PATRICK CHARRON

REPONSE DES CELLULES ENDOTHELIALES A UN FLUX HÉMODYNAMIQUE DANS UN SUBSTITUT

VASCULAIRE CONSTRUIT PAR GÉNIE TISSULAIRE

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de Maître ès sciences (M. Se.)

DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLÉCULAIRE FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2008

© Patrick Charron, 2008

Résumé L'environnement hémodynamique des cellules endothéliales est un stimulus capital

pour l'activation et le maintien de leurs fonctions. Les vaisseaux sanguins sont

constamment soumis aux forces hémodynamiques sous forme de tension et de forces de

cisaillement et ces forces font partie intégrante de l'environnement physiologique des

cellules endothéliales. La force de cisaillement présente à l'interface sang-paroi vasculaire

agit au niveau de l'endothélium et influence la biologie des cellules endothéliales. La

présence de ces forces est souvent négligée dans les modèles in vitro traditionnels d" étude

de l'endothélium. Une simple couche de cellules, en deux dimensions, dans un

environnement statique s'éloigne de l'environnement natif des cellules endothéliales. La

méthode d'autoassemblage développée dans notre laboratoire a permis de mettre au point

un modèle in vitro d'étude de l'endothélium humain dans des conditions plus

physiologiques. Ce modèle appelé matrice fibroblastique tubulaire est formé de matrice

extracellulaire endogène, tridimensionnelle et de forme tubulaire. Ces caractéristiques

permettent la culture de cellules endothéliales humaines sur une matrice endogène en plus

de les exposer à un flux hémodynamique physiologique. L'objectif de ces travaux était

d'évaluer la réponse au flux hémodynamique des cellules endothéliales cultivées dans ce

modèle. Après une période d'exposition de 4 heures au flux, les observations

microscopiques de l'endothélium démontrent des changements de morphologie des cellules

endothéliales qui se rapproche de la réalité in vivo. Nous avons observé un alignement et un

étirement des cellules parallèles à la direction du flux et un réarrangement du cytosquelette

par la formation de fibres de stress également parallèles à la direction du flux. De plus,

nous n'avons pas observé de décollement des cellules par le flux, indiquant l'affinité du

substrat de matrice extracellulaire. Nous avons analysé l'influence de l'exposition au flux

sur l'expression de 7 gènes impliqués dans la biologie endothéliale : PECAM, eNOS, ET-

B l , PAI-1, tPA, VECAD et vWF. Nous n'avons pas observé de différences significatives

des niveaux d'expression de ces gènes entre la condition statique et dynamique. Le modèle

de la matrice fibroblastique tubulaire possède un potentiel certain pour l'étude des cellules

endothéliales dans un environnement hémodynamique physiologique. Son utilisation

pourrait profiter à plusieurs domaines d'étude impliquant les cellules endothéliales.

Abstract The hemodynamic environment of endothelial cells (EC) is a major stimulus for their

functions and maintenance. Blood vessels are constantly exposed to hemodynamic forces in

form of tension and shear stress. Thèse forces are part of the natural envrionment of blood

vessels and EC. The shear stress présent at the blood-vessel wall interface acts directly on

the endothelium and modulate its fonctions at several levels. The hemodynamic

environment is oiten neglected with traditional in vitro models of the endothlium. A simple

layer of EC. in two dimensions, in a static environment is far away from the native

physiological conditions. The self-assembly method. developed in our laboratory. open the

door for a new in vitro model of the human endothelium which can be study under more

physiological conditions. This model is composed of fibroblastic three dimensional tubular

extracellular matrix (FTM). Its features allow us to culture human EC on an endogenous

matrix and to expose them to a physiological flow. In order to study the response of human

EC under shear stress in our FTM, the endothelialized FTMs were submitted to static and

flow conditions for 4 hours in an hemodynamic bench. Following flow experiments,

microscopic observations of the endothelium show changes of cell morphology which

approach in vivo reality. We observed an alignment and a stretching of the cells parallel to

the flow direction. We also observed a rearrangement of the cytoskeleton by actin stress

fibers formation parallel to flow direction. Moreover, we did not observe any cell removed

by the flow indicating the affinity for the extracellular matrix. We analyzed the influence of

hemodynamic flow on the expression of 7 gènes involved in EC biology: PECAM, eNOS,

ET-B1, PAI-1, tPA, VECAD and vWF. We did not observe any signifîcant différences

induced by the flow in the expression levels of thèse gènes. The FTM model has an

undeniable potential for EC studies under a physiological hemodynamic environment and

several fields involving EC could benefit from it.

Avant-Propos Ces travaux ont été réalisés au Laboratoire d'Organogénèse Expérimentale (LOEX)

de l'hôpital du Saint-Sacrement de Québec, sous la direction du Docteur François A.

Auger.

Au cours de ma maîtrise, la majorité de mon travail à porté sur la mise au point des

techniques d'utilisation de nos models in vitro. L'adaptation des techniques pour la biologie

moléculaire (RT-PCR, PCR et PCR quantitative), l'extraction de TARN, l'augmentation du

temps d'exposition au flux, les méthodes d'ensemencement des cellules endothéliales dans

la MFT, la validation du flux utilisé et le traitement des échantillons pour la microscopie ne

sont que quelques exemples. Quoique nous n'ayons obtenu que peu de résultats et qu'il

reste du travail à faire, j e considère avoir appris énormément lors de mon cheminement,

tant du point de vue scientifique que personnel. La planification d'expériences scientifiques

complexes m'a amené à développer mon autonomie, mes aptitudes à la recherche et au

travail d'équipe. Je suis reconnaissant de l'opportunité d'avoir évolué au sein d'un

laboratoire dynamique et visionnaire.

Je tiens à remercier tous les gens qui ont contribué de près ou de loin à mon projet de

maîtrise. Tout d'abord, Dr Auger pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et de m'avoir

rappeler : « Patrick, si tu savais le nombre de fois qu'on m'a dit que ce que je faisais

n'allait pas fonctionner ! ». Ensuite, Dr Dan Lacroix, qui a toujours été là pour moi et sur

qui j 'a i toujours pu compter. Également, Cindy Perron avec ses doigts de fée et Todd

Galbraith avec ses mains de velours qui ont été d'une aide plus que précieuse pour toutes

mes manipulations. Dr Maud Vallée qui avec une patience et une gentillesse remarquable

m'a pratiquement tout appris sur l'ARN et l'ADN. Dr Caroline Basoni et Valérie Cattan,

deux postdocs en or. En plus d'être sympathiques et très agréables à côtoyer, elles m'ont

éclairé par leurs expériences et leurs connaissances. L'inoubliable Jean-François Oligny,

qui est à l'origine de tout mon savoir-faire avec le montage du banc hémodynamique et des

MFT. Dr Pierre-Luc Tremblay, qui a été pour moi un exemple à suivre et la source de

nombreux conseils. Marie-Christine Fiola, qui en plus d'être une merveilleuse « coloc » a

passé beaucoup de temps avec moi au confocal. Jean Dubé, qui lui aussi a été un exemple à

suivre et une ressource on ne peut plus polyvalente. L'incarnation de la gentillesse.

Kathleen Baker, pour ces efforts de transfert du savoir-faire et du maintien de Tordre dans

le monde des cellules congelées. Karl-Stéphane Rossignol, pour son aide en mécanique des

fluides. Tous les membres du groupe vasculaire et du LOEX qui forment une formidable

équipe. Finalement, Vicky Gagnon qui en plus de m'avoir aidé au confocal est devenue ma

plus grande source de motivation. A vous tous : MERCI !

/ only know îhat I was born and I know that 111 die.

The in between is mine. (Eddie Vedder)

Table des matières Résumé i Abstract ii Avant-Propos iii Table des matières vi Liste des tableaux viii Liste des figures viii Liste des abréviations x Introduction 11

1.1 Système vasculaire 11 1.2 Vaisseaux sanguins 11

1.2.1 Artères 13 1.2.2 Capillaires 14 1.2.3 Veines 15

1.3 Cellules endothéliales 16 1.3.3 Barrière hémato-encéphalique 17 1.3.4 Implication des cellules endothéliales dans les pathologies 20

1.4 Forces hémodynamiques et circulation sanguine 22 1.4.1 Pression transmurale 23 1.4.2 Force de cisaillement 24 1.4.3 Écoulement laminaire et turbulent 26

1.5 Forces hémodynamiques et biologie de l'endothélium 26 1.5.1 Mécanotransduction 28 1.5.2 Expression génique 31 1.5.3 Fonctions des cellules endothéliales 34

1.6 Modèles d'étude des cellules endothéliales 37 1.6.1 Substitut vasculaire construit par génie tissulaire comme modèle d'étude in vitro 38

1.7 Problématique et objectif 42 Matériels et Méthodes 44

2.1 Culture cellulaire 44 2.1.1 HUVEC 44 2.1.2 Fibroblastes 44 2.1.3 Cellules d'astrocytome 45

2.2 Matrice Fibroblastique Tubulaire (MFT) 46 2.3 Banc hémodynamique 47 2.4 Microscopie 49

2.4.1 Contraste de phase 49 2.4.2 Microscopie électronique à balayage 49 2.4.3 Immunofluorescence 50

2.5 Biologie Moléculaire 51 2.5.1 Extraction d'ARN total 51 2.5.2 RT-PCR 52 2.5.3 PCR 52 2.5.4 Séquençage 53

2.5.5 PCR quantitative 53 2.6 Culture en chambre de Boyden 54 2.7 Test de perméabilité transendothéliale 55

Résultats 57 3.1 Morphologie 57 3.2 Expression génique 64 3.3 Barrière hémato-encéphalique 70

Discussion 76 4.1 Réponses des cellules endothéliales au flux hémodynamique 76 4.2 Barrière hématoencéphalique 81

Conclusion 83 Annexe 1 85 Bibliographie 86

Liste des tableaux

Tableau 1. Liste des anticorps utilisés pour immunofluorescence 51

Tableau 2. Liste des amorces utilisées 53

Tableau 3. Résultats du séquençage des produits PCR purifiés 66

Tableau 4. Expression relative des gènes PECAM eNOS, ET-B1. PAI-1. tPA. VECAD

et vWF 66

Liste des figures

Figure 1. Schéma de la circulation sanguine systémique et des types de vaisseaux 12

Figure 2. Schéma de vaisseau sanguin composé des trois couches distinctes 13

Figure 3. Vue microscopique de capillaires sanguins 15

Figure 4. Schéma des forces de pression et de tension 24

Figure 5. Schéma de la force de cisaillement 25

Figure 6. Résumé schématique de la réponse des CE à la force de cisaillement laminaire..28

Figure 7. Étapes de la production d'un équivalent vasculaire humain reconstruit par génie

tissulaire selon la technique d'autoassemblage 39

Figure 8. Vaisseaux sanguin humain reconstruit par génie tissulaire selon la technique

d'autoassemblage 40

Figure 9. Étapes de la production d'une matrice fibroblastique tubulaire (MFT)

endothélialisée 42

Figure 10. Enroulement d'un feuillet de fibroblastes autour d'un mandrin tubulaire 46

Figure 11. Montage d'une MFT pour endothélisation 48

Figure 12. Montage du banc hémodynâmique relié aux pompes péristaltiques 49

Figure 13. Principe de l'immunofluorescence 51

Figure 14. Schéma d'une chambre de Boyden 56

Figure 15. Coupes transversales de MFT 57

Figure 16. Microscopie électronique à balayage d'une MFT sans cellule 59

Figure 17. Microscopie électronique à balayage d'une MFT endothélialisée en condition

statique 59

Figure 18. Microscopie électronique à balayage de MFT endothélialisées 60

Figure 19. Microscopie confocale du marquage immunohistochimique des fibres

d'actine 61

Figure 20. Microscopie confocale du marquage immunohistochimique de VECAD 62

Figure 21. Microscopie confocale du marquage immunohistochimique de PECAM 63

Figure 22. Gel d'agarose des produits de PCR pour différents gènes 65

Figure 23. Graphique de l'expression relative moyenne des gènes PECAM, eNOS,

ET-B1, PAI-1, tPA, VECAD et vWF 67

Figure 24 Graphique des données individuelles de l'expression relative des gènes

PECAM, eNOS, ET-B1, PAI-1, tPA, VECAD et vWF 68

Figure 25. Test de perméabilité transendothéliale au BSA-FITC en chambres de

Boyden 71

Figure 26. Marquage immunohistochimique pour GFAP 73

Figure 27. Marquage immunohistochimique de ZO-1 75

Liste des abréviations

ADNc: Acide Désoxyribonucléique complémentaire

ATCC : American Type Culture Collection

BHE : Barrière Hémato-Encéphalique

BSA: Bovine Sérum Albumin

CE : Cellule Endothéliale

CML : Cellule Musculaire Lisse

ECGS: Endothelial Cell Growth Supplément

eNOS : Endothelial Nitric Oxide Synthase

ET-B : Endothelin Type B Receptor

FC : Force de Cisaillement

FITC: Fluoresceine Iso Thio Cyanate

GFAP: Glial Fibrillary Acidic Protein

HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cell

LOEX: Laboratoire d'Organogénèse Expériementale

MEC : Matrice Extracellulaire

MFT: Matrice Fibroblastique Tubulaire

PAI-1 :Plasminogen Activator Inhibitor

PECAM : Patelet Endothelial Cell Adhésion Molécule

tPA : Tissue Plasminogen Activator

VECAD : Vascular Endothelial Cadherin (VE-Cadherin)

VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor

vWF : Von Willebrand Factor

ZO-1 : Zona Occludens 1

Introduction 1.1 Système vasculaire

L'évolution des organismes unicellulaires vers des organismes pluricellulaires

nécessite d'approvisionner les cellules en nutriments et en oxygène en plus de les

débarrasser des déchets métaboliques. Pour permettre ces échanges entre les cellules et

l'environnement, le système vasculaire a évolué avec l'augmentation en volume des

organismes [1]. Chez les mammifères, le système cardio-vasculaire est tellement développé

que presque toutes les cellules du corps ont accès aux échanges avec le sang. Par exemple,

dans le muscle squelettique, la densité des capillaires sanguins est d'environs 500/mm 2[2.

3] et chez l'humain adulte, mis bout à bout, les vaisseaux sanguins couvrent une distance de

100 000 km [4]. Ceci démontre bien l'étendue et l'importance du système vasculaire. Cette

voie de distribution du sang est essentielle au maintien de l'homéostasie de l'organisme. En

plus de permettre le transport des éléments essentiels tels les gaz et les nutriments, le

système vasculaire est le support de transport des systèmes immunitaire et endocrinien. Il

joue des rôles centraux dans l'osmorégulation et la thermorégulation. Les vaisseaux

sanguins se divisent en trois principales catégories : les artères, les capillaires et les veines.

1.2 Vaisseaux sanguins

Chez les mammifères, la circulation sanguine systémique part du ventricule gauche

d'où le sang oxygéné passe part l'aorte pour ensuite se jeter dans les différentes artères.

Ensuite, le sang emprunte les artérioles de plus petit calibre pour aboutir au réseau

capillaire. C'est à cet endroit que les échanges entre le sang et le milieu interstitiel ont lieu.

Le sang désoxygéné retombe dans des veinules, puis dans les veines et revient finalement

au cœur par les veines caves.

Réseau capillaire

Artérioles Veinules

Figure 1. Schéma de la circulation sanguine systémique et des types de vaisseaux. © Patrick Charron

Les artères et les veines sont composées de trois couches concentriques. En partant du

centre, on retrouve le vide central où circule le sang, soit le lumen (lumière). Directement

en contact avec le sang se trouve l'endothélium (intima). L'endothélium est un épithélium

pavimenteux simple qui tapisse la lumière de tous les vaisseaux sanguins et du muscle

cardiaque (endocarde). Les cellules endothéliales (CE) de l'intima reposent sur une

membrane basale composée de matrice extracellulaire (MEC). La couche centrale, la

média, est formée par des anneaux concentriques de cellules musculaires lisses (CML)

incluses dans une MEC complexe de collagènes, d'élastine, de fibrine et de protéoglycanes

[5]. Cette couche est le principal siège de la régulation de la circulation sanguine par son

pouvoir de vasoconstriction et de vasodilatation. La dernière couche, l'adventice (externa),

est principalement composée de fibres de collagènes provenant de fibroblastes résidants et

d'élastine [5]. L'adventice protège les vaisseaux et les ancres aux tissus environnants.

Lorsque les vaisseaux présentent une épaisseur importante, la diffusion des gaz sanguins

n'est plus suffisante pour atteindre les cellules des couches externes. Dans cette situation,

on retrouve à travers l'adventice des petits vaisseaux, un réseau de capillaires, des

neurofibres et des vaisseaux lymphatiques. Ces petits vaisseaux qui nourrissent l'extérieur

des gros vaisseaux sont appelés vasa-vasorum. Cet agencement en trois couches distinctes

est commun aux artères et aux veines. Cependant, leur composition varie selon le calibre et

la fonction des vaisseaux [1, 4. 6. 7]. Il sera maintenant discuté des principales

caractéristiques des différents types de vaisseaux sanguins.

