“Rol de GCSF-CHR19; CXCL8a y CXCL8b en la migración de ...

Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela de Ingeniería en Biotecnología

“Rol de GCSF-CHR19; CXCL8a y CXCL8b en la migración de neutrófilos a

través de los vasos sanguíneos en pez cebra (Danio rerio)”

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de

Magister en Biotecnología

Profesor patrocinante: Dra. Carmen Gloria Feijoo García

Facultad de Ciencias Biológicas

Universidad Andrés Bello

Constanza Del Pilar Zúñiga Traslaviña

Santiago, Chile Mayo, 2017

Escuela de Ingeniería en Biotecnología, Universidad Andrés Bello • República 239, segundo piso • Santiago

1

Dedicatoria

A mis padres, Lincoyan Zúñiga y Christhal Traslaviña, por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, en toda mi

educación, tanto académica, como de la vida, por su incondicional apoyo mantenido a través del tiempo. Todo este trabajo ha

sido posible gracias a ellos.

A mis hermanos, Christhal Zúñiga y Javier Zúñiga, por ser ejemplos de hermanos mayores y de quienes

aprendí aciertos y de momentos difíciles.

A mis abuelos, Guido Traslaviña, Mireya Farías y Raquel Urbina, a mis tíos y primos que me apoyaron directa o

indirectamente en la elaboración de esta tesis.

A Ángel Arias, mi compañero de vida, quien comprendió, comprendió y apoyó en este largo camino de estudio y

trabajo.

A mis amigas que me apoyaron en mi formación como persona, que me apoyaron y comprendieron hasta

ahora, seguimos siendo amigas: Camila Paul, Andrea Trullen y Constanza Vera.

Al laboratorio de inmunología en peces, quienes me apoyaron en mi formación profesional, a la Dra. Carmen Feijoo

quien me guio en todo este trabajo, y a mis compañeros de laboratorio especialmente a Karina Bravo con quien trabajamos a la

par.

¡Gracias por todo!


2

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico

1171199 y 1150816, Dirección de Investigación UNAB DI-483-14/R, y Fondo de

Financiamiento de Centros de Investigación en Áreas Prioritarias 15110027.


3

Índice

Abstract ....................................................................................................................... 5

Resumen ..................................................................................................................... 7

Introducción ................................................................................................................ 9

Marco teórico ........................................................................................................... 9

Sistema inmune ...................................................................................................... 9

Neutrófilos y respuesta inflamatoria ...................................................................... 10

Regulación de la migración de neutrófilos durante un proceso inflamatorio ......... 10

Regulación de la migración de neutrófilos en pez cebra ...................................... 14

Hipótesis ................................................................................................................ 16

Objetivo General ................................................................................................... 16

Objetivos específicos ........................................................................................... 17

Materiales y métodos ............................................................................................... 18

Mantención de peces ............................................................................................ 18

Daño estéril ............................................................................................................ 18

Expresión génica .................................................................................................. 19

Ensayos falta de función génica ......................................................................... 21

Cuantificación de neutrófilos ............................................................................... 23

Estadística ............................................................................................................. 23

Resultados ................................................................................................................ 24

Niveles transcripcionales de diferentes genes durante un proceso inflamatorio

luego de un daño severo ....................................................................................... 24

Niveles transcripcionales de diferentes genes durante un proceso inflamatorio

luego de un daño severo en ausencia de Gcsf-chr19 ........................................... 26

Niveles transcripcionales de diferentes genes en un proceso inflamatorio luego

de un daño leve ..................................................................................................... 28


4

Determinación del número de neutrófilos presentes en circulación y en zona

afectada luego de un daño severo ........................................................................ 30

Determinación del número de neutrófilos presentes en circulación y en zona

afectada luego de un daño leve ............................................................................ 32

Discusión .................................................................................................................. 34


5

Abstract Neutrophils migration is one of the characteristics that distinguish an

inflammatory process, and its deregulation occurs in several diseases with immune

component.

This thesis focused on studying the regulation, at a molecular level, of the

migration of neutrophils to blood vessels to reach the site of inflammation caused by

sterile damage. In mammals, specifically in mice, this process is regulated by the

CXCL1/ 2 cytokine pathway and its receptor CXCR2, and in turn are controlled via G-

CSF signaling. On the other hand, in humans, the main ligand of the CXCR2 receptor is

CXCL8, but it is not known if this signaling pathway regulates the migration of

neutrophils into the bloodstream. This deference between the murine model and human

prevents the development of studies of the mentioned problem in mice, so it is proposed

the use of zebrafish as an alternative study model. The zebrafish presents in its genome

two paralogs for Cxcl8, Cxcl8a and Cxcl8b. Available evidence indicates that Cxcl8a

regulates neutrophil migration during an inflammatory process and that Cxcl8b

increases its transcriptional levels in zebrafish. For its part, Gcsf-chr19 performs a

function similar to that described for its orthologous G-CSF in mammals.

Based on the above problem, the following hypothesis is proposed: "Cxcl8a

regulates the entry of neutrophils into the bloodstream, in response to mechanical

damage in zebrafish. This chemokine is regulated by Gsf-Chr19 ". Thus, the aim was to

characterize the function of Cxcl8a and Cxcl8b during the process of migration of

neutrophils to blood vessels triggered by sterile zebrafish damage and their relationship

to Gcsf-Chr19.

Using double transgenic larvae, Tg (BACmpx: GFP) i114 and Tg (fli1: EGFP) y1,

and two damage models with different intensities (severe and mild), which allowed

carried out in vivo monitoring of the migration of neutrophils in Cxcl8a and Cxcl8b lack of

function. In addition, measuring of the transcriptional levels of cxcl8a and cxcl8b, and

other genes involved in an inflammatory process such as: il-1b, il-6, cxcr1, cxcr2, sdf-1,

cxcr4, gcsf-chr12, gcsf-chr19 and myd88, in both types of damages and in severe

damage with lack of function of Gcsf-chr19.


6

The results indicate that, in an inflammatory process triggered by severe sterile

damage, Gcsf-Chr19 represses the expression of sdf-1 and induces the expression of

Cxcl8b and thus favors the entry of neutrophils into the blood vessels. For its part,

Cxcl8a regulates the migration of neutrophils through the interstitial tissue.


7

Resumen La migración de neutrófilos es una de las características que distinguen a un

proceso inflamatorio, y su desregulación se presenta en diversas enfermedades con

componente inmune.

Esta tesis se enfocó en estudiar la regulación, a nivel molecular, de la migración

de los neutrófilos a los vasos sanguíneos para llegar al lugar de inflamación causada

por un daño estéril. En mamíferos, específicamente en ratones, este proceso es

regulado por la vía de las citoquinas CXCL1/2 y su receptor CXCR2 y que a su vez

están controlados por vía de señalización G-CSF. Por su parte, en humanos, el

principal ligando del receptor CXCR2 es CXCL8, pero no se sabe si esta vía de

señalización regula la migración de neutrófilos a la circulación sanguínea. Esta

diferencia entre el modelo murino y humanos impide el desarrollo de estudios de la

mencionada problemática en ratones, por lo que se propone el uso de pez cebra como

modelo de estudio alternativo. El pez cebra presenta en su genoma dos parálogos para

Cxcl8, Cxcl8a y Cxcl8b. Antecedentes disponibles indican que Cxcl8a regula la

migración de neutrófilos durante un proceso inflamatorio y que Cxcl8b aumenta sus

niveles transcripcionales en pez cebra. Por su parte, Gcsf-chr19 ejerce una función

similar a la descrita para su ortólogo G-CSF en mamíferos.

