Naskah Publikasi Rolando revisi 088114127

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGANFENOLIK TOTAL FRAKSI AIR EKSTRAK METANOL DAUN SIRIH

(Piper betle L.)Rollando dan C.J.Soegihardjo

Fakultas Farmasi Universitas Sanata DharmaKampus III, Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman,

Yogyakarta 55281

ABSTRACT

This research was conducted to determine theantioxidant activity and determine the total phenoliccontent of the water fraction of methanol extracts ofbetel leaf. Test of the antioxidant activity conductedqualitatively and quantitatively using a radical 1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). The principle of methodis to decrease the intensity of the absorbance of DPPHthat is comparable with the increase in the concentrationof antioxidant compounds and is expressed as InhibitionConcentration 50 (IC50), which states the concentration ofan antioxidant compound to produce a 50% scavenging offree radicals.Determination of total phenolic contentcarried by the Folin-Ciocalteu reagent using gallic acidstandard raw. The content of total phenolic acidsexpressed as equivalent mass of gallic acid. Theprinciple of this method is the oxidation reductionreaction, oxidized phenolic compounds and Folin-Ciocalteureagent would be reduced to be a blue solution which canbe measured by visible spectrophotometer at a wavelengthof 750 nm.The results showed that the fraction of waterextract of betel leaf metanolik have IC50 of 45,628 ± 1,474µg/mL and total phenolic content of (6,971 ± 0,167) mggallic acid equivalents per gram of water fraction ofmethanol extract of betel leaf.

1

Keywords: antioxidants, betel leaf (Piper betle L.), fractionof water, DPPH, total phenolic content

INTISARI

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitasantioksidan dan menetapkan kandungan fenolik total darifraksi air ekstrak metanol daun sirih. Pengujianaktivitas antioksidan dilakukan secara kualitatif maupunkuantitatif menggunakan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH). Prinsip metode DPPH adalah penurunan intensitasabsorbansi larutan DPPH sebanding dengan kenaikankonsentrasi senyawa antioksidan dan dinyatakan denganInhibition Concentration 50 (IC50 ), yang menyatakan konsentrasisuatu senyawa antioksidan untuk menghasilkan penangkapan50% radikal bebas. Penentuan kandungan fenolik totaldilakukan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu denganmenggunakan baku standar asam galat. Kandungan fenoliktotal dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.Prinsip metode ini adalah senyawa fenolik teroksidasi danpereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi menjadi larutanberwarna biru yang dapat diukur dengan spektrofotometervisibel pada panjang gelombang 750 nm.Hasil penelitianmenunjukkan bahwa fraksi air ekstrak metanolik daun sirihmempunyai nilai IC50 sebesar 45,628 ± 1,474 µg/mL dankandungan fenolik total sebesar 6,971 ± 0,167 mg ekivalenasam galat per gram fraksi air ekstrak metanol daunsirih.

Kata Kunci: antioksidan, daun sirih (Piper betle L.),fraksi air, DPPH, kandungan fenolat total

PENDAHULUAN

Secara alami,

dalam tubuh manusia

terbentuk radikal

bebas secara terus

menerus, hal ini bisa

2

disebabkan proses

metabolisme sel

normal manusia maupun

respon imun terhadap

pengaruh dari luar

tubuh seperti cahaya

ultraviolet, asap

pabrik, asap

kendaraan, asap rokok

maupun efek dari

pemanasan global

(global warming).

Radikal bebas adalah

atom atau molekul

yang tidak stabil dan

sangat reaktif karena

mengandung satu atau

lebih elektron tidak

berpasangan pada

orbital terluarnya.

Untuk mencapai

kestabilan atom atau

molekul, radikal

bebas akan bereaksi

dengan molekul

disekitarnya untuk

memperoleh pasangan

elektron. Radikal

bebas akan sangat

reaktif menyerang

molekul-molekul alami

tubuh seperti

lipoprotein, asam

lemak tak jenuh,

protein, serta unsur

DNA tubuh termasuk

karbohidrat (Prakash,

2001; Trevor ,1995).

Reaksi ini akan

berlangsung terus

menerus dalam tubuh

dan bila tidak

dihentikan akan

menimbulkan berbagai

penyakit seperti

kanker, jantung,

katarak, penuaan

dini, serta penyakit

3

degeneratif lainnya.

Oleh karena itu,

tubuh memerlukan

suatu substansi

penting, yaitu

antioksidan yang

mampu menangkap

radikal bebas

tersebut sehingga

tidak dapat

menginduksi suatu

penyakit (Kikuzaki

et al., 2002; Sibuea,

2003; dan Halliwell,

2000).

Antioksidan

merupakan se-nyawa

yang dapat menangkal

radikal bebas,

senyawa antioksidan

dapat memberikan

elektron (electron

donor). Dengan kata

lain antioksidan me-

rupakan senyawa yang

dapat menghambat

reaksi oksidasi

dengan mengikat

radikal bebas yang

mengakibatkan

kerusakan sel oleh

radikal bebas dapat

dihambat (Kim et al.,

2002). Antioksidan

sintesis biasa

digunakan ke dalam

formulasi makanan

untuk mengurangi

oksidasi lemak yang

menyebabkan

ketengikan,

toksisitas, dan

destruksi biomolekul

makanan

(Decker,1998).

Antioksidan sintesis

yang digunakan

seperti tert-butyl

4

hydroquinone (tBHQ), butyl

hydroxyl anisol (BHA) dan

propil galat (PG)

mempunyai efektivitas

yang tinggi dalam

menghambat radikal

bebas, akan tetapi

dapat menyebabkkan

kanker melalui mutasi

DNA (Malkinson, 1999;

Gharavi, Haggaty,dan

El-Kadi,2007). Usaha

untuk mencari senyawa

antioksidan baru

yang aman dan efektif

berkembang selama

beberapa tahun

terakhir. Banyak

penelitian yang

menunjukan bahwa

senyawa antioksidan

dalam tumbuhan dapat

dihubungkan dengan

pencegahan stres

oksidatif dan

penyakit karena

penuaan (Zou et al.,

2004). Hal inilah

yang menyebabkan

adanya penelitian

eksplorasi secara

intensif sumber

antioksidan alam yang

berasal dari

tumbuhan.

