Stable genetic transformation of Jatropha curcas via Agrobacterium tumefaciens-mediated gene

transfer using leaf explantsNitish Kumara,1, K.G. Vijay Ananda, D.V.N. Sudheer Pamidimarria, Tanmoy Sarkara,Muppala P. Reddya, ,2∗ , T. Radhakrishnanb, Tanushri Kaulc, M.K. Reddyc, Sudhir K. Soporic

a Discipline of Wasteland Research, Central Salt & Marine Chemicals Research Institute (Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi), Bhavnagar, Gujarat 364002, Indiab National Research Center for Groundnut, Junagadh, Gujarat, Indiac Plant Molecular Biology Division, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, New Delhi 110067, India

Diajukan Kepada Program Studi Bioteknologi Fakultas Sekolah Pasca Sarjana

Universitas Gadjah Mada pada Tanggal 19 April 2013untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Rekayasa Genetika

KELOMPOK DUA- Muhammad Yusro 12/338637/PMU/07365- Diana Larasati G 12/338669/PMU/07367- Sri Lestari 12/338674/PMU/07368- Nur Rohmah 12/338710/PMU/07375- Weny Widya N 12/338720/PMU/07378-Ratih Feraritra 12/338744/PMU/07385-Dinihari Indah K. 12/338855/PMU/07399- Lusty Istiqomah 12/338752/PMU/07387- Arung Desah P 12/338787/PMU/ 07391- Medina Uli Alba S 12/338866/PMU/07404

LATAR BELAKANG

MAHAL

LANGKA

Alternative renewable energysources

BIOFUEL J. CURCAS

Stres biotik maupun abiotik

membatasi potensi hasil

Transgenik yang tahan atau toleran

terhadap cekaman

biotik atau abiotik

Agrobacterium-mediated genetic transformation

Lebih fleksibel (biaya, perawatan & produksi)dapat ditanam di berbagai jenis lahan

Agrobacterium Tumefaciens

Agrobacterium tumifaciens

Metode transfer gen yang paling banyak digunakan untuk perbaikan sifat tanaman

• Mudah • Efektivitas biaya• Transgen re-arrangement relatif rendah• Mampu mentransfer segmen DNA yg panjang

Teknik rekayasa genetika

Studi TerkiniPenelitian selama 2 dekade telah gagal membuat suatu protokol regenerasi J. circas secara in vitro

Menggunakan ekplan dari kotiledon

• Efisiensi transformasi rendah• Menghasilkan variabilitas genetik• Menghilangkan karakteristik tanaman targetMengekplorasi kemungkinan regenerasi

tanaman melalui direct organogenesis dari ekplan daun Mengoptimalkan beberapa parameter penting untuk memaksimalkan efisiensi transformasi

BAHAN DAN METODEPlant material

Strain Agrobacterium dan vektor plasmid

Determinasi level fitotoksik dari antibiotik

Transformasi

Evaluasi parameter transformasi

Analisis transforman

Analisis molekuler

Multiplikasi dan pembuatan tanaman transforman

Plant material

Kultur tunas J. curcas (umur 3-4 tahun)

Disayat (3–4 cm)

Sterilisasi (HgCl, 15 menit) dan

dicuci

Kultur(15 ml medium

agar)

4 minggu diambil tunas

sebagai eksplan

Regenerasi eksplan ke medium

pH 5,7; 25±2◦C under a 16/8 h (day/night)

Fotoperiod dengan white fluorescent

lamps

pCAMBIA1304 T-DNA cassette.