Basado en la problemática antes descrita que se plantea la siguiente hipótesis:

“Cxcl8a regula el ingreso de neutrófilos al torrente sanguíneo, en respuesta a un daño

mecánico en pez cebra. Esta quimioquina a su vez es regulada por Gcsf-Chr19”. Así, el

objetivo general fue caracterizar la función de Cxcl8a y Cxcl8b durante el proceso de

migración de neutrófilos a los vasos sanguíneo gatillado por daño estéril en pez cebra y

su relación con Gcsf-Chr19. Utilizando larvas doble transgénicas Tg (BACmpx:GFP) i114 X Tg (fli1:EGFP)y1, se

llevaron a cabo dos modelos de daño con diferente intensidad (severo y leve), y se

monitoreo in vivo la migración de neutrófilos en condiciones de falta de función de

Cxcl8a y Cxcl8b. Además, se determinaron los niveles transcripcionales de cxcl8a y

cxcl8b, y otros genes involucrados en un proceso inflamatorio tales como: il-1b, il-6,

cxcr1, cxcr2, sdf-1, cxcr4, gcsf-chr12, gcsf-chr19 y myd88, en ambos tipos de daños y

en daño severo en ausencia de Gcsf-chr19.


8

Los resultados obtenidos, indican que, en un proceso inflamatorio gatillado por un

daño estéril severo, Gcsf-Chr19 reprime la expresión de sdf-1 e induce la expresion de

Cxcl8b y con ello favorece la entrada de neutrofilos a los vasos sanguineos. Por su

parte, Cxcl8a regula la migracion de neutrofilos a traves del tejido intersticial.

.


9

Introducción

En la actualidad existen diversas enfermedades relacionadas al sistema inmune

que afectan considerablemente la calidad de vida de las personas. En su mayoría,

éstas se deben a alteraciones en los distintos procesos que ocurren durante una

respuesta inmune (Licastro et al., 2005). En particular, la desregulación de la función de

los neutrófilos, células pertenecientes al sistema inmune innato, pueden causar

enfermedades tales como neutropenia, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del

intestino y enfermedad obstructiva crónica de pulmón (Eyles et al., 2006). En

condiciones de homeostasis, los neutrófilos se encuentran retenidos en el tejido

hematopoyético, pero al generarse un estímulo inflamatorio se favorece su migración al

área afectada. Dicho proceso de migración consta de varias etapas; salida del tejido

hematopoyético, entrada a los vasos sanguíneos y circulación, salida de los vasos

sanguíneos y migración final al daño. En cada uno de estas etapas participan diferentes

genes regulando finamente el proceso.

Esta tesis se focaliza en el estudio de la regulación de la migración de neutrófilos

hacia los vasos sanguíneos y la acción de las citoquinas Cxcl8a, Cxcl8b y Gcsf-chr19

en este proceso en el modelo de estudio pez cebra (Danio rerio).

Marco teórico

Sistema inmune

El sistema inmune tiene como función proteger al organismo de diferentes

amenazas (patógenos, daño tisular, etc.) manteniendo las condiciones de homeostasis

durante su desarrollo y crecimiento (Klosterman, 2009). Éste se divide clásicamente en

inmunidad innata e inmunidad adaptativa (Magnadóttir, 2010). De estos dos tipos de

inmunidades, la presente tesis tendrá enfoque en la inmunidad innata.

El sistema inmune innato corresponde a la primera línea de defensa de los

organismos, consiste en un mecanismo celular y bioquímico que se encuentra listo para

responder rápidamente frente a una infección o daño (Abbas et al., 2015). En algunos

organismos, como los peces, el sistema inmune innato tiene mayor relevancia que el

sistema inmune adaptativo (Magnadóttir, 2006). Por ejemplo, en el caso de pez cebra

permite la sobrevivencia durante las primeras semanas de desarrollo, dado que el


10

sistema inmune adaptativo se encuentra activo a partir de la tercera semana posterior a

la fertilización (Kanther & Rawls, 2010).

La principal respuesta del sistema inmune innato es la respuesta inflamatoria, la

cual corresponde al proceso de migración y reclutamiento de células inmunes a la zona

afectada. Dicha respuesta puede ser activada por una infección o por un daño tisular

(Abbas et al., 2015).

Neutrófilos y respuesta inflamatoria

Dentro de los tipos celulares que participan en el proceso inflamatorio podemos

encontrar los neutrófilos (White et al., 1998). Éstos son células inflamatorias móviles, y

tienen la habilidad de fagocitar y destruir microorganismos como bacterias, hongos y

virus (Vento & Cainelli., 2003). La activación y consecuente migración de los neutrófilos

se considera un indicador de que está ocurriendo un proceso inflamatorio en el

organismo (Issekutz & Movat, 1980). Durante una infección, los neutrófilos migran a

esta zona para eliminar el agente infeccioso utilizando enzimas proteolíticas y proteínas

anti-microbiales (Palic et al., 2007). Por otro lado, se denomina inflamación estéril

cuando se genera un daño mecánico en un tejido. En Ambas situaciones se activan

vías de señalización de diferentes citoquinas que gatillan la migración de neutrófilos al

lugar afectado (Chen & Nuñez, 2010).

Regulación de la migración de neutrófilos durante un proceso inflamatorio

A pesar de que la entrada de neutrófilos a la circulación sanguínea es una etapa

crucial en el proceso inflamatorio, su regulación en humanos no se encuentra

completamente descrita. En mamíferos, en condiciones de homeostasis los neutrófilos

se encuentran unidos a los osteoblastos presentes en la médula ósea. Esta unión es

regulada por la interacción de interleuquina 12, también conocida como Factor 1

Derivado de Células Estromales (SDF-1), y su receptor de quimioquina C-X-C tipo 4

(CXCR4), además de moléculas de adhesión del tipo integrinas (Figura 1) (Teixidó et

al., 1992). Por otro lado, luego de un estímulo nocivo, los neutrófilos son liberados

desde la medula ósea y atraídos a la circulación sanguínea con el fin de favorecer su

rápida llegada al lugar afectado (Eash et al., 2010). Así, es necesario entonces que se


11

produzca una inhibición de la señal pro-retención de neutrófilos y un aumento de la

señal pro-migración para permitir la salida de neutrófilos desde la medula ósea. Ambos

procesos son regulados por la citoquina Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos

(G-CSF por sus siglas en ingles), junto a su receptor G-CSFR (Layton & Hall, 2006;

Taga & Kishimoto, 1997). En condiciones de homeostasis, G-CSF se encuentra en

niveles muy bajos, pero durante un proceso inflamatorio sus niveles de expresión

aumentan drásticamente en diferentes tipos celulares, incluyendo monocitos,

fibroblastos y células endoteliales (Anderlini et al., 1996; Demetri & Griffin, 1991).