Figure 2. Schéma de vaisseau sanguin composé des trois couches distinctes. L'intima formée de cellules endothéliales, la média formée de cellules musculaires lisses et de matrice extracellulaire et l'adventice formée de fibroblastes et de matrice extracellulaire. Modifié de Fox, 1990 [8]

1.2.1 Artères

Les artères sont des vaisseaux de gros calibre qui acheminent le sang du cœur vers les

organes. Selon leur fonction et leur calibre, les artères se divisent en trois catégories : les

artères élastiques, les artères musculaires et les artérioles [1, 4, 6].

Les artères élastiques sont les plus grosses artères du corps. Elles se situent à proximité du

cœur, tels l'aorte et ses principales ramifications ainsi que le tronc pulmonaire et ses

ramifications. Ce sont des artères conductrices qui présentent les plus gros calibres et le

plus grand pouvoir élastique. Ce type d'artère produit la plus grande quantité d'élastine

surtout au niveau de la média. Cette abondance d'élastine et l'élasticité qu'elle confère à

ces vaisseaux permettent de supporter les imposantes variations de pression engendrées par

les systoles ventriculaires. Cet étirement de la paroi vasculaire permet l'accumulation

d'énergie issue de la contraction du muscle cardiaque. Le resserrement de la paroi et sont

élasticité font en sorte que ces vaisseaux sont une pompe auxiliaire essentielle à la

circulation sanguine [6]. Elles offrent donc la circulation du sang avec un minimum de

résistance.

Les artères musculaires tiennent leur nom de leur média qui est la plus épaisse de tous les

vaisseaux. Leur média est pourvue d'un grand nombre de CML compris dans une MEC

moins riche en élastine par rapport aux artères élastiques. Ainsi, les artères musculaires ont

une capacité de vasoconstriction plus importante. Elles jouent un rôle de distribution du

sang aux divers organes du corps. Leur diamètre varie de moins de 1 mm jusqu'aux

environs de 1 cm [4].

Les artérioles sont les plus petites artères puisque leur diamètre est inférieur à 0,3 mm [4].

Les plus grosses artérioles possèdent les trois différentes couches vasculaires. mais leur

média est constituée principalement de cellules musculaires lisses et de très peu d'élastine.

Les plus petites ne possèdent qu'une seule couche de cellules musculaires lisses autour de

l'intima. La circulation sanguine dans les lits capillaires est régulée principalement par la

vasoconstriction des artérioles.

1.2.2 Capillaires

Les capillaires sont les plus petits vaisseaux sanguins de l'organisme. Ils sont constitués

seulement de cellules endothéliales et de leur membrane basale. Les capillaires mesurent en

moyenne 1 mm et leur calibre moyen n'est que de 8 à 10 um [6, 9]. Ils sont le siège des

échanges entre le sang et le milieu interstitiel. Mis à part quelques exceptions, on les

retrouve dans toutes les parties du corps [4]. Il existe deux types de capillaires : les

capillaires continus et fenestrés. Les continus sont les plus communs et répandus. Ils sont

appelés continus du fait que leur endothelium recouvre entièrement la lumière du capillaire

et que les cellules endothéliales adjacentes sont jointes par des jonctions adhérentes et

serrées [4, 9]. Cependant, on y retrouve aussi des fentes intercellulaires permettant les

échanges de molécules et de liquides entre le sang et le milieu interstitiel. La présence des

ces fentes est absente au niveau de la barrière hémato-encéphalique qui sera discutée plus

loin. Pour leur part, les capillaires fenestrés présentent certaines cellules endothéliales

munies de pores appelés fenestrations. La présence de ces fenestrations augmente

grandement la perméabilité de l'endothélium. On retrouve donc ce type de capillaires dans

les organes où les échanges sont importants tels que l'intestin grêle, le foie, les glandes

endocrines et les reins [4, 10].

Figure 3 Vue microscopique de capillaires sanguins. A) Photographie d'un capillaire par microscopie électronique à transmission. Le capillaire est formé d'une seule cellule endothéliale entourée de sa membrane basale. B) Photographie d'un capillaire par microscopie électronique à balayage. Modifié de Alberts et al 2002 [9].

1.2.3 Veines

En poursuivant l'itinéraire du sang, l'union des capillaires forme les veinules. Le diamètre

de ces dernières varie entre 8 et 100 u,m. Les plus petites veinules sont composées

simplement d'un endothelium entouré de quelques fibroblastes alors que les plus grosses

présentent les trois couches distinctes de cellules vasculaires. La perméabilité des veinules

est très réactive, c'est pourquoi les cellules de l'immunité utilisent souvent ce type de

vaisseau pour sortir de la circulation [11]. Des veinules, le sang rejoint ensuite les veines.

Tout comme les artères, la première mission des veines est le transport du sang, mais dans

la direction inverse, des organes vers le cœur. Les vaisseaux du système veineux sont

caractérisés par leur grand diamètre interne par rapport aux artères correspondantes. Les

parois des veines sont plus fines et contiennent moins de CML. Elles sont moins élastiques

comparativement aux artères puisqu'elles contiennent plus de fibres de collagènes que de

'Cellule tndotheliak

s Lumen

fibres élastiques. Pour permettre le retour veineux malgré la pression sanguine plus faible

dans les veines, on y retrouve des valvules. Celles-ci empêchent le reflux sanguin dans la

mauvaise direction. On les retrouve majoritairement dans les veines des membres inférieurs

de façon à contrer la force de gravité qui s'exerce sur le sang. Les valvules collaborent à

contrer l'intolérance orthostatique qui consiste à une incapacité à maintenir une posture

debout provoquée par l'accumulation de sang dans les membres inférieurs par la force de

gravité. Cette accumulation peut même aller jusqu'à provoquer la perte de conscience. Ces

caractéristiques des veines permettent au réseau veineux de jouer le rôle de réservoir

sanguin. En effet, chez les mammifères, plus de 50 % du volume total de sang est contenu

dans les veines [6]. Lorsqu'une hémorragie survient, le volume veineux diminue, mais pas

le volume artériel, ce qui contribue à maintenir à un niveau suffisant la pression artérielle et

le débit au niveau des lits capillaires. Cette diminution de volume engendrée par la

vasoconstriction des CML compense la perte de volume sanguin.

1.3 Cellules endothéliales

Maintenant que l'anatomie du système sanguin a été brièvement décrite, il sera

question du type cellulaire central de cet ouvrage : la cellule endothéliale. Les CE dérivent

du mésoderme embryonnaire [9, 12] et recouvrent le système vasculaire en entier. Chez

l'humain, le volume total des CE est comparable à celui du foie [7]. L'endothélium est bien

plus qu'une simple couche de cellules qui tapisse le lumen du système vasculaire. Il

contrôle le passage des substances de part et d'autre de la circulation sanguine et du milieu

interstitiel. Les CE jouent un rôle central dans le développement, le maintien et le

remodelage de la vasculature [13]. Elles participent à la régulation de la circulation

sanguine et au maintien de son homéostasie par la production de plusieurs facteurs et

l'interaction avec les CML [14]. Par exemple, l'expression d'angiotensine II [15, 16],

d'oxyde d'azote (NO) [17], d'endothéline [18] et d'autres prostaglandines affecte le

maintien de la pression sanguine. L'endothélium est également impliqué dans la

conservation de la viscosité normale du sang et de la coagulation, entre autres, par

l'expression des enzymes plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) [19] et de tissue

plasminogen activator (tPA) [20]. Les CE sont également impliquées dans des phénomènes

inflammatoires et immunitaires [11, 21]. Elles participent au contrôle de l'extravasion des

cellules immunitaires par l'expression de molécules d'adhérence comme les sélectines. les

intégrines, des immunoglobulines ainsi que par la production de chimiokines.

Les CE ont une remarquable capacité à s'ajuster aux conditions environnantes. Bien qu'on

les retrouve partout dans l'organisme et qu'elles possèdent des caractéristiques communes,

elles diffèrent selon leurs emplacements, le type de vaisseau et leurs rôles. Cette plasticité

notable des CE entraîne la spécialisation locale du système vasculaire qui doit répondre aux

besoins des différents tissus et organes nécessitant une grande variété de flux et de pression.

Les CE forment donc une population cellulaire hétérogène [10. 22-24]. Elles expriment

différents gènes selon le vaisseau dans lequel elles se trouvent et l'état environnant. Ainsi,

les CE des artères diffèrent des CE des veines et des capillaires. De plus, l'endothélium des

capillaires est spécialisé et diffère selon son origine. Par exemple, les CE micros

vasculaires des reins, du foie ou du cerveau arborent des caractéristiques différentes.

1.3.3 Barrière hémato-encéphalique

Un exemple frappant de cette spécialisation des CE se retrouve au niveau de la micro-

vasculature du système nerveux central. En effet, l'endothélium du cerveau forme une

barrière sélective entre la circulation sanguine et le milieu interstitiel cérébral. Ce

phénotype particulier de l'endothélium est appelé barrière hémato-encéphalique (BHE) [4,

6].

Cette barrière entre la circulation systémique et le milieu interstitiel nerveux est un

phénomène très conservé au cours de l'évolution. Dès l'apparition d'une céphalisation, on

retrouve en parallèle l'évolution d'une séparation des environnements nerveux et

systémiques [6, 25]. Les mécanismes précis qui permettent cette séparation ont divergé au

cours de l'évolution. Néanmoins, la protection du contenu du milieu interstitiel cérébral

demeure universelle chez les animaux dotés d'une céphalisation [26-29]. Les mécanismes à

la base des fonctions nerveuses nécessitent un environnement dont le contenu est stable et

contrôlé. Les neurones sont pourvus de propriétés particulières qui leur permettent de

recevoir et de transmettre de l'information aux autres cellules. D'une part, la polarisation de

la membrane cellulaire via le transport d'ions permet la formation de potentiel d'action. La

composition et la concentration ionique du milieu interstitiel cérébral doivent donc être

stables et propices aux fonctions nerveuses. D'autre part, la communication neuronale par

synapses chimiques utilise des neurotransmetteurs. Ces molécules qui jouent le rôle de

neurotransmetteur dans le système nerveux central se retrouvent également en périphérie et

dans la circulation sanguine où elles accomplissent d'autres fonctions. Le contrôle de la

circulation de ces molécules entre le sang et le milieu interstitiel cérébral devient donc

essentiel pour ne pas interférer avec les fonctions neuronales. Ainsi, la BHE protège le

cerveau des fluctuations ioniques et des substances neuroactives qu'on retrouve dans le

sang [29]. La BHE protège également le cerveau de certaines substances neurotoxiques. En

outre, elle confère le statut de site immunologique privilégié au cerveau en empêchant le

passage des lymphocytes naïfs [11]. Malgré la restriction des échanges entre le sang et le

milieu cérébral, l'endothélium de la BHE transporte les nutriments essentiels et les déchets

métaboliques de part et d'autre de la circulation sanguine.

La BHE se situe directement au niveau des CE des micros vaisseaux cérébraux. On peut la

subdiviser en trois types de barrière : physique, de transport et enzymatique [25, 28].

L'endothélium de la BHE agit en barrière physique grâce à la présence de jonctions serrées

entre les CE adjacentes. Ces jonctions forcent le trafic des molécules par la voie

transcellulaire (au travers les membranes cellulaires) plutôt que par la voie paracellulaire

(entre les CE) comme dans la plupart des endothéliums. Les jonctions serrées de

l'endothélium du cerveau sont plus complexes et réduisent plus efficacement le passage

paracellulaire par rapport aux endothéliums de la périphérie [30-32]. Elles réduisent même

le passage de très petites molécules comme les ions sodium et chlore. Parmi les molécules

qui contribuent de façon importante aux jonctions serrées de la BHE, on retrouve les

protéines transmembranaires de la famille des occludines (3, 5 et 12) et des claudines. Ces

protéines sont souvent liées à des protéines adaptatrices zona occludens (ZO-1, 2 et 3) qui

les relient au cytosquelette [33]. On retrouve également chez les CE de la BHE des

molécules de jonctions adhérentes (JAM-A, B et C) qui sont impliquées dans la formation

et le maintient des jonctions serrées [32]. La partie cytoplasmique de ces protéines

transmembranaires interagit avec une multitude de protéines à la périphérie de la membrane

formant de larges complexes protéiques [34]. Ces complexes interagissent avec différentes

protéines kinases, ce qui engendre l'activation de voies de transduction et de facteurs de

transcription. Les jonctions serrées de la BHE sont donc actives et modulables. La

réduction du passage paracellulaire n'est pas Tunique fonction des jonctions serrées, elles

permettent également une polarisation apicale-basale des CE. Cette propriété est

indispensable pour la barrière de transport de la BHE.

Un système de transport spécifique sur la surface luminale et abluminale régule le trafique

transcellulaire des petites molécules hydrophiles, créant ainsi une barrière de transport

sélective. Ceci permet l'entrée des nutriments requis et l'exclusion des composés

potentiellement dommageables. Les grosses molécules hydrophiles comme les peptides et

les protéines sont généralement exclues sauf lorsqu'elles sont transportées par transcytose

spécifique ou d'absorption. Toutefois, ce type de transport est beaucoup plus rare au niveau

des CE de la BHE [25]. Les CE cérébrales expriment plusieurs transporteurs

transmembranaires. Par exemple, le transporteur du glucose GLUT-1 [35], plusieurs

transporteurs d'acides aminés comme LAT-1 [36], des transporteurs de nucléosides et bien

d'autres. On retrouve également des transporteurs de la famille ABC (ATP Binding

Cassette) [37] qui agissent contre un gradient de concentration, des transporteurs d'efflux

comme P-glycoprotéine [38] et des protéines de la famille MRP (Multidrug Resistance-

related Protein). Finalement, on retrouve aussi des transporteurs dépendant du sodium

(Na +).

Une combinaison d'enzymes intra- et extra-cellulaires forme la barrière métabolique [39].

Par exemple, des peptidases et des nucléotidases sont en mesure de métaboliser des

peptides extracellulaires alors que des enzymes intracellulaires comme la monoamine-

oxydase et le cytochrome P450 peuvent inactiver plusieurs composés neurotoxiques ou

neuroactifs.

Qu'est-ce qui cause cette spécialisation aussi évoluée des vaisseaux sanguins du cerveau ?

Depuis longtemps, les études histologiques ont démontré l'association et l'enroulement très

serré des capillaires avec d'autres types cellulaires incluant des astrocytes, des péricytes,

des cellules microgliales et neuronales [40]. Il y a maintenant beaucoup d'études qui

démontrent que les astrocytes ont la capacité de réguler les caractéristiques de la BHE chez

les CE [41], Des preuves expérimentales soutiennent que la présence des astrocytes est

nécessaire à l'apparition du phénotype de barrière physique [42]. de transport [38] et

métabolique [43] chez les CE. Étant donné l'énorme complexité de la BHE. il n'est pas

surprenant que d'autres types cellulaires jouent un rôle dans son induction. Malgré que les

astrocytes demeurent les principaux inducteurs du phénotype de la BHE, des travaux ont

souligné les contributions d'autres types cellulaires comme les péricytes [44]. les

macrophages périvasculaires [45] et les neurones [46].

Étant donné son implication dans plusieurs pathologies [28. 47-52]. la biologie de la BHE

fait l'objet d'un nombre impressionnant d'études. L'imposante complexité de la BHE

limite les conclusions qu'il est possible de tirer des études in vivo. Dans un contexte in vivo,

il est impossible de contrôler tous facteurs en mesure d'influencer les caractéristiques de la

BHE. A l'opposé, les conditions de culture cellulaire classiques in vitro sont trop loin des

conditions natives. Le développement de modèles in vitro de BHE arborant des

caractéristiques plus physiologiques serait un outil précieux pour ce domaine d'étude [25.

26, 28, 41 , 42, 49, 53, 54]. Il sera question de l'élaboration d'un tel modèle plus loin dans

ce mémoire.

1.3.4 Implication des cellules endothéliales dans les pathologies

Les implications des CE dans la physiopathologie de maladies connues sont multiples. Il

serait impossible d'en dresser une liste exhaustive dans ce travail. En effet, comme les CE

sont présentes dans tous les tissus de l'organisme, leur implication dans le développement

de conditions pathologies n'est pas surprenante. Dans le cadre de cet ouvrage, nous allons

nous concentrer sur seulement deux exemples : l'athérosclérose et le cancer.

