Luna HILIC NOUVEAU L'héritage Luna - Phenomenex

Luna C18

Luna C18(2)

Luna C8

Luna C8(2)

Luna C5

Luna Phenyl-Hexyl

Luna CN

Luna NH2

Luna SCX

Luna Silice(2)

Luna HILIC

Les colonnes Luna HILIC respectent les normes rigoureuses de qualité et de satisfaction de la clientèle qui caractérisent la gamme Luna depuis une dizaine d’années.

Laissez votre empreinte !Les colonnes de chromatographie à interaction hydrophile (HILIC) Luna utilisent une couche enrichie en eau à la surface de la silice. Cette couche aqueuse facilite le transfert des composés polaires sur la phase stationnaire afin d’en améliorer la rétention. La séparation est réalisée par la partition de solutés polaires de la phase mobile organique, miscible avec l’eau et à concentration élevée, dans l’environnement à surface hydrophile.

Les solutés polaires présentent une rétention accrue et s’éluent dans l’ordre croissant d’hydrophilicité.

Luna HILIC

NOUVEAU

L’héritage Luna

(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

Phenomenex I tél.: 01 30 09 21 10 I fax: 01 30 09 21 11 I email: franceinfo@�phenomenex.com

�

Avantages de la chromatographie à interaction hydrophile (HILIC)

Avantages de la colonne Luna HILIC

Stratégie pour le développement de méthodes HILIC

Table des matièresRétention des composés polaires ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Page 2

Amélioration de la sensibilité de la spectrométrie de masse ~~~~~~~~~~~~Page 4

Augmentation du débit d’échantillons ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Page 6

Stabilité~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Page 8

Reproductibilité inter lots ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Page 9

Faible niveau de perte de phase stationnaire en mode MS ~~~~~~~~~~~~~Page 9

Avantages sur le plan de la sélectivité ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Page �0

Approche étape par étape ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Page ��

Informations relatives aux commandes ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~Page �6

Les colonnes Luna HILIC assurent

Enfin, des séparations reproductibles et robustes

en chromatographie à interaction hydrophile

• Une rétention supérieure des composés polaires

• Une sensibilité accrue de la spectrométrie de masse

• Une augmentation du rendement et de la productivité des laboratoires


2

Composés polaires sur la colonne Luna HILIC

Remarque sur les caractéristiques de rétention et de solubilité des analytes en HPLC : un analyte doit, à un certain degré, être soluble ou présenter une affinité pour à la fois la phase stationnaire et la phase mobile de la colonne.

Ce principe est illustré dans l’équation de performance chromatographique générale comme facteur de rétention ou (k), une mesure du degré auquel le composé est retenu par la colonne.

Ce paramètre critique peut être optimisé pour influencer la séparation chromatographique globale.

Bien que la majorité des séparations en chromatographie liquide à haute performance soient aujourd’hui effectuées dans des conditions de phase inverse à l’aide de phases stationnaires hydrophobes (par exemple, C18, C8 et phényle), les composés (polaires) hydrophiles ne sont pas bien retenus dans des conditions de phase inverse. Le solvant organique stagnant, présent près de la phase stationnaire hydrophobe ne facilite pas l’interaction avec les composés polaires ; en conséquence, ces composés sont mal retenus. Ils peuvent s’éluer à l’approche du volume mort, rendant ainsi leur quantification difficile.

La colonne Luna HILIC permet une rétention accrue des composés polaires dans une phase mobile à haute teneur organique. La surface en silice fonctionnalisée attire et retient l’eau à la surface de la silice. Cette couche enrichie d’eau stagnante facilite le transfert des composés polaires dans la phase stationnaire où se produit la rétention des analytes. Dans les conditions de chromatographie à interaction hydrophile, plus les composés polaires ont une forte interaction avec cette phase stationnaire polaire, plus les facteurs de rétention de ces composés augmentent.

-1Rs=N4 k+1

kto

25

3

16 4

7

8

9

2 4 6 8 10 12 min0

Pourquoi des vitamines ?Les vitamines constituent une plate-forme idéale pour démontrer les avantages de la chromatographie HILIC.

Les vitamines choisies pour nos essais représentent :

• Une vaste plage de valeurs pKa

• Une variété de groupes fonctionnels

• Une plage étendue de logP (5,4 unités)

L’effet d’une rétention accrue des composés polaires est facile à discerner avec ce groupe de vitamines.