Figura 1. Modelo de ubicación de neutrófilos en homeostasis. Los neutrófilos son

retenidos en el tejido hematopoyético debido a la unión del ligando SDF-1 al receptor

CXCR4.

En el modelo murino, al aumentar los niveles de G-CSF se induce la disminución

de los niveles de SDF-1 en la médula ósea, además de reducir la expresión de CXCR4

en la superficie de las células mieloides permitiendo la salida de neutrófilos desde la

médula ósea hacia el torrente sanguíneo (Kyung et al., 2006; Nagase et al., 2002;

Semerad et al., 2002). Por otro lado, G-CSF también actúa a nivel de células


12

endoteliales para promover el aumento en la expresión de la interleuquina 1 (CXCL1) e

interleuquina 2 (CXCL2), además de aumentar la expresión del receptor de quimioquina

C-X-C tipo 2 (CXCR2), en neutrófilos. Dicha vía de señalización es la encargada de

dirigir la migración de los neutrófilos a los vasos sanguíneos (Nagase et al., 2002)

(Figura 2).

Figura 2. Modelo de Inflamación por daño. Los niveles de G-CSF aumentan

disminuyendo los niveles de SDF-1 y CXCR4 generando la liberación de los neutrófilos

y posterior entrada a los vasos sanguíneos, para finalmente dirigirse al lugar del daño

por señales quimioatractantes de CXCL1/2.

En humanos, los genes que participan en la regulación de la migración de

neutrófilos difieren de lo descrito en roedores. La diferencia radica en el ligando de

CXCR2 en humano, el cual es interleuquina 8 (CXCL8), y no CXCL1/CXCL2 (Van et al.,

1989). Además, se ha reportado que existe afinidad entre CXCL8 y el receptor de

quimioquina C-X-C tipo 1 (CXCR1) (Raghuwanshi et al., 2012).

Diversos antecedentes indican que al aumentar de manera exógena los niveles

de G-CSF en la sangre, se gatilla un aumento de los niveles endógenos de CXCL8 en


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la sangre en conjunto con una mayor cantidad de células inmunes en circulación,

particularmente neutrófilos, sugiriendo que ésta quimioquina está regulada directa o

indirectamente por GCSF. Además, en este mismo estudio se muestra que al generar

un aumento de CXCL8 de manera exógena, existe una mayor movilización de

neutrófilos en la sangre (Watanabe et al., 1999). Por otro lado, en condiciones de falta

de función de CXCR2 se observa una disminución en la migración y quimiotaxis de los

neutrófilos al lugar del insulto (White et al., 1998).

Debido a las diferencias moleculares antes mencionadas en el proceso

inflamatorio entre ratones y humano, es que proponemos el uso pez cebra como

modelo alternativo y complementario para estudiar en detalle dicho proceso, ya que,

diversos antecedentes sugieren que al menos a nivel celular, el proceso inflamatorio en

pez cebra esta conservado con respecto a mamíferos (Deng Q et al., 2013; Galdames

et al., 2014).

Pez cebra (Danio rerio) es un pez teleósteo que se utiliza ampliamente en la

investigación biomédica debido a las grandes ventajas que presenta frente a otros

modelos de estudios, entre estas ventajas podemos encontrar que posee un alto grado

de similitud relacionado a los mecanismos moleculares como celulares con los

humanos, además de que el desarrollo embrionario ocurre de forma externa y rápida, lo

que permite que la manipulación se puede realizar desde el momento de la fecundación

y donde a las 24 horas post fertilización (hpf) se tiene un organismo funcional, también

son ópticamente trasparente lo cual facilita la observación de órganos internos, otra

ventaja es que se encuentra completamente secuenciado, y gracias a esto se pueden

utilizar técnicas de biología molecular como la generación de transgénico, knock out,

knock down, sobre expresiones, etc., finalmente posee un bajo costo de manejo y

mantención (Kari et al., 2007).

Proceso inflamatorio en pez cebra

Desde hace ya algunos años que el pez cebra se utiliza para estudiar la

respuesta inmune, sobre todo la respuesta innata (Novoa & Figueras, 2012). Esto,

debido a las ventajas comparativas que este modelo presenta, como la transparencia

de tejidos durante etapas embrionarias y larvales, además de la existencia de líneas


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transgénicas donde células inmunes están fluorescentemente marcadas. Lo anterior

hace posible monitorear in vivo en un organismo completo la participación de

determinadas células en el proceso inflamatorio.

Regulación de la migración de neutrófilos en pez cebra

Se sabe que los neutrófilos permanecen retenidos en el tejido caudal

hematopoyético (TCH) debido a la señal pro-retención que es llevada a cabo por SDF-1

y CXCR4 (Walters et al., 2010). Posterior a un insulto se genera un incremento en los

niveles transcripcionales de Gcsf-chr19, el ortólogo de G-CSF, lo que favorece la

migración de neutrófilos desde el TCH hacia los vasos sanguíneos para posteriormente

migrar hacia la zona afectada (Galdames et al., 2014). Además, se ha demostrado que

concomitante con el aumento de Gcsf-chr19 ocurre un incremento significativo de la

expresión del transcrito de cxcl8a (Galdames et al., 2014), sugiriendo que Cxcl8a

estaría participando en conjunto con Gcsf-chr19 en el proceso inflamatorio generado

por daño estéril en pez cebra.

Se ha demostrado que Cxcl8a ejerce una función atractante sobre neutrófilos,

regulando su migración al tejido afectado (Oehlers et al., 2010; Sarris et al., 2012; Deng

et al. 2013). Por su parte, se ha reportado que Cxcl8b participa en el proceso de

migración con un aumento de sus niveles de expresión durante un daño mecánico (De

Oliveira et al., 2013).

En resumen, se sabe que en ratones la vía de señalización encargada de dirigir

la migración de neutrófilos a los vasos sanguíneos está compuesta por las citoquinas

CXCL1/2 y su receptor CXCR2, las que a su vez están reguladas por GCS-F. Esta

citoquina también disminuye los niveles de CXCL12 (Figura 3A). En cambio, en

humanos, esta función es llevada a cabo por CXCL8 y CXCR2, y es también regulada

por la vía de GCS-F (Figura 3B). En pez cebra, Gcsf-Chr19 regula la migración de

neutrófilos por los vasos sanguíneos, pero no se sabe si regula los niveles

transcripcionales de Sdf-1, Cxcl8a, Cxcl8b y Cxcr2 (Figura 3C).


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Figura 3. Diagrama resumen de la problemática. (A) En ratones, la vía de G-CSF/G-

CSFr regula negativamente la unión de CXCL12/CXCR4, y positivamente los niveles de

CXCL1/2/CXCR2. (B) En humanos, la vía de G-CSF/G-CSFr regula negativamente la

unión de CXCL12/CXCR4, y positivamente los niveles de CXCL8/CXCR2. (C) En pez

cebra, si bien la vía de Gcsf-Chr19/Gcsfr regula la migración de neutrófilos a los vasos

sanguíneos, no se sabe si está controlando a Sdf1/Cxcr4b, y/o a Cxcl8a/b/Cxcr2.