L'athérosclérose est une réponse inflammatoire chronique de la paroi vasculaire des artères

et artérioles due principalement à l'accumulation de lipoprotéines telles que les

triglycérides et les LDL (Low Density Lipoprotein) [55]. Cette situation mène à la

formation de multiples plaques athéromateuses formées de LDL oxydées, de cholestérol et

de macrophages, à l'intérieur des parois vasculaires artériels. L'accumulation de plaques

athéromateuses, bien que compensée par un remodelage vasculaire, mène éventuellement à

une sténose artérielle provoquant à son tour un apport sanguin insuffisant aux organes

touchés. De plus, la rupture de plaques provoque la formation de thrombus qui est souvent

à l'origine d'infarctus d'artères coronaires. Un autre effet adverse possible de

l'accumulation de ces plaques est élargissement compensatoire excessif de la paroi

vasculaire menant à un anévrisme. Les CE sont au centre de la physiopathologie de

l'athérosclérose [56]. Dans un premier temps, les CE sont directement en contact avec les

lipoprotéines circulantes et sont le siège de leur absorption. Lorsque les LDL s'accumulent

dans les CE, elles sont oxydées par de complexes réactions biochimiques à l'intérieur des

CE, principalement dues à la présence de radicaux libres. Il en résulte des dommages à

l'endothélium ce qui mène à une réaction inflammatoire des CE [57, 58]. Ces dernières

expriment des facteurs inflammatoires et des cytokines qui recrutent des monocytes

circulant via l'expression de molécules d'adhésion comme VCAM-1 (Vascular Cell

Adhésion Molécule 1). Ces monocytes sortent de la circulation sanguine et se différencient

en macrophages. À la suite de cette extravasation, les macrophages phagocytent les LDL

oxydées et deviennent de grosses cellules remplies de lipides. Ces cellules finissent par

mourir et amplifient la réaction inflammatoire. Malgré toute la recherche consacrée à ce

sujet, les mécanismes moléculaires et cellulaires à l'origine de ce phénomène sont encore

mal connus. Des travaux ont démontré que les localisations susceptibles de développer des

plaques d'athérome coïncident avec les endroits où le flux sanguin présente des

caractéristiques hémodynamiques perturbées ou turbulentes [59-61]. Les forces

hémodynamiques de la circulation sanguine seront discutées plus loin. En somme, les CE

sont directement impliquées dans la physiopathologie de l'athérosclérose.

L'apparition de cancer nécessite inévitablement l'implication des CE. En effet, la

croissance d'une tumeur est limitée par l'augmentation de sa taille qui atteint un point où la

diffusion des gaz et des nutriments est insuffisante. Pour que la croissance tumorale se

poursuive, il doit y avoir un processus d'angiogenèse tumorale pour contrer le manque

d'apport en oxygène et nutriments. Ce phénomène d'angiogenèse est provoqué par

l'expression de facteurs angiogéniques par les cellules cancéreuses tels que VEGF

(Vascular Endothelial Growth Factor) et bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) [62]. Ces

facteurs agissent sur les CE environnantes qui sont à l'origine de la néo-vasculature

tumorale. L'angiogenèse tumorale fait l'objet de nombreuses études puisque l'arrêt de

celle-ci pourrait être un traitement efficace contre le cancer [63]. Un autre niveau

d'implication des CE dans le cancer est l'émergence des métastases. Le processus

métastatique consiste au détachement de cellules cancéreuses de la tumeur primaire,

l'entrée dans la circulation sanguine, l'extravasation de ces cellules dans un site secondaire,

la prolifération dans ce nouveau site et l'induction de néo-vascularisation. Ce processus

implique donc des interactions entre l'endothélium et les cellules cancéreuses circulantes

[64]. Pour permettre l'extravasation des cellules cancéreuses, elles doivent être en mesure

d'adhérer aux CE. Ceci nécessite l'expression de molécules d'adhésion par les CE [65]

telles que e-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1 (Intercellular Adhésion Molécule). Ce

phénomène complexe d'interactions entre les cellules cancéreuses circulantes et

l'endothélium fait aussi l'objet de plusieurs études [66-68].

En somme, l'étude de la biologie des CE est capitale pour la compréhension de pathologies

variées. Nous en décrivons brièvement que deux exemples, mais les champs d'intérêt sont

nombreux. Nous pourrions citer les domaines de la sclérose en plaque [48], de

l'hypertension [14], du diabète [69, 70] et bien d'autres. Tous ces domaines d'études

profitent de différentes expériences in vitro impliquant des CE et bénéficieraient de

modèles d'études in vitro physiologiques.

1.4 Forces hémodynamiques et circulation sanguine

La circulation sanguine engendrée par les contractions du cœur implique la présence

de forces hémodynamiques dans l'ensemble de l'appareil circulatoire. Ces forces

mécaniques issues du mouvement du sang se divisent en deux types : des forces

circonférentielles et tangentielles à la paroi vasculaire, engendrées par la pression sanguine

et des forces longitudinales à la paroi, agissant à l'interface sang-endothélium et issues de

l'écoulement sanguin [6, 7, 14, 23, 71, 72].

1.4.1 Pression transmurale

L'action de pompage du cœur provoque l'écoulement du sang grâce à un gradient de

pression systémique. La contraction des ventricules tente de comprimer le sang qui est

incompressible comme tout liquide. Le sang est alors expulsé des ventricules en suivant un

gradient de pression engendré par les contractions cardiaques. Le sang se déplace donc

d'une zone de haute pression vers une zone de basse pression. Puisque le système

vasculaire est un circuit de conduits fermés, le sang y circule sous pression. Lorsqu'il est

question de pression sanguine, on réfère généralement à la pression transmurale, c'est-à-

dire la différence entre la pression externe et interne qui s'exerce de part et d'autre de la

paroi du vaisseau. La pression transmurale est exprimée en millimètres de mercure (mm

Hg) et la pression systolique (pression maximale au moment de la systole ventriculaire) et

diastolique (pression minimale lors de la diastole) sont donnée dans l'ordre. Par exemple,

chez un humain adulte au repos la pression normale se situe aux environs de 120/80 mm

Hg. Ceci provoque inévitablement des forces mécaniques de pression et de tension au

niveau des parois des vaisseaux. La pression s'exerce perpendiculairement à la paroi du

vaisseau alors que les forces de tension sont parallèles et en circonférence par rapport à la

paroi. L'action de la pression provoque l'étirement et l'augmentation du diamètre des

vaisseaux. Pour équilibrer ces forces et ne pas aboutir à un éclatement de la paroi, les

vaisseaux sont pourvus d'une certaine élasticité et la contraction des CML de la média

empêche la dilatation excessive de la paroi. La pression et les tensions sont donc

compensées par les propriétés de la média et de l'adventice des vaisseaux et c'est

principalement à ces niveaux qu'elles agissent.

Jens

Intima

Membrane Menbrane élastique élastique interne externe

Média Adventice

Figure 4. Schéma des forces de pression et de tension. La pression transmurale est tangentielle à la paroi alors que les forces de tension sont parallèles et circonférentielles. Ces forces agissent surtout au niveau de la média et de l'adventice (en rouge). L'intima est formé de CE. La média est composé de CML et de MEC. L'adventice est composée de fibroblastes et de MEC. © Patrick Charron. LOEX

1.4.2 Force de cisaillement

L'écoulement sanguin engendre aussi des forces parallèles à la paroi vasculaire au niveau

de l'interface sang-endothélium. Cette force produite par la friction issue du déplacement

sanguin est appelée force de cisaillement (FC) ou plus communément dans la littérature,

shear stress.

Intima

Membrane élastique interne

Menbrane élastique externe

Média Adventice

Figure 5. Schéma de la force de cisaillement. L'écoulement laminaire du sang induit des force de cisaillement à l'interface sang-paroi vasculaire. Ces forces sont appliquées directement au niveau de l'endothélium. A gauche, les flèches parralèles représentent le profil d'écoulement laminaire. À droite, la flèche de la force de cisaillement à l'interface sang-endothélium. © Patrick Charron, LOEX

Cette force a pour effet d'entraîner les CE dans la même direction que l'écoulement

sanguin. Les CE doivent donc s'adapter à la présence de cette force pour demeurer en

situation d'équilibre, il sera question plus loin de l'effet des FC sur l'endothélium.

Les valeurs théoriques de la FC sont basées sur la loi de Poiseuille qui décrit l'écoulement

laminaire dans les tubes [73] :

T = 4r| q

nx3

Où T - Force mécanique de cisaillement (dynes/cm2)

n, = Viscosité du milieu (Poises)

q = Flux (cm*s _ 1)

r = Rayon du lumen (cm)

Les variables qui influencent l'importance de la FC sont donc la viscosité du sang, la

vélocité du flux et le diamètre du vaisseau. Étant à la puissance 3, cette dernière variable est

très importante puisque, pour un flux donné, une légère diminution du diamètre vasculaire

entraîne une importante augmentation de la FC. La viscosité du sang des mammifères se

situe entre 3 et 4 [6] par rapport à l'eau qui est de 1, ce qui veut dire que le sang est de 3 à 4

fois plus visqueux que Leau. Le facteur qui influence le plus la viscosité du sang est

rhématocrite. Chez l'homme, en condition physiologique normale, la valeur moyenne de la

FC dans les artères est environ de 10 à 15 dynes/cm2 [74-76] et cette valeur semble

constante le long du circuit artériel [77-79] excepté aux endroits où le flux n'est pas

laminaire. Compte tenu de la nature puisée du flux, on parle de valeur moyenne puisque la

valeur de la FC varie en fonction du cycle cardiaque, elle atteint un maximum à la systole et

un minimum à la diastole.

1.4.3 Écoulement laminaire et turbulent

L'écoulement sanguin normal s'effectue par le déplacement parallèle de lames de liquide

concentriques par rapport à Taxe du vaisseau. La vitesse d'écoulement est minimale au

niveau de la paroi et maximale au centre du vaisseau. Ce profil parabolique des vitesses

d'écoulement est appelé laminaire. Lorsque les déplacements des différentes parties du

liquide ne sont pas parallèles à l'axe, on réfère à un écoulement turbulent. L'écoulement

laminaire pulsatile est caractéristique de la circulation périphérique [6, 7, 72]. L'écoulement

turbulent y est rare bien que possible dans certaine situation comme lorsque la vitesse est

très élevée et au niveau des ramifications où des boucles tourbillonnaires peuvent se former

[6, 7 , 7 1 , 7 2 ] .

1.5 Forces hémodynamiques et biologie de l'endothélium

Les vaisseaux sanguins sont constamment soumis aux forces hémodynamiques sous

forme de tension et de forces de cisaillement. Toute variation de ces contraintes mécaniques

est perçue au niveau des cellules vasculaires et se traduit par des modifications

fonctionnelles et structurales [14, 23, 71. 80, 81], La pression sanguine, qui est à l'origine

des forces de tension, affecte tous les types cellulaires du vaisseau. Parallèlement, les FC

agissent à l'interface sang-paroi vasculaire et affectent principalement l'endothélium [23].

Bien que la pression soit un important stimulus des vaisseaux, ce travail se concentre sur

les effets des FC sur F endothelium.

Tel que mentionné précédemment, la contrainte de cisaillement soumise à l'endothélium

artériel est relativement constante aux environs de 10-15 dynes/cm2. Cette constance est

assurée par des mécanismes humoraux autocrines et paracrines qui permettent au système

vasculaire de s'ajuster aux modifications hémodynamiques [6. 7. 15. 76]. Les changements

locaux des forces hémodynamiques induisent des transformations de la paroi du vaisseau

de manière à s'ajuster aux nouvelles conditions et de rétablir un climat physiologique de

tension et de FC. Par exemple, lorsque le flux augmente, les CE produisent de l'oxyde

d'azote (NO) [17, 82]. Ceci induit le relâchement des CML de la média et du même coup

l'augmentation du diamètre du vaisseau, rétablissant du même coup les valeurs des forces

hémodynamiques. Toutefois, lorsque les variations du tonus vasomoteur sont insuffisantes

pour compenser les modifications des contraintes mécaniques, les vaisseaux s'adaptent à

leur nouvel environnement hémodynamique en ajustant leur calibre et la structure de leur

paroi pour équilibrer les FC imposées à la surface endothéliale [23, 80, 83-85]. La présence

des FC à la surface endothéliale est un stimulus primordial pour les CE. Ces forces agissent

sur toutes les facettes de la biologie cellulaire des CE [80, 83, 86, 87]. La réponse des CE

aux FC est complexe et implique une multitude de phénomènes cellulaires et moléculaires.

Force de cisaillement

Intégrines

Canaux ioniques

Protéines G

Récepteurs membranaires

M e m b r a n e lipidique

G l y c o c a l i x

Transduction : F A K N O Akt

M A P K

Facteurs de trancription

Expression génique

Propriétés mécaniques

Alignement

Perméabilité

Migration

Prolifération

Apoptose

Figure 6. Résumé schématique de la réponse des CE à la force de cisaillement laminaire. Des mécanismes moléculaires sensibles au flux activent des voies de transduction ce qui mènent à la modulation de l'expression génique. La FC est un stimulus complexe qui module plusieurs facettes de l'activité des CE. © Patrick Charron, LOEX.

1.5.1 Mécanotransduction

Pratiquement tous les organismes vivants sont sensibles aux forces mécaniques. Mais

comment une force mécanique provoque-t-elle une réponse biologique ? Les cellules sont

munies de système mécanosensibles permettant de transformer une force physique en

information biochimique. Ce phénomène appelé mécanotranduction est essentiel au

développement des organes et à plusieurs processus physiologiques [88]. Outre le système

vasculaire, la mécanotransduction est impliquée dans la modulation de processus

physiologiques des systèmes pulmonaire, otique, osseux, tégumentaire, sensitif et est

nécessaire au contrôle du cycle cellulaire [89, 90]. Généralement, la mécanotransduction est

occasionnée par des changements de conformation de protéines qui activent ensuite

différents sentiers de transduction de signaux intracellulaires.

Plusieurs mécanismes de mécanotransduction impliqués dans la réponse des CE aux FC

sont suggérés dans la littérature [23, 80, 83, 86, 88, 91-93]. Dans le cadre de ce mémoire,

seulement une brève description des plus communes sera présentée.

Intégrines :

Les intégrines sont une famille de plus de 20 hétérodimères transmembranaires composés

d'une sous unité a et p [9. 94]. Le domaine extracellulaire des intégrines se lie à des

domaines spécifiques des composants de la MEC tels que la fibronectine. la vitronectine et

le collagène. Le domaine intracellulaire des intégrines interagit avec des molécules de

signalisation aux sites d'adhésions focaux. Par exemple, les kinases FAK (Focal Adhésion

Kinase), c-Src et des protéines du cytosquelette telles que a-actinine et taline. Lorsque les

CE sont exposées aux FC, les intégrines sont activées et cette activation est très importante

pour les fonctions endothéliales [81, 95]. De plus, la présence et la nature du ligand des

intégrines (MEC) joue aussi un important rôle dans la réponse des CE aux FC [96].

Canaux ioniques :

Des travaux ont démontré que les FC entraînent une hyperpolarisation des CE en culture

via l'activation des canaux potassiques [97]. Ceci entraîne une augmentation de l'entrée du

Ca 2 + ce qui à son tour régule plusieurs voies de signalisation et des fonctions des CE [98].

Bien que les mécanismes précis par lesquels les FC provoquent l'ouverture de ces canaux

ne sont pas connus, il ait tout de même établi que les canaux ioniques jouent un rôle

significatif dans la conversion des FC en signaux biochimiques.

Protéines G :

Plusieurs études ont démontré l'activation directe de certaines protéines G par les FC chez

les CE en plus de certains récepteurs couplés aux protéines G [99]. Cette activation

déclenche plusieurs autres voies de transduction en aval.

Récepteur de type tyrosinc kinase

Lors de l'exposition au flux des CE, le récepteur de type tyrosine kinase (RTK) au VEGF.

Flk-1, est phosphorylé et s'associe avec la protéine adaptatrice Shc et certaines intégrines

[100]. Ceci semble être inhérent à l'activation de la voie des ERK (Extracellular Regulated

Kinases) et JNK (c-Jun N-terminal Kinases) ainsi que du PI3K (Phosphoinositide 3-

Kinase).

Membrane lipidique :

Lorsque les CE sont exposées au flux, la FC a pour effet d'augmenter la fluidité de la

double couche de phospholipides de la membrane cellulaire [101]. Cette modulation de la

fluidité de la bicouche lipidique semble être un autre moyen de ressentir les FC puisqu'une

augmentation de la fluidité est couplée à l'activation des MAPK [102].

Glycocalix :

Les CE sont recouvertes du côté luminal par un mince réseau de protéoglycanes. de

glycosaminoglycanes (GAG) et de protéines plasmatiques [103]. Ce réseau, appelé

glycocalix, semble jouer un rôle fondamental dans la mécanotransduction des FC [91. 104].

puisque lorsque le glycocalix est altéré, la réponse des CE aux FC est déficiente.

