Phytothérapie (2012) 10:151–160© Springer-Verlag France 2012DOI 10.1007/s10298-012-0704-3

Article original

Pharmacognosie

Activités antioxydante, apoptotique et antiproliférative de Tetraena gaetula (Emb. & Maire) Beier & Thulin et de Berberis hispanica Boiss. & Reut. originaires du Maroc

A. El H. El Youbi1,2, D. Bousta2,*, B. Jamoussi3, H. Greche2, L. EL Mansouri2, J. Benjilali2, S.H. Soidrou2

1LMBF, faculté des sciences et techniques, Fès, Maroc2LPAMSN, institut national des plantes médicinales et aromatiques, Taounate, Maroc3Laboratoire de chimie analytique, institut supérieur de l’éducation et de la formation continue, Tunis, TunisieCorrespondance : dalila_bousta@yahoo.fr

Résumé : Les extraits aqueux (EA) de la partie aérienne de Tetraena gaetula et de l’écorce de la racine de Berberis hispa-nica ont montré d’intéressants profils immunomodulateurs dans nos travaux précédents [16,17]. Dans ce sens, nous avons entrepris des études sur les activités antiprolifératives et apoptotiques d’EA de Tetraena gaetula et de Berberis his-panica sur les sous-populations des leucocytes des rats, après avoir étudié leur pouvoir antioxydant in vitro. Nous rap-portons ici que l’administration du peroxyde d’hydrogène « H2O2 » à une dose de 34 mg/kg de poids corporel (p.c.) de l’animal, utilisé comme lot témoin, induit une prolifé-ration incontrôlée du cycle cellulaire des sous-populations leucocytaires. Nous avons également noté une activité anti-proliférative importante après le traitement avec l’EA de Tetraena gaetula à 300 mg/kg, p.c., avec un arrêt du cycle en phase G0/G1 (85 %) et une apparition d’un pic pré-G0/G1 (14 %). Dans cette étude, nous avons également évalué, au moyen de deux tests, les activités antioxydantes (test DPPH) et apoptotiques (annexine V-FITC/IP). À ce propos, nos extraits ont montré une activité antioxydante, avec une plus grande activité in vitro de l’EA de Berberis hispanica (IC 50 = 0,2 mg/ml). Nous avons également noté une activité apoptotique in vivo des deux extraits de Berberis hispanica et de Tetraena gaetula respectivement à 80 et 300 mg/kg, p.c., probablement via des voies différentes. L’analyse phyto-chimique a révélé la présence d’alcaloïdes et des coumarines dans l’EA de Berberis hispanica, de saponines de type tri-terpénoïde et d’alcaloïdes à noyau tropolone dans l’EA de Tetraena gaetula. En conclusion, notre travail a mis en évi-dence le pouvoir antioxydant, antiprolifératif et apoptotique des EA de Berberis hispanica et de Tetraena gaetula, in vitro et in vivo. Ces résultats peuvent contribuer à l’élaboration de nouveaux médicaments anticancéreux d’origine naturelle complémentaires à la médication chimique.

Mots clés : Tetraena gaetula – Berberis hispanica – Anti-oxydant – Apoptotique – Antiprolifératif

Antioxidant, antiproliferative and apoptotic activities of Tetraena gaetula (Emb. & Maire) Beier & Thulin and Berberis hispanica Boiss. & Reut. from Morocco

