirus
humano, la glicoproteína D del virus herpes tipo 2, el
HBsAg, el virus completo de la influenza,
Haemophilus influenzae, el conjugado peptídico del antígeno 2
de superficie de merozoítos de Plasmodium falciparum, el
extracto de esperma de ratón (vacuna anticonceptiva), y
membranas de micoplasma porcino.
Las saponinas también han sido utilizadas como parte de
formulaciones adyuvantes en los complejos
inmunoestimulantes (ISCOM, por sus siglas en inglés), y se
ha demostrado la eficacia de combinaciones de aquéllas con
microesferas, liposomas e hidróxido de aluminio.
Los ISCOM son partículas relativamente estables de 30-40 nm
de diámetro y estructura dodecahédrica, compuestos por Quil
A, lípidos y antígenos anfipáticos. Se diseñaron para
combinar la presentación física óptima, desde el punto de
vista inmunogénico, de los antígenos en una forma
multimérica particulada submicroscópica con un adyuvante
incorporado. Una amplia variedad de proteínas de parásitos,
bacterias y virus han sido formuladas en ISCOM. También se31
han unido proteínas no anfipáticas y péptidos mediante
enlaces covalentes, lo que ha generado una respuesta
intensa de anticuerpos contra estos antígenos que son poco
inmunogénicos en solución. Estas estructuras han
posibilitado una presentación óptima del antígeno con
retención de la actividad adyuvante y una disminución de
los efectos colaterales de Quil A. Los ISCOM han sido
utilizados en modelos animales y han inducido inmunidad,
tanto sistémica como local, cuando se administran por las
vías oral, respiratoria y vaginal.
En todos los casos evaluados, los antígenos formulados en
ISCOM muestran un incremento en la respuesta de anticuerpos
y en la respuesta mediada por células, en comparación con
los antígenos no incorporados. En experimentos de reto
antigénico, las inmunizaciones con ISCOM han protegido
varias especies contra numerosos virus envueltos, incluidos
los retrovirus, las bacterias y los parásitos. Se ha
reportado que los ISCOM modulan la expresión de moléculas
del MHC clase II y podrían actuar induciendo la liberación
de IFN-g. También se ha establecido que son capaces de
32
estimular las células T CD8+ restringidas a moléculas del
MHC clase I.
Otro ejemplo de formulación es el ACF, mezcla de agua,
aceite y micobacterias muertas capaz de generar uno de los
mayores efectos inmunopotenciadores. Sin embargo, su uso
está restringido al trabajo de laboratorio por su
toxicidad.
Se ha demostrado que las formulaciones de vehículos como
los liposomas, a los que se les adiciona o incorpora los
MDP o monofosforil lípido A (MPL, según las siglas en
inglés), pueden incrementar la respuesta inmune específica,
tanto por vías mucosales como parenterales.
Adyuvantes mucosales
El desarrollo de los adyuvantes para uso mucosal constituye
actualmente una necesidad en el campo de las vacunas. El
progreso en el conocimiento de la fisiología de las mucosas
y del modo de acción de los adyuvantes, puede ayudar en el
desarrollo de vacunas mucosales más efectivas. Aunque los
adyuvantes mucosales se pueden clasificar dentro de los
grupos anteriormente expuestos, en nuestra opinión merecen
33
ser considerados de forma independiente. La actividad
inmunopotenciadora del adyuvante o sistema de envío de
antígenos a mucosas, debe tener en cuenta, en primer lugar,
la penetración de los antígenos por esa vía y
posteriormente, la potenciación de la inmunogenicidad de
los antígenos por diferentes mecanismos que pudieran ser
similares o no a los sistémicos. Se han obtenido resultados
diferentes cuando se usa un mismo adyuvante, tanto por vía
sistémica como mucosal. La alúmina —adyuvante sistémico más
universalmente utilizado— no ha sido efectivo por vía oral
y nasal con antígenos que tradicionalmente son inyectados
con este adyuvante, como el toxoide tetánico.
Es bueno destacar que el antígeno per se puede poseer
características que lo hagan "penetrante", como es el caso
de determinados antígenos particulados y de otros que,
aunque no lo sean, tengan la capacidad de adherirse a
receptores específicos, o de establecer otro tipo de
interacción con células o componentes mucosales. Estas
características conducen a una correcta asimilación del
antígeno por vías que favorecen las respuestas mucosal y
sistémica.
34
Se ha demostrado que las mucosas son puertas de entrada muy
eficaces para ciertos patógenos. Aunque es muy difícil
lograr una inmunidad de mucosa efectiva a partir de la
inmunización sistémica, por la vía mucosal se logra
inmunidad de mucosas y sistémica. También se ha demostrado
que para los patógenos que permanecen en las superficies
mucosales o tienen en ellas una puerta de entrada, la
protección se relaciona mejor con una respuesta local
fuerte.
La estrategia de adyuvación por la vía mucosal, de acuerdo
con las características del antígeno, exige procedimientos
de unión o recubrimiento con ligandos específicos que
envíen el antígeno a células especializadas del epitelio
mucosal simple (células M). Además, para que el antígeno
pueda cruzar las barreras que la ruta impone, se manipulan
características propias del antígeno como tamaño, presencia
de ligandos mucosales, carga eléctrica y lipofilicidad, así
como el uso de sistemas de envío de antígenos que
favorezcan dichas características. Una vez asimilado el
antígeno, el adyuvante puede favorecer la respuesta por
cualquiera de los mecanismos conocidos: adsorción del
35
antígeno, efecto de depósito, inducción de citocinas,
activación del sistema del complemento, reclutamiento de
distintas poblaciones de células del sistema inmunológico,
envío del antígeno a diferentes células presentadoras de
antígenos, regulación de la expresión vía MHC clase I o
clase II, y estimulación de la producción de diferentes
subclases de anticuerpos, en dependencia de la estrategia
de adyuvación utilizada.