Bien qu'il s'agisse des mécanismes les plus communs de mécanotransduction des FC chez

les CE, d'autres mécanismes sont aussi suspectés de jouer un rôle, notamment,

l'implication de PECAM (Patelet Endothelial Cell Adhésion Molécule) [105, 106] et des

radicaux libres oxygénés (ROS) [107]. Cela dit, il est évident qu'il existe plusieurs

mécanismes moléculaires permettant aux CE de ressentir les forces hémodynamiques. Ces

mécanismes interagissent entre eux et permettent une réponse très finement régulée des CE

aux FC. Les études portant sur les CE en relation avec les FC ont souligné que les

mécanismes de mécanotransduction sont en mesure d'activer plusieurs voies de

signalisation intracellulaires, entre autres les voies de PKC (Protein Kinase C) [108], la

famille Rho [109], PI3K [110] et les MAPK [92]. En plus de moduler plusieurs processus

cellulaires, l'activation de ces voies régule l'expression génique [23, 100, 111-114]. Par

exemple, les FC activent le facteur de transcription N F - K B (Nuclear Factor-kappa B ) [95.

115] qui contrôle un large éventail de gènes [9, 94], particulièrement les gènes impliqués

dans les processus d'inflammation et de la réponse immunitaire. Ainsi, les FC mènent à

l'activation et la propagation de signaux intracellulaires à travers un réseau complexe de

transduction ce qui module l'activité cellulaire et l'expression génique des CE. Ceci fait en

sorte que les FC modulent de façon importante l'activité des CE.

1.5.2 Expression génique

Le profil d'expression génique des CE varie selon l'environnement hémodynamique. En

effet, la présence d'un flux laminaire augmente ou diminue l'expression de plusieurs gènes.

Les changements d'expression sont nombreux et affectent des gènes qui codent pour

différent types de protéines impliquées dans la physiologie des CE. On y retrouve, entre

autres, des facteurs de croissance, des molécules d'adhésion, des substances vasomotrices.

des facteurs impliqués dans la coagulation et beaucoup d'autres types. L'évolution des

micros puces à ADN (DNA microarray) a permis d'évaluer le profil d'expression génique

in vitro des CE dans différente condition de flux hémodynamique [100, 111, 112, 114]. Le

profil d'expression génique des CE en condition de flux diffère de celui qui est en condition

statique, mais on remarque également des différences selon le temps d'exposition au flux et

selon la nature du flux, c'est-à-dire laminaire ou turbulent et puisé ou continu [116, 117].

La présence de FC physiologique induit l'expression de gènes nécessaires au maintien de

l'homéostasie des CE et des vaisseaux sanguins. Il est impossible de survoler tous les gènes

dont l'expression est influencée par les FC. Néanmoins, nous présentons une brève

description de gènes impliqués dans la physiologie endothéliale et étudiés dans le cadre de

ce travail.

PECAM

Aussi connu sous le nom de CD-31, PECAM est une glycoprotéine exprimée dans les CE,

les plaquettes et les leucocytes. Elle est souvent utilisée comme marqueur endothelial.

PECAM a des fonctions d'adhésion cellulaire et de signalisation. On la retrouve aux sites

des jonctions entre les CE avoisinantes et confluentes. Elle joue un important rôle dans les

interactions entre les CE et les éléments circulants du sang, notamment dans l'agrégation et

l'extravasation des leucocytes [9, 11, 94]. L'influence de l'exposition des CE à un flux

physiologique sur le niveau d'expression du gène de PECAM semble différer selon les

études [111, 114. 116, 118-120]. Toutefois, la tendance penche vers une diminution de

l'expression.

VECAD

VECAD est aussi une protéine d'adhésion cellulaire qui est également un marqueur

endothelial commun étant donné sa spécificité aux CE. Elle fait partie de la super famille

des cadhérines qui sont des protéines d'adhésion cellule-cellule dépendantes du calcium

[121]. On la retrouve aux jonctions d'adhésion cellulaire et son côté cytoplasmique peut se

lier avec plusieurs partenaires comme des caténies et des desmoplaquines qui permettent de

faire un lien avec les microfilaments d'actine et les filaments intermédiaires. VECAD joue

un rôle indispensable à la vasculogenèse, au remodelage vasculaire et est impliquée dans la

régulation de la perméabilité endothéliale. Elle fait aussi partie du même complexe

protéique mécano sensible que PECAM [106]. Encore une fois, l'influence des FC sur le

niveau d'expression du gène de VECAD diffère dans la littérature. Les résultats changent

dépendamment du substrat sur lequel les CE sont ensemencées [118], la nature du flux et le

type de CE [100, 111, 119].

vWF

Le facteur de Von Willebrand est une glycoprotéine plasmatique synthétisée de façon

constitutive par les CE. Bien qu'il ne soit pas spécifiquement produit par les CE, vWF est

aussi utilisé comme marqueur endothelial. vWF a des fonctions primordiales pour les

processus de coagulation. Sa fonction principale consiste à la liaison d'autres protéines

impliquées dans le mécanisme de coagulation. Sous sa forme active, le vWF est un gros

polymère formé de plusieurs monomères. Chaque monomère possède plusieurs domaines

spécifiques permettant l'interaction avec d'autres protéines comme le facteur VIII, le

récepteur des plaquettes gplb, l'héparine, le collagène et des intégrines. Ces interactions

sont nécessaires au déroulement normal de la coagulation sanguine. Les FC semble

diminuer l'expression du gène du vWF, mais encore une fois, les résultats ne sont pas

constants d'une étude à l'autre [100, 111, 118. 119, 122. 123].

tPA

Le gène du tPA code pour une protéase qui a comme principale cible la proenzyme

plasminogène. ce qui conduit à sa conversion en plasmine. Cette dernière dégrade plusieurs

protéines sanguines, notamment les caillots de fibrine [124]. Le tPA est donc une enzyme

antithrombotique qui est produite par l'endothélium. En plus de son rôle dans la fibrinolyse,

elle est impliquée dans la migration cellulaire et le remodelage vasculaire. L'imposition de

FC aux CE produit une élévation de l'expression du gène du tPA [100, 125. 126].

PAI-1

PAI-1 est le principal inhibiteur des activateurs du plasminogène tPA et urokinase. Il est

donc un inhibiteur de protéases à activité pro thrombotique [127]. Il est sécrété

principalement par les CE mais il peut aussi être exprimé dans le tissu adipeux. L'influence

des FC sur l'expression du gène PAI-1 est encore une fois mitigée. Certaines études

montrent une augmentation [114, 116] alors que d'autres indiquent une diminution de

l'expression [128].

eNOS

eNOS est une enzyme exprimée constitutivement par les CE dont l'activité produit de

l'oxyde d'azote (NO) à partir de L-arginine en présence d'oxygène et de NADPH

(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate). eNOS joue un rôle majeur dans

l'homéostasie cardiovasculaire [129]. Elle est impliquée dans la régulation de la pression

sanguine, fangiogenèse et le remodelage vasculaire. L'influence positive du flux sanguin et

des FC sur l'activité d'eNOS et la production de NO est bien connue [82]. Néanmoins, le

rôle des FC dans l'expression du gène d'eNOS est moins clair [111, 125], même si certains

travaux ont observé une augmentation de l'expression de l'ARNm d'eNOS lorsque les CE

sont exposées aux FC [129-131].

ET-B

Chez les mammifères, il existe trois isoformes d'endothéline : ET-1. ET-2 et ET-3. Les

récepteurs membranaires qui transmettent leurs effets sont divisés en deux types : ET A et

E T B [132]. Les endothélines. principalement produites par les CE. sont de puissants

vasoconstricteurs. Les interactions entre les types d'endothéline et leurs récepteurs sont au

cœur de la régulation du tonus vasculaire [133]. Les récepteurs des endothélines sont

présents chez plusieurs types cellulaires, notamment les fibroblastes, les cellules

musculaires lisses vasculaires et les CE. Bien qu'on retrouve aussi les récepteurs des

endothélines dans le cœur, les reins et les poumons, il sera discuté seulement de leurs

actions dans les vaisseaux sanguins. Lorsque le récepteur se lie à l'endothéline. il peut

activer plusieurs types de protéine G qui à leur tour activent la voie de la phospholipase C

(PLC). L'effet de la liaison des endothélines au récepteur ET-B diffère selon le type

cellulaire. Chez les CML, elle provoque la vasoconstriction alors que chez les CE, elle

induit la production de NO qui a des effets vasodilatateurs. Malgré que des études aient

démontré l'influence des FC sur l'augmentation de l'expression du gène de l'endothéline-1

(ET-1), elles ne semblent pas avoir d'effet sur l'expression du gène du récepteur de type B

(ET-B) [100, 111, 114]. Cependant, une étude a démontré une augmentation de

l'expression du gène de ET-B avec des HUVEC exposées pendant 24 heures aux FC [134].

1.5.3 Fonctions des cellules endothéliales

Nous avons vu que les FC ont l'habileté de déclencher des signaux de transduction et de

modifier l'expression génique chez les CE. Par conséquent, la présence des FC dans

l'environnement des CE influence plusieurs facettes de leur physiologie. Nous présentons

une brève description de l'effet des FC sur la morphologie, la prolifération, la migration et

la perméabilité des CE.

Morphologie

L'effet le plus facilement observable des FC sur 1"endothelium est sans contre dit le

changement de morphologie des CE. En condition de culture traditionnelle, c'est-à-dire

dans un environnement hémodynamique statique, les CE ont une allure polygonale

communément appelée cobblestone. Lorsque que les contraintes de cisaillement sont

présentes, la morphologie des CE se transforme, passant de la forme polygonale à une

forme allongée dans l'axe [135]. Les CE s'allongent de façon parallèle à la direction du

flux. Cette morphologie correspond à celle qu'on retrouve in vivo. Ce changement de

morphologie est également observable au niveau des éléments du cytosquelette [81. 136].

En plus de l'allongement cellulaire, on observe la formation de microfilaments et de fibres

de stress parallèles au flux [137]. Ce phénomène de remodelage s'applique également aux

microtubules et aux filaments intermédiaires [138]. Au début de l'exposition au flux, durant

environ les trois premières heures, on observe le changement de morphologie, le

remodelage du cytosquelette et aussi un démembrement des jonctions cellulaires adhérentes

[139] et serrées [140]. Après une période d'ajustement (12 à 24 h), les CE ont formé un

dense réseau d'épaisses fibres de stress et rétablissent les jonctions cellulaires qui co

localisent avec les fibres de stress d'actine. D'un point de vue physique, ce remodelage de

la morphologie cellulaire est très important pour le maintien de l'équilibre des forces

mécaniques [141] et de l'homéostasie.

Prolifération et migration

Plusieurs études ont démontré que les FC influencent le cycle cellulaire et le taux de

renouvellement de l'endothélium [142, 143]. Un flux laminaire puisé ou continu réduit le

taux de prolifération des CE par rapport aux conditions statiques alors qu'un flux turbulent

en provoque l'augmentation. Sous un régime laminaire, on observe un nombre réduit de

cellules qui entre dans le cycle cellulaire et une majorité de cellules arrêtées en phase GO ou

Gl [144]. L'activation de la protéine p53 ainsi que la protéine du rétinoblastome (Rb) sont

impliquées dans cet arrêt du cycle cellulaire. En plus de diminuer le taux de prolifération

des CE, les FC physiologiques exercent un effet de suppression de l'apoptose via une

multitude de mécanismes [145-147]. L'addition de la diminution de la prolifération et de la

suppression de l'apoptose contribue grandement au maintien de l'intégrité de l'endothélium

par les FC.

Dans le même ordre d'idées, les FC influencent aussi la migration des CE. Sous un flux

laminaire, la migration est largement favorisée par rapport aux conditions statiques et

turbulentes [148-150]. Bien que plusieurs mécanismes soient impliqués dans cette

augmentation de la motilité. on peut souligner l'importance de l'augmentation des

interactions cellule-MEC et de la signalisation engendrée par la voie des FAK (Focal

Adhésion Kinase) [151, 152]. Dans un contexte de réparation de blessures et de remodelage

de la paroi vasculaire. la présence de FC constitue un stimulus important pour la migration

des CE.

Perméabilité

En temps normal, le passage des macromolécules est restreint par les jonctions

intercellulaires des CE. Lorsque les cellules entrent en mitose et se divisent, ces jonctions

sont altérées et mènent à l'augmentation de la perméabilité de Fendothélium [153]. Étant

donné que les FC provoquent la diminution du taux de division des CE, elles induisent du

même coup la diminution de la perméabilité. Des études ont lié avec une forte corrélation le

renouvellement des CE et le passage transendothélial de macromolécules [100. 144. 154].

Plusieurs études in vivo ont également associé les zones de flux turbulent aux zones de plus

grande perméabilité endothéliale [155]. Cette modulation de la perméabilité par les FC doit

être prise en compte leur d'études in vitro de la perméabilité endothéliale, notamment les

études de la biologie de la BHE [156-158].

Nous avons survolé quelques phénomènes physiologiques influencés par les FC, mais cette

revue n'est pas exhaustive. D'autres mécanismes sont aussi modulés par les forces

hémodynamiques tels que le métabolisme [159] et l'organogenèse du système

cardiovasculaire [160]. Néanmoins, il est indéniable que la présence des FC joue un rôle

prépondérant dans la physiologie vasculaire et endothéliale. Cette importance de l'impact

des FC sur le phénotype des CE doit donc être prise en compte lors des études in vitro de la

biologie endothéliale.

1.6 Modèles d'étude des cellules endothéliales

Dans un contexte de recherche portant sur la biologie cellulaire, l'expérimentation

in vivo est souhaitable, voire indispensable. Cependant, dans certains cas. ce type

d'expérimentation est souvent très complexe, voire même impossible, comme dans le cadre

de la recherche sur les interactions entre les forces hémodynamiques et l'endothélium. En

effet, la circulation sanguine est peu accessible à l'expérimentation et la quantification

précise des forces hémodynamiques in vivo reste particulièrement difficile. De plus, les

procédures d'expérimentation sur la circulation entraînent des conditions d'hypoxie et

d'hyponutrition qui rendent ardues les analyses phénotypiques. Dans cette optique,

l'expérimentation in vitro constitue un excellent substitut.

La plupart des études in vitro impliquant des CE utilisent des techniques de culture

cellulaire classique dans un environnement hémodynamique statique. La simplicité de ces

méthodes est certes un avantage. Toutefois l'interprétation et l'extrapolation des résultats

doivent tenir compte de cet environnement physique moins physiologique. Le domaine de

la biologie vasculaire exploite beaucoup l'étude de l'influence des forces hémodynamiques

sur la physiologie des différents types cellulaires vasculaires. ce qui permet une meilleure

compréhension de leur fonctionnement. Les travaux portant sur les CE en condition

dynamique sont nombreux. Bien qu'il s'agisse d'un pas vers un environnement plus

physiologique, il n'en demeure pas moins que les modèles in vitro utilisés sont souvent

encore loin des conditions in vivo. Effectivement, la majorité des études en condition

dynamique utilisent des chambres à flux laminaires qui exposent des monocouches de CE

en deux dimensions sur une surface recouverte de protéines permettant l'adhésion des

cellules comme la gélatine ou la fibronectine. Comparativement, in vivo, les CE sont dans

un environnement tridimensionnel composé d'une MEC complexe accompagnée d'autres

types cellulaires (CML et fibroblastes). L'utilisation du génie tissulaire pour développer des

modèles d'études in vitro possédant des caractéristiques physiologiques se rapprochant des

conditions in vivo est un outil particulièrement intéressant pour la biologie vasculaire [161-

163]. Dans le cadre de cet ouvrage, nous utilisons un tel modèle.

1.6.1 Substitut vasculaire construit par génie tissulaire comme modèle d'étude in vitro

Le laboratoire d'organogénèse expérimentale (LOEX) a développé une technique de

fabrication par génie tissulaire d'un substitut vasculaire complètement biologique [164]. La

technique de construction de ces vaisseaux reconstruits est appelée l'autoassemblage et elle

sera exposée en détail au chapitre matériel et méthodes. Le but ultime de cette méthode est

l'application clinique. Cependant, elle permet également la production de modèles d'études

in vitro élaborés et par conséquent plus près des conditions physiologiques in vivo. Ils sont

composés de MEC endogène sans aucun biomatériau artificiel, ils sont tridimensionnels et

formés des trois tuniques cellulaires présentes dans les vaisseaux sanguins : intima, média

et adventice. En plus de l'histologie homologue aux réalités in vivo [164, 165], ces

vaisseaux reconstruits possèdent également des propriétés mécaniques similaires aux

vaisseaux natifs, notamment pour la résistance à l'éclatement et la vasomotricité [164, 166-

168]. Ces caractéristiques de notre modèle en font un excellent outil pour des études de la

biologie vasculaire, notamment en environnement hémodynamique. Relativement aux

vaisseaux natifs humains isolés, les vaisseaux reconstruits par autoassemblage sont plus

facilement accessibles et plusieurs exemplaires peuvent être produits à partir des cellules

d'un même individu, réduisant ainsi la variabilité des résultats. D'une part, ils offrent

certains des avantages de la culture cellulaire comme l'accessibilité, la reproductibilité et

des enjeux éthiques plus simples. D'autre part, ils offrent également certains avantages des

vaisseaux ex vivo en étant plus près physiologiquement du tissu d'origine, d'un point de

vue cellulaire et fonctionnel.