Abstract: The aqueous extracts (AE) of aerial part of Tetra-ena gaetula and root bark of Berberis hispanica showed some interesting immunomodulatory activities in our pre-vious works [16,17]. In this sense we undertook studies on the antiproliferative and apoptotic activities of AE of Tetraena gaetula and Berberis hispanica on leukocyte subpopulations in rats, after studying their antioxydant power in vitro. Here, we report that administration of hydrogen peroxide “H2O2” at a dose of 34 mg/kg of animal body-weight (b.w.), used as control, causes uncontrolled proliferation of the cell cycle of leukocytes subpopulation. The higher antiproliferative activity was observed with the AE of Tetraena gaetula (300 mg/kg, b.w.), inducing a cycle arrest in G0/G1 phase (85%) with the appearance of sub-G0/G1 peak detection (14%) for Tetraena gaetula. According to the antioxydant (DPPH test) and apoptotic profiles (annexine V-FITC/IP) tests, our extracts show a radical-scavenging power with a higher in vitro activity for AE of Berberis hispanica (IC 50 = 0,2 mg/ml). We also noted an in vivo apoptotic activity of AE of Berberis hispanica and Tetraena gaetula, respectively at 80 and 300 mg/kg, b.w. in the same order, probably by different pathways. Further, the phytochemical analysis revealed the presence of alkaloids and coumarins in AE of Berberis hispanica, and triterpenoid saponins and tropolone-alkaloids in the Tetraena gaetula ones. Therefore, this work demonstrated an antioxidant, antiproliferative and apoptotic activities of AE of Berberis hispanica and Tetraena gaetula, in vitro

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and in vivo. These results may contribute to the devel-opment of natural anticancer-drugs, complementary to chemical medication.

Keywords: Tetraena gaetula – Berberis hispanica – Anti-oxidant – Apoptotic – Antiproliferative

IntroductionLes plantes médicinales ont été employées pendant des siècles comme remèdes pour les maladies humaines, parce qu’elles contiennent des composants de valeurs théra-peutiques. Toutefois, malgré les énormes progrès réalisés par la médecine moderne dans la prise en charge des mala-dies, la phytothérapie est devenue, à l’heure actuelle, l’une des issues les plus empruntées pour se soigner et lutter contre les maladies chroniques telles que le cancer.

Les plantes immunomodulatrices, dans le concept d’acti-vité globale immunostimulante ou immunosuppressive, agissent sur plusieurs facteurs de l’immunité extra- et intracellulaire, et par conséquent, elles exercent une action directe et/ou indirecte sur les cellules tumorales [7,24]. De ce fait, leurs propriétés thérapeutiques, telles les activités antioxydantes et antiprolifératives, ne sont pas directe-ment liées au cancer, mais à des modulations pharmaco-logiques d’ordre immunitaire pour combattre sa propaga-tion [19,58,60].

Dans le présent travail, nous nous sommes intéressés aux propriétés antioxydantes, apoptotiques et antiprolifé-ratives de deux plantes (Tetraena gaetula [Emb. & Maire] Beier & Thulin et Berberis hispanica Boiss. & Reut), précé-demment décrites par leurs activités immunomodulatrices [16,17], afin de mettre au point des traitements naturels complémentaires à la médication chimique utilisée dans le traitement du cancer.

Matériels et méthodes

Matériel

Matériel animal

L’étude a été réalisée sur des rats de souche « Wistar » dont le poids varie entre 130 et 170 g. Ces animaux ont été fournis par le centre ECWP « Emirates Center for Wildlife Propagation » de la région de Missour (Maroc). Les animaux sont logés dans des cages métalliques et main-tenus à une température ambiante de l’ordre de 21 ± 2 °C et à une photopériode de 12 heures/12.

Matériel végétal

La partie aérienne de Tetraena gaetula est récoltée à Boudnib (région d’Errachidia, Sud du Maroc) durant la saison de végétation 2007 ; l’écorce de la racine de Berberis hispa-nica est collectée dans la région d’Immouzer-Mermoucha

(Centre Nord du Maroc) durant la saison de végéta-tion 2008. Des spécimens de ces plantes sont déposés à l’herbier de l’Institut national des plantes médicinales et aromatiques, Taounate (exsiccata INP210 et INP76 respectivement pour Tetraena gaetula et Berberis hispa-nica). Les échantillons ont été lavés à l’eau distillée, puis séchés à l’ombre à l’abri de la lumière et à température ambiante. Après séchage, ces échantillons ont été broyés pour obtenir une poudre fine, utilisée pour la préparation des extraits.