Derivados de bacterias. Algunos de los inmunoestimulantes
conocidos, como el MDP, el MPL, la amina lipoidal Avridina
y las conocidas toxinas de Vibrio cholerae (CT) y de
Escherichia coli (HLT), son adyuvantes reconocidos para
antígenos administrados por vía de mucosas.
Aunque el MDP y el MPL han sido evaluados en formulaciones
liposomales con fines terapéuticos y profilácticos, las
toxinas o sus subunidades (en especial CT y CTB), son los
adyuvantes mucosales más estudiados. La capacidad de CT de
actuar como adyuvante oral ha sido confirmada por un gran
número de investigadores. La toxina del cólera no cumple
con la definición clásica de un adyuvante porque estimula
una respuesta inmune contra ella misma y su actividad36
adyuvante es dependiente de su inmunogenicidad. Los efectos
de CT y HLT que explican su fuerte actividad adyuvante,
incluyen el incremento de la presentación de antígenos por
varios tipos de células B, el incremento en la
diferenciación de células B a células secretoras de IgA, la
interacción con células T y la producción de citocinas.
Desde el punto de vista práctico, el uso de la holotoxina
en humanos no es factible debido a su toxicidad. Una
estrategia acertada es la destoxificación de CT por
escisión de la subunidad A o por mutación del gen que la
codifica. Tanto CT como CTB —subunidad no tóxica— pueden
potenciar la respuesta inmune contra varios antígenos
acoplados covalentemente, debido a las interacciones
específicas que se establecen con las células M.
Sistemas de envío de antígenos a mucosas. Los sistemas de envío de
antígenos, del inglés antigen delivery systems, han alcanzado un
nivel de desarrollo suficiente que avala su introducción en
la práctica de la inmunización. Se espera que los sistemas
particulados sólidos, tanto para administración parenteral
como no parenteral, se encuentren dentro de los primeros
productos a licenciar. 37
Por las posibilidades que brindan los sistemas de envío de
antígenos en la particulación de antígenos solubles, y
aprovechando las características fisiológicas de la vía
mucosal, estos sistemas han sido ensayados y han mostrado
actividad adyuvante. En la literatura se han clasificado
como: a) sintéticos o inactivados, y b) vivos.
• Sistemas sintéticos o inactivados de envío de
antígenos
Se han obtenido diferentes resultados a partir del estudio
de las partículas poliméricas artificiales. Estas
partículas comprenden las microesferas DL-PLG, los
polímeros alternativos como polifosfacenos, los polímeros
de acetato de celulosa, los iminocarbonatos, los polímeros
de etilenvinilacetatos, las microesferas proteinoides, los
polianhídridos y las nanosferas de dextranas, las
partículas producidas a partir de materiales naturales
(alginatos, gelatina y semillas de plantas), y los
liposomas y sus variantes (proteoliposomas, virosomas e
ISCOM).
38
El tamaño de las partículas es uno de los factores
importantes para el envío de antígenos. Para el caso de la
vía mucosal de inmunización, se ha informado que las
partículas de diámetro mayor de 10 mm no son absorbidas. En
experimentos en ratas se ha observado, luego de la
administración oral, que sólo las partículas de 5 mm
penetran profundo en las placas de Peyer y las de 1 mm
penetran a los linfonodos y al hígado, y pasan a la
circulación sanguínea. La extrapolación de estos resultados
a humanos aún no está definida y a veces la absorción por
el tracto gastrointestinal no es un requisito del poder
adyuvante. Aunque se ha comprobado que se potencie la
respuesta inmune con la adsorción del toxoide diftérico en
semillas de plantas de hasta 2 mm de diámetro, la
determinación de la talla óptima de los sistemas de
liberación controlada para vía nasal, rectal o vaginal es
motivo de investigación en la actualidad.
Otro factor que afecta las partículas es el balance
hidrofobicidad-hidrofilicidad, que puede ser modificado
para obtener una modulación de la respuesta inmune.
39
Los cocleatos proteicos son complejos de liposomas y
cationes divalentes —fundamentalmente calcio— que, mediante
la interacción calcio-fosfolípido, posibilitan la formación
de una estructura de liposoma enrollado sobre sí mismo, lo
que permite la inmunización por diferentes vías. Con esta
estructura se estimula tanto la respuesta inmune de
anticuerpos como la respuesta mediada por células.
Los liposomas y las micropartículas pueden adherirse a
superficies mucosales por interacciones hidrofóbicas, pero
la entrada de los antígenos a las células M es muy poco
eficiente debido a que son rápidamente atrapados en los
geles mucosales y muchos no llegan a alcanzar la mucosa.
Las macromoléculas o partículas que se conjugan o recubren
con ligandos como CTB, tienen como factor limitante la
accesibilidad a los receptores.
El uso de ligandos unidos a partículas puede resultar en
una adherencia específica a las células M, pero sólo dentro
de un rango de tallas restringido por el glicocáliz. Las
partículas de 1 mm o mayores requieren ligandos dirigidos
específicamente a componentes de las células M, aunque la
40
identificación de estos componentes aún se encuentra en
investigación.
• Sistemas vivos de envío de antígenos
En este grupo se puede apreciar bien que el concepto de
adyuvante no se restringe a compuestos, sino que también
incluye las estrategias encaminadas a desarrollar una
respuesta inmune aunque no implique la adición de alguna
sustancia.
Un grupo de bacterias patógenas es capaz de superar las
dificultades de los sistemas no vivos al ser asimiladas
eficientemente por receptores a nivel de las células M.
Estas bacterias utilizan este mecanismo para infectar los
tejidos mucosales y diseminarse sistémicamente antes de ser
detenidas por el sistema inmune. Los patógenos bacterianos
que se adhieren a la superficie de las células M, inician
eventos de transducción de señales a nivel epitelial que
promueven su internalización. Teniendo en cuenta esta
propiedad, se han obtenido cepas atenuadas de Salmonella typhi
ty21a para la cual se ha descrito una interacción de tipo
lectina con receptores de naturaleza polisacarídica de la
41
membrana citoplasmática de las células M. También son
consideradas seguras y efectivas las cepas vivas atenuadas
de V. cholerae y poliovirus para la inmunización oral. Las
cepas manipuladas genéticamente de estos microorganismos,
comienzan a ser usadas en humanos como portadoras de
antígenos heterólogos.