- CaMV35S 35S promoter from cauliflower mosaic virus; - S-DREB2A, sense-dehydration responsive

element binding protein gene- GUS, -glucuronidase gene

Strain Agrobacterium dan vektor plasmid

Agrobacterium strain LBA 4404 YMB medium, pada kondisi gelap 28ºC

DETERMINASI LEVEL FITOTOKSIK ANTIBIOTIK

• Higromycin0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 50 µg/ml

• Cephalexin250, 500, 750, 1000 µg/ml

• Cefotaxime250, 500, 750, 1000 µg/ml

• Carbenicilin250, 500, 750, 1000 µg/ml

TRANSFORMASISingle cell

koloni Agrobacterium

• 25gml/1 hygromycin • Tumbuhkan pada ruang gelap(16-18 h, 28ºC, 180

rpm)

Eksplan daun

Ditumbuhkan di medium YMB

Sentrifugasi(6000 rpm, 10min)Pelet sel dicuci dengan YMB cair (2x)Suspensi

AgrobacteriumBlotted dry pada kertas steril

Kepadatan sel bakteri 109

sel/ml+

Transfer ke medium regenerasi tunas (- hygromycin)

co-kultivasiEksplan daun

dicuci air destilasi + 500 g/ml cefotaximeBlotted dry pada kertas steril

Transfer ke medium

regenerasi tunas (0.7% agar-solidified)

• MS garam, 3% sukrosa

• 2.27 M TDZ• 500 g/ml cefotaxime

4 minggu

Eksplan disubkulturkanpada medium

segar

• Cefotaxime• 5 µg/ml hygromycin

4 minggu

Tunas resisten hygromycindisubkulturkan

Regenerasi bakal tunas

Tunas dapat dihasilkan dari ekplan daun (10–12 tunas/eksplan)

Evaluasi pengaruh antibiotik terhadap eksplan dan kultur tunas• Antibiotik hygromycin efektif pada konsentrasi

rendah (2.5 µg/ml) • Tiga antibiotik lainnya (sporidex,

carbenicillin, dan cefotaxime) eliminasi Agrobacterium500 g/ml cefotaxime paling efektif mengeliminasi bakteri

HASIL & PEMBAHASAN

Hygromycin resisten pada tunas transforman

• Tunas dapat tumbuh dari ekplan daun (10–12 tunas/ekplan) tanpa adanya Agrobacterium pada medium rendah hygromycin

• Ekplan tidak dapat tumbuh menjadi tunas pada medium yang ditambahkan 5 µg/ml hygromycin (kontrol negatif)

• Ekplan yang dikultivasi dengan Agrobacterium menghasilkan 3–4 tunas per ekplan dan 20–30% memberikan respon positif terhadap medium mengandung hygromycin

Induksi tunas adventif dari tunas daun yang tidak

diinfeksi Agrobacterium

Ekplan daun yang diinfeksi

Agrobacterium

Seleksi tunas adventif pada

medium mengandung hygromycin

Ekspresi GUS pada tunas transforman

• GUS-positif warna biru dapat dideteksi secara visual pada seluruh jaringan tanaman transgenik (pewarnaan dengan reagen X-gluc

• Tidak adanya warna biru pada jaringan non-transforman

Eksplan daunNon

transforman

Blue GUS spot pada ekplan daun transforman

Tabel 1. Pengaruh berbagai parameter terhadap transformasi (%) pada eksplan daun J. curcas.

Karakterisasi Molekuler dan Tanaman Transforman

(a) Analisis PCR untuk mendeteksi gen GUS (400 bp)(b) Analisis PCR untuk mendeteksi gen S-DREB2A (866 bp) pada tanaman transgenik.Lanes: • M molecular size marker

(100 bp ladder)• 1 kontrol negatif

(tanaman non-transgenik)• 2 kontrol posiftif

(plasmid DNA)• 3–12 tanaman transgenik(c) Analisis DNA gel blot hibridasasi pada tanaman transgenikLanes: • 1 plasmid DNA• 2 tanaman non-transgenik• 3–7 tanaman transgenikGenomik DNAs dipotong oleh HindIII dan dihibridisasi pada S-DREB2A probe.