Réactifs

Les produits utilisés sont :– 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) (Sigma Aldrich,

Allemagne) ;– l’acide ascorbique et l’hydroxytoluène butylé (BHT)

(Sigma Aldrich, Allemagne) ;– kit Annexine V-FITC, IP (Immunotech, France) ;– kit DNA Pre, IP (Immunotech, France).

Méthodologie

Préparation des extraits aqueux (EA)

Des macérations aqueuses de Tetraena gaetula et de Berberis hispanica à 12 % ont été préparées dans du tampon phosphate salin (PBS, pH : 7,4), suivi d’une agita-tion pendant deux heures. L’ensemble est gardé pendant une nuit à 4 °C. Ensuite, les solutions sont centrifugées à 2 700 g durant 15 minutes, et les surnageants sont filtrés. Les extraits obtenus après filtration sont conservés à –20 °C jusqu’à utilisation.

Criblage phytochimique

Les essais phytochimiques ont été menés selon les techni-ques décrites par Bruneton [8], Dohou et al. [15] et Karumi et al. [31]. Ces essais consistent à mettre en évidence la présence d’un certain nombre de groupes chimiques des EA de Tetraena gaetula et de Berberis hispanica et réputés pour leurs effets pharmacologiques étudiés. Les réactifs de caractérisation utilisés nous ont permis de mettre en évidence les groupes chimiques suivants : les alcaloïdes (Dragendorff et de Mayer), noyau tropolone, saponines–triterpènoïdes (Liebermann Burchard), caroténoïdes–triterpènes (Carr et Price), coumarines, flavonoïdes (cyanidine), tanins (chlorure ferrique), quinones (Born-traeger), anthraquinones et anthocyanes.

Activité antioxydante

Nous avons évalué les activités antioxydantes des extraits des plantes étudiées par le biais de la méthode du 1,1-Di-phenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) [6,13,57]. La solution de DPPH est obtenue en dissolvant 2 mg de la poudre

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dans 50 ml de l’éthanol (EtOH). Les antioxydants de référence, tels l’acide ascorbique, le BHT et les extraits testés, sont ajoutés à la solution de DPPH à différentes concentrations. La mesure de la variation de l’absorbance a été effectuée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 517 nm, 30 minutes après l’ajout des extraits. Le graphique de la variation de l’absorbance en fonc-tion de la concentration a permis de déterminer l’IC 50 (concentration correspondant à 50 % d’inhibition). Les pourcentages d’inhibition ont été calculés en utilisant la formule suivante [59] :

% d’inhibition = {[absorbance (témoin) – absorbance (antioxydant)]⁄absorbance (témoin)} × 100

Pour mieux caractériser le pouvoir antioxydant, deux autres paramètres ont été calculés [44] :

– concentration effective à 50 % (EC 50) [EC 50 = IC 50/masse DPPH en mg] ;

– pouvoir antiradicalaire (APR) [APR = 1/EC 50].

Quantifi cation de l’apoptose

Vingt-quatre heures après le traitement avec les extraits de Tetraena gaetula et de Berberis hispanica, les animaux sont anesthésiés par voie intrapéritonéale « i.p. » par du pentobarbital sodique à raison de 30 mg/kg p.c. Le sang est récupéré dans des tubes héparinés ; les héma-ties sont lysées par l’ajout du chlorure d’ammonium. Les cellules ajustées à 5,106 cellules/ml sont incubées avec 1 µl d’annexine V-FITC et 5 µl de l’iodure de propidium (IP) pendant 15 minutes à l’obscurité et au froid. Après l’incu-bation, 400 µl de tampon binding ont été ajoutés. Le pour-binding ont été ajoutés. Le pour-bindingcentage des cellules préapoptotiques, postapoptotiques et nécrotiques est déterminé par l’analyse au cytomètre en flux (CMF) [CMF de type Epics-XL MC]. L’acide buty-rique (5 mg/kg, p.c.) a été utilisé comme substance de référence [61].