Es importante mencionar que en pez cebra existen dos parálogos de CXCL8,

Cxcl8a (EH557944) y Cxcl8b (HF674400) ubicados en cromosoma 1 y 7

respectivamente, Cxcl8a posee una identidad del 94% con humano (NM_000584.3),

mientras que Cxc8b sólo de un 79%. En lo que respecta a GCS-F, este también se

encuentra en forma paráloga como Gcsf-Chr12 (FM174388.1) y Gcsf-Chr19

(EH451519.1), los cuales posee una identidad de 89% y 88% con respecto a humano

(NC_000017.11) respectivamente.


16

En casi la totalidad de los trabajos disponibles en pez cebra, incluidos los

mencionados anteriormente, la migración de neutrófilos durante un proceso inflamatorio

ha sido estudiada como un proceso único, sin etapas, por lo que no se tiene mayores

antecedentes de cómo o cuando ocurre la migración de neutrófilos hacia los vasos

sanguíneos y que genes la regulan.

Con el fin de desarrollar nuestros objetivos, se llevaron a cabo dos tipos de

daños estériles, denominados severo y leve. El daño severo corresponde a una

amputación de aleta caudal incluyendo tejido muscular, mientras que el daño leve sólo

se realiza amputación del tejido de la aleta. Esta diferencia en la intensidad de los

daños gatilla procesos inflamatorios distintos. Entre las diferencias más importantes

encontramos que en el modelo de daño severo se gatilla migración de neutrófilos a la

zona afectada tanto a través de los vasos sanguíneos como por el tejido tisular, mientas

que en un daño leve la migración es exclusivamente por matriz extracelular (Galdames

et al.,2014). Así, la comparación de lo que ocurre a nivel molecular y celular entre estos

dos daños nos permitirá contestar nuestra pregunta: ¿Participa Cxcl8a o Cxcl8b o

ambas en la regulación de la migración de neutrófilos a los vasos sanguíneos gatillado

por un daño estéril, y son estas a su vez reguladas por Gcsf-Chr19?

Hipótesis “Cxcl8a regula el ingreso de neutrófilos al torrente sanguíneo, en respuesta a un

daño mecánico en pez cebra. Esta quimioquina a su vez es regulada por Gcsf-Chr19”.

Objetivo General Caracterizar la función de cxcl8a y cxcl8b durante el proceso de migración de

neutrófilos a los vasos sanguíneo gatillado por daño estéril en pez cebra y su relación

con Gcsf-Chr19.


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Objetivos específicos

1. Determinar los niveles transcripcionales de cxcl8a y cxcl8b, y otros genes

involucrados en un proceso inflamatorio tales como: il-1b, il-6, cxcr1, cxcr2,

cxcr4b, gcsf-chr12, gcsf-chr19 y myd88 después de un daño estéril severo en

presencia y ausencia de Gcsf-Chr19.

2. Determinar los niveles transcripcionales de cxcl8a y cxcl8b, y otros genes

involucrados en un proceso inflamatorio tales como: il-1b, il-6, cxcr1, cxcr2,

cxcr4b, gcsf-chr12, gcsf-chr19 y myd88 después de un daño estéril leve.

3. Caracterizar la migración de neutrófilos luego de un daño estéril leve y severo en

presencia y ausencia cxcl8a o cxcl8b.


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Materiales y métodos

Mantención de peces Se utilizaron peces cebra (Danio rerio) que se mantuvieron en el bioterio del

Laboratorio de biología del Desarrollo, Universidad Andrés Bello, de acuerdo a

protocolos previamente establecidos (Westerfield, 2009). Se usaron dos líneas

transgénicas, Tg(BACmpx:GFP)i114 (Renshaw et al., 2006) y Tg (fli1:EGFP)y1 (Lawson et

al., 2002). Tg(BACmpx:GFP)i114, es una línea transgénica de pez cebra que expresa

proteína fluorescente verde (GFP) bajo el promotor de mioeloperoxidasa (mpx)

específica de neutrófilos. Tg(fli1:EGFP)y1 es una línea transgénica que expresa EGFP

bajo el promotor del factor de transcripción Friend leukemia integration 1 (Fli1) que se

expresa en vasos sanguíneos (células endoteliales). Los embriones se recolectaron por

desove natural (Kimmel et al., 1995), y luego se mantuvieron en medio E3 (5 mM NaCl,

0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, pH 7.0) con Azul de metileno 0.01% (3

mL por 1 L de E3), en placas petri con no más de 50 embriones por placa en una

incubadora (VELP Scientifica) a 28°C. Los ensayos se realizaron 48 horas posteriores a

la fertilización (hpf).

Daño estéril Se llevaron a cabo dos tipos de daño, severo y leve. El daño severo corresponde

a una transección de la aleta caudal que incluye la amputación de tejido muscular

(Figura 4A), mientras que el daño leve corresponde a una transección de aleta caudal

que no incluye tejido muscular (Figura 4B). Ambos daños fueron realizados con bisturí

estéril. Previo a la realización de daños, los embriones se anestesiaron con tricaína

0.017% (Fluka Analytical) de acuerdo al protocolo descrito por Elks et al., 2011. Se

realizaron tres replicas biológicas de cada ensayo.


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Figura 4. Esquema de daños realizados. (A) Daño severo, cercano al loop circulatorio

y pérdida de tejido muscular. (B) Daño leve, perdida de tejido de la aleta sin músculo.

Expresión génica Se realizaron PCR de tiempo real (qPCR) para la determinación de la expresión

génica relativa de los distintos genes en estudio (cxcl8a y cxcl8b, il-1b, il-6, cxcr1, cxcr2,

sdf-1, cxcr4, gcsf-chr12, gcsf-chr19 y myd88) en las diferentes condiciones

experimentales con partidores que se especifican en la Tabla 1. Primeramente, se

extrajo el ARN utilizando TRIzol® Reagent (Life Technology) de acuerdo a las

instrucciones del fabricante, en los tiempos correspondientes de cada ensayo.

Posteriormente se sintetizó cADN utilizando la enzima Improm-II™ Reverse (Promega)

según las instrucciones del fabricante, con partidores oligo-dT. Finalmente se realizaron

qPCR utilizando un programa especificado en la Tabla 2, los resultados obtenidos se

estandarizaron con respecto a β-Actina. Se realizaron tres replicas bilógicas con cuatro

replicas técnicas cada una.

Los análisis de resultados de qPCR se realizaron, primero se normaliza al gen de

referencia calculando el ∆𝐶𝑡, para cada muestra obtenida, con la siguiente formula:

∆𝐶𝑡 = 𝐶𝑡%&')*+&,-.) − 𝐶𝑡%&'0&1&2&1&'3-4, luego se calculó la expresión con la siguiente

formula ∆𝐶𝑡&561&7-ó' = 2:∆;,, posteriormente se saca el promedio de las réplicas

técnicas y se calcula la desviación estándar, finalmente se normaliza al control

dividiendo los datos por el valor del control para dejarlo con valor igual a 1,


20

Tabla 1. Secuencia de partidores utilizados en los ensayos de qPCR.