La biología de estos vectores vivos introduce nuevos retos.
Las cepas vacunales de V. cholerae que no poseen los genes de
la toxina aún pueden causar diarreas, al parecer porque las
células epiteliales liberan citocinas en respuesta a la
adherencia bacteriana. La estrategia en el uso de las cepas
manipuladas genéticamente de S. typhi y S. typhimurium,
consiste en lograr una atenuación suficiente que brinde
seguridad a la vez que conserve la adherencia a las células
M y la proliferación en mucosas para mantener su
inmunogenicidad. Las cepas atenuadas de Shigella también son
internalizadas por las células M, pero no son capaces de
diseminarse de una célula a la otra. Este fenómeno es la
base de la atenuación, pero aún hay una liberación local de
citocinas y factores quimiotácticos que puede producir la
pérdida de la función normal de la barrera epitelial.
42
Los virus se encuentran también en estudio. El hecho de que
el poliovirus tipo 1 y la cepa atenuada de Sabin utilicen
el transporte a través de las células M para cruzar la
barrera epitelial, los convierte en candidatos importantes
de vacunación oral para el envío de antígenos foráneos en
humanos. El virus vaccinia y otros poxvirus son asimilados
por las superficies mucosales, pero su interacción con las
células M no ha sido documentada.
Nuevas tendencias en el desarrollo de adyuvantes
Adyuvantes para la inmunización con ADN
A principios de la década de 1990, se pensó que las vacunas
basadas en ADN desnudo, como su nombre lo indica, no
tendrían ningún componente adyuvante ni ninguna estrategia
de adyuvación. Esta creencia se generalizó teniendo en
cuenta los resultados iniciales que demostraron que es
posible generar respuestas inmunes potentes cuando
determinadas proteínas codificadas por vectores plasmídicos
eran inoculadas en distintos modelos animales.
El aumento del número de antígenos evaluados con esta
tecnología, permitió comprobar que no todos los antígenos
43
tienen el mismo comportamiento y que compuestos que se usan
rutinariamente en ensayos en modelos murinos —como los
agentes necrosantes—, no pueden ser extrapolados a humanos
por motivos obvios de reactogenicidad. En la actualidad,
existe un número creciente de reportes en los que se
utilizan nuevos elementos o estrategias para
inmunopotenciar los candidatos vacunales basados en ADN.
Coinoculación de plásmidos que codifican inmunopotenciadores. Aunque los
mecanismos involucrados en la inducción y el mantenimiento
de la respuesta inmune aún no están claros, se ha utilizado
con éxito la estrategia de coinocular plásmidos que
codifican citocinas y factores coestimuladores, con el
objetivo de potenciar la respuesta inmune generada por el
plásmido vacunal. Recientemente, se ha reportado que la
inoculación, en un mismo adenovirus, de genes que codifican
el HBsAg y el factor coestimulador B7-1, induce una
respuesta citotóxica específica mayor contra el antígeno
viral con respecto a la generada por el gen de este
antígeno solo. También se ha demostrado que la
coinoculación del plásmido de expresión de B7-2 junto al
ADN vacunal del VIH-1, incrementa la respuesta celular
44
específica contra el virus, comparado con la inoculación
del ADN del VIH-1 solo. Además, se encontró que esta
potenciación de la inmunidad celular por B7-2 es
dependiente de IFN-g. Otros autores han obtenido resultados
similares que demuestran la potenciación de la respuesta
citotóxica de linfocitos CD8+ restringidos al MHC clase I.
Actualmente, se conoce que los miocitos, a pesar de
expresar pobremente las moléculas del MHC, tienen la
capacidad de presentar antígenos asociados al MHC clase I.
Con el uso de plásmidos que codifican las moléculas
coestimuladoras B7-1 y B7-2, se puede expresar una fuerte
señal coestimuladora en los miocitos que no se puede
generar de otro modo, y que induce niveles mayores de
proliferación y activación de células T específicas para el
antígeno introducido.”
ADYUVANTES INMUNOLÓGICOS
Se ha precisado (MORRIS et al., 1999) que:
Las sustancias inmunomoduladoras constituyen una familia
muy heterogénea si se toman en consideración su origen,
naturaleza química y actividad biológica específca. Dentro
de ellas ocupan un lugar muy importante los agentes
45
inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2
funciones fundamentales: la estimulación de la resistencia
no específica del huésped contra las enfermedades
infecciosas y el cáncer; y, por otra parte, la potenciación
de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la
respuesta de los animales de laboratorio durante la
inmunización experimental con vistas a la producción de
antisueros. Los avances experimentados en la última década
en la síntesis de péptidos, la secuenciación de nucleótidos
y la ingeniería genética han posibilitado el desarrollo de
las denominadas "vacunas de nueva generación"; sin embargo,
la utilización exitosa de estas nuevas tecnologías requiere
de un esfuerzo investigativo sostenido para hallar
sustancias con actividad inmunopotenciadora (adyuvantes),
eficaces en la estimulación de la respuesta inmune y
desprovistas de propiedades biológicas adversas. Los
adyuvantes son sustancias o preparados químicos que,
incorporados al antígeno o inyectados simultáneamente con
él, hacen más efectiva la respuesta inmune.
Con su empleo se logra una economía de antígeno y de
tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos.
46
El mecanismo de acción de estas sustancias ha sido objeto
de numerosos estudios y, al parecer, existen diversos
factores que explican su modo de acción. El antígeno libre
normalmente difunde con mucha rapidez desde los tejidos
locales que rodean el sitio de inoculación, y una de sus
funciones importantes es crear un reservorio o depósito del
antígeno de larga vida. Las investigaciones realizadas han
demostrado que virtualmente todos los adyuvantes activan o
estimulan los macrófagos; éstos cuando son activados
estimulan la respuesta inmune por un incremento de la
cantidad de antígeno expresado en la membrana celular y de
la eficiencia de su presentación a los linfocitos. El
macrófago también libera factores solubles estimulantes,
que amplifican la proliferación de los linfocitos. Por otro
lado, algunos adyuvantes poseen la capacidad de actuar
específicamente sobre los linfocitos; pero, en general,
éstas funcionan mejor si facilitan la liberación simultánea
del antígeno y de sustancias inmunomoduladoras al tejido
linfoide.