Cycle d’ADN

La répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire a été étudiée par cytométrie en flux en

utilisant le kit DNA Prep (Immunotech, France). Cette méthode consiste à marquer l’ADN par l’IP, qui s’intercale entre les bases de l’ADN après la dégradation de l’ARN par l’ARNase.

Cette technique révèle les différents stades de multipli-cation cellulaire : pré-G0/G1 : (< 2 N) ; G0/G1 : (= 2 N) ; S : (2 < N < 4), G2/M : (= 4 N).

Au cours de cette étude, nous avons testé les effets de Tetraena gaetula et de Berberis hispanica sur la proliféra-tion cellulaire anarchique induite in vivo par l’utilisation de l’H2O2 [28]. En effet, les animaux ont été repartis en quatre lots de cinq animaux. Chaque lot reçoit pendant quatre jours les traitements suivants :

– lot I : NaCl à 0,9 % ;– lot II : H2O2 à la dose 34 mg/kg, p.c. ;– lots III et IV : EA de Tetraena gaetula et de

Berberis hispanica ; 30 minutes après, les animaux reçoi-vent un second traitement par l’H2O2.

Étude statistique

Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Le test t de Student t de Student ta été utilisé pour comparer statistiquement les résultats obtenus. Les valeurs de p ≤ 0,05 sont considérées statisti-quement significatives.

Résultats

Screening phytochimique

Les essais phytochimiques effectués sur l’extrait de Berberis hispanica ont révélé la présence de couma-rines et surtout celle d’alcaloïdes de manière abondante (Tableaux 1 et 2). La chromatographie sur couche mince de l’extrait dans le système éluant AcEt/MeOH/NH40H (9:1:1) présente de nombreuses taches orange après révélation avec le réactif de Dragendorff ; ce qui signifie la présence des alcaloïdes bases (Tableau 2). Les alcaloïdes sels ont été mis en évidence par le réactif de Mayer (Tableau 1). En revanche, l’exposition aux vapeurs de NH3 sur les CCM

Tableau 1. Screening phytochimique de l’extrait de Berberis hispanica

Plante

Alcaloïdes Coumarines

Alc

aloï

des

à no

yau

trop

olon

e

Qui

none

s

Ant

hraq

uino

nes

Ant

hocy

anes

Flav

onoï

des

Sapo

nosi

des

Tanins

Stér

ols-

trite

rpèn

es

Car

otén

oïde

s-tr

iterp

ènesRéactif

de Mayer « sels »

Réactif de Dragendroff « bases »

CCM Tubes

Gal

lique

s

Cat

èchi

ques

Berberis hispanica +++ +++ ++ ++ – – – – – – – – – –

NB : la présence des composés chimiques est : (+++) importante, (++) : modérée, (+) légère, (–) absence.

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Tableau 2. Révélation sur CCM des coumarines et des alcaloïdes de l’extrait de Berberis hispanica

Plante Coumarines Alcaloïdes

Berberis hispanica

Couleurs après révélation au NH3

Types de composés possibles

Couleurs après révélation au réactif de Dragendorff

Types de composés possibles

Rf Visible 365 nm Rf Visible

0.46 Jaune Bleu CoumarinesChristelle-Chantal et al. [12]

0.08 Orange NI0.59 Jaune Bleu 0.35 Orange NI0.63 Jaune Bleu 0.44 Orange NI

0.56 Orange Chlorhydrate de berbérineChristelle-Chantal et al. [12]

NI : non identifié.