Science et vie. no 9 7 3 , 1 9 9 8

Figure 7. Étapes de la production d'un équivalent vasculaire humain reconstruit par génie tissulaire selon la technique d'autoassemblage. SMC : Smooth Musle Cell = Cellule Musculaire Lisse. EC : Endothelial Cell = Cellule Endothéliale.

Figure 8. Vaisseau sanguin humain reconstruit par génie tissulaire selon la technique d'autoassemblage.

A) Vue macroscopique du vaisseau. Diamètre interne de 3 mm. B) Coupe histologique transversale de la paroi vasculaire colorée au trichrome de Masson : le collagène apparaît en bleu et les cellules en violet. C) Immunofluorescence de l'endothélium vu de face : Le vert intracellulaire révèle la viabilité, l'activité métabolique et le degré de confluence des cellules. Le rouge confirme la viabilité et la nature endothéliales des cellules. Le bleu met en évidence la présence de vWF. D) Coupe à congélation d'une section transversale de la jonction média-adventice (flèches) marquant en rouge la desmine. Les noyaux sont marqués en bleu. E) Coupe à congélation d'une section transversale de l'adventice mettant en évidence félastine en vert et la vimentine en rouge. D'après L'Heureux et al. 1998 [164]

À partir de la technique d'autoassemblage de vaisseaux reconstruits, notre laboratoire a

développé un modèle simplifié pour l'étude spécifique de fendothélium. Brièvement, la

production de MEC par des fibroblastes est stimulée par l'ajout d'acide ascorbique au

milieu de culture. Les fibroblastes synthétisent et organisent les protéines de la MEC de

façon à former un feuillet de cellules vivantes entourées de MEC. Après environ trois

semaines de maturation, les feuillets présentent une solidité suffisante pour être manipulés

et enroulés autour d'un mandrin tubulaire pour obtenir une adventice reconstruite. Ensuite,

les fibroblastes vivants sont éliminés par déshydratation pour obtenir une MEC

fibroblastique acellularisée tubulaire (MFT). Le support tubulaire est par la suite retiré afin

d'injecter les CE dans la lumière de la MFT. La MEC sécrétée par les fibroblastes fournie

la résistance mécanique nécessaire pour exposer les CE à un flux hémodynamique puisé à

des valeurs physiologiques. Cette version de substitut vasculaire construit par génie

tissulaire (MFT) est simplifiée du fait que la média et les fibroblastes de l'adventice sont

absents. En plus d'être plus simple techniquement, la MFT nous permet d'étudier

spécifiquement l'endothélium sans l'intervention des autres types cellulaires. Il est donc

possible d'extraire les protéines et l'ARN des CE en étant assuré de ne pas avoir de

contaminations des autres types cellulaires (CML et fibroblastes). En somme, la MFT est

un environnement tridimensionnel tubulaire composé de MEC endogène qui nous permet

d'étudier l'endothélium en condition de flux hémodynamique. Dans le cadre de ces

travaux, nous avons utilisé la MFT pour l'étude de l'endothélium en condition de flux

hémodynamique.

Figure 9. Étapes de la production d'une matrice fibroblastique tubulaire (MFT) endothélialisée. © Danielle Larouche, Patrick Charron. LOEX

1.7 Problématique et objectif

Bien plus qu'une simple couche de cellules pavimenteuses qui tapisse l'intérieur des

vaisseaux sanguins, l'endothélium est une composante centrale du système circulatoire.

Les CE sont impliquées dans une multitude de processus physiologiques allant de la

régulation de la circulation sanguine au contrôle de l'extravasation des cellules de

l'immunité. Étant donné cette grande implication dans divers processus biologiques, il

n'est pas surprenant que les CE soient présentes dans une panoplie de travaux de recherche

de tous les domaines. Cependant, les études impliquant les CE se font majoritairement

dans des conditions in vitro excluant une importante caractéristique de l'environnement

physique in vivo : les forces hémodynamiques. Nous avons vu dans l'introduction de cet

ouvrage que les forces hémodynamiques constituent d'importants stimuli pour les

fonctions endothéliales. L'étude des CE dans un environnement soustrait de ces stimuli

n'est donc pas idéal puisqu'il n'est pas fidèle aux conditions in vivo. Pour plusieurs

domaines d'études, il est déjà bien établi que la présence de ces forces change la réponse

des CE. La présence de ces forces est significative non seulement pour l'étude des CE par

rapport aux forces hémodynamiques mais aussi pour les domaines de l'artériosclérose, du

remodelage vasculaire [169, 170], de l'angiogenèse [171], de la pression artérielle [172],

des prothèses vasculaires artificielles [118, 173], du génie tissulaire [161. 163. 165]. du

cancer [65, 174], de la BHE [157, 158, 175] et bien d'autres champs d'étude impliquant les

CE. Etant donné que l'étude des CE humaines in vivo ou ex vivo est très complexe, tous

ces domaines de recherche bénéficieraient d'un modèle d'étude in vitro permettant l'étude

des CE dans un environnement plus physiologique. Nous supposons que notre modèle de

la MFT répond bien à cette problématique puisqu'il permet d'exposer les CE à un flux

hémodynamique sur une MEC endogène tridimensionnelle.

Objectif

Notre objectif principal est d'évaluer la réponse des CE ensemencées dans notre modèle de

la MFT, à suite d'une exposition de 4 heures à un flux hémodynamique physiologique. La

réponse a été évalué d'une part par la morphologie des CE analysée par microscopie.

d'autre part, par les changements du niveau d'expression de gènes impliqués dans la

biologie des CE. Nous avons comparé le niveau d'expression des gènes CD-31. VECAD.

vWF, tPA, PAI-1, eNOS et ET-B par PCR quantitative pour des conditions statiques et

avec flux hémodynamique.

Comme il a été démontré que la présence d'un flux hémodynamique permet de conserver

plus longtemps le phénotype de BHE chez les CE microvasculaires cérébrales in vitro [25,

156, 158, 175], nous croyons que notre modèle de la MFT pourrait être la base d'un

modèle in vitro innovateur de BHE construit par génie tissulaire. Notre objectif secondaire

est donc d'évaluer la possibilité de diminuer la perméabilité transendothéliale in vitro

d'HUVEC (Human Umbilical Vein Endithelial Cell) cultivées dans un milieu conditionné

d'astrocytome. L'utilisation des HUVEC plutôt que des CE cérébrales pour les étapes

préliminaires de développement d'un modèle in vitro de BHE s'explique par leur facilité

d'obtention et d'utilisation en culture. Dans le même ordre d'idées, les cellules

d'astrocytome sont aussi beaucoup plus accessibles et propices à la culture in vitro par

rapport aux cultures primaires d'astrocytes humains. Comme il a été rapporté dans la

littérature qu'il est possible de diminuer la perméabilité d'HUVEC [98, 144, 176, 177] par

l'influence de facteurs astrocytaires [25, 41 , 43, 178], nous voulons déterminer s'il est

possible de diminuer la perméabilité des HUVEC via l'exposition à du milieu conditionné

d'astrocytome humain. La perméabilité des HUVEC a été mesurée à l'aide de chambres de

Boyden et d'un marqueur moléculaire conjugué à un fluorochrome.

Matériels et Méthodes

2.1 Culture cellulaire

2.1.1 HUVEC

L'extraction des CE de veine de cordon ombilical humaine (HUVEC) a été effectuée tel

que décrit précédemment [164]. Brièvement, des cordons ombilicaux obtenus de nouveau

nés en bonne santé ont été conservés dans du milieu de transport à 4°C moins de 12 heures.

La veine a été canulée. à chaque extrémité pour y faire circuler du tampon HEPES (ICN

Biomedicals, Saint-Laurent, Québec. Canada) sans calcium à 10 mmol/L HEPES, 119

mmol/L NaCl, 6,7 mmol/L KC1 et à pH 7.35. Une solution de thermolysine 0.250 mg/mL

(Sigma, Oakville, On, Canada) à 37°C a ensuite été injectée pour rincer et remplir la veine.

Après une période d'incubation de 30 minutes à 37°C, la veine a été perfusée avec du

milieu de culture et les HUVEC ont été cultivé dans du M199 (Sigma. Oakville. ON,

Canada) contenant 20 % de sérum de veau fœtal (FBS, Hyclone, Logan, UT. USA). 20

fig/mL d'ECGS (Endothelial Cell Growth Supplément) (Sigma, Oakville, ON, Canada),

2,28 mM de glutamine (Invitrogen), 40 U/mL d'héparine (Léo Laboratories, Pickering.

Canada) 100 U/mL de pénicilline G (Sigma Oakville, ON, Canada) et 25 ug/mL de

gentamicine (Schering, Pointe-Claire, QC, Canada). Les HUVEC étaient utilisées à leur

cinquième passage dans les MFT. Les cellules ont été obtenues conformément à

l'approbation du comité éthique de l'Université Laval.

2.1.2 Fibroblastes

L'extraction des fibroblastes humains a été effectuée à partir d'un morceau de peau

provenant d'une réduction mammaire, tel que décrit précédemment [179]. Brièvement, les

morceaux de peau ont été incubés 3 h à 37°C dans une solution de thermolysine (Sigma,

Oakville, ON, Canada) à une concentration de 500 |ag/ml dans de l'HEPES (ICN

Biomedicals, Saint-Laurent, QC, Canada). L'épiderme a ensuite été séparé mécaniquement

du derme à l'aide de pinces. Le derme a été incubé 16 h à 37°C dans 0.125 U/ml de

collagénase H (Boehringer Mannheim. Laval, QC, Canada) pour récupérer les fibroblastes.

Les fibroblastes humains ont été cultivés dans du milieu DME complet, soit du Dulbecco-

Vogt modification of Eagle 's médium (DMEM; Gibco. Burlington, ON, Canada) contenant

10% de sérum de veau fœtal (SVF; H>clone. Logan. UT, USA). 100 U/ml de pénicilline G

(Sigma) et 25 ug/ml de gentamicine (Schering, Pointe-Claire, QC, Canada). Les

fibroblastes ont été utilisés à leur quatrième passage. Les cellules ont été incubées à 37°C

dans 8% de C O 2 et le milieu de culture a été changé tous les 2 jours. Les cellules ont été

obtenues conformément à l'approbation du comité éthique de l'Université Laval.

2.1.3 Cellules d'astrocytome

Les cellules d'astrocytome ont été obtenues de ATCC (Manassas, VA, USA).

CRL-1718 est une lignée isolée d'un astrocytome humain de grade IV. Selon ATCC

(American Type Culture Collection), ces cellules ont une morphologie astrocytaire et 70 à

80% des cellules expriment le GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein).

CCL-107 est une lignée isolée d'un astrocytome C 6 de rat. {Rat tus novegicus). Selon

ATCC, ces cellules ont une morphologie fibroblastique et expriment la protéine S-100

spécifique aux cellules gliales.

Ces cellules ont été cultivées dans du milieu DME complet, soit du Dulbecco-Vogt

modification of Eagle's médium (DMEM; Gibco, Burlington, ON, Canada) contenant 10%

de sérum de veau fœtal (SVF; Hyclone, Logan, UT, USA), 100 U/ml de pénicilline G

(Sigma) et 25 |ug/ml de gentamicine (Schering, Pointe-Claire, QC. Canada). Les

fibroblastes ont été utilisés à leur quatrième passage. Les cellules ont été incubées à 37°C

dans 8% de C O 2 et le milieu de culture a été changé tous les 2 jours.

2.2 Matrice Fibroblastique Tubulaire (MFT)

La technique d*autoassemblage utilisée pour la confection des MFT, tel que décrit

précédemment [164], s'est faite à partir de fibroblastes dermiques humains isolés telle que

décrite précédemment. Brièvement. 10 4 cellules/cm2 de fibroblastes humains sont cultivés

dans du milieu tel que décrit précédemment. Le milieu de culture est supplémenté de 50

ug/mL de sodium d'ascorbate (Sigma, Oakville, ON, Canada) pour stimuler la synthèse de

MEC. Après environ 28 jours de culture, les cellules ont formé un feuillet manipulable

comprenant cellules et leur propre MEC. Le feuillet a été détaché du flacon de culture de 75

cm 2 (Falcon, Becton Dickinsin Labware. Franklin Lakes, NJ, USA) et enroulé autour d'un

mandrin tubulaire de PTFE (Falcon. Becton Dickinsin Labware. Franklin Lakes. NJ. USA)

d'un diamètre externe de 4 mm. Les feuillets ont été enroulés trois ou quatre tours autour

du mandrin formant ainsi une épaisseur de 3 ou 4 couches. Les feuillets enroulés ont été

cultivés pendant un autre 28 jours dans des tubes de 50 mL (Falcon, Becton Dickinsin

Labware, Franklin Lakes, NJ, USA). Le milieu de culture supplémenté de sodium

d'ascorbate a été changé trois fois par semaine. Après cette période de maturation, les

couches de feuillets ont adhéré fermement les unes aux autres, formant un tissu tubulaire

cohésif. Ensuite, les tissus tubulaires ont été décellularisés. déshydratés et conservés à

-80°C jusqu'à utilisation. Nous avons ainsi obtenu des matrices fibroblastiques tubulaires

acellularisées.

Figure 10. Enroulement d'un feuillet de fibroblastes autour d'un mandrin tubulaire.

© Patrick Charron, LOEX.

2.3 Banc hémodynamique

Les MFT ont été décongelées et réhydratées dans du milieu M199 (Sigma. Oakville,

ON, Canada) à 4°C pendant 24 heures. Pour procéder à l'endothélisation. les MFT ont été

canulées à chaque extrémité et reliées à une tubulure pouvant être reliée à une pipette de 5

mL (Falcon, Becton Dickinsin Labware. Franklin Lakes. NJ. USA). Des HUVEC au

cinquième passage ont été ensemencé dans le lumen des MFT à raison d'environ 3 à 4

millions de cellules selon la longueur de la MFT. Les MFT endothélialisées ont été ensuite

placées à 37°C pendant trois heures pour laisser les cellules adhérer à la MEC. Pendant

cette période, les MFT sont placées dans des tubes spéciaux de 100 mL dans un dispositif

permettant une rotation lente des MFT pour assurer une endothélisation uniforme du lumen.

Après cette période d'adhésion, les cellules qui n'ont pas adhéré ont été rincées avec du

M199 (Sigma, Oakville, On, Canada). Les MFT endothélialisées ont été ensuite transférées

dans un banc hémodynamique de plexiglas stérile. Les MFT ont été reliées à une tubulure

stérile reliée à une pompe péristaltique (MasterFlex L/S, Cole-Parmer Instrument

Company, Barrington. IL, USA). Les MFT contrôle statique ont été placées dans le même

banc hémodynamique excepté qu'elles n'ont pas été reliées à la pompe. Le milieu de

culture dans lequel baigne les MFT est du M199 avec antibiotiques 100 U/mL de

pénicilline G (Sigma Oakville, ON. Canada) et 25 (ig/mL de gentamicine (Schering.

Pointe-Claire, Qc, Canada) et 5.96 g/L d'HEPES (ICN Biomedicals, Saint-Laurent, QC.

Canada). Le milieu qui circule dans la lumière des MFT est du M199 5 % de sérum de veau

fœtal (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA), 2,28 mM de glutamine (Invitrogen), 40 U/mL

d'héparine (Léo Laboratories, Pickering, Canada) 100 U/mL de pénicilline G (Sigma

Oakville, ON, Canada) et 25 jag/mL de gentamicine (Schering, Pointe-Claire, QC, Canada).

5.96 g/L d'HEPES, 1 g/L de BSA (Sigma, Oakville, ON, Canada) et 80 g/L de Dextran

(Sigma, Oakville, ON, Canada)de façon à obtenir une viscosité de 0,04 Poise soit

l'équivalent du sang humain [6]. Le montage a été placé à 37°C et la pompe a fourni un

débit minimum pour faire circuler le milieu de culture à l'intérieur des MFT sans engendrer

une force de cisaillement significative. Les MFT ont maturé de cette façon pendant la nuit.

Le lendemain matin, le débit de la pompe a été élevé graduellement jusqu'à 170 mL/min,

de façon à obtenir un flux de 10 dynes/cm2 pendant 4 heures.

Après la période d'exposition au flux, les MFT ont été retirées du banc hémodynamique.