App

N° 1

6430

Avec les techniques du mode de chromatographie à interaction hydrophile ou HILIC, les composés polaires bénéficient du degré de rétention le plus élevé. Ainsi, la colonne Luna HILIC retiendra les composés polaires qui sont élués près du

volume mort en chromatographie de phase inverse.

Rétention des composés polaires

Afin d’illustrer efficacement les capacités de la chromatographie en mode HILIC, nous avons sélectionné neuf vitamines hydrosolubles, démontrant différentes compositions chimiques et sélectivités, pour servir d’exemples.

Grande variété de fonctionnalités et de pKa

• Acides carboxyliques (pKa 2,7 – 4,7) • Amines (pKa 3,4 – 5,6) • Phosphate (pKa �,5) • Amine quaternaire (pKa 5,5)

Plage étendue de logP (5,4 unités) • LogP minimum = –4,6 (Thiamine) • LogP maximum = 0,83 (acide p-aminobenzoïque)

Demandez la note technique !

min

Solution de vitamines sur la colonne Luna HILIC

Colonne: Luna 5 µm HILIC Dimension: 150 x 4,6 mm

Référence N°: 00F-4450-E0Phase Mobile: A: Acétonitrile

B: EauC: 100 mM d’acétate d’ammonium pH 5,8

Gradient: A/B/C (90:5:5) pendant 2,5 min puis A/B/C (50:45:5) en 7,5 min, maintien pendant 2,5 min. Ré-équilibrez à A/B/C (90:5:5) pendant 7,5 min

Débit: 2,0 mL/minDétection: UV à 260 nm

Température: AmbiantEchantillon: 1. p-Aminobenzoic Acid pKa 4,7, H+pKa 2,7 logP 0,83

2. Nicotinamide H+pKa 3,35 logP –0,373. Riboflavin pKa 10,2 logP –1,464. Nicotinic Acid pKa 4,7, H+pKa 3,0 logP 0,365. Pyridoxine H+pKa 5,6, pKa 8,6 logP –0,776. Thiamine H+pKa 5,5 logP –4,67. Ascorbic Acid pKa 4,1, 11,2 logP –1,858. Cyanocobalamine pKa 1,59 logP –0,909. Folic Acid pKa 2,7, 4,1, 8,9 logP –0,02

AvAntAges de lA chromAtogrAphie hilic


0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 min

0.20 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 min3.0

3

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 min

0.01000.0

2000.0

3000.0

4000.0

5000.0

6000.0

7000.0

8000.0

9000.0

1.0e4

1.1e4

1.2e4

1.3e4

1.4e4

1.5e4

1.6e4

1.7e4

1.8e4

1.9e4

2.0e4

2.1e4

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 min0.0

1000.0

2000.0

3000.0

4000.0

5000.0

6000.0

7000.0

8000.0

9000.0

1.0e4

1.1e4

1.2e4

1.3e4

1.4e4

1.5e4

1.6e4

1.7e4

1.8e4

1.9e4

2.0e4

2.1e4

Rétention des composés polaires

Ribavirine sur la colonne Luna HILIC

Ribavirine

O

O

OHHO

HO

NH2

N

NN

k’ = 0,85

Rétention et sensibilité accrues

Surface du pic = 20 759

Pus le composé est polaires = plus grande est la rétention !

0,5 ng sur la colonne


1. Acyclovir = rouge2. Ganciclovir = bleu

Ribavirine sur C18

App

N° 1

6442

App

N° 1

6343

App

N° 1

6440

Ganciclovir et acyclovir sur la colonne Luna HILIC

Ganciclovir et Acyclovir sur C18 avec groupe polaire intégré

App

N° 1

6441

• Les composés hautement polaires tels que la ribavirine risquent d’être mal retenus sur les colonnes de phase inverse

• Les techniques HILIC augmenteront la rétention et la sensibilité des composés polaires

• Comme le mode HILIC emploie un système à base de solvants qui est l’inverse de ce qui est communément utilisé en phase inverse, l’ordre d’élution des pics est inversé sur la colonne Luna HILIC.

• Les composés polaires/hydrophiles qui sont particulièrement difficiles à retenir, même sur les colonnes de phase inverse avec groupe polaire intégré, bénéficieront d’une rétention maximale avec le mode HILIC.