montre, après visualisation sous UV à 365 nm, une appa-rition de taches bleues fluorescentes ; cela confirme la présence de coumarines (Tableau 2). Ces résultats ont été confirmés par une autre technique décrite dans les travaux de Benmehdi [5] (Tableau 1). Les tests de révélation des quinones, des anthraquinones, des anthocyanes, des flavonoïdes, des saponines–triterpènoïdes, des carotènes–triterpènes, des alcaloïdes à noyau tropolone et des tanins ont été négatifs dans l’extrait de Berberis hispanica. Par ailleurs, la révélation des mêmes composés chimiques étudiés dans l’extrait de Tetraena gaetula révèle l’absence de toutes les familles chimiques citées, à l’exception de saponines–triterpènoïdes, des alcaloïdes à noyau tropolone (Tableau 3) et des flavonoïdes de types flavones, ayant été antérieurement démontrés [16].

Activité antioxydante

Les EA de Tetraena gaetula et de Berberis hispanicapossèdent une activité antioxydante dose-dépendante (Figs. 1,2). Nous avons noté que le pouvoir antioxydant de Berberis hispanica est plus important que celui du Tetraena gaetula avec une IC 50 de 0,2 mg/ml et un APR de 0,2 mg/ml, suivi par Tetraena gaetula avec une IC 50 de 0,8 mg/ml et un APR de 0,047 mg/ml (Tableau 4). En comparaison avec les antioxydants standard, les deux extraits testés s’avèrent moins actifs.

Activité apoptotiqueL’évaluation de l’activité apoptotique des EA de Tetraena gaetula et de Berberis hispanica a été réalisée par

Tableau 3. Screening phytochimique de l’extrait de Tetraena gaetula

Plante

Alcaloïdes Coumarines

Alc

aloï

des

à no

yau

trop

olon

e

Qui

none

s

Ant

hraq

uino

nes

Ant

hocy

anes

Sapo

nine

s-tr

iterp

ènoï

des

Car

otén

oïde

s-tr

iterp

ènes

Réactif de Mayer « sels »

Réactif de Dragendroff « bases » CCM Tubes

Tetraena gaetula – t – – + – – – +++ –

NB : la présence des composés chimiques est : (+++) importante, (++) modérée, (+) légère, t : trace, (–) absence.

Tableau 4. Activité antioxydante des extraits aqueux de Berberis hispanica et Tetraena gaetula

IC 50 (mg/ml) EC 50 APR

Berberis hispanica 0,200 ± 0,010 5,000 ± 0,002 0,200 ± 0,001Tetraena gaetula 0,855 ± 0,050 21,370 ± 0,002 0,047 ± 0,000Acide ascorbique 0,055 ± 1,750 1,370 ± 0,167 0,720 ± 0,002BHT 0,070 ± 1,050 1,750 ± 0,070 0,570 ± 0,010

EC 50 = IC 50/masse du DPPH en mg ; APR = 1/EC 50.

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le biais du CMF. Ainsi, le double marquage par l’annexine V-FITC/IP nous a permis une distinction évidente de quatre types de populations cellulaires : des cellules vivantes « N-AP » (annexine V-FITC–/IP–), des cellules apoptotiques précoces « Pr-AP » (annexine V-FITC+/IP–), des cellules apoptotiques tardives « Ps-AP » (annexine V-FITC+/IP+) et des cellules nécrotiques « Nec » (annexine V-FITC–/IP+).

Les résultats de la Figure 3a soulignent une corrélation significative entre l’administration de l’EA de Berberis hispa-nica et l’induction de la mort cellulaire en comparaison avec le lot témoin. Nous notons des effets apoptotique et nécrotique prononcés à la dose de 80 mg/kg, p.c. (Pr-AP : 36 % ; Ps-AP : 33 % et Nec : 60 %) (Fig. 4d).

Cependant, l’administration de l’EA de Tetraena gaetulainduit un profil différent après l’administration de la dose de 300 mg/kg, p.c. (Fig. 3b), un stade précoce d’apoptose (Pr-AP : 7 %) et un stade de nécrose (Nec : 3 %) (Fig. 4c).