Par la suite, elles ont été ouvertes sur la longueur avec des instruments stériles et sur une

surface stérile sur glace, puis nous avons conservé un morceau d'environ 1 cm 2 pour les

analyses en microscopie. Les restes des MFT ont été placés dans des tubes stériles de 2 mL

(Eppendorf). puis plongés immédiatement dans de l'azote liquide et ensuite conservés à

-80°C.

Une étude de la mécanique des fluides a été effectuée pour notre montage de banc

hémodynamique dans le but de s'assurer que le flux est bel et bien laminaire et que la force

de cisaillement équivaut à 10 dynes/cm2. Cette étude a été réalisée par un l'étudiant au

doctorat en mécanique des fluides Karl Stéphane Rossignol.

Figure 11. Montage d'une MFT pour endothélisation. Une MFT est reliée à la tubulure

pour ensemencer des CE dans le lumen. © Patrick Charron, LOEX.

Figure 12. Montage du banc hémodynamique relié aux pompes péristaltiques. Les MFT endothélialisées sont installés dans une cuve de plexiglas stérile. Les MFT en condition dynamique sont reliées à la pompe. Les MFT en condition statique sont déposées dans le fond de la cuve. © Jean-François Oligny, LOEX

2.4 Microscopie

2.4.1 Contraste de phase

Les MFT ont été fixées au moins 24 h dans une solution d'Histochoice (Amresco, Solon.

OH, USA), puis enrobées dans la paraffine. Des coupes de 5 um ont finalement été

colorées au trichrome de Masson (TM) pour l'analyse histologique des tissus. Les images

ont été prises avec un microscope Nikon Eclipse E600 (Nikon, Tokyo, Japon) et une

caméra.

2.4.2 Microscopie électronique à balayage

Les biopsies de MFT ont été placées dans une solution de 2,5% glutaraldéhyde (M.E.C.A.

LAB) dans un tampon cacodylate 0,1 M, pH 7,5 pendant une nuit. Le lendemain, les

échantillons ont été rincés avec du tampon cacodylate 0,1 M à quatre reprises. La

déshydratation et la coloration ont été effectuées au service de microscopie électronique de

l'Université Laval. Les images ont été prises avec l'assistance de M. Richard Janvier.

2.4.3 Immuno fluorescence

Suite à l'expérience du banc hémodynamique, les biopsies de MFT ont été rincées avec du

tampon salin phosphate (PBS) et immédiatement transférées sur des lamelles de verre et

fixées dans du formol 3.7%. Les biopsies ont été perméabilisées avec du TritonR 0,1%)

(Bio-Rad Laboratories). Les images ont été obtenues et analysées avec un microscope

confocal Nikon Eclipse E800 combiné au système Nikon D-Eclipse Cl (Nikon).

Des cellules d'astrocytomes humain CRL-1718 ou de rat CCL-107 (ATCC) ont été

cultivées sur des lamelles de verre recouvertes de bromure de poly-L-lysine 0.01 mg/mL

(Sigma. Oakville. ON, Canada). Ces cellules ont été fixées avec du paraphormaldéhyde 4 %

(Baker) et perméabilisées avec de Féthanol 70% (Fisher). Les lamelles ont ensuite été

marquées pour GFAP. Des cerveaux de souris ont été enrobées dans une solution d'OCT

(Somagen, Edmonton. Ab. Canada), puis congelées à -80°C. Des coupes de 5 u.m

d'épaisseur ont subi le même traitement que les cellules sur lamelles et ont servies de

contrôles positifs.

Des HUVEC au cinquième passage ont été cultivées sur des lamelles de verre recouvertes

de gélatine en présence ou non de milieu conditionné de cellules d'astrocytomes (voir

culture en chambre de Boyden). Ces cellules ont été fixées avec du paraphormaldéhyde 4 %

(Baker) et perméabilisées avec de Féthanol 70% (Fisher). Les lamelles ont ensuite été

marquées pour ZO-1.

Les immunofluorescences pour GFAP et ZO-1 ont été visualisées avec des microscopes à

épifluorescence Nikon Eclipse E600 (Nikon, Tokyo, Japon) et Nikon Eclipse TE2000-U

(Nikon).

Pour toutes les immunofluorescences, les anticorps primaires ont été d'abord incubés 45

minutes sur les échantillons. Puis, les anticorps secondaires couplés à un fluorochrome ont

été incubés 30 minutes. Les anticorps primaires et secondaires ont été dilués avec du PBS

1% BSA (Sigma, Oakville, ON, Canada). Un marquage des noyaux cellulaires au Hoechst

33258 (Sigma) a aussi été effectué par une incubation de 10 minutes. Les contrôles négatifs

pour les immunomarquages ont été obtenus par omission du premier anticorps. La

luminosité et/ou le contraste des images ont été ajustés avec Adobe® Photoshop® 6.0

(Adobe Systems Inc., San José. CA. USA).

Figure 13. Principe de rimmunofluorescence. © Vicky Gagnon, LOEX

Anticorps primaires Compagnie Dilution

AC monoclonal de souris lgG1 anti CD-144 (VECAD) humain BD 1/400 AC monoclonal de souris lgG1 anti CD-31 (PECAM) humain Chemicon 1/800 AC monoclonal de souris lgG1 anti GFAP Chemicon 1/400 AC monoclonal de souris lgG1 anti ZO-1 BD 1/100

Anticorps primaires Compagnie Dilution

AC de chèvre anti IgG de souris (H+L), Alexa 594 Molecular Probes 1/400 AC de lapin anti IgG (H+L) de souris, Alexa 488 Molecular Probes 1/500

Tableau 1. Liste des anticorps utilisés pour immunofluorescence.

Le marquage des fibres d'actine a été obtenu par un marquage avec la toxine Phalloidine

couplée au rluorochrome TRITC (Sigma, Oakville, On, Canada) diluée 1/40 avec du PBS

BSA 1%.

2.5 Biologie Moléculaire

2.5.1 Extraction d'ARN total

Aussitôt les échantillons de MFT sortis du congélateur -80°C, ils ont été placés dans un

mortier stérile avec de l'azote liquide et réduits en fine poudre. La poudre a été récupérée et

placée dans du tampon de lyse. L'ARN total a été extrait à l'aide de mini-colonnes

d'extraction RNeasy* (Qiagen, Mississauga, On. Canada). Le protocole recommandé par le

fabriquant a été suivi. La concentration et la pureté des extractions d'ARN ont été

effectuées à l'aide d'un spectrophotomètre ND-1000 (NanoDrop. Wilmington, DE. USA).

La pureté des extractions a été évaluée par les rapports d'absorbance des longueurs d'onde

260/280 nm et 260/230 nm.

2.5.2 RT-PCR

Les réactions de transcription inverse ont été effectuées avec 200 UI de l'enzyme

SuperScript 7/7® Reverse Transcriptase (Invitrogen, Burlington. On. Canada). Les réactions

ont été faites à partir de 1 ug d'ARN et selon le protocole recommandé par le fabriquant de

l'enzyme. Les réactions ont été effectuées dans un thermocycleur Icycler (Bio-Rad).

2.5.3 PCR

Toutes les réactions de PCR ont été effectuées avec l'enzyme Taq DNA Polymerase (New

England BioLabs, Pickering, On, Canada). Les réactions ont été effectuées dans un

thermocycleur Icycler (Bio-Rad) et selon le protocole recommandé par le fabriquant de

l'enzyme. Les réactions ont été effectuées avec 35 cycles d'amplification. Les amorces ont

été choisies à l'aide des logiciels en ligne Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer3/primer3_www.cgi) et IDT Oligo Analyser 3.0

(http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/QligoAnalyzer/).

Nom du gène Amorce Sens Amorce Non sens T M (°C) Ampl icon (pb)

PECAM (CD-31) cagcct tcaacagagccaacc cactccgatgataaccactgc 61 116

eNOS agctgtgctggcatacagga atggtaacatcgccgcagac 62 486

ET-B1 acttcccgtctctgctttaggtg tctgcgaatctgcttgcttcatcc 63 179

PAI-1 t tggtgaagggtctgctgtg ggctcctt tcccaagcaagt 62 485

tPA atgggaagacatgaatgcac gaaaggggaaggagact tga 58 319

VECAD cgcctctgtcatgtaccaaa gtct tcaggcacgacaaatg 59 253

vWF caccat tcagctaagaggagg gccctggcagtagtggata 59 310

Cinguline cagagccagaacctgagtcc ctggtctcgaaggaggtctg 60 625

MMP 9 cctggagacctgagaaccaatc gatt tcgactctccacgcatc 62 104

PPIA catctgcactgccaagactgag tgcaatccagctaggcatg 62 302

POLR2 gcaccacgtccaatgacat gtgcggctgcttccataa 60 267

e-selectine cacacacctggttgcaattc attgttgggttcacctggag 60 181

GAPDH tgatgacatcaagaaggtggtgaag tcct tggaggccatgtgggccat 60 240

Tableau 2. Liste des amorces utilisées

2.5.4 Séquencage

Les produits des réactions PCR ont été purifiés à l'aide de mini-colonnes de purification

QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen, Mississauga, On, Canada). Le protocole

recommandé par le fabriquant a été suivi. La purification a été dosée et analysée avec un

spectrophotomètre ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, DE, USA). Les produits purifiés ont

été envoyés à la plateforme de séquencage du CHUL (Québec, Qc, Canada). Les résultats

du séquencage ont été analysés à l'aide du logiciel Chromas Lite Version 2.01

(Technelysium, www.technelysium.com.au).

2.5.5 PCR quantitative

Les réactions des PCR quantitatives ont été effectuées à l'aide d'un kit commercial

QuantiTect® SYBR® Green PCR (Qiagen. Mississauga. On. Canada). Le protocole

recommandé par le fabriquant a été suivi. Les amorces utilisées figurent au tableau 2. Les

réactions ont été effectuées dans un thermocycleur Rotor-Gene RG-3000 (Corbett

Research, Kirkland, QC, Canada) et les résultats ont été analysés à Laide du logiciel Rotor-

Gene Version 6.0 (Corbett Research). Toutes les réactions pour un même gène ont été

effectuées lors de la même séance d'amplification. Toutes les réactions ont été faites à la

même température d'hybridation de 58°C. Pour chaque réaction, les données ont été

rapportées aux valeurs d'expression du gène rapporteur GAPDH [111. 114, 116. 119. 120,

180. 181]. L'expression de ce dernier n'était pas influencée par les conditions

expérimentales (Annexe 1). Les valeurs d'expression des gènes analysés ont été exprimées

en valeurs relatives par rapport au gène rapporteur GAPDH. Toutes les réactions ont été

effectuées à partir d'une quantité égale d'ADNc. Toutes les réactions ont été effectuées en

duplicata. Pour chaque gène, des courbes standard ont été obtenues à partir de dilutions des

produits de PCR purifiés (voir séquencage). Un duplicata d'une concentration connue

(environ 5 x 10° ng/rx) de chaque gène a été utilisé lors des réactions pour rapporter la

courbe standard respective.

2.6 Culture en chambre de Boyden

Des inserts ou chambres de Boyden adaptés pour des plaques de culture de 12 puits

(Falcon, Becton Dickinsin Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) avec des membranes de

polyéthylène téréphtalate (PTE) et une porosité de 0,4 micron ont été enduites de gélatine

0,2 %. Des HUVEC au cinquième passage ont ensuite été ensemencées à l'intérieur des

inserts à raison de 30 000 cellules par insert. Les cellules ont maturé jusqu'à confluence

avant de faire le test de perméabilité transendothéliale. Le milieu de culture utilisé est du

M199 (Sigma, Oakville, On, Canada) contenant 20 % de sérum de veau fœtal (FBS.

Hyclone, Logan, UT, USA), 20 |ag/mL d'ECGS (Sigma, Oakville, On, Canada ), 2,28 mM

de glutamine (Invitrogen), 40 U/mL d'héparine (Léo Laboratories, Pickering, Canada)

100 U/mL de pénicilline G (Sigma Oakville, On, Canada) et 25 jag/mL de gentamicine

(Schering, Pointe-Claire, Qc. Canada). Les cellules ont été incubées à 37°C dans 8% de

C 0 2 et le milieu a été changé pendant 72 heures. Le milieu a été changé deux fois pendant

cette période. 24 heures avant le test de perméabilité, le milieu a été changé pour du M199

avec les mêmes constituants excepté FECGS et avec seulement 5 % de sérum de veau

foetal.

Dans le fond des puits, soit la chambre inférieure des chambres de Boyden, des cellules

d'astrocytomes CRL-1718 ou CCL-107 (ATCC) ont été ensemencées à raison de 100 000

cellules par puits recouvert de poly-L-lysine hydrobromide 0,01 mg/mL (Sigma. Oakville,

On, Canada). Les cellules ont été cultivées dans du milieu DME complet, soit du Dulbecco-

Vogt modification of Eagle 's médium (DMEM; Gibco. Burlington, ON. Canada) contenant

10% de sérum de veau fœtal (SVF; Hyclone, Logan, UT, USA), 100 U/ml de pénicilline G

(Sigma) et 25 |ig/ml de gentamicine (Schering, Pointe-Claire. QC. Canada). Les

fibroblastes ont été utilisés à leur quatrième passage. Les cellules ont été incubées à 37°C

dans 8% de C O 2 et le milieu de culture a été changé tous les 2 jours.

2.7 Test de perméabilité transendothéliale

Les tests de perméabilité ont été effectués avec des inserts tels que décrits

précédemment. Au moment du test, le milieu de culture de la chambre supérieure a été

changé pour du M199 (Sigma, Oakville, On. Canada) contenant 5 % de sérum de veau

fœtal (FBS, Hyclone, Logan, UT. USA), 2,28 mM de glutamine (Invitrogen). 40 U/mL

d'héparine (Léo Laboratories, Pickering, Canada) 100 U/mL de pénicilline G (Sigma

Oakville, On, Canada), 25 jag/mL de gentamicine (Schering, Pointe-Claire, QC, Canada) et

50 |ig/mL de BSA conjuguée au fluorochrome FITC (Molecular Probes. Eugène. OR.

USA). Les cellules ont été incubées à 37°C dans 8%o de C O 2 . A toutes les heures, pendant 6

heures et après 24 heures, un échantillon de 50 uL de milieu des chambres inférieures a été

recueilli et conservé à l'abri de la lumière à 4°C. La quantité de BSA-FITC ayant traversé

la monocouche d'HUVEC a été mesurée à l'aide d'un fluoromètre Varioskan Flash

(Thermo Electron Corporation. Finlande) et les résultats ont été analysé à l'aide du logiciel

Skanlt RE for Varioskan Flash version 2.4.1 (Thermo Electron Corporation, Finlande).

Les tests ont été effectués avec des inserts en présence de cellules d'astrocytome (CRL-

1718 ou CCL-107) dans la chambre inférieure ou avec du milieu conditionné de ces

Membrane

Chambre supérieure

Chambre inférieure

Cel ules endothéliales

nsert

Puit

Membrane

Figure 14. Schéma d'une chambre de Boyden. À gauche, on voit l'allure macroscopique

d'un insert. À droite, une coupe schématisée de Finsert à l'intérieur d'un puit d'une plaque

de culture. Adapté de http://www.bd.com (Falcon, Beckton Dickinson Labware, Franklin

Lakes, NJ, USA)

cellules ou encore avec seulement des HUVEC. Les contrôles étaient constitués d'inserts

sans cellules recouverts de gélatine 0,2%.

Le milieu conditionné de cellules d'astrocytome a été obtenu en récoltant le surnageant de

cellules CRL-1718 ou CCL-107 confluente dans des flacons de culture de 75 cm 2 (Falcon,

Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes. NJ. USA). Le surnageant a été filtré avec un

filtre Milex GV (Millipore) de 0,22 u,m et mélangé avec du milieu frais dans un rapport un

pour un. Le milieu conditionné a été fait avec du M199 complet ou du DME complet avec

5 ou 20 % de sérum de veau foetal. Le temps de culture des HUVEC avec du milieu

conditionné a varié entre 24, 48, 72 et 96 heures.

Résultats

3.1 Morphologie

Pour évaluer la réponse des CE exposées à un flux hémodynamique physiologique

dans notre modèle d'étude de la MFT. nous avons observé l'endothélium suite à une

exposition de 4 heures à un flux de 10 dynes/cm2. De cette façon, il nous est possible

d'observer la confluence, la morphologie et l'expression de certaines protéines des CE

ensemencées dans une MFT avec et sans flux hémodynamique.

Figure 15. Coupes transversales de MFT. A et C) Coupes transversales de MFT sans cellule B et D) Coupe transversales de MFT endothélialisées et exposées à une flux de 10 dynes/cm2 pendant 4h. Coloration hématoxyline-éosine : La MEC est colorée en bleu et les cellules en rose. La barre de mesure = 100 |um

La MFT est composée d'une grande quantité de MEC synthétisée par les fibroblastes et

enroulée en plusieurs couches consécutives autour d'un mandrin. Une fois les fibroblastes

éliminés, nous conservons la MEC tubulaire dans laquelle nous ensemençons des HUVEC.