�

2

1. Acyclovir = rouge2. Ganciclovir = bleu

2

�

S’élue au volume mort Surface du pic = 17 996

Besoin d’un gradient pour s’éluer

Colonne: Gemini 5 µm C18Dimension: 100 x 2,0 mm

Référence N°: 00D-4435-B0Phase Mobile: Acétonitrile avec 0,1 % v/v acide formique /

Eau avec 0,1 % v/v acide formique (3:97)Débit: 0,4 mL/min

Détection: Mass Spectrometer (MS) (Ambiant)Température: Ambiant

Echantillon: 1. Ribavirin (MRM: 245,2/113,2)

Colonne: Luna 3 µm HILICDimension: 100 x 2,0 mm

Référence N°: 00D-4449-B0Phase Mobile: A: Acétonitrile/100 mM Formate d’ammonium,

pH 3,2 (90:10) B: Acétonitrile/20 mM Formate d’ammonium, pH 3,2 (50:50)

Gradient: 100 % A pendant 3 min, puis vers 100 % B en 4,5 min puis retour vers 100 % A pendant 10 min

Débit: 0,4 mL/minDétection: Mass Spectrometer (MS)

Température: Ambiant Echantillon: 1. Ribavirin (MRM: 245,2/113,2)


Référence N°: 00D-4449-B0Phase Mobile: Acétonitrile/100 mM Formate d’ammonium,

pH 3,2 (90:10)Débit: 0,4 mL/min

Détection: Mass Spectrometer (MS) Température: Ambiant

Echantillon: 1. Acyclovir2. Ganciclovir

Colonne: Synergi 4 µm Fusion-RP 80 ÅDimension: 100 x 2,0 mm

Référence N°: 00D-4424-B0Phase Mobile: Acétonitrile/10 mM Formate d’ammonium,

pH 3,2 (3:97)Débit: 0,4 mL/min

Détection: UV à 260 nmTempérature: Ambiant

Echantillon: 1. Acyclovir2. Ganciclovir

AvAntAges de lA chromAtogrAphie hilicAvAntAges de lA chromAtogrAphie hilic


4

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4min0.0

2000.04000.0

6000.08000.0

1.0e41.2e4

1.4e41.6e4

1.8e42.0e4

2.2e42.4e4

2.6e42.8e4

3.0e43.2e4

3.4e43.6e4

3.8e44.0e4

4.2e44.4e4

4.6e44.8e4

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 min0.0

2000.04000.0

6000.08000.0

1.0e41.2e4

1.4e41.6e4

1.8e42.0e4

2.2e42.4e4

2.6e42.8e4

3.0e43.2e4

3.4e43.6e4

3.8e44.0e4

4.2e44.4e4

4.6e44.8e4

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4min0.0

2000.04000.0

6000.08000.0

1.0e41.2e4

1.4e41.6e4

1.8e42.0e4

2.2e42.4e4

2.6e42.8e4

3.0e43.2e4

3.4e43.6e4

3.8e44.0e4

4.2e44.4e4

4.6e44.8e4

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 min0.0

2000.04000.0

6000.08000.0

1.0e41.2e4

1.4e41.6e4

1.8e42.0e4

2.2e42.4e4

2.6e42.8e4

3.0e43.2e4

3.4e43.6e4

3.8e44.0e4

4.2e44.4e4

4.6e44.8e4

2Sensibilité accrue en LC-MS/MS avec la colonne Luna HILIC

L’analyse d’échantillons bioanalytiques en support d’études pharmacocinétiques cliniques et précliniques nécessite une méthodologie analytique à haute sensibilité, capable d’assurer des limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) assez basses.

L’obtention de niveaux très bas pour les LOD et les LOQ peut être réalisée par une augmentation du signal analytique, une diminution du bruit ou les deux à la fois.

Un des problèmes rencontrés avec un certain nombre d’analytes est une sensibilité insuffisante. Les deux facteurs les plus critiques de la sensibilité avec la méthode LC-MS/MS sont :

1. Les propriétés chimiques et physiques de l’échantillon.

2. La composition de la phase mobile.

Nous avons illustré une combinaison indésirable de ces deux facteurs survenant ensemble dans l’application en phase inverse à droite.