Eff ets antiprolifératifs des extraits de Berberis hispanica et de Tetraena gaetula in vivo sur les subpopulations leucocytaires (Figs. 5a,b).

Le suivi des quantités d’ADN des leucocytes périphériques dans les différents stades (G1, S et G2/M) a révélé des arrêts différents du cycle cellulaire en fonction de l’extrait étudié en comparaison avec le lot traité avec l’H2O2 in vivo [G1 : 57 % ; S : 22 % et G2/M : 21 %].

Dans ce sens, l’administration de l’extrait de Berberis hispanica à 80 mg/kg, p.c. induit un arrêt du cycle cellulaire des leucocytes en phase G0/G1 [G0/G1 : 85 %], avec une accumulation des cellules en phase S [S : 15 %] (Figs. 5a et 6d). Cependant, l’administration de l’EA de Tetraena gaetula à 300 mg/kg, p.c. provoque un arrêt du cycle cellulaire leucocytaire au stade G1, avec une induc-tion d’apoptose au stade pré-G0/G1 [38,56], correspondant aux cellules caractérisées par une quantité d’ADN (N < 2) [pré-G0/G1 : 14 % ; G1 : 85 %] (Figs. 5b et 6c).

Fig. 2. Activité antioxydante de l’extrait aqueux de Berberis hispanica, exprimée par l’inhibition de l’activité radicalaire du DPPH

Fig. 1. Activité antioxydante de l’extrait aqueux de Tetraena gaetula, Tetraena gaetula, Tetraena gaetula exprimée par l’inhibition de l’activité radicalaire du DPPH

(a)

(b)

Fig. 3. E� ets de l’extrait aqueux de Berberis hispanica (a) et de Tetraena gaetula (b) sur l’apoptose des cellules leucocytaires, détectée par un comarquage à l’annexine V-FITC/IP. Les valeurs représentent les pourcentages cellulaires en phases d’apoptose et de nécrose. N-Ap : non apoptotique, Pr-Ap : proapoptotique, Ps-Ap : postapoptotique, Nec : nécrose

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DiscussionDans une étude antérieure [16], nous avons relevé par le biais de criblage phytochimique quelques principales familles chimiques existantes dans l’EA de Tetraena gaetula. Dans ce sens, d’autres investigations d’ordre chimique ont été réalisées pour élucider les différents composants de Berberis hispanica et également pour compléter le travail initié chez Tetraena gaetula [16].

Dans notre étude, nous avons montré pour la première fois la présence de coumarines dans l’extrait de Berberis hispanica au lieu des flavonoïdes type « flavonols » exis-tants chez des espèces voisines telles Berberis vulgaris et Berberis croatica [62]. En concordance avec les travaux de Lmnaouer [37], nos résultats démontrent également la présence dominante d’alcaloïdes avec une quantité moins importante de coumarines dans l’extrait de Berberis hispanica. Comme pour les autres espèces de la famille des Berberi-daceae, les alcaloïdes sont les constituants majoritaires de

Berberis hispanica [37], dont le principal composé est la berbérine [4,33,49].

Dans ce même contexte, et en concordance avec les travaux de Safir et al. [47] et Aquino et al. [2], nos résul-tats montrent, d’une part, l’existence de saponines–triterpènoïdes dans l’extrait de Tetraena gaetula et, d’autre part, une présence d’alcaloïdes à noyau tropolone, révélés pour la première fois dans la littérature.

Dans ce travail, nous avons évalué le pouvoir anti oxydant des EA de Berberis hispanica et de Tetraena gaetula. Les résultats obtenus montrent un potentiel antioxydant important de l’extrait de Berberis hispanica avec une IC 50 de 0,2 mg/ml et un APR de 0,2 mg/ml. Ce pouvoir antioxy-dant est en relation étroite avec la nature des composés chimiques existants dans chaque espèce, particulièrement les alcaloïdes [34,49,57] et les coumarines [3,42,54,55].