En el nivel internacional, la lista de productos naturales
y derivados de la síntesis química, con propiedades
47
adyuvantes/inmunopotenciadoras, es cada vez mayor; sin
embargo, sólo un reducido número se utiliza en la
formulación de vacunas veterinarias y humanas, existiendo
una tendencia relacionada con la evaluación de nuevas
sustancias con esta finalidad. En función del campo de
aplicación y de la relación eficiencia/seguridad se pueden
reconocer diferentes categorías de adyuvantes, que serán
examinadas a continuación con más detenimiento.
SELECCIÓN DE UN ADYUVANTE CON FINES INVESTIGATIVOS
Con fines investigativos, las exigencias más importantes se
relacionan con una elevada eficacia, un amplio espectro de
aplicación, una fácil manipulación y, por supuesto, la
disponibilidad comercial.
El adyuvante completo de Freud (FCA) ha sido utilizado
durante más de 50 años en la producción de antisueros en
animales y es empleado con frecuencia cuando se dispone de
cantidades limitadas de antígenos o cuando presentan una
baja inmunogenicidad. La gravedad de su toxicidad fue
reconocida inmediatamente, pero los esfuerzos por encontrar
opciones igualmente efectivas y menos tóxicas no han
48
resultado del todo exitosos. Con los avances alcanzados en
numerosas áreas de las ciencias biológicas y el creciente
interés por el bienestar de los animales de
experimentación, existe una considerable presión para
restringir el uso del FCA, y aunque no se cuenta en la
actualidad con alternativas definitorias para este
adyuvante, en diferentes estudios comparativos se informan
resultados estimulantes en cuanto a eficiencia, menor
número de efectos adversos y mayor facilidad en la
manipulación.
En la investigación pueden utilizarse, además, los
compuestos de aluminio, la formulación "Syntex-1" (SAF-1)
que contiene el treonil análogo del dipéptido murámico,
polímeros no iónicos en bloque (NBP), saponinas, bromuro de
dimetil dioctadecil amonio (DDA), lipopéptidos, etc.
SELECCIÓN DE UN ADYUVANTE EN EL CAMPO DE LA SALUD
VETERINARIA
En este campo, la eficacia es un elemento de gran
importancia y se toleran ciertos niveles de efectos
colaterales. Los adyuvantes más ampliamente utilizados en
49
las vacunas veterinarias son las emulsiones de aceite
mineral (del tipo aceite en agua o agua en aceite) y los
adsorbentes (hidróxido y fosfato de aluminio). En algunos
casos, se emplean liposomas, saponinas, vitamina E,
complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), así como diferentes
emulsiones de aceites de origen vegetal o animal. Las
emulsiones de aceite mineral, especialmente las del tipo
agua en aceite, si bien inducen una fuerte respuesta
inmune, pueden provocar riesgos y efectos no deseados, a
causa posiblemente de su limitada biodegradabilidad y
biocompatibilidad.
Por tal razón, se han realizado numerosos intentos para
desarrollar adyuvantes eficaces y a la vez seguros. Ejemplo
de ello es la formulación compuesta por
sulfolipopolisacáridos sintéticos, con características
hidrofóbicas, incorporados a una emulsión de escualeno en
agua, desarrollada por la compañía belga Solvay SA. Este
adyuvante ha sido validado exitosamente en animales de
laboratorio con antígenos proteicos y virales, y resulta,
al menos, tan efectivo como los adyuvantes basados en
50
aceite mineral, empleados hoy día en diversas vacunas
veterinarias.
ADYUVANTES PARA VACUNAS HUMANAS
El criterio más importante, sin lugar a dudas, para la
selección de un adyuvante destinado a vacunas humanas es la
bioseguridad y, en la práctica, los compuestos de aluminio
son los únicos adyuvantes licenciados para uso humano.
El hidróxido de aluminio tiene un punto isoeléctrico de
11,1 y, por tanto, está cargado positivamente en las
condiciones biológicas, por lo que puede adsorber proteínas
cargadas negativamente y adsorber débilmente las proteínas
básicas. El grado de adsorción depende de la naturaleza y
concentración del antígeno, de la presencia de sales e
iones bufferantes y del pH de la mezcla resultante. Las
fuerzas de atracción electrostáticas y las interacciones
hidrofóbicas son las responsables de la adsorción de los
antígenos a los adyuvantes que contienen aluminio, pero
probablemente las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de
hidrógenos también contribuyan a la adsorción en estos
sistemas; sin embargo, se ha señalado que el alumbre puede
51
inducir anticuerpos de la clase IgE, así como reacciones
alérgicas. Según las regulaciones de la FDA, son
permisibles cantidades no mayores de 0,85 mg de aluminio
por dosis de vacuna.
Las nuevas vacunas recombinantes y sintéticas poseen una
baja inmunogenicidad en comparación con las vacunas
tradicionales, consistentes en los microorganismos
intactos, atenuados o inactivados por el calor; de ahí el
interés por la búsqueda de diferentes inmunoadyuvantes para
incrementar la efectividad de estas nuevas vacunas para uso
humano. En este sentido, Tamura y otros, notifican en
estudios realizados en ratones, la utilidad de 2 derivados
del dipéptido murámico como adyuvantes para la vacuna
recombinante de la hepatitis B, primera de esta categoría
en ser licenciada para uso en humanos y disponible
comercialmente en forma adsorbida al alumbre. La respuesta
de anticuerpos obtenida con los derivados del MDP resultó
similar a la inducida por la vacuna adsorbida en alumbre y
se discute, por los autores, el posible papel de estos
compuestos como su sustituto.