1. Difficulté de retenir les composés polaires.

2. La matrice biologique crée une zone de suppression d’ions ou l’aire dans laquelle de nombreux composés endogènes de la matrice biologique s’éluent - le résultat est une insuffisance de la méthode LC-MS/MS, communément appelée « l’effet matrice ».

Avec la colonne Luna HILIC, nous observons une augmentation de la rétention des analytes à l’écart de la zone de suppression – avec une réduction effective du bruit. La phase mobile à haute teneur organique offre des conditions plus favorables de désolvatation et d’ionisation, permettant ainsi une augmentation du signal analytique.

En créant des conditions plus favorables à la fois pour la rétention et l’ionisation, les colonnes Luna HILIC améliorent la sensibilité pour l’analyse d’échantillons bioanalytiques.

Amélioration de la sensibilité de la spectrométrie de masse

Nicotine et métabolites sur la colonne Luna HILIC

Nicotine et métabolites sur C18

Surface du pic de nornicotine 4 281

Surface du pic de nicotine

82 900Surface du pic de nornicotine

69 200


Surface du pic de nicotine 4 849

Surface du pic de cotinine

123 700

Surface du pic de cotinine 97 400


Augmentation de la sensibilité

Elution dans la zone de suppression d’ionsAp

p N°

163

35

La rétention accrue en mode HILIC permet l’élution des analytes en dehors de la région de suppression, d’où une hausse de sensibilité du détecteur. En plus de l’augmentation de la rétention et de la

sensibilité, le mode HILIC a également résolu les composés dans l’ordre inverse de celui observé en chromatographie liquide de phase inverse.

L’inversion de l’ordre d’élution en mode HILIC peut être avantageuse si des interférences sont observées avec la chromatographie liquide de phase inverse.

App

N° 1

6345



Référence N°: 00D-4450-B0Phase Mobile: Acétonitrile

/100 mM Formate d’ammonium, pH 3,2 (90:10)

Débit: 0,4 mL/minDétection: Mass Spectrometer

(MS) Température: Ambiant

Echantillon: 1. Cotinine (MRM: 177/80)2. Nicotine (MRM: 163/80)3. Nornicotine (MRM: 149/80)


Référence N°: 00D-4435-B0Phase Mobile: A: Eau avec 0,1 % v/v

acide formique B: Acétonitrile avec 0,1 % v/v acide formique

Gradient: A/B (97:3) pendant 1 min, puis (70:30) en 2 min, puis (97:3) en 0,01 min, maintien pendant 2,5 min

Débit: 0,4 mL/minDétection: Mass Spectrometer

(MS)Température: Ambiant

Echantillon: 1. Nornicotine (MRM: 149,1/80,1)2. Nicotine (MRM: 163,3/105,9)3. Cotinine (MRM: 177,3/80,1)



1 2 min0

S/N = 6,2

S/N = 20,62

0 1 2 min

La colonne Luna HILIC permet la rétention de métabolites polaires à faible

concentration sur la colonne, au-delà de la zone de suppression critique, permettant ainsi :

• Une augmentation de la sensibilité de MS

• Un rapport signal/bruit plus élevé (S/B)

to

to

to= 0,5 min~

k'=1= =tR–to

to

1- 0,5

0,5

La région de suppression des ions est de 0,5 à �,0 min

Principale région de suppression des ions

5

Composé polaire en mode HILIC

Composé polaire en phase inverse sur C18

Amélioration de la sensibilité de la spectrométrie de masse

Excellente sensibilité de MS

Mauvaise sensibilité de MS

App

N° 1

6443

App

N° 1

6444



Référence N°: 00D-4449-B0Phase Mobile: Acétonitrile / 100 mM Formate

d’ammonium, pH 3,2 (90:10) Débit: 0,4 mL/min

Détection: Mass Spectrometer (MS)Température: Ambiant

Echantillon: Bamethan


Référence N°: 00D-4435-B0Phase Mobile: 0,1 % Acide formique / Acétonitrile (97:3)

Débit: 0,4 mL/minDétection: Mass Spectrometer (MS)

Température: AmbiantEchantillon: Bamethan


6

Le mode HILIC vous permet d’injecter directement après la préparation de l’échantillon dans des éluents à forte teneur organique et ainsi de sauter l’étape fastidieuse d’évaporation et reconstitution.3

Augmentation du débit d’échantillons Luna HILIC

Actuellement, un développement de méthodes rationnel inclut l’optimisation des conditions chromatographiques, des conditions du détecteur et de la méthode de préparation des échantillons. Une amélioration de l’interface entre ces trois paramètres peut augmenter la productivité et réduire les coûts d’analyse.