À l’issue de ce travail, les résultats obtenus montrent un profil à la fois pré/post-apoptotique et nécrotique de l’EA de Berberis hispanica à la dose 80 mg/kg, p.c. in vivo.

Fig. 4. E� ets de l’extrait aqueux de Tetraena gaetula (c) et de Berberis hispanica (d) sur l’apoptose des cellules leucocytaires, détectée par un comarquage à l’annexine V-FITC/IP en comparaison avec un lot traité à l’acide butyrique (b) et un lot traité au NaCl 0,9 % (a). Les histogrammes montrent les quatre phases cellulaires N-Ap : non apoptotique, Pr-Ap : proapoptotique, Ps-Ap : postapoptotique, Nec : nécrose

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Fig. 6. E� ets de l’extrait aqueux de Tetraena gaetula (c) et de Berberis hispanica (d) sur la quantité d’ADN des leucocytes du rat, détectée par un marquage à l’IP en comparaison avec un lot traité à l’eau oxygénée (b) et un lot traité au NaCl 0,9 % (a)

(a) (b)

Fig. 5. E� ets des extraits aqueux de Berberis hispanica (a) et de Tetraena gaetula (b) sur le cycle cellulaire des leucocytes du rat. Les valeurs représentent les pourcentages cellulaires à di� érentes phases du cycle cellulaire

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Tandis que l’EA de Tetraena gaetula à la dose 300 mg/kg p.c. induit plutôt un effet préapoptotique et nécrotique. En accord avec le travail de Mercié et Belloc [40], nous soupçonnons que le déclenchement de la mort cellulaire programmée, précoce (préapoptose), postapoptose ou accidentelle (nécrose), est conditionné par la nature des molécules bioactives existantes dans l’extrait, et par la survenue d’un signal inducteur de l’apoptose, l’état, le type et l’origine histologique des cellules. Dans cette optique, nous pouvons soupçonner l’induction de l’apoptose et de la nécrose cellulaire par les principaux constituants chimi-ques de l’EA de Tetraena gaetula qui sont les saponines et les flavonoïdes. Ces hypothèses s’inscrivent dans le fait que les saponines sont des molécules cytotoxiques [45] capables de déclencher la fragmentation de l’ADN via l’activation des caspases 3 et 7 et donc, l’induction de l’apoptose [10]. Cependant, les flavonoïdes ont tendance à emprunter une autre voie d’induction de la fragmentation de l’ADN via l’activation des caspases 3, 8 et 9 [11,48].

En outre, les constituants majoritaires de l’EA de Berberis hispanica, tels les alcaloïdes (berbérine) et les coumarines, sont fortement soupçonnés dans le processus d’apoptose [18,20,32,46]. Dans ce sens, la voie apoptotique d’alcaloïdes est corrélée probablement avec l’activation de la voie mitochondriale [35,36,39].

Il est connu également que le système immunitaire joue un rôle crucial dans l’apoptose et la nécrose cellulaire, et cela pourrait dépendre directement et/ou indirectement des propriétés immunomodulatrices des espèces étudiées. De ce fait, les mécanismes d’actions, probablement sollicités par les molécules immunosuppressives de Tetraena gaetula à la dose de 300 mg/kg, p.c. [16], pourraient être à l’origine de l’activation de la voie glucocorticoïdergique et l’induc-tion de l’apoptose [52].

Cependant, la propriété immunostimulante de l’EA de Berberis hispanica à la dose de 80 mg/kg, p.c. [17] pourrait emprunter une autre voie directe et/ou indirecte via :

– l’activation de la sécrétion des médiateurs responsables de l’induction de l’apoptose par les cellules immunitaires, tels que l’IL-1, IL-2, TNFα, INFα et INFγ gamma [21,23,41,60] ;

– l’activation des cellules NK et/ou les cellules lympho-cytaires cytotoxiques [1,14,30,51].