52
SAPONINAS
Los vegetales que contienen saponinas (Evans, 1989),
heterósidos llamados saponinas (del latín sapo, jabón), se
han utilizado profusamente en muchas partes del mundo por
sus propiedades detergentes.
Saponina es una sustancia capaz de formar espuma al ser
agitada con agua o disuelta en alcohol. Las contienen
plantas muy diversas (Evans, 1989), entre ellas la acacia,
la saponaria o jabonera, el castaño de indias y muchas
otras. Las saponinas se han utilizado mucho, y aún se
utilizan en ocasiones, como agentes limpiadores de la
contaminación producida por vertidos tóxicos. Algunas
presentan propiedades hipocolesterolémicas.
Existen unas 6 familias de plantas que presentan grandes
cantidades de saponinas, una de éstas es Sapindaceas con la
especie Sapindus saponaria. Las saponinas son glicósidos
resultante de la unión de la sapogenina (aglicón) con uno o
más azúcares. Las Saponinas aisladas (Tsuzuki et al.,
2007) de Sapindus saponaria son las L-Hederina
(sapindussaponinas): “two pure triterpene acetylated
saponins: 3-O-(4-acetyl-β-D-xylopyranosyl)-(1→3)-α-
53
Lrhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-hederagenin (1)
and 3-O-(3,4-di-acetyl-β-D-xylopyranosyl)-(1→3)-α-L-
rhamnopyranosyl-(1→2)-α- L-arabynopyranosyl-hederagenin
(2)”, la sapogenina es la L-Hederagenina y los azúcares:
rhamnosa y arabinosa.
En nuestro país, tenemos la especie Sapindus saponaria L.
(“choloque” o “boliche”), de la que desde épocas
precolombinas (Almenara, 1984) se ha utilizado el
pericarpio del fruto maduro por su alto contenido de
saponinas. Motivo por el cual los seis últimos años se ha
trabajado en nuestros laboratorios con la cáscara del fruto
maduro, para desarrollar una tecnología de obtención de un
extracto concentrado de saponinas. Ahora es necesario
encontrar aplicaciones científico-tecnológicas que a futuro
demanden la producción industrial y la industrialización
del producto.
Se ha reportado (Bonnin y Llorens, 2011) que del Castaño de
indias (Aesculus hippocastanum L.), se usan las hojas y la
corteza porque contienen escina, mezcla de saponinas
triterpénicas, que le confieren propiedades como venotónico
54
y vitamínico P. En forma de cápsulas en mezcla con
extractos de otras plantas se usa en la terapia de la
lipoesclerosis.
En Colombia están formulando productos cosméticos que
incluyen extracto de saponinas de Ruscus (Pizano, 2009)
para estimular el metabolismo celular, la multiplicación
celular y micro circulación cutánea.
Investigadores del Centro de Investigaciones de Energía
Solar en Santiago de Cuba (Morris et al., 1999), destacan
las amplias posibilidades que ofrecen los productos
naturales, especialmente polisacáridos de diversas fuentes,
en la tamización de sustancias con propiedades
inmunoestimulantes y reportan que las saponinas están
siendo utilizadas como adyuvantes inmunológicos en el campo
de la salud veterinaria.
En ciudad de La Habana, Cuba; luego de una evaluación
científica de plantas medicinales con acción
antileishmanial, se ha reportado (Monzote, n.d.) que la
saponina hederacolchisida A, purificada de Hedera colchica, ha
mostrado una potente actividad in vitro frente a
promastigotes (IC50=1.2 µM) y amastigotes (IC50=0.053 µM)55
de L. infantum. Otras dos saponinas purificadas de Hedera
helix, α y β-Hederina; también han mostrado una actividad
significativa contra esta misma especie de Leishmania,
mostrando una inhibición media del crecimiento menor de 14
µM frente a promastigotes y menor de 0.4 µM frente a
amastigotes. Yuccasaponina MC3, saponina purificada de
Yucca filamentosa 5 µg/mL, ha mostrado un 100% de inhibición del
crecimiento de promastigotes de Leishmania mexicana
amazonensis. Experimentos llevados a cabo por citometría de
flujo, revelan que estos compuestos actúan sobre el
parásito mediante una unión inespecífica con la membrana
que provoca la muerte celular. Según datos anteriores, las
saponinas interactúan con el ergosterol presente en las
membranas, induciendo pérdida de su integridad o alteración
en la porción hidrocarbonada cargada negativamente.
En la Pontificia Universidad Católica de Chile, en 2002 se
anunció (Rosso, 2002) la creación de una industria para la
extracción y comercialización de saponinas, que en la
actualidad muestra interesantes perspectivas de desarrollo
por su aplicación en el proceso de refinación del cobre.
56
La oferta de productos para la firma del Tratado de Libre
Comercio (TLC Perú – EEUU); entre tantos otros productos
naturales, incluye saponinas. Así también, en la Lista
Arancelaria de Colombia para el TPD (Colombia-USA), están
las saponinas.
En el marco de la investigación inmunológica actual y con
la finalidad de proponer como fuente de sustancias con
propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L.
“Choloque” es necesario explicar científicamente el
mecanismo de la actividad de las saponinas de esta especie
vegetal. Los resultados permitirán un mejor enfoque
científico, tecnológico y ecológico de promoción de su
cultivo.
Adyuvante es una sustancia distinta de un antígeno que
potencia la activación de los linfocitos T al favorecer la
acumulación y activación de otros leucocitos (Abbas et al.,
2004), denominados células accesorias, en el lugar de
exposición al antígeno. En las células accesorias, los
adyuvantes aumentan la expresión de coestimulantes y
citocinas que activan a los linfocitos T y pueden prolongar
57
también la expresión de complejos péptido-CPH en la
superficie de las CPA.
En el marco de la investigación inmunológica actual y con
la finalidad de proponer como fuente de sustancias con
propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L.
“Choloque” es necesario explicar científicamente el
mecanismo de la actividad de las saponinas de esta especie
vegetal. Los resultados permitirán un mejor enfoque
científico, tecnológico y ecológico de promoción de su
cultivo.