Masyarakat

Indonesia sejak zaman

dahulu telah mengenal

tumbuhan yang

mempunyai khasiat

obat atau

menyembuhkan berbagai

macam penyakit.

Tanaman yang

berkhasiat obat

tersebut dikenal

dengan sebutan

tanaman obat

5

tradisional (Thomas,

1993). Sirih (Piper

betle L.) termasuk

tanaman obat yang

sering digunakan, ini

karena khasiatnya

untuk menghentikan

pendarahan, sariawan,

gatal-gatal, dan

lain-lain. Khasiat

obat ini karena

senyawa aktif yang

dikandungnya terutama

adalah minyak atsiri

(Noorcholies et

al.,1997; Djatmiko et

al., 1998; Moeljatno,

2003). Minyak atsiri

dari daun sirih

mengandung 30% fenol

dan beberapa

derivatnya. Kavikol

dan katekol merupakan

komponen paling

banyak dalam minyak

atsiri yang memberi

bau khas pada sirih.

Persenyawaan fenol

ini diketahui

memiliki aktivitas

antioksidan (Zou et

al ,2004). Senyawa-

senyawa polifenol

mampu menghambat

autooksidasi melalui

mekanisme

pengangkapan radikal

(radikal scavenging)

dengan cara

menyumbangkan satu

elektron yang tidak

berpasangan pada

radikal bebas

sehingga banyaknya

radikal bebas menjadi

berkurang dan

energinya menjadi

6

lebih rendah (Pokorny

et al., 2001)

Metode yang

digunakan untuk

menentukan aktivitas

antioksidan dalam

penelitian ini adalah

metode DPPH. Tujuan

metode ini adalah

untuk meneliti

parameter konsentrasi

yang ekuivelen

memberikan 50% efek

aktivitas antioksidan

(IC50). Uji DPPH

(1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl) adalah

suatu metode

kolorimetri yang

cepat, efektif dan

sensitif untuk

memperkirakan

aktivitas

antiradikal. Uji

kimia ini telah

digunakan secara luas

pada penelitian

fitokimia untuk

menguji aktivitas

penangkap radikal

dari ekstrak atau

senyawa murni (Widodo

et al, 2004). Pada

penentuan kandungan

fenolik total

digunakan metode

Folin-Ciocalteau.

Metode ini umum

digunakan sebagai

standar penentuan

kandungan fenolik

total setara massa

ekivalen asam galat

pada uji aktivitas

antioksidan sumber

tumbuhan (Aqil et

al., 2006).

7

Permasalahan

yang dapat dirumuskan

berdasarkan latar

belakang tersebut

adalah berapakah

nilai aktivitas

antioksidan fraksi

air ekstrak metanol

daun sirih dengan

menggunakan radikal

bebas DPPH yang

dinyatakan dengan

IC50 dan berapakah

kandungan fenolik

total fraksi air

ekstrak metanol daun

sirih yang dinyatakan

dengan massa ekivalen

asam galat ?

METODOLOGI

Bahan utama

Bahan yang

digunakan dalam

penelitian ini antara

lain: daun sirih

(Piper betle L.) yang

berasal dari Kebun

Obat “MERAPI FARMA”

daerah KM 21,5

Kaliurang,

Cangkringan, Sleman,

Yogakarta. Bahan kima

kualitas farmasetis

(CV. General Labora)

berupa akuades. Bahan

kimia kualitas pro

analitik (E.Merck)

meliputi metanol.

Bahan kualitas pro

analitik Sigma Chem.

Co., USA meliputi

rutin, DPPH , reagen

Folin-Ciocalteu, asam

galat. Bahan kualitas

teknis Brataco

Chemica, yaitu:

wasbensin dan etil

8

asetat dan aluminium

foil.

Alat

Alat-alat yang

digunakan dalam

penelitian ini berupa

vortex (junke & kunkel),

spektrofotometer UV-

VIS (Perkin Elmer

Lamda 20), blender,

corong, Buchner, oven,

mikropipet 10-1000

µL; 1-10 mL (Acura

825, Socorex), neraca

analitik (Scaltec SBC

22, BP 160P), vacuum

rotary evaporator (Junke &

Kunkel), waterbath

(labo-tech,

Heraceus), tabung

reaksi bertutup, dan

alat-alat gelas yang

lazim digunakan di

laboratorium analisis

(Pyrex-Germany dan

Iwaki).

Jalannya penelitian

Determinasi tanaman

Determinasi

tanaman sirih

dilakukan di

Laboratorium

Farmakognosi -

Fitokimia, Fakultas

Farmasi Universitas

Sanata Dharma menurut

van Steenis (1980).

Pengumpulan bahan

Daun sirih

diperoleh dari kebun

obat “MERAPI FARMA”

daerah KM 21,5

Kaliaurang,

Cangkringan, Sleman,

Yogakarta

Pengumpulan pada

musim kemarau bulan

9

Mei. Pemanenan

dilakukan pada

tanaman yang sebelum

berbunga saat pagi

hari. Preparasi ekstrak

daun sirih

Sebanyak 1 kg

daun sirih segar,

dibersihkan ,dan

dihaluskan dengan

blender. Ketika

dihaluskan, daun

tersebut ditambahkan

sedikit cairan

penyari (metanol).