Les services ADME (absorption, distribution, métabolisme, excrétion) et DMPK (pharmacocinétique, toxicocinétique, métabolisme) des sociétés pharmaceutiques, ainsi que des organismes de recherche sous contrat (CROs), illustrent parfaitement le besoin d’une stratégie chromatographique/de préparations d’échantillons plus sophistiquée. Dans ce domaine, les deux techniques de préparation d’échantillons les plus souvent utilisées restent encore la précipitation des protéines (PPT) et l’extraction en phase solide (SPE).

Les solvants d’élution les plus souvent utilisés pour ces techniques ont une plus forte puissance organique que la phase mobile de départ employée avec les méthodes typiques par gradient en phase inverse. Cette disparité entraîne généralement un élargissement significatif de la bande d’élution ou une élution très précoce dans les injections chromatographiques ultérieures. C’est pourquoi l’évaporation de l’éluent, suivie d’une reconstitution à l’aide d’un solvant compatible en phase mobile, est nécessaire. L’élimination de ces longues étapes améliorerait grandement le débit des échantillons pour un laboratoire d’analyses traitant de gros volumes.

Les colonnes Luna HILIC augmentent la capacité de production d’un laboratoire par une amélioration de l’interface entre la chromatographie et l’extraction des échantillons. Les colonnes Luna HILIC permettent une injection directe de solvants d’élution à forte teneur organique, provenant aussi bien d’une étape SPE que d’une précipitation de protéines. En mode HILIC, il s’agit de solvants d’élution plus faibles que la phase mobile HILIC et ils ne contribueront pas à un élargissement de la bande ni à une élution précoce. L’élimination des étapes finales d’évaporation et de reconstitution peut diminuer fortement (jusqu’à 50 %) la durée totale de préparation de l’échantillon.

Augmentation du débit d’échantillons

Déroulement des opérations en mode HILIC

Étape 3.Analyse

Étape 1.Préparation de l’échantillon • LLE • SPE • PPT

Sautez l’étape 2 !

Déroulement des opérations en phase inverse

Étape 2.AnalyseÉvaporation et

reconstitution

Étape 3.Étape 1.Préparation de l’échantillon • LLE • SPE • PPT




3

1 2 3 4 5 6 min01 2 3 4 5 6 min0 min

10 2 3 4 5 6 7 8 9 minmin

min

7

En mode de chromatographie HILIC, un solvant d’injection acétonitrile/eau (5:�) constitue un solvant d’injection « faible ». De la morphine et des métabolites ont été injectés sur la colonne Luna HILIC dans un éluent typique

acétonitrile/eau (5:�) pour une préparation d’échantillon et les composés sont bien retenus et bien résolus.

En mode de chromatographie en phase inverse, l’injection de solutés dans des éluents typiques pour une préparation d’échantillon, tels

qu’avec une teneur organique de l’ordre de 75 à 85 %, donnera des résultats défavorables, comme des pics larges ou une perte de rétention. La morphine et les métabolites perdent toute rétention et s’éluent au volume mort.

Injection après la préparation de l’échantillon (acétonitrile/eau à raison de 5:1)

1

2

3

12

3

Augmentation du débit d’échantillons

Injection après la préparation de l’échantillon (acétonitrile/eau à raison de 5:1)

Avec l’étape fastidieuse de séchage / reconstitution.

Injection après l’évaporation et la reconstitution

Co-élution

App

N° 1

6445

App

N° 1

6447

App

N° 1

6446


Référence N°: 00D-4449-B0Phase Mobile: A: Acétonitrile / 100 mM Formate

d’ammonium, pH 3,2 (90:10)B: Acétonitrile / 20 mM Formate d’ammonium, pH 3,2 (50:50)

Gradient: A/B (100:0) maintenu pendant 1 min à (0:100) en 2 min, A/B (0:100) maintenu pendant 1,5 min