En tal perspectiva se planteó el problema ¿Cuál es el
efecto adyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. para
antígenos de Leishmania braziliensis en músculo estriado de
Rattus rattus var albinus?
La hipótesis de trabajo fue: “Las saponinas de Sapindus
saponaria L. actuando como adyuvantes en el músculo estriado
de Rattus rattus var albinus, favorecen la acumulación y
activación de células accesorias en la zona de depósito;
potenciando las respuestas celular y humoral para los
antígenos de Leishmania braziliensis”.
58
Dado que en nuestro país subsiste el problema de la
leishmaniasis estos resultados pueden representar una
esperanza para desarrollar una vacuna para L. braziliensis que
permita solucionar en parte la urgencia de atención de
salud en las zonas endémicas como los valles interandinos
occidentales y la selva peruanos.
59
II. MATERIAL Y MÉTODO
Material de estudio
Rattus rattus var albinus: 20 especímenes machos con peso entre
300 – 400 g; divididos al azar en cuatro grupos, un testigo
y tres grupos ensayo de 5 especímenes cada uno.
Materiales de prueba: Concentrado de Saponinas de Sapindus
saponaria L. purificadas en el laboratorio de Análisis
Instrumental, suspensión de fracciones antigénicas aisladas
de Leishmania braziliensis preparada en el laboratorio de
Toxicología, suero fisiológico, reactivos para microscopia
óptica.
Material de vidrio de uso corriente en el Laboratorio.
Equipos: Columna de fraccionamiento de espuma,
espectrofotómetro UV/Vis HP 8452A, microscopio óptico
binocular, balanza analítica.
Métodos y técnicas
Diseño experimental: Diseño clásico
Los grupos de Rattus rattus var albinus testigo y
experimentales, fueron inyectados vía intramuscular con
60
suero fisiológico (grupo T), suspensión de antígenos de
Leishmania braziliensis en solución salina fisiológica (grupo A),
saponinas en solución salina fisiológica (grupo B) y
saponinas - suspensión de fracciones antigénicas solución
salina fisiológica (grupo C). Se tomaron muestras de sangre
periférica (cola) de los especímenes de cada grupo, a las
48 y 192 horas.
Extracción de saponinas por maceración.
Cada vez se seleccionó una muestra 25 frutos secos de
Sapindus saponaria L. Se cortó la cáscara por el diámetro
peciolar, se registró el peso de cáscaras en balanza
sensible al 0,01 g. Se maceró las cáscaras en 250 mL de
agua por 24 horas. Se filtró el extracto a través de
torunda de algodón. El filtrado acuoso se depositó en el
balón del Equipo de fraccionamiento de espuma con 70 cm de
columna, a velocidad mínima. Se realizó el fraccionamiento
de espuma hasta completar 100 mL de escurrido, el que fue
sometido a ebullición por 5 minutos. Se determinó la
concentración de las saponinas mediante la ecuación de la
curva de calibración respectiva.
61
Preparación de los antígenos de Leishmania braziliensis
El cultivo de Leishmania braziliensis se realizó en frascos Roux
con medio BHI agar enriquecidos con sangre total de conejo,
con penicilina 100 UI/mL, estreptomicina 100 UI/mL,
solución salina fisiológica. Se sembró e incubó por 15 días
a 20º C, se cosechó con solución salina fisiológica
estéril, se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm. Se
desechó el sobrenadante, se resuspendió el precipitado en
solución salina fenolada 0,25% y nuevamente se centrifugó.
Se eliminó el sobrenadante y se agregó solución salina
fisiológica fenolada; se esterilizó a 121º C por 15 minutos
a 15 atmósferas de presión y se conservó a -20º C.
Ensayo inflamatorio
Un estudio comparativo en ratas se llevó a cabo para
investigar las reacciones locales y los cambios
hematológicos después de la inyección de una dosis
intramuscular de sapindussaponina (19,59 mg), y de vacuna
de L. braziliensis – sapindussaponina (19,59 mg – 0,25 mL
suspensión). Los efectos fueron comparados con los causados
62
por suero fisiológico y por la vacuna de L. braziliensis (0,25
mL suspensión). Grupos de cinco ratas machos fueron
inyectados en el músculo del muslo izquierdo con 0.25 mL de
la solución de prueba a 0 días. A las 48 y 192 horas se
tomaron muestras de sangre periférica (cola) de los
especímenes de cada grupo. Se preparó los frotis y se
realizó el conteo de glóbulos blancos con microscopio
óptico con lente de inmersión.
Análisis estadístico
Se realizó el ANOVA (Walpole et al., 1999) con las prueba
de MSD y Dunnett para determinar si existe o no diferencia
significativa entre las respuestas grupo experimental y
testigo, mediante el software (Pérez, 2001) SPSS v 16.
63
III. RESULTADOS
Los resultados se presentan en los siguientes TABLAS
TABLA 1. FORMULA LEUCOCITARIA EN Rattus rattus var albinus
PORCENTAJE DE CÉLULAS
GrupoHoras
Neutrófilos
Eosinófilos Basófilos Linfoci
tos Monocitos
Testigo 48 32 5 1 58 4Testigo 48 32 6 1 56 5Testigo 48 34 4 1 56 5Testigo 48 33 3 1 58 5Testigo 48 35 6 1 55 3
A 48 32 6 0 58 4A 48 33 5 0 58 4A 48 32 5 1 58 4A 48 34 3 1 57 5A 48 32 4 1 58 5B 48 44 4 0 45 7B 48 43 3 0 47 7B 48 45 3 1 44 7B 48 46 2 0 46 6B 48 44 4 0 46 6C 48 42 3 1 48 6C 48 42 2 1 49 6C 48 43 2 1 48 6C 48 42 3 0 48 7C 48 44 2 0 47 7
Testigo 192 33 6 1 55 5Testigo 192 32 4 1 58 5Testigo 192 34 5 1 55 5Testigo 192 32 4 1 59 4Testigo 192 33 6 1 56 4
A 192 33 6 1 56 4A 192 31 5 1 59 4A 192 32 4 1 59 4A 192 34 6 1 54 5A 192 32 6 1 56 5B 192 35 3 1 57 4B 192 36 3 1 56 4B 192 36 2 1 57 4B 192 35 2 1 58 4
64
B 192 34 3 1 57 5C 192 35 3 1 57 4C 192 34 3 1 57 5C 192 36 2 1 56 5C 192 35 2 1 58 4C 192 34 2 1 59 4
TABLA 2. FORMULA LEUCOCITARIA Rattus rattus var albinus
Análisis de varianza ANOVA de un factor
Sum ofSquares df
MeanSquare F Sig.