Simplisia yang telah

dihaluskan ditimbang

sebanyak 30 gram dan

dituang kedalam

bejana maserasi,

ditambah metanol

sampai terendam

sempurna, dan

dicampur homogen.

Campuran dimasersi

pada suhu ruangan

selama dua hari.

Filtrat diperoleh

melalui penyaringan

dengan corong

Buchner. Ampas

penyaringan

diremaserasi dengan

metanol secukupnya

selama 2 hari.

Kemudian disaring.

Lalu hasil

penyaringan filtrat

diuapkan pelarutnya

hingga diperoleh

ekstak metanol daun

sirih.

Ekstrak metanol

daun sirih

ditambahkan 300 mL

air hangat dan di

ekstraksi cair-cair

menggunakan wasbensin

10

dengan perbandingan

larutan ekstrak

wasbensin (1:1 v/v),

kemudian didiamkan

hingga terpisah

sempurna. Fase air

akan berada pada

paling bawah,

sedangkan fase

washbensin berada

pada bagian atas.

Dari hasil

partisi diperoleh dua

fraksi, yaitu fraksi

wasbensin dan fraksi

air. Selanjutnya,

fraksi air

diekstraksi cair-cair

lagi menggunakan etil

asetat dengan

perbandingan larutan

fraksi air-etil

asetat (1:1 v/v)

sehingga didapatkan

fraksi air dan etil

asetat. Setelah

dipisahkan fraksi air

diuapkan dengan vacum

rotary evaporator. dan

waterbath hingga

didapakan ekstrak

kental. Lalu hasil

fraksi tersebut

digunakan analisis

lebih lanjut.

Pembuatan larutan pembanding

dan uji

a. Pembuatan larutan

DPPH. Sejumlah DPPH

dilarutkan ke dalam

metanol p.a sehingga

diperoleh larutan DPPH

dengan konsentrasi 0,4 mM.

Larutan tersebut ditutup

dengan alumunium foil dan

harus selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan stok

rutin. Sebanyak 2,5 mg rutin

11

dilarutkan dengan metanol

p.a sampai 10,0 mL.

c. Pembuatan larutan

pembanding. Diambil

sebanyak 0,5; 1,0; 1,5;

2,5; 3,0 mL larutan stok

rutin, kemudian

ditambahkan metanol p.a

sampai 10,0 mL, sehingga

diperoleh konsentrasi

larutan standar rutin

sebesar 12,5; 25,0; 37,5;

50,0; dan 62,5 μg/mL.

d. Pembuatan larutan uji

i. Larutan uji

untuk aktivitas

antioksidan.Sejumlah 25,0

fraksi air ditimbang dan

di ad metanol p.a sampai

25,0 mL. Diambil sebanyak

1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mL

larutan tersebut, kemudian


sampai 10,0 mL, sehingga

diperoleh konsentrasi

larutan uji sebesar 100;

150; 200; 250; 300 μg/mL.

ii. Larutan uji

untuk penentuan kandungan

fenolik total. Sebanyak 7,5 mg

fraksi air ditimbang, lalu


sampai diperoleh

konsentrasi larutan uji

sebesar 750,0 µg/mL.

e. Pembuatan larutan

asam galat. Dibuat larutan

asam galat dengan

konsetrasi 500 µg/mL dalam

akuades : methanol p.a

(1:1). Diambil sebanyak

1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan

3,0 mL larutan tersebut,

kemudian ditambahkan

akuades : metanol p.a

(1:1) sampai 10,0 mL,

sehingga diperoleh

konsentrasi larutan baku

12

asam galat sebesar 50; 75;

100; 125; dan 150 µg/mL.

Uji pendahuluan

a. Uji fenolik.

Sejumlah 0,5 mL larutan

uji 750,0 µg/mL dan

larutan pembanding asam

galat 150,0 µg/mL

ditambahkan 2,5 mL

pereaksi fenol Folin-

Ciocalteu yang telah

diencerkan dengan akuades

(1:10 v/v) kedalam tabung

reaksi. Diamkan selama 10

menit. Tambahkan 7,5 mL

larutan natrium karbonat

1 M. Kemudian amati warna

larutan tersebut.

b. Uji pendahuluan

aktivitas antioksidan.

Sebanyak 1 mL larutan DPPH

dimasukan ke dalam masing-

masing tiga tabung reaksi.

Ditambahkan masing-masing

dengan 1 mL metanol p.a,

larutan pembanding rutin

37,5 μg/mL , dan larutan

uji 200,0 μg/mL.

Selanjutnya, larutan


dengan 3 mL metanol p.a.

Larutan tersebut kemudian

divortex selamam 30 detik.

Setelah 30 menit, amati

warna pada larutan

tersebut.

Optimasi metode uji


a. Penentuan operating

time ( OT ) .Sebanyak 1 mL

larutan DPPH dimasukan

kedalam masing-masing tiga

labu ukur 5 mL,

ditambahkan masing-masing

dengan 1 mL larutan

pembanding rutin 12,5;

37,5 dan 62,5 μg/mL.

Selanjutnya larutan

13


dengan metanol p.a hingga

tanda batas. Larutan

tersebut kemudian divortex

selama 30 detik. Setelah

itu dibaca absorbansinya

denga spektrofotometer

visibel pada panjang

gelombang 517 nm selama 1

jam. Dilakukan demikian

juga untuk larutan uji

100; 200; 300 μg/mL.

b. Penentuan panjang

gelombang serapan maksimum.

Pada 3 labu ukur 10 mL,

dimasukan masing-masing

0,5; 1,0; 1,5 mL larutan

DPPH. Ditambahkan larutan

tersebut dengan metanol

p.a hingga tanda batas

sehingga konsentrasi DPPH

menjadi 0,020; 0,040; dan

0,080. Larutan tersebut

kemudian divortex selama

30 detik. Diamkan selama

OT. Lalu dilakukan scanning

panjang gelombang serapan

maksimum dengan

spektrofotometer visibel

pada panjang gelombang

400-600 nm.

Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas

antioksidan ditentukan

dengan menggunakan metode

spoktrofotometri sesuai

dengan penelitian Nusarini

(2007).

a. Pengukuran absorbansi

larutan DPPH (kontrol). Pada

labu ukur 10 mL, dimasukan

sebanyak 2 mL larutan

DPPH. Ditambahan larutan

tersebut dengan metanol

p.a hingga tanda batas.

Kemudian larutan tersebut

dibaca absorbansinya pada

saat OT dan panjang

14

gelombang maksimum.

Pengerjaan dilakukan

sebanyak 5 kali. Larutan

ini digunakan sebagai

kontrol untuk menguji

larutan pembanding dan

uji.

b. Pengukuran absorbansi

larutan pembanding dan uji.

Sebanyak 1 mL larutan DPPH

dimasukkan ke dalam tabung

reaksi bertutup kemudian

ditambah dengan 1 mL

larutan pembanding dan uji

pada berbagai seri

konsentrasi telah dibuat.

Selanjutnya larutan

tersebut ditambah dengan

metanol p.a hingga tanda

batas. Larutan tersebut

kemudian divortex selama

30 detik dan diamkan

selama OT. Larutan dibaca

absorbansinya dengan

spektrofoto-meter visibel

pada panjang gelombang

maksimum hasil optimasi.

Pengujian dilakukan dengan

5 kali replikasi.

c. Validasi metode uji

aktivitas antioksidan. Hasil

dari prosedur 7 a dan b,

divalidasi akurasi (%

recovery), presisi (%CV)

spesipisitas (spektra

kontrol), dan linearitas

(nilai r).

d. Estimasi aktivitas

antioksidan. Hasil dari

prosedur 7 a dan b,

dihitung nilai % IC

dan IC50 untuk rutin

dan fraksi air


sirih.

Optimasi metode penetapankandungan fenolat total

15

Optimasi metode

penetapan kandungan

fenolat total

ditentukan dengan

menggunakan metode

spektrofotometri

sesuai dengan

penelitian Nusarini (

2007).

a. Penentuan

OT.Sebanyak 0,5 mL

larutan asam galat

50; 100; dan 150

μg/mL ditambahkan

dengan 5 mL reagen

Folin-Ciocalteu yang

telah diencerkan

dengan air (1:10

v/v). Larutan

selanjutnya

ditambahkan dengan

4,0 mL natrium

karbonat 1 M. Setelah

itu, dibaca

absorbansinya dengan

spektrofotometer


gelombang 750 nm

selama 30 menit.

b. Penentuan

panjang gelombang

maksimum. Sebanyak

0,5 mL larutan asam

galat 50; 100; dan

150 μg/mL ditambahkan

dengan 5 mL reagen


telah diencerkan

dengan air (1:1 v/v).

Larutan selanjutnya

ditambahkan dengan

4,0 mL natrium

karbonat 1 M. Diamkan

selama OT,

absorbansinya dibaca

pada λ maksimum

dengan

spektrofotometer

16


gelombang 600-800 nm.

Penetapan kandungan

fenolat total

a. Pembuatan kurva

baku asam galat.

Sebanyak 0,5 mL

larutan asam galat

50; 75; 100; 125; dan

150 μg/mL ditambah

dengan 5 mL reagen


telah diencerkan

dengan air (1:1 v/v).

Larutan selanjutnya

ditambah dengan 4,0

mL natrium karbonat

1M. Setelah OT,

absorbansinya dibaca

pada λ maksimum

terhadap blanko yang

terdiri atas

akuades : metanol p.a

(1:1), reagen Folin-

Ciocalteu dan larutan

natrium karbonat 1M.

Pengerjaan dilakukan

5 kali.

b. Validasi metode

penetapan kandungan

fenolik total. Hasil dari

prosedur 9 a ,

divalidasi akurasi

(%recovery), presisi

(%CV), spesipisitas

(spektra kontrol),

dan linearitas (nilai

r).

c. Estimasi

kandungan fenolik total

larutan uji. Diambil 0,5

mL larutan uji 750

μg/mL, lalu masing-

masing dimasukan ke

17

dalam labu takar 10,0

mL dan dilanjutkan

sebagaimana perlakuan

pada pembuatan kurva

baku asam galat .

Kandungan fenolik

total dinyatakan

sebagai gram ekivalen

asam galat (mg

ekivalen asam galat

per g fraksi air).

Lakukan 5 kali

replikasi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil ekstraksi sampel

Sampel yang

digunakan untuk

penelitian ini adalah

sampel daun sirih

yang masih segar.

Digunakan sampel daun

yang masih segar

menurut Nusarini

(2007) untuk menjaga

kestabilan senyawa

fenolik dan flavonoid

dalam sampel, karena

bahan tumbuhan yang

telah dikeringkan

mempunyai

kecenderungan terjadi

perubahan susunan

senyawa fenolik dan

flavonoid yang akan

berpengaruh terhadap

aktivitas

antioksidannya.

Pembuatan ekstrak

daun sirih diawali

dengan melakukan

sortasi basah

terhadap daun sirih

yang sudah dipetik

sebelumnya. Sortasi

basah ini dilakukan

guna membebaskan

bahan baku daun sirih

yang akan digunakan

18

dari pengotor-

pengotor seperti

tanah dan debu.

Setelah itu, daun

sirih diangin-

anginkan untuk

menghilang-kan air

yang terdapat pada

daun dari proses

pencucian. Kemudian

sampel daun sirih

diblender untuk

memperkecil ukuran

daun sirih dan

didapatkan partikel-

partikel daun yang

kecil sehingga luas

permukaannya lebih

besar.