Multiplikasi dan Pengembangan Tanaman Transforman

Multiplikasi dari tanaman resisten hygromycin

Pemanjangan tunas

AklimatisasiPerakaran

• Hanya tunas yang berasal dari line transgenik secara konsisten menunjukkan hasil amplifikasi PCR (+) dan hibridasasi DNA gel blot (+)

• Tunas (0,3-0,5 cm) ditransfer kedalam media pemanjangan tunas,

• Sekitar 40% akan tumbuh akar • Setelah 6-8 minggu 50-60% tanaman berhasil

diaklimatisasi dan ditanam ke tanah

Protokol menggunakan Agrobacterium-mediated genetic transformation dan

regenerasi tanaman J. curcas menggunakan eksplan daun telah

berhasil dilakukan

KESIMPULAN

SEKIAN DAN

TERIMA KASIH

Senyawa phenol

acetosyringone

Stok volume dengan air destilasi yang

diautoklafAlikuot

ditambahkan ke medium

regenerasi

Dilarutkan dalam etanol

Evaluasi dan optimasi berdasarkan tunas yang

bertahan hidup pada medium selektif

Ekspresi gen penanda dan positif dengan PCR

ANALISIS DATA :• Rancangan percobaan

(RAL) analisis ANOVA

• Perbedaan diantara rataan Duncan’s multiple range test (SPSS ver 7.5)

Evaluasi faktor-faktor yang mempengaruhi transformasiPARAMETER :1. Lama periode prekultur

• 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, atau 7 hari

2. Fase pertumbuhan bakteri• Nilai OD 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.8, atau 1.0 pada 600 nm

3. Durasi infeksi• 10, 20, atau 30 menit

4. Metode perlukaan (wounding)• Glass bead, manual pricking, non-wounding

5. Lama periode co-kultivasi• 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, atau 7 hari

6. pH medium co-kultivasi• 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, atau 6.0

7. Konsentrasi acetosyringone• 50, 100, 200, atau 400 M

Analisis Transforman

Histochemical GUS Assay

Inkubasi(1 malam, 37ºC) pada larutan X-

gluc

Jaringan dauntanaman tranforman

Ekspresi GUS (mikroskop

stereo-zoom)

Jaringan dauntanaman non tranforman

• 100mM sodium phosphatase

• 1mM EDTA• 0,5 mM potassium ferricyanide

• 0,5 mM triton X-100• 1 mM X-gluc

Klorofil dihilangkan (dicuci 70% alkohol)

Molekuler AnalisisPCR dan

Karakterisasi

Amplifikasi PCR(gen S-DREB2A dan

GUS)Thermal cycler

Elektroforesis

Tanaman non transforman

Isolasi DNADaun muda

Gel didokumentasikan dengan gel documentation system (Syngene, USA)

Gen S-DREB2A :5-GATCCCTCGAGATGGAGCGGGGGGAGGG-3 5-TCCGAGGTACCCTAATAGGAGAAAAGGCTA-3

Gen GUS :5-GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG-35-TGGATCCCGGCATAGTTAAA-3

Inkubasi(1 malam, 37ºC)

dengan HindIII (10 units/g of DNA)

Separasi (0.8% gel agarose

DNA blotted (muatan positif) Hybond N membrane

cross-linked ke membran oleh UV

irradiationHybridisasi ke

AlkPhosNon-radioaktif yang dilabel DNA probe

50g of genomic DNA

DNA gel blot hibridisasi

Tanaman transforma

n

50 ng DNA

15 µl PCR reaction mixture10 mM TRIS-HCL (pH 9)50 mM KCL 0,1%0,2 mM/ dntp3,0 mM MgCl20,4 primer1 unit Taq DNA polimerase

Amplifikasi

S-DREB2A (866 BP)

Gus (400 bp)

• Inisiasi Denaturasi 94°C selama 4 menit, 35 siklus 94°C selama 30 detik

• Primer annealing 55° selama 1 menit• Extension 72°C selama 1 menit• Final Extension 72°C selama 1 menit

Gel Elektroforesis

1,5% agarose1 x TAE buffer, 80 V selama 45 menitStained: 0,5 µg/ml ethidium bromide selama 10 menit

Molekuler Analisis

Vektor pCAMBIA