Gen Partidor Secuencia 5’à3’

β-Actina Forward TTCTGGTCGTACTACTGGTATTGTG

Reverse ATCTTCATCAGGTAGTCTGTCAGGT

Cxcl8a Forward TGTGTTATTGTTTTCCTGGCATTT

Reverse GCGACAGCGTGGATCTACAG

Cxcl8b Forward CTACCGAGACGTGGGTGATT

Reverse GCTCGGTGAATGGTCATTTT

Cxcr2 Forward TGACCTGCTTTTTTCCCTCACT

Reverse TGACCGGCGTGGAGGTA

Cxcr4 Forward GCGACTTTTTTCACCATTCC

Reverse TTTCTCCAGACCCTGTTCC

Gcsf-chr12 Forward CTACTGGAGTCTGGTGATTGTGC

Reverse AGTTTCTGAGGAACAGGAGCAGA

Gcsf-chr19 Forward GTGAGTTCCAGATCCCGACG

Reverse TGTGATGAAGCTCCAGACCG

Il-1b Forward TGGACTTCGCAGCACAAAATG

Reverse GTTCACTTCACGCTCTTGGATG

Il- 6 Forward TCAACTTCTCCAGCGTGATG

Reverse TCTTTCCCTCTTTTCCTCCTG

MyD88 Forward TAAACGGCTAATCCCTGTCG

Reverse ATGGTCAGAAAGCGCAGAAT


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Tabla 2. Programa qPCR. Segmento Número de ciclos Temperatura Tiempo 1 1 25 °C 1 segundo

2 1 95 °C 10 minutos

3 40

95 °C 15 segundos

Tm 15 segundos

72 °C 15 segundos

4 1

95 °C 15 segundos

25 °C 1 segundo

70 °C 15 segundos

95 °C 1 segundo

*Tm: temperatura específica para cada par de partidores.

Ensayos falta de función génica Se llevaron a cabo ensayos de falta de función génica utilizando morfolinos de

Splicing (Gene Tools) para Gcsf-Chr19, Cxcl8a y Cxcl8b (Tabla 3). Estos fueron

inyectados en embriones dobles transgénicos, obtenidos de la cruza entre la línea

Tg(Bacmpx: GFP) i114 y la línea Tg(fli1:EGFP)y1, un estadio de 1 célula de acuerdo al

protocolo descrito por Rosen et al. 2009. Para la selección de fenotipo morfante de

Cxcl8a y Cxcl8b se utilizó el criterio de disrupciones existentes en la vasculatura (Figura

5) descrita por Stoll at al. 2011, donde se utilizaron embriones con 2 o 3 disrupciones en

la prolongación de los vasos intersegmentales, y sin alteración en los vasos que se

encuentran en el tejido caudal hematopoyético. Para la selección de fenotipo morfante

ce Gcsf-chr19 se utilizó el criterio de Galdames et al. 2014, con una sección de

morfantes los cuales posee un número de entre 14 y 20 neutrófilos en el tejido caudal

hematopoyético. Como control de inyección de utilizaron morfolinos missences. Se

realizaron tres replicas biológicas de cada ensayo.


22

Tabla 3. Secuencias de morfolinos

Nombre Tipo Secuencia 5’ à 3’ Concentración Gcsf-ch19 spli Splicing CAGGTGTTAGTGTGTATTTACCAGT 2,5 ng/embrión

Gcsf-ch19 ATG Traducción TAAAGAGCCTGATTGTTCAACTGGG 2,5 ng/embrión

Cxcl8a spli Splicing GGTTTTGCATGTTCACTTACCTTCA 10 ng/embrión

Cxcl8b spli Splicing TTAGTATCTGCTTACCCTCATTGGC 20 ng/embrión

Figura 5. Fenotipo morfante. (A, B, C) Imágenes representativas de los diferentes

fenotipos observados después de la microinyección de morfolino de Cxcl8a o Cxcl8b.

(A) Fenotipo control mostrando la vasculatura normal. (B) Fenotipo morfante usado en

los ensayos, de 2 a 3 disrupciones en la vasculatura, sólo en las venas

intersegmentales (fechas). (C) Fenotipo severo, con más de 3 alteraciones en la

vasculatura.


23

Cuantificación de neutrófilos La cuantificación de neutrófilos se realizó en embriones controles e inyectados

con morfolino. En el del conteo de neutrófilos que llegaron al daño se realizó mediante

monitoreo in vivo a las 0, 1, 2 y 3 horas posterior al daño severo o leve (Figura 6A). En

el conteo de neutrófilos en sangre, se realizaron time-lapse de 5 minutos; a los tiempos

de 1, 2, 3 horas posterior al daño, severo o leve, además de un control sin daño. Los

conteos fueron realizados en la vena caudal (Figura 6B). Todas las cuantificaciones in

vivo y los time-lapse fueron realizados en una lupa estereoscópica de fluorescencia

(Olympus, SZX16). Se realizaron tres replicas biológicas de cada ensayo.

Figura 6. Esquema de las zonas de cuantificación de neutrófilos. (A) Área de

conteo en aleta caudal. (B) Área de conteo en circulación, vena caudal.

Estadística Los datos fueron analizados en el programa Prism 6 (GraphPad) usando Kruskal-

Wallis no-paramétrico, ANOVA de dos vías y test de múltiple comparación Dunn.


24

Resultados Objetivo 1: Determinar los niveles transcripcionales de cxcl8a y cxcl8b, y otros genes

involucrados en un proceso inflamatorio tales como: il-1b, il-6, cxcr1, cxcr2, cxcr4b,

gcsf-chr12, gcsf-chr19 y myd88 después de un daño estéril severo en presencia y

ausencia de Gcsf-Chr19.

Con el fin de desarrollar el presente objetivo, se evaluaron los niveles

transcripcionales de distintos genes en un daño severo. Este daño corresponde a la

amputación de la aleta caudal incluyendo tejido muscular. Así, a embriones Tg(Bacmpx:

GFP)i114 de 48 horas post fertilización (hpf) se les realizó un daño severo y luego se

monitoreó los niveles de mRNA de un grupo de genes según se detalla a continuación.

Se evaluaron genes participantes en el proceso de liberación de neutrófilos del

tejido hematopoyético, Sdf-1, Cxcr4 y Gcsf-chr19, junto con su parálogo Gcsf-chr12.

También se evaluó el cambio en la expresión de los parálogos Cxcl8a y Cxcl8b, los

cuales corresponden a ortólogos de CXCL8 en humanos, además de los receptores

Cxcr1 y Cxcr2. Para verificar que el daño realizado efectivamente gatilló un proceso

inflamatorio se midieron las citoquinas pro-inflamatorias Interleuquina 1b (Il-1b) e

Interleuquina 6 (Il-6). Finalmente, para comprobar que el proceso inflamatorio fue

gatillado por un daño estéril y no por una infección se midieron los niveles del transcrito

del gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide 88 (Myd88).

Niveles transcripcionales de diferentes genes durante un proceso inflamatorio luego de

un daño severo

Los resultados obtenidos, indican que, los niveles transcripcionales de il-1b e il-6

aumentan significativamente luego del daño. il-1b mantiene esta sobrexpresión durante

las tres horas posterior al daño (hpd), mientras que, il-6 vuelve a su estado basal a la

tercera hpd. Los niveles de mRNA de myd88 no presentan cambio significativo durante

el tiempo analizado (Figura 7A).