Pemilihan

metanol diban-dingkan

etanol karena

berdasarkan deret

elutropik menurut

Snyder (1997),

metanol memiliki

nilai kepolaran yang

lebih besar (metanol

= 6.6 dan etanol =

5.2) dibandingkan

dengan etanol

sehingga lebih mudah

untuk berinterksi

dengan senyawa

fenolik yang cederung

polar (like dissolve

like). Selain itu,

viskositas metanol

lebih kecil

dibandingkan etanol.

Pada suhu 20 °C,

viskositas metanol

0,597 sedangkan

etanol 1,2 (Snyder,

1997).Viskositas yang

lebih kecil, metanol

dapat berdifusi

menembus sel-sel daun

19

sirih dibandingkan

etanol (Pedriclli,

2001). Penggunaan

metanol juga dapat

mencegah terjadinya

browning karena

metanol dapat

mendenaturasi

protein, yang

merupakan komponen

dari enzim polifenol

oksidase. Bobot

ekstrak metanol yang

didapat adalah 90,80

g dan rendemen yang

didapat dari ekstrak

metanol daun sirih

adalah 3,0267 %.

Hasil fraksinasi ekstrak

Ekstrak metanol

yang didapat,

dilarutkan dengan air

hangat agar lebih

melarutkan ekstrak

metanol. Ekstrak

metanol yang telah

dilarutkan kemudian

difraksinasi dengan

menggunakan wasbensin.

Fraksi wasbensin dan

faksi air akan

terpisah didalam

corong pisah, fraksi

wasbensin terdapat pada

bagian atas dan

fraksi air terdapat

pada bagian bawah.

Hal ini karena bobot

jenis wasbensin lebih

kecil dari pada bobot

jenis air. Wasbensin

memiliki bobot jenis

0,730 dan air

memiliki bobot jenis

0,996 (Direktorat

Jendral Pengawasan

Obat dan Makanan RI,

1995). Senyawa polar

20

seperti fenolik akan

tertinggal didalam

fraksi air dan fraksi

wasbensin yang tidak

digunakan untuk

analisis akan

mengandung senyawa

non polar seperti

klorofil, vitamin,

karbohidrat dan

protein.

Fraksi air

kemudian difrak-

sinasi kembali

menggunakan etil

asetat. Menurut

Snyder (1997) indeks

polaritas etil asetat

adalah 4,4. Etil

asetat berfungsi

untuk mengekstraksi

aglikon polihidroksi

misalnya aglikon

flavonon, flavon dan

flavonol. Fraksi etil

asetat dan air akan

terpisah, fraksi etil

asetat yang berbobot

jenis kecil

dibandingkan dengan

air (0,898 : 0,996)

(Direktorat Jendral

Pengawasan Obat dan

Makanan RI, 1995)

berada pada bagian

atas dan fraksi air

berada pada bagian

bawah. Fraksi air di

uapkan dengan

menggunakan vaccum

rotary evaporator untuk

memini-malkan

pemanasan supaya

stabilitas senyawa

fenolik tetap

terjaga. Sisa fraksi

air kemudian

dipanaskan dengan

21

waterbath dengan

bantuan kipas untuk

menguapakan sisa

pelarut sehingga

didapatkan ekstrak

kental. . Fraksi air

yang sudah dibungkus

dimasukan didalam

desikator agar tidak

terpapar lembab dan

ditumbuhi jamur atau

mikroba. Bobot fraksi

air yang didapat

sebesar 15,8876 g dan

rendemen fraksi air

yang didapat adalah

0,5296 %.

Hasil Uji Pendahuluan

1. Uji pendahuluan senyawa

fenolat

Pengukuran kualitatif

total fenol dengan metode

Folin-Ciocalteau

didasarkan pada reaksi

oksidasi-reduksi alam

suasana basa. Reagen


terdiri dari asam

fosfomolibdat dan asam

fosfotungstad akan

tereduksi oleh senyawa

polifenol menjadi

malibdenum-tungsen (The

Grape Seed Method Evaluation

Committee, 2001). Reaksi

ini mem-bentuk kompleks

warna biru. ).

A B

C

22

Blangko (A), Fraksi air +

Folin-Ciocalteu (B), Asam galat

+ Folin Ciocalteu (C)

Hasil penelitian

yang dilaku-kan,

fraksi air yang

diberi reagen Folin-

Ciocalteu menunjukan

warna biru. Dapat

disimpulkan fraksi

air ekstak metanol

daun sirih mengandung

senyawa fenolat.

2. Uji pendahuluan aktivitas

anti-oksidan

Fraksi air

ekstrak metanol yang

memiliki potensi


maka senyawa itu akan

bereaksi dengan

radikal DPPH karena

adanya elektron yang

tidak berpasangan.

Ketika elektronnya

menjadi berpasangan

oleh keberadaan

penangkap radikal

bebas, maka

absorbansinya menurun

secara stokiometri

sesuai jumlah

elektron yang

diambil. Keberadaan

senyawa antioksidan

dapat mengubah warna

larutan DPPH dari

ungu menjadi kuning.

A

B C

Blangko (A), Fraksi air +

DPPH (B), Rutin +

DPPH (C)

23

Dari hasil

pengujian terlihat

adanya penurunan

intensitas warna

larutan uji fraksi

air ekstak metanol

dari warna ungu

menjadi warna kuning.

Dengan demikian dapat

disimpulkan hasil

pengujian positif dan

didalam fraksi air


sirih terdapat

senyawa yang memiliki

aktivitas

antioksidan.

Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kan-dungan Fenolat Tolat

Penentuan Operating Time

(OT)

Pengukuran OT

bertujuan untuk

mengetahui waktu yang

tepat untuk

pengukuran suatu

senyawa, dimana

reaksi terjadi secara

optimal. Pada rentang

waktu tersebut

senyawa berada dalam

keadaan reaksi

sempurna. Dari

penentuan OT pada

larutan pembanding

dan larutan uji pada

tiga tingkat

konsentrasi,

absorbansi stabil

pada menit ke-30

hingga menit ke-60.

Penentuan OT asam

galat menunjukan dari

menit ke-10 sampai

ke-30 absorbansi

senyawa molybdenum

blue yang merupakan

24

senyawa hasil reaksi

asam galat dengan

pereaksi Folin-

Ciocalteu terbentuk

secara stabil. Dapat

disimpulkan secara

praktis OT penetapan

kadar adalah 10

menit, pengukuran

absorbansi pada

penetapan kadar

kandungan fenolat

total agar

mendapatkan hasil

yang reliabel dan

valid dilakukan pada

menit ke-10 sampai

ke-30.

Penentuan panjanggelombang maksimum ( λmaks)

Penentuan

panjang gelombang

serapan maksimum ini

bertujuan untuk

menentukan panjang

gelombang dimana

senyawa yang ingin

diukur memberikan

absorbansi yang

paling optimum. Hasil

scanning tiga

konsentrasi larutan

DPPH didapatkan hasil

panjang gelomabang

maksimum rata-rata

adalah 515,8 nm.

Hasil Scanning tiga

konsentrasi asam

galat yang sudah

direaksikan dengan

pereaksi Folin-

Ciocalteu didapatkan

hasil panjang

gelombang maksimum

rata-rata adalah 750

nm. Hal ini sesuai

dengan panjang

gelombang teoritis

25

yaitu 750 nm. Jadi

Untuk menentukan

kandungan fenolat

total menggunakan

panjang gelombang 750

nm.

Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan dan Penetapan Kandungan Fenolat Total

Lineritas

Linearitas

menunjukkan kemampuan

metode untuk menghasilkan

hasil uji yang secara

langsung proporsional

dengan konsentrasi analit

dalam sampel. Dari 5

repikasi yang dilakukan

untuk validasi metode

analisis rutin ,

didapatkan bahwa hasil

dari repliksi 2 mempunyai

harga koefisien korelasi

yang paling baik, dimana r

= 0,9992. Nilai r yang

memenuhi persyaratan

linearitas yang baik

menurut Mulja dan Hanwar

(2003) adalah lebih besar

dari 0,999, sehingga nilai

r yang dihasilkan dalam

penelitian ini masih dapat

diterima karena masih

berada di atas nilai r

yang dipersyaratkan.

Persamaan regresi linier

fraksi air ekstrak

metanolik daun sirih,

dari 5 replikasi yang

dilakukan didapatkan hasil

dari replikasi 4 yang

paling baik, dengan nilai

r = 0,9998. Percobaan pada

penetapan kandungan

fenolat total 5 replikasi

hasil didapatkan nilai r

dari persamaan kurva baku,

yaitu r = 0,9999, maka

26

dapat dikatakan bahwa

kurva baku memenuhi

persyaratan linearitas.

Nilai r yang memenuhi

persyaratan linearitas

yang baik menurut Mulja

dan Hanwar (2003) adalah

lebih besar dari 0,999,

sehingga nilai r yang

dihasilkan dalam

penelitian ini masih dapat

diterima karena masih

berada di atas nilai r

yang dipersyaratkan.

Akurasi

Akurasi

merupakan analisis

kedekatan hasil

analisis yang

diperoleh dengan

menggunakan metode

analisis tertentu,

dengan nilai yang

sebenarnya. Penentuan

akurasi metode

analisis dapat

dilakukan dengan

membanding-kan kadar

terukur dengan kadar

teoritisnya.

Berdasarkan ketiga

macam konsentrasi

yang diuji dalam

validasi metode

penentuan aktivitas

antioksidan mempunyai

rata-rata nilai

recovery 93,680%,

101,29538%, dan

99,07242% berturut

turut untuk

konsentrasi terkecil,

tengah, dan tinggi,

sehingga semua seri

konsentrasi DPPH yang

diuji mempunyai nilai

rata-rata perolehan

kembali yang masuk

27

dalam rentang nilai

recovery yang

dipersyaratkan

(antara 75-125%). Hal

ini berarti bahwa

untuk menganalisis

rutin metode ini

sudah mempunyai

akurasi yang baik

untuk penelitian ini.

Berdasarkan data dari

recovery fraksi air

ekstrak metanolik

daun sirih ada pada

rentang 93,750 –

120,186 % .Dari data

persen recovery asam

galat berada pada

rentang 98.331 % -

102.332 %. Semua

replikasi berada pada

rentang recovery yang

baik untuk baku

analit dengan kadar

sekitar 100 ppm

sesuai yang di

persyaratkan Harmita

(2004), sehingga

dapat dikatakan bahwa

metode ini memiliki

akurasi yang baik.

Hasil ini masih

berada pada rentang

recovery yang masih

bisa diterima yaitu

antara 75-125% %

untuk analit dengan

konsentrasi kurang

dari 0,1% (b/v)

(Kingstone, 2004).

Kesimpulannya metode

ini memiliki akurasi

yang baik untuk

menganalisis fraksi

air ekstrak metanol

daun sirih. Presisi

Presisi dari

metode analisis

28

dinyatakan dalam CV

(Coeffisien of Variant),

dimana dalam

menghitung CV dilihat

dari hasil yang

didapat pada tiga

tingkatan konsentrasi

dalam lima kali

replikasi.