En parallèle à l’activité apoptotique des extraits des plantes étudiées, d’autres investigations ont été entreprises pour élucider leurs profils antiprolifératifs. Les résultats obtenus avec le traitement à l’H2O2 plaident en faveur d’une forte augmentation de l’oxydation de l’ADN des subpopulations leucocytaires et une prolifération anar-chique traduite par l’apparition des cellules en synthèse S (22 %) et en mitose G2/M (21 %). Cet état prolifératif des leucocytes pourrait être comparé à un cas cancéreux décrit dans l’étude de Chen et al. [9].

Nos résultats ont démontré un effet antiprolifératif signifi-catif in vivo de l’EA de Tetraena gaetula à la dose de 300 mg/kg, p.c. puisqu’il y a une induction d’apoptose (14 %), due probablement aux effets apoptotiques des saponines de type

triterpénoïdes, et un important effet antiprolifératif de ces composés induisant un arrêt du cycle en phase G0/G1. Cette activité antiproliférative est le résultat d’une sous-régulation des cyclines du cycle cellulaire [29]. Hormis ces postulats, il ne faut pas exclure l’effet antiprolifératif des flavonoïdes par arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S en contrôlant la protéine phosphokinase du G1/S [22,26,27].

Ainsi, nous avons observé l’apparition d’une popula-tion pré-G0/G1 (< 2 N) en stade d’apoptose sous l’effet du traitement par l’EA de Tetraena gaetula. Selon les travaux décrits par Lopez-Gonzalez et al. [38] et Yan et al. [56], ce phénomène d’apoptose pré-G0/G1 est dû probablement à une fragmentation de l’ADN internucléosomale.

En concordance avec les travaux de Khan et al. [33], l’administration de l’extrait de Berberis hispanica à la dose de 80 mg/kg p.c. n’a arrêté le cycle cellulaire qu’à la phase S (15 %), probablement via le mécanisme d’apoptose induit par la berbérine [33,39] et sans négliger l’effet apoptotique des coumarines [46].

En comparaison avec l’effet antiprolifératif des sapo-nines de type triterpénoïdes et celui des flavonoïdes de Tetraena gaetula, médié par la fragmentation d’ADN, les alcaloïdes et les coumarines de Berberis hispanica semblent emprunter la voie mitochondriale et/ou la voie des caspases comme des voies d’activation de l’apoptose [35,36,39]. Cette dernière explique en partie l’effet antiprolifératif des EA de Tetraena gaetula et de Berberis hispanica.

Nous pouvons également souligner l’intérêt des propriétés antioxydantes des plantes étudiées dans l’inhibition de la proli-fération cellulaire anarchique. D’autres travaux ont démontré les effets antiprolifératifs des composés doués d’activités antioxydantes [53,58]. En effet, ces molécules anti oxydantes, particulièrement les composés phénoliques (flavonoïdes et coumarines), sont capables de modifier la réponse proliféra-tive des cellules par la modulation de la sécrétion des protéines kinases intervenant dans la prolifération des cellules tumo-rales et induisant l’expression des enzymes anticarcinogènes et/ou empêchant l’induction des enzymes impliquées dans la promotion du cancer [25,43,50].

ConclusionLa présente étude a permis de mettre en évidence pour la première fois des activités antioxydante, apoptotique et antiproliférative des EA de Tetraena gaetula et de Berberis hispanica in vitro et in vivo. Ces résultats pour-raient constituer une base scientifique solide pour la recherche de nouveaux composés anticancéreux naturels, complémentaires à la thérapie chimique existante.

RemerciementsNous remercions le Pr Abdeslam Ennabili de l’Institut national des plantes médicinales et aromatiques (province de Taounate) pour l’identi� cation botanique du matériel végétal,

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et le « Center Emiratie Wildlife Propagation (ECWP) », région de Missour (Maroc) pour le don des animaux.

Conflit d’intérêt : les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

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