neu1 Between Groups 794,000 7 113,429 113,42
9 0,000
Within Groups 32,000 32 1,000
Total 826,000 39eos1 Between
Groups 56,800 7 8,114 10,143 0,000
Within Groups 25,600 32 0,800
Total 82,400 39bas1 Between
Groups 3,200 7 0,457 4,571 0,001
Within Groups 3,200 32 0,100
Total 6,400 39lin1 Between
Groups 805,575 7 115,082 67,695 0,000
Within Groups 54,400 32 1,700
Total 859,975 39mon1 Between
Groups33,575 7 4,796 13,704 0,000
65
Within Groups 11,200 32 0,350
Total 44,775 39
1; neu, neutrófio; eos, eosinófilo; bas, basófilo; lin, linfocito;mon, monocito
66
IV. DISCUSIÓN
La hipótesis de trabajo planteaba que las saponinas de
Sapindus saponaria L. actuando como adyuvantes en el músculo
estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la acumulación
y activación de células accesorias en la zona de depósito;
potenciando las respuestas celular y humoral para los
antígenos de Leishmania braziliensis. Se pasó entonces a tomar
las muestras de sangre para evaluar los cambios
hematológicos mediante el conteo de células blancas
(fórmula leucocitaria).
Luego de la inyección de saponinas y saponinas asociadas a
fracciones antigénicas de L. braziliensis, el porcentaje de
neutrófilos se incrementa a las 48 horas y disminuye muy
poco a las 192 horas; las pruebas estadísticas indican con
95% de seguridad que tal variación es significativa. No hay
variación estadísticamente significativa por inyección de
las fracciones antigénicas de L. braziliensis.
Se conoce que en los seres humanos (Rodríguez et al.,
1993), un aumento del porcentaje de neutrófilos puede
deberse a inflamaciones y ciertas enfermedades infecciosas
agudas.
67
A las 48 horas hay una disminución estadísticamente
significativa de eosinófilos en los grupos que recibieron
saponinas y saponinas más fracciones antigénicas de L.
braziliensis; esta condición se mantiene a las 192 horas.
Cuando la persona tiene ciertas reacciones alérgicas,
infecciones u otras afecciones médicas (Gersten et al.,
n.d.), los eosinófilos se vuelven activos. Estas células
conforman solamente un pequeño porcentaje del número total
de células blancas, pero son una parte importante de la
respuesta inmunitaria del cuerpo, pues liberan histamina y
otras sustancias químicas que actúan sobre los vasos
sanguíneos cuando la respuesta inmunitaria es activada.
A las 192 horas se registra una disminución
estadísticamente significativa de basófilos en los grupos
que recibieron saponinas y saponinas asociadas a fracciones
antigénicas de L. braziliensis.
Los basófilos conforman solamente un pequeño porcentaje del
número total de células blancas (Dugdale et al. n.d.); pero
son una parte importante de la respuesta inmunitaria del
cuerpo, pues liberan histamina y otras sustancias químicas
que actúan sobre los vasos sanguíneos cuando la respuesta
68
inmunitaria es activada. El basófilo es una célula
preponderantemente sanguínea (Bordés, n.d.), acude a los
tejidos durante el proceso inflamatorio y supone un
refuerzo en la liberación de mediadores ya que se activa
por los mismos mecanismos que el mastocito y libera
mediadores equivalentes a los de esta célula.
El porcentaje de linfocitos disminuye a las 48 horas en los
grupos que recibieron saponinas y saponinas asociadas a
fracciones antigénicas de L. braziliensis. A las 192 horas la
diferencia no es estadísticamente significativa.
A las 48 horas los grupos que recibieron saponinas y la
combinación saponinas – antígenos de L. braziliensis
experimenta una disminución estadísticamente significativa
en el porcentaje de monocitos; pero a las 192 horas el
porcentaje tiende a su valor normal. Los monocitos
colaboran con otros glóbulos blancos en la eliminación de
tejidos muertos o dañados, en la destrucción de células
cancerosas y en la regulación de la inmunidad contra las
sustancias extrañas. Al igual que otros glóbulos blancos,
los monocitos se originan en la médula ósea y luego entran
en el flujo sanguíneo. En unas horas, emigran a los tejidos
69
donde se convierten en macrófagos, y constituyen las
células defensivas (fagocitos) del sistema inmunitario.
Estos hechos pueden ser explicados en parte por la dinámica
del proceso inflamatorio presentado por Bordés (n.d.). La
inflamación es un proceso tisular constituido por una serie
de fenómenos moleculares, celulares y vasculares de
finalidad defensiva frente a agresiones físicas, químicas o
biológicas. Los aspectos básicos que se destacan en el
proceso inflamatorio son en primer lugar, la focalización
de la respuesta, que tiende a circunscribir la zona de
lucha contra el agente agresor. En segundo lugar, la
respuesta inflamatoria es inmediata, de urgencia y por
tanto, preponderantemente inespecífica, aunque puede
favorecer el desarrollo posterior de una respuesta
específica. En tercer lugar, el foco inflamatorio atrae a
las células inmunes de los tejidos cercanos. Las
alteraciones vasculares van a permitir, además, la llegada
desde la sangre de moléculas inmunes.