Berdasarkan ketiga

macam konsentrasi

yang diuji dalam uji


ini mempunyai nilai

CV 1,7701 %, 1,4133

%, 1,1351 % dan

untuk uji antioksidan

rutin mempunyai nilai

0,4642%, 0,6124%,

6,8085% berturut

turut untuk

konsentrasi terkecil,

tengah, dan

tertinggi, sehingga

semua seri

konsentrasi DPPH yang

diuji mempunyai nilai

CV yang masuk dalam

rentang nilai CV yang

dipersyaratkan untuk

konsentrasi analit

<0,1% (b/v), yaitu CV

≤ 20%. Hal ini

menunjukkan bahwa

metode yang digunakan

mempunyai presisi

yang baik. Presisi

biasanya dinyatakan

dengan koefisien

variasi atau CV.

Untuk kadar analit

sekitar 100 ppm, CV

kurang dari 5 % dapat

dikatakan metode

tersebut memberikan

presisi yang baik

( Harmita,2004).

Spesifisitas

29

Spesifisitas

adalah kemampuan

untuk mengukur analit

yang dituju secara

tepat dan spesifik

dengan adanya

komponen-komponen

lain dalam matriks

sempel seperti

ketidakmurnian,

senyawa lain, produk

degradasi dan

komponen lain. Hasil

scanning pada larutan

pembanding rutin dan

larutan uji fraksi

air pada panjang

gelombang 515,8 nm

tidak terdapat

serapan dan hasil

scanning pada larutan

asam galat dan fraksi

air ekstrak metanol

daun sirih dengan

kisaran panjang

gelombang 500-900 nm,

pada panjang

gelombang 750 nm

tidak terdapat

serapan.sehingga

ketika rutin

direaksikan dengan

radikal DPPH maka

yang terbaca hanya

absorbansi DPPH hasil

reaksi. Dapat

disimpulkan metode

uji aktivitas

antioksidan untuk

rutin dan fraksi air

memiliki spesisitas

yang baik.

Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dan Kandungan Fenolat Total

Parameter yang

digunakan untuk


30

dengan metode

penangkapan radikal

DPPH ini adalah IC50

yakni konsentrasi

senyawa uji yang

dibutuhkan untuk

mengurangi radikal

DPPH sebesar 50%.

Nilai IC50 diperoleh

dari suatu persamaan

regresi linier yang

menyatakan hubungan

antara konsentrasi

senyawa uji dengan

persen aktivitas

antioksidan (Zou et

al., 2004). Semakin

kecil nilai IC50

senyawa uji, maka

semakin poten senyawa

uji tersebut sebagai

antioksidan.

Tabel I. Hasil perhitungan IC50

rutin dan fraksi air ekstrak metanol daun sirih

Sampel

IC50

(µg/mL)

Tingkatan aktivitasantioksidan (nilaiIC50) dengan metode

DPPH

Sangat

kuat(<50

µg/mL)

Kuat(50-100µg/mL)

Sedang

(101-150µg/mL)

Lemah

(>150

µg/mL)

Rutin

10,176

√

Fraksiair

45,628

√

Rata-rata nilai

IC50 rutin sebesar

10,176 ± 0,380 µg/mL,

nilai ini menunjukkan

bahwa dibutuhkan

rutin dengan

konsentrasi 10,176 ±

0,380 µg/mL untuk

menghasilkan

penurunan 50% dari

aktivitas DPPH.

31

sedangkan fraksi air

sebesar 45,628 ±

1,474 µg/mL, nilai

ini menunjukkan bahwa

dibutuhkan fraksi air


sirih dengan

konsentrasi 45,628 ±

1,474 µg/mL untuk

menghasilkan

penurunan 50% dari

aktivitas DPPH.

Berdasarkan nilai

IC50, aktivitas

antiosidan rutin

lebih besar daripada


fraksi air ekstrak

metanolik daun sirih,

akan tetapi

berdasarkan tingkat

kekuatan antioksidan,

baik rutin maupun

fraksi air memiliki


pada tingkat sangan

kuat karena IC50

keduanya kurang dari

50 µg/mL.

Pengujian secara

statistik menggunakan

software SPSS 17.0.

Hasil uji normalitas

dengan statistik

menunjukan nilai p

sebesar masing-masing

0,092 untuk rutin dan

0,060 untuk fraksi

air. Bila

dibandingkan dengan

nilai signifikansi

yang ditentukan,

yaitu 0,05 (taraf

kepercayaan 95%) maka

Hnull diterima karena

nilai signifikansi

yang dihasilkan lebih

besar daripada nilai

32

signifikansi yang

ditentukan. Maka

dapat disimpulkan

bahwa % IC rutin

maupun fraksi air

mengikuti distribusi

normal. Hasil

pengujian statistic

uji T tidak

berpasangan uji T

tidak berpasangan

diperoleh nilai

signifikansi yang

ditentukan yaitu

0,000 antara rutin

dan fraksi air. Bila

dibandingkan dengan

nilai signifikansi

yang ditentukan,

yaitu 0,05 maka Hnull

ditolak karena nilai

signifikansi yang

dihasilkan lebih

kecil daripada nilai

signifikansi yang

ditentukan. Oleh

karena itu, dapat

disimpulkan bahwa

nilai IC50 rutin lebih

kecil daripada fraksi

air.

Kandungan

fenolik total

diekspresikan sebagai

ekivalen asam galat.

Hubungan antara asam

galat dan

absorbansinya setelah

direaksikan dengan

pereaksi Folin-

Ciocalteu digunakan

dari replikasi yang

ke-2 dengan persamaan

y = 0,006x – 0,052;

dengan nilai

koefisien korelasi, r

= 0,9999. Nilai r ini

lebih besar r tabel

33

(db = 5; p = 0,05),

sebesar 0,878 ( Hadi,

1996).