On peut observer en bleu la volumineuse MEC par rapport au revêtement de CE en rose

(Fig. 15 B et D). En microscopie électronique à balayage, on observe les fibres de MEC qui

composent la MFT.

Figure 17. Microscopie électronique à balayage d'une MFT endothélialisée en condition statique. Vue en pente de l'endothélium.

Figure 18. Microscopie électronique à balayage de MFT endothélialisées. Condition statique (A et C) et dynamique (B et D). Comparaison des endothéliums après 4 h d'exposition au flux de 10 dynes/cm . Sur les photos B et D, le flux est de gauche à droite.

Statique mÊÊ Flux 9 H S I

•

I

Figure 19. Microscopie confocale du marquage immunohistochimique des fibres d'actine. Vue de l'endothélium à l'intérieur de MFT en condition statique, à gauche, et en condition avec flux de 10 dynes/cm pendant 4h à droite. Sur les photos, la direction du flux est de bas en haut. La barre de mesure = 100 (tm

Statique Flux

•

Figure 20. Microscopie confocale du marquage immunohistochimique de VECAD. Vue de l'endothélium à l'intérieur de MFT en condition statique, à gauche, et en condition avec flux de 10 dynes/cm2 pendant 4h à droite. Sur les photos, la direction du flux est de bas en haut. La barre de mesure = 100 \im

Statique

Figure 21. Microscopie confocale du marquage immunohistochimique de PECAM. Vue de l'endothélium à l'intérieur de MFT en condition statique, à gauche, et en condition avec flux de 10 dynes/cm2 pendant 4h à droite. Sur les photos, la direction du flux est de bas en haut. La barre de mesure = 100 um

On remarque clairement que l'endothélium qui a été exposé au flux présente des CE

alignées et allongées parallèlement à la direction du flux comparativement à la morphologie

polygonale en condition statique. Malgré l'exposition aux forces hémodynamiques, les CE

présentent une confluence quasi parfaite à l'intérieur de la MFT. On doit mentionner que le

relief de la MFT fait en sorte qu'il est difficile d'obtenir un champ de visualisation aplani

qui permet de mettre au foyer l'ensemble des cellules. Ceci fait en sorte qu'on peut croire

qu'il y a des endroits sans cellules, en réalité ces endroits sont plus profonds ou plus élevés

par rapport au reste du champ qui est au foyer. En plus de l'alignement des cellules par le

flux, la microscopie électronique à balayage nous permet même d'observer l'aplatissement

des CE exposées au flux par rapport aux CE en condition statique (Fig. 18). Au niveau du

marquage des fibres d'actine, on remarque à plus fort grossissement, la présence de fibres

de stress parallèles à la direction du flux comparativement à la condition statique où elles

n'ont pas de direction communes (Fig. 19). Les marquages de VECAD (Fig. 20) et

PECAM (Fig. 21) montrent également l'alignement des CE en condition dynamique. On

remarque également, au niveau des marquages de VECAD et PECAM, une localisation

cytoplasmique plus prononcée chez la condition dynamique.

3.2 Expression génique

Pour complémenter l'analyse de la réponse des CE exposées à un flux

hémodynamique dans notre modèle de la MFT, nous voulions observer les changements

d'expression génique provoqués par le flux. Pour ce faire, nous avons extrait l'ARN total

des CE exposées ou non au flux dans une MFT. Après avoir converti l'ARN en ADN

complémentaire (ADNc), nous avons vérifié l'expression de certains gènes par PCR.

S S F F

VECAD I 1 1 1 I

Figure 22. Gel d'agarose des produits de PCR pour différents gènes. Réalisé à partir de l'ADNc des CE ensemencées dans une MFT. S = Condition Statique. F = Condition avec flux de 10 dynes/cm2 pendant 4 h. CE activées avec Finterleukine (3.

En dépit du fait que sur les gels d'agarose utilisés pour faire migrer les produits

d'amplification PCR nous avons observé une seule bande visible pour chaque paire

d'amorces utilisée, nous voulions tout de même nous garantir de la spécificité de la réaction

pour les amorces destinées à être utilisées ultérieurement en PCR quantitative. Pour nous

assurer de la spécificité de nos amorces, nous avons séquence les produits des réactions de

PCR.

a b r é v i a t i o n L Gène correspondant Numéro d'accession Homologie

(%)

PECAM Platelet Endothelial Cell Adhésion Molécule (CD-

31) NM 000442 98

eNOS Nitric Oxide Synthase 3 (endothelial cell) NM 000603 99

ET-B1 Endothelin receptor Type B (EDNRB) NM 000115 98

PAI-1 Serpin Peptidase Inhibitor, Clade E

(nexin, Plasminogen Activator Inhibitor type 1) NM 000602 99

tPA plasminogen activator, t issue (PLAT) NM 000930 99

VECAD cadherin 5, type 2, VE-cadher in (vascular

epithelium) NM 001795 100

v W F von Wil lebrand Factor (VWF) NM 000552 99

GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

(GAPDH) NM 002046 99

Tableau 3. Résultats du séquencage des produits PCR purifiés.

Pour analyser 1" influence de F exposition à un flux de 10 dynes/cm pendant 4 heures sur

l'expression de ces gènes (Tableau 1). nous avons effectué des PCR quantitatives. Pour ce

faire, nous avons comparé le niveau d'expression de ces 7 gènes au niveau d'expression de

GAPDH pour chaque condition. Etant donné que GAPDH est exprimé de façon constitutive

(housekeeping gene) et que son expression n'est pas modulée par nos conditions

expérimentales, nous avons pu ainsi comparer les niveaux d'expression de chaque gène

entre les conditions statique et dynamique.

Condition CD-31 eNOS ET-B PAI-1 tPA VECAD vWF Statique 1 1,67 1,65 0,04 4,91 0,14 0,93 5,36 Statique 2 0,84 2,72 0,02 3,27 0,10 1,23 3,65 Statique 3 0,51 3,28 0,02 2,14 0,22 0,41 7,86 Moyenne 1,01 2,55 0,03 3,44 0,15 0,86 5,62

Ecart-type 0,35 0,48 0,01 0,80 0,04 0,24 1,22 Flux 1 0,75 2,77 0,03 2,98 0,11 0,37 5,30 Flux 2 0,81 0,46 0,03 5,35 0,07 0,46 4,99 Flux 3 0,79 3,42 0,03 6,86 0,11 0,73 2,14

Moyenne 0,78 2,22 0,03 5,06 0,10 0,52 4,14 Ecart-type 0,02 0,90 0,00 1,13 0,01 0,11 1,01

Tableau 4. Expression relative des gènes PECAM, eNOS, ET-B1, PAI-1, tPA, VECAD et vWF. L'expression est quantifiée relativement à l'expression de GAPDH. Données pour chaque échantillon fourni pour la condition statique et avec flux (4 h, 10 dynes/cm ).

Figure 23. Graphique de l'expression relative moyenne des gènes PECAM, eNOS, ET-B1, PAI-1, tPA, VECAD et vWF. L'expression des gènes est contrôlée par rapport à l'expression du gène rapporteur GAPDH. Le graphique compare l'expression des gènes selon la condition statique ou après une exposition de 4 h à un flux de 10 dynes/cm". Les colonnes représentent l'expression relative moyenne des gènes par le ratio d'expression flux/statique. L'expression en condition statique est fixée à 1 sur l'ordonnée. Il n'y a pas de différence significative entre les deux conditions pour aucun gène, n =3 pour chaque valeur.

oc

1,8

1,6

1,4

tPA

M 1,2 (D

o 1 CO co Q) Q. 0,8 X LU

0,6

0,4

0,2

1,8

1,6

> 5 1,2 CD

VECAD

1 g

co

| 0 . 8 X

LU

0,6

0,4

0,2

II 1,8

1,6

1,4 CD ' >

5 1,2 CD

i 1 co co CD CL x LU

vWF

0,8

0,6

0,4

0,2

• I I 0 Figure 24. Graphique des données individuelles de l'expression relative des gènes PECAM, eNOS, ET-B1, PAI-1, tPA, VECAD et vWF. L'expression des gènes est contrôlée par rapport à l'expression du gène rapporteur GAPDH. Le graphique compare l'expression des gènes selon la condition statique ou après une exposition de 4 h à un flux de 1 0 dynes/cm2. Les colonnes représentent l'expression relative des gènes par le ratio d'expression flux/statique. L'expression en condition statique est fixée à 1 sur l'ordonnée.

Sur les figures 23 et 24, une expression relative inférieure à 1 sur l'ordonnée signifie que

l'expression du gène en condition dynamique est inférieure à celle en condition statique qui

est fixée à 1. Par contre, une expression relative supérieure à 1 signifie que l'expression du

gène en condition dynamique est supérieure à celle en condition statique. Par exemple, une

expression relative égale à 2 signifierait que l'expression de gène est 2 fois plus élevée en

condition dynamique par rapport à la condition statique. Dans le même ordre d'idées, une

expression relative égale à 0.5 signifierait que l'expression du gène est 2 fois plus basse en

condition dynamique par rapport à la condition statique. Nous n'avons observé aucune

différence significative (p>0,05) entre les niveaux relatifs moyens d'expression mesurés en

condition statique et dynamique pour les 7 gènes analysés. On remarque une grande

variabilité des valeurs d'expression pour certains gènes (eNOS et PAI-1) et une meilleure

stabilité pour d'autres (PECAM et ET-B). On peut tout de même relever une certaine

tendance à une augmentation de l'expression en condition de flux pour ET-B1 et PAI-1

comparativement à une tendance à la baisse pour tPA, VECAD et vWF.

3.3 Barrière hémato-encéphalique

Dans le but d'évaluer la perméabilité des HUVEC en monocouche, nous avons

ensemencé des HUVEC dans la chambre supérieure de chambres de Boyden. Nous avons

ensuite suivi le passage d'un marqueur protéique au travers la couche de CE. Pour évaluer

l'influence sur la perméabilité endothéliale que pourraient avoir des facteurs solubles

astrocytaires, nous avons ensemencé des cellules d'astrocytome humain ou de rat dans la

chambre inférieure des chambres de Boyden. Le passage du marqueur BSA-FITC de la

chambre supérieure à la chambre inférieure a été mesuré toutes les heures pendant 4 heures

et après 24 heures.

45

Figure 25. Test de perméabilité transendothéliale au BSA-FITC en chambres de Boyden. La BSA-FITC est placée dans la chambre du haut et la quantité qui traverse la monocouche d'HUVEC est mesurée toutes les heures. Le contrôle est fait avec des chambres recouvertes de gélatine 0,2 % sans cellules. CE : chambres avec seulement des HUVEC. CCL-107 : chambres avec des HUVEC et des cellules d'astrocytome de rat dans la chambre inférieure. CRL-1718 : chambres avec des HUVEC et des cellules d'astrocytome humain dans la chambre inférieure. Pour chaque conditions n = 3. Les différences entre les trois conditions avec cellules sont non significatives (p>0,05).

On remarque que la présence de CE réduit la vitesse de passage du BSA-FITC dans la

chambre inférieure comparativement au contrôle sans CE. Cependant, la présence de

cellules d'astrocytome humain (CRL-1718) ou de rat (CCL-107) ne semble pas diminuer la

perméabilité des HUVEC au BSA-FITC. Malgré que les différences ne soient pas

significatives (p > 0,05), on remarque que les HUVEC seules sont moins perméables à la

BSA-FITC par rapport aux HUVEC cultivées avec les cellules d'astrocytomes. Nous avons

répété cette expérience à plusieurs reprises avec différentes conditions de culture. Nous

avons utilisé différents milieux de culture (M 199 et EBM2) différents temps de culture

dans les chambres avant de faire le test de perméabilité (24, 48. 72 et 96h) et différentes

expositions des HUVEC aux facteurs solubles des cellules d'astrocytome, soit en utilisant

du milieu conditionné ou par la culture directe de ces cellules dans la chambre inférieure.

Malgré ces différentes conditions, nous avons toujours obtenu des résultats similaires,

c'est-à-dire pas de différence significative entre la perméabilité des HUVEC seules et de

celles cultivées en présence de milieu conditionné d'astrocytome.

Figure 26. Marquage immnuhistochimique pour GFAP. Morphologie des cellules d'astrocytome. CRL-1718 (A) et CCL-107 (B) cultivées sur plastique. Marquage du GFAP (vert) pour CRL-1718 (C) et CCL-107 (D) cultivées sur lamelles recouvertes de poly-L-lusine. (E) Contrôle positif du marquage de GFAP sur une coupe congelé de cerveau de souris. Les noyaux cellulaires sont marqués par le Hoetchst (bleu). Barre de mesure = 100 uni.

Les cellules d'astrocytome ne présentent pas une morphologie similaire à des astrocytes

primaires. On remarque aussi que seulement un faible pourcentage de cellules CRL-1718 et

CCL-107 est positif pour le marquage du GFAP. Le fait de cultiver des HUVEC avec du

milieu de culture conditionné par les cellules d'astrocytome C6 CCL-107 ne semble pas

changer la présence et la quantité de ZO-1.

Figure 27. Marquage immunohistochimique de ZO-1. HUVEC cultivées sur lamelles de verre gélatinée 0,2 % pendant 72 h. A) Milieu de culture de CE traditionnel B) Milieu de culture conditionné par des cellules d'astrocytome CCL-107. Barre de mesure = 100 um.

Discussion

4.1 Réponses des cellules endothéliales au flux hémodynamique

Les observations microscopiques de l'endothélium des MFT en condition statique

ou dynamique démontrent bien que notre modèle de la MFT constitue un bon

environnement pour T étude des CE en condition hémodynamique. D'une part, la

conservation d'une confluence quasi parfaite et d'autre part le changement notable de

morphologie suite à une exposition de 4 heures à un flux hémodynamique physiologique

suppose que la MFT, composée de MEC endogène, constitue un support adéquat pour les

cellules. Comme prévu, les CE en condition dynamique se sont allongées et alignées

parallèlement au flux [135] en plus de présenter un remodelage du cytosquelette par la

formation de fibres de stress d'actine également parallèles au flux [137]. Ce changement de

morphologie et la réorganisation du cytosquelette sont essentiels au maintien des CE en

condition hémodynamique [141]. Les liens établis entre les cellules et la MEC semblent

être suffisamment forts pour permettre aux CE de résister aux forces engendrées par le flux.

Ces liens sont particulièrement importants dans un contexte de forces hémodynamiques

puisqu'en plus de maintenir les cellules en place, la liaison des intégrines à leurs ligands de

la MEC permet l'activation de signaux intracellulaires importants dans la réponse des CE

aux forces hémodynamiques [81, 95, 96]. La présence d'une localisation cytoplasmique de

VECAD et PECAM en condition dynamique nous amène à supposer qu'après 4 heures

d'exposition au flux, les cellules soient toujours en période d'ajustement. En effet, nous

supposons que cette localisation cytoplasmique concorde avec la disruption des jonctions

adhérentes [139] qui, après la période d'ajustement, se reformeront et établiront des liens

avec les éléments du cytosquelette remodelé. Ainsi, la préservation de la confluence

additionnée au remodelage du cytosquelette et au changement de morphologie nous pousse

à croire que les CE ensemencées dans notre modèle de la MFT sont en mesure de répondre

de façon adéquate aux forces induites par un flux hémodynamique physiologique. Bien que

ces résultats ne nous surprennent pas, ils appuient la validité de notre modèle de la MFT

pour l'étude des CE en condition hémodynamique.

Quoique l'observation des CE semble démontrer qu'elles sont en mesure de bien répondre

aux forces hémodynamiques, l'étape suivante était d'analyser si l'exposition aux FC

provoque des changements d'expression de certains gènes. Nous avons choisi d'analyser

l'influence du flux sur le niveau d'expression par PCR quantitative de 7 gènes impliqués

dans la physiologie endothéliale : PECAM. eNOS. ET-B1. PAI-1. tPA. VECAD et vWF.

Pour ce faire, nous avons soumis les CE ensemencées dans des MFT à un flux puisé

physiologique de 10 dynes/cm2 pendant 4 heures. En parallèle, nous avons traité

exactement de la même façon d'autres MFT, excepté qu'elles n'ont pas été exposées à un

flux. Nous avons ensuite extrait l'ARN total de ces CE pour analyser les différences

d'expression des 7 gènes entre les deux conditions, soit avec (dynamique) ou sans flux

(statique).

La PCR classique ne nous permet pas d'évaluer de façon précise le niveau d'expression des

gènes. Néanmoins, elle nous permet d'optimiser les conditions de la réaction PCR en plus

de valider la performance et la spécificité des amorces utilisées. A la suite d'une migration

sur gel d'agarose des produits de réactions PCR, nous n'avons observé qu'une seule bande

par paire d'amorces, ce qui nous laisse croire que la réaction est bel et bien spécifique.