Esquemáticamente la inflamación tiene cinco etapas:
1. Liberación de mediadores. Son moléculas, la mayor parte
de ellas, de estructura elemental que son liberadas o
70
sintetizadas por el mastocito bajo la actuación de
determinados estímulos.
2. Efecto de los mediadores. Una vez liberadas, estas
moléculas producen alteraciones vasculares y efectos
quimiotácticos que favorecen la llegada de moléculas y
células inmunes al foco inflamatorio.
3. Llegada de moléculas y células inmunes al foco
inflamatorio. Proceden en su mayor parte de la sangre,
pero también de las zonas circundantes al foco.
4. Regulación del proceso inflamatorio. Como la mayor
parte de las respuestas inmunes, el fenómeno
inflamatorio también integra una serie de mecanismos
inhibidores tendentes a finalizar o equilibrar el
proceso.
5. Reparación. Fase constituida por fenómenos que van a
determinar la reparación total o parcial de los tejidos
dañados por el agente agresor o por la propia respuesta
inflamatoria.
Es muy importante la Fase tardía. Llegada de células
1. Basófilo. Contribuye, junto con el mastocito, a la
liberación de mediadores.
71
2. Neutrófilo. Es de las primeras células en llegar al foco
inflamatorio. Elimina al germen mediante fagocitosis o
liberando factores tóxicos que contiene en sus gránulos
citoplasmáticos y produciéndole, así, una muerte
extracelular.
3. Monocito/Macrófago. Procedente de la sangre el monocito,
y de los tejidos cercanos el macrófago, llegan al foco
más tardíamente. El monocito, en los tejidos, se
diferencia en macrófago. Esta célula presenta idénticas
funciones a las señaladas para el neutrófilo. Actúa
además, como célula presentadora del antígeno a las
células específicas T y B, iniciando, de esta forma, la
respuesta específica.
El macrófago sintetiza un péptido inespecífico, la
interleucina 1 (IL-1), que es una auténtica hormona del
Sistema Inmune, ya que pasando a la sangre produce
efectos sobre distintas partes del organismo. Determina
la aparición de fiebre, probablemente induciendo la
síntesis de PGE en las células endoteliales que revisten
los vasos sanguíneos del hipotálamo; a su vez la PGE
actúa sobre el centro termorregulador. Sobre la médula
72
ósea favorece la producción y liberación de neutrófilos,
con la consiguiente neutrofilia. En el hígado incrementa
la síntesis de proteínas de la fase aguda.
A nivel local, la IL-1 activa la proliferación y
diferenciación de las células T y B contribuyendo, así a
la respuesta específica. También activa la proliferación
de fibroblastos y producción de colágeno, fenómenos
incluidos en la fase de reparación de la inflamación.
4. Linfocitos T y B. Potenciados por el macrófago inician
la respuesta específica. Las células B procedentes de
los tejidos linfoides asociados a tejidos o mucosas
sintetizan IgE, que unidas al mastocito o basófilo
pueden potenciar la inflamación. Por otra parte, las
células T comienzan a producir linfoquinas que prolongan
la inflamación en una respuesta inmune más elaborada.
5. Eosinófilo. Aunque es una célula citotóxica en las
infecciones parasitarias, parece además tener en la
inflamación una función reguladora, por lo que será
estudiada en el siguiente apartado.
Pero también la REGULACIÓN DE LA RESPUESTA INFLAMATORIA
73
Como la mayor parte de las respuestas inmunes, el
fenómeno inflamatorio se encuentra estrechamente regulado,
evitando, así una respuesta exagerada o perjudicial.
Algunos de los mediadores que producen activación, al
variar su concentración o actuar sobre distintos
receptores, van a producir inhibición, consiguiendo, de
esta forma, un equilibrio o modulación de la respuesta
inflamatoria. Los siguientes factores intervienen en esta
regulación:
1. Histamina. Actuando sobre receptores H2, induce en el
mastocito y basófilo una inhibición de la liberación de
mediadores, inhibe la actividad del neutrófilo, inhibe
la quimiotaxis y activa las células T supresoras.
2. PGE. Produce en el mastocito y basófilo una inhibición
de la liberación de mediadores y sobre los linfocitos
una inhibición de la proliferación y diferenciación.
3. Agonistas autonómicos. El mastocito y basófilo parecen
presentar receptores α y β-adrenérgicos y ζ-colinérgicos
que sugieren que la liberación de mediadores podría
estar sometida a una regulación autonómica. La
activación del receptor β-adrenérgico produce una
74
inhibición, mientras que la activación del α-
adrenérgico y ζ-colinérgico inducen la estimulación
4. Heparina. Inhibe la coagulación y la activación de los
factores del complemento.
5. Eosinófilo. Esta célula, atraída por el ECF-A, acude al
foco inflamatorio donde libera una serie de enzimas que
degradan determinados mediadores potenciadores de la
inflamación. La histaminasa actúa sobre la histamina, la
arilsulfatasa sobre los leucotrienos y la fosfolipasa
sobre el PAF.
75
V. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados se concluye:
1. La inyección de saponinas y saponinas - antígenos de L.
braziliensis provoca cambios en la fórmula leucocitaria.
2. las variaciones de porcentaje de leucocitos:
neutrófilos, eosinófilos, linfocitos y monocitos indican
la respuesta celular a las saponinas y la asociación
saponinas – fracciones antigénicas de L. braziliensis.
76
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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WALPOLE, R. et al. 1999. Probabilidad y Estadística para
Ingenieros. Prentice - Hall Hispanoamericana, S.A. México
D.F.
80
ANEXOS
81
Anexo 1. Corte pelo del muslo izquierdo para inyectar
82
Anexo 2. Inyección en el músculo del muslo izquierdo
Anexo 3. Grupo testigo T. Recibió Solución Salina
83
Fisioógica
Anexo 4. Grupo Experimental C. Recibió Asociación Saponinas
– Antígenos de L. braziliensis
Anexo 4. Obtención de Sangre Periférica (cola)
M.Sc. Q.F. Segundo M. Miranda Leyva
VºBº _____________________________
Dr. Ramón Piminchumo Carranza
84