Los genes que participan en la liberación de neutrófilos desde el TCH, se pueden

observar que gcsf-chr19 se encuentra significantemente aumentado durante las tres

hpd, a diferencia de gcsf-chr12 que tiene una conducta oscilante, aumentando


25

significativamente su expresión durante la primera y tercera hpd, no así a la segunda

hpd. Por su parte, la expresión de sdf-1 disminuye significativamente durante la primera

hora de daño, para luego aumentar desde a la segunda hpd. Finalmente, los niveles de

cxcr4 no se ven afectados durante todo el tiempo analizado (Figura 7B).

Los niveles transcripcionales de los genes participantes en la migración de

neutrófilos, se puede observar que cxcl8a, cxcl8b y cxcr2 se encuentran

significativamente elevados durante las tres hpd, a diferencia de cxcr1 que no varía

(Figura 7C).

Figura 7. Niveles transcripcionales de genes relacionados a un proceso inflamatorio posterior a un daño severo. (A) Niveles de expresión relativos de genes

relacionados a un proceso inflamatorio en general. (B) Niveles de expresión relativo de

genes involucrados en la liberación de neutrófilos desde el tejido hematopoyético. (C)

Niveles de expresión relativo de genes relacionados a la migración de neutrófilos. Los

datos se presentan como el cambio en la expresión respecto a su control a 0 hpd y

están normalizados contra b-actina. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01, ***p-value <

0.005.


26

Niveles transcripcionales de diferentes genes durante un proceso inflamatorio luego de

un daño severo en ausencia de Gcsf-chr19

Dado que los antecedentes existentes indican que Gcsf-chr19 regula la entrada

de neutrófilos a la circulación y que en esta tesis se quiere determinar si esto lo hace

regulando la función de Cxcl8a o Cxcl8b, se analizaron los niveles transcripcionales de

los genes inmunes antes mencionados en ausencia de Gcsf-chr19. Para realizar la

inhibición de la función de Gcsf-chr19, se utilizó un morfolino (MO) contra dicho gen. Se

inyectaron embriones al estado de 1 célula con el MO y luego a las 48 hpf se realizó un

daño severo y se cuantificaron los niveles de mRNA de una serie de genes durante las

3 primeras horas posteriores al daño. Los resultados obtenidos muestran que tanto il-1b

e il-6 no se ven afectadas por la ausencia de Gcsf-chr19, manteniendo el mismo

comportamiento observado en presencia dicha citoquina. Es decir, il-1b esta

significativamente elevada durante las tres hpd analizadas e il-6 durante las dos

primeras hpd. Así mismo, los niveles de mRNA de myd88 no presentaron cambios

(Figura 8A).

Al analizar los genes relacionados con la salida de los neutrófilos del TCH,

pudimos observar que la ausencia de Gcsf-chr19 altera la expresión de gcsf-ch12,

aumentando significativamente desde la 0,5 hpd con un máximo de expresión a las 2

hpd (comparar Figura 7B con Figura 8B). Lo mismo ocurre con los niveles de sdf-1, los

que no se alteran en la ausencia de Gcsf-chr19 (comparar Figura 7B con Figura 8B). El

único gen que no altera su comportamiento de expresión es cxcr4, el cual no aumenta

sus niveles de expresión luego de un daño ni en ausencia como en presencia de Gcsf-

chr19. Finalmente, y a modo de control del experimento, los niveles transcripcionales de

gcsf-ch19 no aumentaron.

Por otra parte, al evaluar los niveles de mRNA de genes relacionados con la

migración de neutrófilos en ausencia de Gcsf-chr19, se pudo observar que su falta de

función altera la expresión de cxcl8b donde se observa que éstos no aumentan durante

un daño severo (Figura 8C), siendo que en presencia de Gcsf-chr19 presenta un

aumento significativo de los niveles de mRNA (Figura 7C). cxcl8a presentó un aumento

significativo en la segunda hora posterior al daño (Figura 8C), lo cual difiere con el


27

comportamiento en presencia de Gcsf-chr19, en donde se observa que se mantiene

aumentado durante las tres hpd (Figura 7C). Finalmente, cxcr2 mantuvo un aumento en

su expresión durante el proceso de inflamación, y cxcr1 no tuvieron cambio en su

expresión (Figura 5C), lo cuales no varían respecto a Gcsf-chr19.

Figura 8. Niveles transcripcionales de genes relacionados a un proceso inflamatorio posterior a un daño severo en ausencia de Gcsf-chr19. (A) Niveles de

expresión relativos de genes relacionados a un proceso inflamatorio en general en

ausencia de Gcsf-chr19. (B) Niveles de expresión relativo de genes involucrados en la

liberación de neutrófilos desde el tejido hematopoyético en ausencia de Gcsf-chr19. (C)

Niveles de expresión relativo de genes relacionados a la migración de neutrófilos en

ausencia de Gcsf-chr19. Los datos se presentan como el cambio en la expresión

respecto a su control a 0 hpd y están normalizados contra b-actina. *p-value < 0.05; **p-

value < 0.01, ***p-value < 0.005.


28

Objetivo 2: Determinar los niveles transcripcionales de cxcl8a y cxcl8b, y otros genes

involucrados en un proceso inflamatorio tales como: il-1b, il-6, cxcr1, cxcr2, cxcr4b,

gcsf-chr12, gcsf-chr19 y myd88 después de un daño estéril leve.

Para poder determinar si la intensidad del daño influye en el patrón de expresión

de los genes involucrados, y si éstos se expresan diferencialmente, es que se evalúa

los niveles de mRNA en un daño leve, el cual corresponde a una amputación de aleta

caudal sin tejido muscular.

Niveles transcripcionales de diferentes genes en un proceso inflamatorio luego de un

daño leve

Los resultados obtenidos muestran que tanto il-1b, il-6 como myd88 se

comportan de igual forma que en la situación de daño severo; il-1b e il-6 se ven

aumentadas significativamente respecto al estado inicial y myd88 que no presenta

cambio en ninguno de los tiempos analizados (Figura 9A).

Respecto a los genes que participan en el proceso de liberación de neutrófilos

TCH, ninguno de los genes evaluados; gcsf-chr12, gcsf-chr19, sdf-1 y cxcr4, aumenta

su expresión luego de realizado el daño leve (Figura 9B).

Finalmente, en los genes relacionados con la migración de neutrófilos, se

observa que cxcl8a y cxcr2 aumentan significativamente su expresión, no así de cxcl8b

y cxcr1. cxcl8a presenta un comportamiento oscilante, aumentando los niveles de

mRNA significativamente a las 0.5hpd y 3hpd. Por su parte, cxcr2 incrementa sus

niveles transcripcionales desde las 0.5hpd (Figura 9C).


29

Figura 9. Niveles transcripcionales de genes relacionados a un proceso inflamatorio posterior a un daño leve. (A) Niveles de expresión relativos de genes

relacionados a un proceso inflamatorio en general. (B) Niveles de expresión relativo de

genes involucrados en la liberación de neutrófilos desde el tejido hematopoyético. (C)

Niveles de expresión relativo de genes relacionados a la migración de neutrófilos. Los

datos se presentan como el cambio en la expresión respecto a su control a 0 hpd y

están normalizados contra b-actina. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01, ***p-value <

0.005.


30

Objetivo 3: Caracterizar la migración de neutrófilos luego de un daño estéril leve y

severo en presencia y ausencia cxcl8a o cxcl8b.