Tabel II. Hasil perhitungan

kandungan fenolik total

Fraksiair Absorbansi

Kandungan

fenolik(µg/mL)

Kandunganfenolik total(mg ekivalenasam galat

per g fraksi) x (rata-rata) ± SDReplikasi

1 0,569 103,5 6,891Replikasi

2 0,604 109,333 7,267Replikasi

3 0,572 104 6,915 6,971 ± 0,167Replikasi

4 0,573 104,667 6,921Replikasi

5 0,606 104 6,861

Berdasarkan

hasil perhitungan

didapatkan hasil

kandungan fenolik

total rata-rata pada

sampel sebesar 6,971

± 0,167 mg ekivalen

asam galat per gram

fraksi air ekstrak

metanol daun sirih.

KESIMPULAN

Nilai aktivitas

antioksidan fraksi air

ekstrak metanol daun sirih

dengan menggunaka radikal

bebas DPPH yang dinyatakan

sebagai IC50 sebesar

(45,628 ±1,474 ) µg/mL dan

kandungan fenol total pada

fraksi air ekstrak metanol

daun sirih yang dinyatakan

dengan massa ekivalen asam

galat sebesar

(6,971±0,167) mg ekivalen

asam galat per gram fraksi

air ekstrak metanol daun

sirih.

SARAN

Perlu dilakukan

isolasi lebih lajut

untuk mengetahui

senyawa yang memiliki

aktivitas sebagai

34

antioksidan dalam

daun sirih. Perlu

dilakukan penelitian


dengan menggunakan

metode yang lain.

Perlu dilakukan uji

korelasi lebih lanjut

melalui uji statistik

antara kandungan

fenolat total dengan

aktivitas

antioksidan.

DAFTAR PUSTAKA

Aqil, F., Ahmad,I., danMehmood, Z., 2006,Antioxidant and FreeRadical ScavengingPropertis of TweleveTraditionally Used IndianMedical Plants, Turk J Biol,30,177-183

Direktorat JendralPengawasan Obat danMakanan RI, 1995,Farmakope Indonesia,

edisi 4, 1061, 1036,Departemen KesehatanRepublik Indonesia,Jakarta

Gharavi,N,. Haggarty,S.,dan El-Kdai, A.O.S.,2007,Chemoprotectiveand carcinogenicEffect of tert-Butylhydroquinone andIts Metabolites,Current Drug Metabolism,8, 1-7

Harmita, 2004, Majalah IlmuKefarmasian Vol.I, No.3:Petunjuk PelaksanaanValidasi Metode dan Cara,117-135, DepartemenFarmasi FMIPA UI,Jakarta

Kikuzaki, H., Hisamoto,M., Hirose,K.,Akiyama, K., andTaniguchi, H., 2002;AntioxidantsProperties of FerulicAcid and Its RelatedCompound, J.Agric.FoodChem, 50:2161-2168.

35

Kim, D.K., Lee, K.W., Lee,H.J., and Lee, C.Y.,2002, Vitamin CEquivalentAntioxidant capacity(VCEAC) of PhenolicPhytochemicals, J.Agric. Food Chem,50,3713-3717

Kingston, 2004, Guidelinesfor The Validation ofAnalytical methods forActive Constituent,Agricultural, and VeterinaryChemical Products,APVMA,

Malkinson, A.M., 1999,Lung Tumor Promotion byBHT, Crisp Data BaseNational Institues OfHealth., 99.

Moeljatno, R., 2003,Khasiat dan Manfaat DauSirih Obat Mujarab dariMasa ke Masa ,Agromedia Pustaka,Jakarta.

Mulja, M., dan Hanwar, D.,2003, Prinsip-Prinsip

Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice),Majalah Farmasi Airlangga,vol. III No. 2, Agustus 2003, 71-76

Nusarini, N.M.R., 2007,Uji AktivitasAntioksidan FraksiEtil Asetat Ekstrakmetanolik Herba Ketul( Bidens pilosa L.),Skripsi, 15-20,Fakultas FarmasiUniversitas GadjahMada, Yogyakarta.

Pedriclli, P., 2001,Antixidant mechanismof Flavonoids,solvent effect onrate constant forchain breakingreaction of quercetinand epicatechininautooxidation ofmethyl linoleat,.Agric Food Chem, 49.

Pokorny, J.,Yanishlieva,N., and Gordon M.,2001, Antioxidant in food;

36

Practical Applications, CRCPress, New York.

Prakash, A., 2001, “Antioxidant Activity “MedallionLaboratories :Analithycal ProgresVol 19 No : 2. 1 – 4.

Sastroamidjojo S., 1988,Obat Asli Indonesia, PTDian Rakyat, Jakarta

Sibuea, P., 2003,Antioksidan Senyawa AjaibPenangkal Penuaan Dini,Sinar Harapan,Yogyakarta

Snyder L.R., and KirklandJ.J,1997, Practical HPLCMethod Development, 2nd

Ed, John Wiley andsons

The Grape Seed MethodEvaluation Committee.2001. Grape SeedExtract white Paper.Http://www.activin.com [10 Oktober 2011]

Thomas, 1993, Tanaman ObatTradisional I, PenerbitKanisius, Yogyakarta.

Trevor R, 1995, KandunganOrganik Tumbuhan, ed.6,diterjemahkan olehKosasih, Padmawinata,ITB, Bandung.

Wangcharoen, W. danMorasuk, W., 2007a,Antioxidant Capacityand Phenolic contentof Some Thai CulinaryPlants, Mj. Int. J.Sci.Tech.,01(02), 100-106

Zou, Y., Lu, Y. and Wei, D.,2004, Antioxidantactivity ofFlavonoid-richextract of Hypericumperforatum L in vitro,J. Agric, Food Chem, 52,5032-5039.

37

Naskah Publikasi Rolando revisi 088114127

Documents

Transcript of Naskah Publikasi Rolando revisi 088114127