Cependant, pour nous assurer que le produit d'amplification est réellement la cible visée,

nous avons isolé les produits de PCR et nous les avons fait séquencer. En somme, les

résultats de séquences obtenus concordent avec la séquence des gènes que nous avions

ciblés (tableau 3). Ceci confirme la spécificité des amorces utilisées pour l'analyse de

l'expression génique par PCR quantitative.

La réalisation de PCR quantitatives avec l'ADNc de CE ensemencées dans des MFT en

condition statique ou dynamique ne nous a pas permis d'observer des différences

significatives des expressions relatives moyennes des 7 gènes analysés. Cette absence de

différences statistiquement significatives est fort probablement due à la grande variabilité

entre les échantillons (figure 24 et tableau 4). En raison du nombre limité de MFT par

expérience, il est techniquement difficile d'avoir un grand échantillonnage. Dans ce cas ci,

nous avons seulement trois MFT par condition. On remarque que la majorité de la

variabilité provient d'un seul échantillons sur trois. Ceci fait en sorte que la moyenne des

trois échantillons ne représente pas nécessairement la situation observée et engendre des

écarts types élevés. Pour pallier à cette situation, il faudrait augmenter le nombre

d'échantillons afin de diminuer l'impact des données aberrantes et du même coup permettre

une analyse beaucoup plus juste de l'influence du flux sur l'expression génique.

Bien que les différences des niveaux d'expression ne soient pas significatives, on peut tout

de même observer certaines tendances. L'exposition pendant 4 heures à un flux de 10

dynes/cm2 semble induire une augmentation de l'expression de ET-B1 et PAI-1 et une

diminution pour PECAM. eNOS. tPA. VECAD et vWF. Il est très difficile de faire un lien

avec nos résultats et ceux qu'on retrouve dans la littérature puisque les conditions

expérimentales diffèrent énormément. Entre autres, la force et la nature du flux, le temps

d'exposition, le substrat et le type de cellules sont tous des facteurs qui altèrent les résultats

et leurs analyses. Malgré ces différences notables, on peut tout de même souligner que les

changements d'expression apportés par l'exposition au flux sur PECAM [118. 119], ET-

Bl[134] et vWF [118, 123] correspondent à la tendance dans la littérature alors qu'ils ne

correspondent pas pour eNOS [129, 131] et tPA [118. 125, 126]. Pour ce qui est de

VECAD et PAI-1. il n'y a pas de consensus sur l'effet du flux sur leur niveau d'expression,

cependant Brooks et al. ont aussi observé une diminution pour VECAD et une

augmentation pour PAI-1 après une exposition de 24 heures au flux [116]. L'influence du

flux ne semble pas avoir d'effet sur l'expression de ET-B1 conformément à ce que d'autres

études ont observé [111, 120].

Les effets antithrombotiques d'un flux hémodynamique sont bien connus [71, 86, 87, 128,

150, 159, 182]. C'est pour quoi à la suite de l'exposition au flux hémodynamique

physiologique, on pouvait s'attendre à une diminution de l'expression des gènes pros

thrombotiques PAI-1 et vWF et à une augmentation du gène antithrombotique tPA. À

l'exception de vWF, nous avons observé le contraire. Encore une fois, le fait que nos

résultats ne soient pas significatifs fait en sorte qu'on ne peut tirer de conclusions valables

et il serait important de reprendre ces expériences avec un plus grand nombre

d'échantillons. Dans le même ordre d'idées, il est bien établi que le flux provoque une

production d'oxyde d'azote (NO) chez les CE [82]. Cependant l'effet sur l'expression du

gène eNOS est beaucoup moins clair [111, 125], même si certains travaux ont démontré

une augmentation de son expression [129-131]. Dans notre cas. nous observons une très

grande variabilité de l'expression d'eNOS entre les échantillons, ce qui nous ne permet pas

de faire ressortir une tendance.

Il est intéressant de voir que les tendances d'une diminution de l'expression de PECAM et

VECAD correspondent à l'observation d'une localisation plus cytoplasmique après

l'exposition au flux chez les marquages immunohistochimiques (figures 20 et 21). Tel qu'il

a été mentionné précédemment, ceci nous laisse croire qu'il est possible que les cellules

soient en période d'adaptation au flux et qu'elles soient en réorganisation des éléments du

cytosquelette et des jonctions adhérentes [139]. On peut supposer qu'après cette période

d'ajustement les cellules rétabliront les jonctions adhérentes avec la nouvelle structure du

cytosquelette de façon à rétablir un nouvel état d'équilibre avec l'environnement

hémodynamique.

Le choix des 7 gènes s'est basé d'une part sur leur implication dans la physiologie

endothéliale et d'autre sur l'influence possible du flux sur leur expression, telle qu'il a été

rapporté dans la littérature. Cela dit, le fait que nous n'observons pas de différences

significatives d'expression pour ces gènes n'indique en rien que les cellules n'ajustent pas

leur expression génique en réponse au flux. En effet, bien des facteurs peuvent expliquer

cette absence de différences significatives. Bien sûr. il faut augmenter le nombre

d'échantillons et répéter l'expérience, mais il faut également préciser qu'il est possible que

le flux, aux valeurs utilisées, n'ait pas d'influence sur l'expression de ces gènes précis.

Également, le temps d'exposition au flux n'était peut-être pas suffisant pour atteindre un

état d'équilibre vis-à-vis le changement d'expression de certains gènes. Le fait que les

cellules pourraient être en période d'ajustement au flux et qu'elles ne soient pas totalement

revenues en état d'équilibre par rapport à l'environnement hémodynamique pourrait

expliquer en partie la variabilité de nos résultats. Manifestement, les changements

d'expression génique ne sont pas instantanés et il est fort possible que les échantillons ne

soient pas tous au même stade. Cependant, les variabilités sont également présentes entre

les échantillons qui n'ont pas été soumis au flux. On peut donc suspecter que les techniques

peuvent être en partie à l'origine de la variabilité. Néanmoins, toutes les précautions ont été

prises pour avoir des conditions constantes d'extraction de l'ARN, de RT-PCR et de PCR

quantitative. Les échantillons ont été analysés en duplicata pour la PCR quantitative, mais il

aurait été préférable de faire deux réactions RT-PCR à partir d'une extraction d'ARN pour

s'assurer de l'uniformité de la réaction. Toutefois, la faible quantité d'ARN recueillie à

partir d'une MFT endothélialisée ne le permet pas selon les conditions de RT-PCR que

nous nous sommes fixées, soit 1 ug d'ARN total par réaction. De plus, chaque MFT est

construite à la main, ce qui occasionne des variations inévitables entre elles. Leurs

caractéristiques peuvent différer quelque peu et ces différences peuvent être à l'origine

d'une certaine variabilité des résultats. Par exemple, une petite différence dans la taille de la

MFT peut engendrer des différences significatives des FC. Des différences au niveau des

forces hémodynamiques peuvent aussi provenir du montage du banc hémodynamique. Par

exemple, si la pompe péristaltique ne fournit pas un flux équivalent pour chaque MFT ou

s'il y a des fuites de liquide non perceptibles, des FC différentes seront imposées aux CE.

Il est important de spécifier que nous avons analysé l'effet du flux hémodynamique sur

l'expression génique. Tel qu'il a été spécifier en introduction de ce travail, la FC est la

force qui agit au niveau de l'endothélium, mais nous n'excluons pas que les autres types de

forces engendrées par le flux puisé peuvent aussi avoir un effet sur la réponse des CE. C'est

pour quoi nous référons à l'effet du flux et non pas à l'effet de la FC uniquement. Au cours

de ces expériences, nous avons utilisé un flux physiologique de 10 dynes/cm2 et nous

n'avons pas mesuré les valeurs de pression transmurale.

En somme, pour améliorer la pertinence de ces travaux, il faut absolument répéter

l'expérience, augmenter le nombre d'échantillons et idéalement faire l'expérience en

fonction du temps. C'est-à-dire qu'on devrait analyser les changements d'expression

génique après 2, 4, 8 et 24 heures par exemple. Il serait également logique d'étendre

l'analyse à plusieurs gènes à l'aide de puces à ADN. Cela dit, il faut mentionner la lourdeur

des manipulations reliées aux modèles construits par génie tissulaire. Il serait

techniquement très difficile de produire une grande quantité de vaisseaux reconstruits et de

les exposer simultanément à un flux dans notre appareillage de banc hémodynamique. De

plus, il faut continuer à peaufiner les méthodes d'extraction d'ARN et étudier la pertinence

d'utiliser des systèmes de RT-PCR qui exigent moins de matériel de départ. De cette

manière, nous pourrions obtenir des échantillons de meilleure qualité et en quantité

suffisante pour travailler aisément.

4.2 Barrière hématoencénhalique

Dans le but de mettre au point un éventuel modèle in vitro de BHE humaine, nous

voulions évaluer la possibilité de maintenir l'intégrité la barrière endothéliale d'HUVEC

par la présence de cellules d'astrocytomes. Le matériel biologique nécessaire à l'utilisation

de cultures primaires de CE micros vasculaires cérébrales et d'astrocytes humains est très

difficile à obtenir pour des questions techniques et éthiques. Effectivement, l'obtention de

tissus cérébraux humains est complexe, sans compter que les astrocytes adultes ne se

conservent pas en culture. C'est pourquoi nous voulions nous rabattre sur les HUVEC et

des cellules d'astrocytomes qui sont beaucoup plus facile d'utilisation et à obtenir.

Quelques études ont rapporté avoir provoqué un phénotype de BHE chez des CE d'origine

non cérébrale [98, 144, 176, 177] suite à une coculture avec des astrocytes. D'ailleurs,

compte tenu des difficultés reliées à l'utilisation des cultures primaires d'astrocytes. il est

commun d'utiliser des cellules d'astrocytomes dans des modèles in vitro de BHE [53. 54.

144, 183, 184]. Étant donné qu'une éventuelle mise au point d'un modèle in vitro de BHE

demandera une quantité appréciable de cellules, nous voulions vérifier la possibilité de

provoquer des caractéristiques de BHE chez des HUVEC cultivées en présence de facteurs

solubles de cellules d'astrocytome. Nous avons vérifié la faculté de conservation de la

barrière endothéliale des HUVEC par deux lignées d'astrocytome : une humaine (CRL-

1718) et une de rat C6 (CCL-107). Aucune des deux lignées n'a permis de diminuer la

perméabilité transendothéliale des monocouches d'HUVEC au marqueur protéique BSA-

FITC. L'utilisation de ce marqueur est très répandue dans la mesure de la perméabilité

transendothéliale puisque que l'albumine est la protéine sanguine la plus commune et la

plus abondante. La diminution de la perméabilité transendothéliale est certainement la

caractéristique indispensable de la BHE et c'est pourquoi nous nous sommes précisément

attardés à cette dernière. Sans cette diminution de la perméabilité, l'analyse des autres

attributs de la BHE serait vaine. Nous avons tout de même vérifié si les HUVEC cultivées

avec du milieu conditionné d'astrocytome exprimaient une plus grande quantité de

jonctions serrées par le marquage immunohistochimique de la protéine ZO-1 [30, 31, 34].

Nous n'avons observé aucune différence entre les contrôles et les HUVEC cultivées avec

du milieu conditionné d'astrocytome. Nous avons choisi les deux lignées d'astrocytome du

fait que ATCC stipule qu'elles ont conservé une morphologie astrocytaire et qu'elles

exprimaient le marqueur glial GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein). Cependant, nous

avons été incapables d'observer un marquage immunohistochimique non équivoque de

GFAP pour les deux lignées. L'efficacité de notre anticorps et de notre méthode de

marquage a été validée sur des coupes congelées de cerveaux de souris (figure 26). A la

suite de ces observations, nous pouvons supposer que l'incapacité de réduire la

perméabilité transendothéliale des HUVEC par le milieu conditionné d'astrocytome peut-

être dû au fait que ces cellules cancéreuses présentent un état dédifférencié et qu'elles

n'expriment plus les facteurs nécessaires à l'induction du phénotype de BHE chez les CE.

Il serait donc intéressant de répéter les tests de perméabilité des HUVEC avec d'autres

cellules d'astrocytome et surtout avec un contrôle positif comme des astrocytes primaires

de fœtus de souris et des CE micros vasculaires cérébrales humaines pour valider les

résultats obtenus. Même si nous avons été incapables de démonter une diminution de la

perméabilité des HUVEC, nos résultats ne nous permettent pas de conclure qu'il n'est pas

possible de diminuer la perméabilité transendothéliale des HUVEC. Dans la mesure où

aucune composante de la BHE n'était présente dans ces expériences, il n'est pas surprenant

de ne pas avoir observé de diminution de la perméabilité transendothéliale. Le

développement d'un modèle in vitro de BHE humaine par génie tissulaire nécessitera fort

probablement la présence d'au moins un type cellulaire de la BHE native. Il est possible

qu'il soit plus efficace de mettre le modèle au point avec des cellules de rongeurs avant de

passer à des cellules humaines, et ce, en dépit des différences physiologiques interespèces

et du fait que les conditions établies avec des cellules de rongeurs devront être adaptées

pour les appliquer aux cellules humaines.

Conclusion

Notre objectif principal était d'évaluer la réponse des CE. ensemencées dans notre

modèle de la MFT. à la suite d'une exposition de 4 heures à un flux hémodynamique

physiologique. La réponse a été évalué d'une part par la morphologie des CE analysée par

microscopie et d'autres parts par les changements du niveau d'expression de gènes

impliqués dans la biologie des CE. La morphologie des CE soumises au flux est très

positive. L'adaptation du cytosquelette et de la morphologie cellulaire suppose que la MFT

constitue un substrat adéquat pour l'étude des CE en condition de flux hémodynamique.

Malgré que des tendances aient été perçues, nous n'avons pas observé de changements

significatifs des niveaux d'expression des gènes analysés. La grande variabilité de nos

résultats a rendu l'analyse de ces derniers problématique et plus ou moins pertinente.

Cependant, la poursuite des expériences et l'amélioration des techniques permettront sans

aucun doute d'en arriver à des conclusions plus solides. La répétition de l'expérience et

l'augmentation des échantillons sont les perspectives immédiates de ce travail.

Notre objectif secondaire était d'évaluer la possibilité de diminuer la perméabilité

tansendothéliale in vitro d'HUVEC cultivées dans un milieu conditionné d'astrocytome.

Nous n'avons pas été en mesure de provoquer cette diminution de la perméabilité des

HUVEC par la présence de cellules d'astrocytome. Le développement d'un modèle in vitro

de BHE humaine par génie tissulaire demandera une source de cellules possédant les

caractéristiques nécessaires à l'induction du phénotype de BHE. Nous en sommes au tout

premier pas du développement d'un tel modèle et les avenues pour y arriver restent à

explorer. Bien qu'il soit compréhensible de tenter d'utiliser des types cellulaires plus

facilement accessibles et plus susceptibles à la culture cellulaire, il ne s'agit peut-être pas

d'une solution possible. Il reste énormément de pain sur la planche pour en arriver à un

modèle humain in vitro, tridimensionnel et perfusé. Cependant, la contribution que pourrait

avoir un tel modèle à la recherche mérite d'y investir des efforts.

L'application du génie tissulaire au développement de modèles d'étude in vitro innovateurs

est certainement un outil de taille pour les chercheurs. Dans des contextes où la recherche

in vivo est ardue, voire même impossible, les modèles in vitro conçus par génie tissulaire

constituent une évolution par rapport à la culture cellulaire traditionnelle qui est souvent

loin des conditions physiologiques naturelles. Notre modèle de la MFT possède plusieurs

caractéristiques lui conférant un potentiel d'utilisation manifeste pour la recherche. Sa

composition en MEC endogène tridimensionnelle, la possibilité d'y faire circuler un flux

hémodynamique et sa relative simplicité font en sorte qu'il pourrait servir à plusieurs

champs d'études. Mise à part l'étude de la biologie des CE et des forces hémodynamiques,

on peut citer l'exemple de l'étude de l'artériosclérose, de l'extravasation des cellules

cancéreuses [65]. de l'angiogenèse. du remodelage vasculaire. de la pression artérielle, des

prothèses vasculaires artificielles, du génie tissulaire. de la BHE et bien d'autres champs

d'études impliquant les CE.

Annexe 1

Graphique de l'expression du gène GAPDH par PCR quantitative. Les colonnes représentent la valeur de cycle du seuil en nombre de cycles (Ct : cycle threshold). Ces valeurs sont inversement proportionnelles à la quantité d'ADN initial et l'incertitude sur la mesure est minimisée (<5%). Il n'y a pas de différence significative entre la condition statique et avec flux (4 h. 10 dynes/cm ) p>0,05. n = 3 pour chaque condition et mesures faites en duplicata.

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