Dada la diferencia encontrada entre un daño severo, donde genes involucrados

con la entrada a los vasos sanguíneos, como Gcsf-chr19, aumentan su expresión, y un

daño leve, donde dichos genes no lo hacen, sumado a la diferencia encontrada en

relación a los niveles relativos de expresión de Cxcl8a y Cxcl8b, se decidió evaluar los

efectos de la falta de funcional de ambas proteínas en la migración de neutrófilos. Para

este propósito se utilizaron morfolinos para cada uno de los genes.

Determinación del número de neutrófilos presentes en circulación y en zona afectada

luego de un daño severo

En el modelo de daño severo, la ausencia de tanto Cxcl8a como Cxcl8b

disminuyen significativamente el número de neutrófilos presentes en la zona del daño

en comparación al control durante las tres horas de monitoreo. En el caso de Cxcl8a,

esta disminución es mayor a la tercera hpd (Figura 10B).

Dado que el número de neutrófilos presentes en el daño es el resultado de las

diferentes etapas de migración hacia éste, y que se postula que Cxcl8a estaría

relacionado al ingreso de neutrófilos a los vasos sanguíneos, es que se determinó el

número de neutrófilos presentes en el torrente sanguíneo durante el proceso

inflamatorio. Se observó que en larvas control sin daño, la cantidad de neutrófilos en

circulación se mantiene constante, siendo esta muy baja, cercana a 0 neutrófilo,

durante los 5 minutos analizados en cada hora (Figura 11A). Al realizar un daño severo,

se genera un aumento significativo y progresivo en el transcurso del tiempo de la

cantidad de neutrófilos que se encuentran en circulación, aumentando de 0 neutrófilos

en 5 min durante la primera hpd hasta 2 neutrófilos en 5 min luego a las tres hpd

(Figura 11B). En los embriones morfantes de Cxcl8a, el número de neutrófilos aumenta

significativamente luego del daño, tal como ocurre en el control con daño (Figura 11C).

Por otro lado, en los embriones morfantes de Cxcl8b el número de neutrófilos en

circulación permanece bajo y constante, similar a lo observado en el control sin daño

(Figura 11D).


31

Figura 10. Determinación del número de neutrófilos que llega a la zona dañada luego de un daño severo en ausencia de Cxcl8a o Cxcl8b. (A) Vista lateral de una

sección de la aleta caudal luego de 1, 2 y 3 horas de realizado el daño severo en larvas

control y morfantes. (B) Cuantificación de neutrófilos en el daño a las 1, 2 y 3 horas

posteriores al daño. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01, ***p-value < 0.005.


32

Figura 11. Cuantificación de neutrófilos circulantes luego de un daño severo en presencia y ausencia de Cxcl8a o Cxcl8b. (A) Cuantificación de neutrófilos

circulantes en el torrente sanguíneo en larvas sin daño; (B) con daño severo; (C) con

daño severo, en ausencia de Cxcl8a; (D) con daño severo ausencia de Cxcl8b. *p-value

< 0.05; **p-value < 0.01, ***p-value < 0.005.

Determinación del número de neutrófilos presentes en circulación y en zona afectada

luego de un daño leve

Los resultados obtenidos durante un proceso inflamatorio gatillado por un daño

leve, indican que sólo la ausencia de Cxcl8a afecta el número de neutrófilos que

migraron al daño, siendo significativamente menor respecto al control. En embriones

morfantes de Cxcl8b no se observa diferencia significativa con embriones control

(Figura 12C).


33

Figura 12. Determinación del número de neutrófilos que llega a la zona dañada luego de un daño leve en ausencia de Cxcl8a o Cxcl8b. (A) Vista lateral de una

sección de la aleta caudal luego de 1, 2 y 3 horas de realizado el daño leve en larvas

control y morfantes. (B) Cuantificación de neutrófilos en el daño a las 1, 2 y 3 horas

posteriores al daño. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01, ***p-value < 0.005.


34

Discusión Con el paso de los años y el avance en los estudios científicos, se ha podido

observar que aun cuando a nivel fisiológico los procesos son conservados, estos

pueden diferir a nivel molecular aún en especies evolutivamente muy cercanas. Un

ejemplo de esto, es la diferencia existente en relación a CXCL8, entre humanos y

roedores. Este hecho realza la importancia de conocer en profundidad la biología de

cada especie, y que no siempre es posible extrapolar mecanismos fisiológicos,

celulares y/o moleculares entre diferentes organismos.

En particular, esta tesis se centra en entender el mecanismo de regulación de la

migración de neutrófilos hacia los vasos sanguíneos en peces. Dada la problemática

antes expuesta y los resultados obtenidos durante el desarrollo de este trabajo, es que

se propone el pez cebra como animal modelo para estudios in vivo sobre la

movilización de neutrófilos durante procesos inflamatorios. Esto, tanto a nivel molecular

como celular, así también como para propósitos biomédicos.

Para determinar los roles de los parálogos Cxcl8a y Cxcl8b en la entrada de

neutrófilos a los vasos sanguíneos durante un daño mecánico estéril y su relación con

Gcsf-chr19, se llevó a cabo dos tipos de daños. En uno de ellos, el severo, en donde

existe migración de neutrófilos por vasos sanguíneos a diferencia del segundo, daño

leve, donde esto no ocurre (Galdames et al., 2014). La comparación de ambos

procesos a nivel molecular nos permitió identificar cuál de estos genes participa en la

entrada de neutrófilos a la circulación sanguínea. Por otro lado, ensayos de daño

severo en ausencia de Gcsf-chr19 nos permitió determinar si dicha citoquina reluga la

función de Cxcl8a y/o Cxcl8b.

En los ensayos de falta de función de Cxcl8a y Cxcl8b, a través de la acción de

un morfolino, se pudo observar que ambas citoquinas participan en la regulación en la

migración de neutrófilos en un modelo de daño severo. El número de neutrófilos

presentes en el daño disminuyó significativamente en larvas morfantes para Cxcl8a o

para Cxcl8b en comparación a larvas control. Este resultado concuerda con lo descrito

por De Oliveira et al., 2013, donde se demuestra que la migración de neutrófilos al lugar

del daño disminuyo en los knock-down de Cxcl8a como de Cxcl8b y que la presencia de

ambas citoquinas es necesaria para la mantención de comportamiento migratorio de


35

neutrófilos. Por otra parte, para poder determinar si los parálogos de Cxcl8 regulan la

entrada de neutrófilos al torrente sanguíneo, se realizó un conteo de neutrófilos

circulantes en la vena caudal. Los resultados obtenidos sugieren que Cxcl8b, no así

Cxcl8a, estaría regulando la migración de neutrófilo a través de los vasos sanguíneos.

Esta regulación de entrada de neutrófilos a los vasos sanguíneos que posee

CXCL8 en mamíferos, ha sido reportada anteriormente en ensayos clínicos con

humanos donde se observó un efecto de aumento de números de neutrófilos de en

ciclación al inyectar de forma exógena CXCL8, también se ha observado el mismo

efecto en estudios realizados en monos, conejos y ratones (Jagels & Hugl, 1992;

Laterveer et al.,1995; Van et al., 1992; Watanabe et al., 1999), la relevancia de los

resultados presentados es que al existir una duplicación de Cxcl8 en pez cebra, éstos

presentan una función complementaria, las cuales suplen la función completa que

posee CXCL8 en mamíferos.

En el caso de daño leve, los resultados obtenidos sugieren que Cxl8a, y no

Cxcl8b, regularía la migración final de neutrófilos al daño a través del tejido intersticial.

Esto, ya que en ausencia de Cxl8a, existió una disminución en el número de neutrófilos

presentes en el daño en comparación con el control, en cambio, Cxcl8b no presenta

variación significativa en el número de neutrófilos en el daño respecto al control.

El análisis transcripcional realizado luego de un daño severo como de uno leve

mostró que los niveles de las citoquinas pro-inflamatorias il-1b e il-6 aumentaron

indicando que ambos tipos de daños gatillaron un proceso inflamatorio (Ogryzko et al.,

2014; Varela et al., 2012).

En relación al proceso de liberación de neutrófilos desde el TCH se observó que,

durante las dos primeras horas de daño severo, sdf-1 disminuyó significativamente,

posiblemente debido a la acción que genera Gcsf-chr19 sobre éste ligando, lo cual

concuerda con lo descrito en ratones que indica que G-CSF inhibe la actividad de los

osteoblastos en la médula ósea, reduciendo la expresión de SDF-1 (Semerad et al.,

2005). Los resultados obtenidos en ausencia de Gcsf-chr19 apoyan esta hipótesis, ya

que los niveles sdf-1 no se vieron afectados respecto al control durante un daño severo.

Por su parte, los niveles de Cxcr4 no sufrieron cambios en ninguno de los daños

llevados a cabo, indicando que la función de este receptor de quimioquina no sería


36

regulada transcripcionalmente. Estos resultados no concuerdan con lo descrito en

mamíferos, donde se ha reportado existe una disminución de CXCR4 en células

mieloides tanto a nivel transcripcional como proteico, gatillada por la acción de G-CSF,

(Kyung et al. 2006; Levésque et al., 2003). Con estos resultados se puede inferir que en

pez cebra, la acción de Gcsf-chr19 en el proceso de liberación de neutrófilos desde el

TCH es mediada por Sdf-1.

Respecto a Gcsf-chr19, los ensayos de qPCR indican que éste únicamente

aumenta sus niveles de mRNA luego de un daño severo, confirmando que solo

participa en aquellos procesos inflamatorios donde ocurre migración de neutrófilos por

los vasos sanguíneos. El aumento significativo de gcsf-chr12 luego de un daño severo

en ausencia de Gcsf-chr19, posiblemente se debe a una función compensatoria. Esta

sería una nueva función de Gcsf-chr12, que se sumaría a su ya descrita participación

en el proceso de mielopoyésis (Liongue et al., 2009; Stachura et al., 2013).

En lo que respecta al proceso de migración de neutrófilos por los vasos

sanguíneos, de todos los genes evaluados, cxcr1 fue el único no que presentó cambios

en su expresión transcripcional, lo que indica que no estaría participando en el proceso,

o si lo hace, su función no es regulada transcripcionalmente. Por otro lado, los niveles

de mRNA de cxcr2 aumentan luego de un daño severo y de uno leve, además en

presencia y ausencia de Gcsf-chr19. Estos resultados sugieren que Cxcr2 participa

activamente en el proceso de migración de neutrófilos y que su función no depende de

Gcsf-chr19. Según lo descrito en la literatura, Cxcr2 participa específicamente en el en

proceso final de migración de neutrófilos, esto es en la llegada a la zona dañada en pez

cebra (Deng et al., 2013), en ratones se ha visto que CXCR2 estaría regulando los

niveles de GCSF y no GCSF los de CXCR2, esto a través de IL-17 con el objetivo de

lograr la homeostasis en los niveles de neutrófilos en circulación y así promover la

resolución de la inflamación (Mei et al., 2012). Con estos resultados no podemos

descartar que Cxcr2 también participe en la regulación de la migración de neutrófilos

por los vasos sanguíneos en pez cebra. Además, se observó que durante un daño

severo la expresión de cxcl8a y cxcl8b aumentó significativamente indicando que

participan en el proceso inflamatorio severo estéril. En cambio, en el daño leve sólo

cxcl8a presento una sobreexpresión de transcritos, sugiriendo que se encuentra


37

involucrado en la migración de neutrófilos a través de matriz extracelular y no por los

vasos sanguíneos, lo cual se estaría correlacionado con los resultados obtenidos con la

falta de función de ambos Cxcl8, donde se sugieren que Cxcl8b, no así Cxcl8a, estaría

regulando la migración de neutrófilo a través de los vasos sanguíneos.

En resumen, con los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis se

refuta una parte de la hipótesis planteada, aquella en donde se asevera que Cxcl8a

regula la entrada de neutrófilos a los vasos sanguíneos. Como ya se dijo, nuestros

resultados indican que es Cxcl8b. La segunda parte de nuestra hipótesis es verdadera

Gcsf-chr19, por medio de su regulación sobre Cxcl8b, controla la entrada de neutrófilos

a los vasos sanguíneos luego de daño severo.

Se plantea el siguiente modelo de migración: Durante un proceso inflamatorio

gatillado por daño estéril severo, Gcsf-chr19 disminuiría los niveles de Sdf-1,

favoreciendo la liberación de neutrófilos desde el tejido hematopoyético y al mismo

tiempo aumentaría la expresión de cxcl8b permitiendo la entrada a los vasos

sanguíneos. Es importante destacar que con nuestros resultados no podemos afirmar ni

descartar que la acción de Cxcl8b se llevase a cabo al unirse al receptor Cxcr2.

Finalmente, los neutrófilos serían atraídos a la zona del daño por la acción de Cxcl8a y

su receptor Cxcr2 (Figura 13).


38

Figura 13. Modelo final de migración de neutrófilos a una inflamación en pez cebra. (A) Los neutrófilos se mantienen retenidos en tejido hematopoyético debido a la

unión del ligando Sdf-1 al receptor Cxcr4. (B) Gsf-chr19 inhibe los niveles de Sdf-1

generando la liberación de los neutrófilos y aumenta los niveles Cxcl8b permitiendo el

paso a los vasos sanguíneos y finalmente dirigirse al lugar del daño por señales

quimioatractantes de Cxcl8a/Cxcr2.

Conclusión El trabajo realizado permite clarificar, al menos en parte, el mecanismo molecular

que controla la migración de neutrófilos a los vasos sanguíneos en pez cebra durante

un proceso inflamatorio. Específicamente, podemos concluir que:

1. En un proceso inflamatorio gatillado por un daño estéril severo, Gcsf-Chr19 regula

la expresión de sdf-1 y cxcl8b principalmente y con ello favorece la salida de neutrofilos

desde el territorio caudal hematopoyetico y su entrada a los vasos sanguineas,

respectivamente.

2. En un proceso inflamatorio gatillado por un daño estéril leve, no se requiere

liberación de neutrófilos desde el tejido caudal hematopoyético, por lo que neutrofilos

ubicados fuera de este territorio serían los que responde. La migración de dichos

neutrofilos es a traves del tejido intersticial y regulada por la vía de señalizacion

Cxcl8a/Cxcr2.


39

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