Débit: 0,4 mL/minVolume

d’injection:5 µL

Détection: Mass Spectrometer (MS) Température: Ambiant

Echantillon: 1. Morphine2. Normorphine3. Morphine-3-ß-Glucuronide

Colonne: Synergi 4 µm Polar-RPDimension: 100 x 2,0 mm

Référence N°: 00D-4336-B0Phase Mobile: A: Eau avec 0,1 % d’acide formique

B: Acétonitrile avec 0,1 % d’acide formiqueGradient: A/B (97:3) maintenu pendant 2 min, jusqu’à

(50:50) en 2,8 minDébit: 0,4 mL/min

Détection: Mass Spectrometer (MS)Volume d’injection: 5 µL

Température: Ambiant Echantillon: 1. Morphine

2. Normorphine3. Morphine-3-ß-Glucuronide

AvAntAges de lA chromAtogrAphie


min0 2 4 10 12 14

min0 2 4 10 12 14

min0 2 4 6 8 10 12 14

min0 2 4 6 8 10 12 14

Nicotinamid Thiamin

Nicotinamid Thiamin

1Les colonnes Luna HILIC utilisent une phase réticulée DIOL stable

Les effets stabilisants de nos ponts éthylène formulés permettent la formation de liaisons covalentes flexibles, suffisamment robustes pour résister aux conditions difficiles qui causeraient une perte de phase sur la plupart des autres phases Diol.

Les phases Diol fournissent :

• Une rétention intéressante de la couche d’eau

• Une liaison hydrogène non tributaire du pH qui est importante pour le mécanisme de rétention en mode HILIC

• Des interactions dipôle-dipôle

• Une absence de groupements dissociables

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2OH2O

ACNACN

ACN

ACNACN

ACN

ACN

ACNACN

ACNACN

ACNACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACNACN

H2O

H2O

H2O

H2OH2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2OH2O

OH

O

O

H

O O

OH

OH OH

O

O

O O

OO OHOH

OH

O-O

O

HO

OHOH

Test de stabilité à pH élevé

Test de stabilité à pH faible

Ajout d’acide trifluoroacétique (TFA)Veuillez noter les effets de rétention causés par le modificateur TFA. Ce réactif d’appariement d’ions faible s’associe avec les groupements chargés sur les vitamines polaires et les amène à devenir de plus en plus hydrophobes, RÉDUISANT la rétention en mode HILIC !

Dans cet exemple, le TFA a été utilisé pour illustrer la stabilité à pH faible. Pour savoir quels sont les tampons recommandés, reportez-vous à la stratégie de développement de méthodes HILIC en LC/MS, page 12 à 15.

Après 7 200 volumes de colonnes

Premier jourCyanocobalamine

Cyanocobalamine

Après 7 200 volumes de colonnes

Premier jourCyanocobalamine

Cyanocobalamine

Nicotinamide

Nicotinamide

Thiamine

Thiamine

8

Stabilité

pH = 8,5

pH = 2,2

AvAntAges de lA colonne lunA hilic


Référence N°: 00F-4450-E0Phase Mobile: A: Eau, B: Acétonitrile, C: 100 mM Acétate

d’ ammonium pH 8,5Gradient: A/B/C (0:90:10) vers (40:50:10) en 15 min


Température: Ambiant


Référence N°: 00F-4450-E0Phase Mobile: A: Eau, B: Acétonitrile, C: 0,1 %TFA dans

l’eau, pH 2,2Gradient: A/B/C (0:90:10) vers (40:50:10)


Température: Ambiant


min0 1 2 3 4 5 6 7

to

1 2

3

4

56

min0 1 2 3 4 5 6 7

6

5

4

3

21

to

min0 1 2 3 4 5 6 7

to

1 2

3

4

5

6

2min0 1 2 3 4 5 6 7

65

3

4

21

to

min0 1 2 3 4 5 6 7

to

1 2

3

4

56

min0 1 2 3 4 5 6 7

to

1 2

3

4

56

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5min0.0

2.0e64.0e66.0e68.0e61.0e71.2e71.4e71.6e71.8e72.0e72.2e72.4e72.6e72.8e73.0e73.2e73.4e73.6e73.8e74.0e74.2e74.4e74.6e74.8e75.0e7 0.65

3.362.302.501.80 2.051.45 1.65

1.200.10

3.91

4.06

4.56

5.36

3

9

Lot 1

Lot 2

Lot 3

Lot 1

Lot 2

Lot 3

Reproductibilité inter lots

3 µm 5 µm

Faible niveau de perte de phase stationnaire en mode MS

Phase Mobile: A: Eau B: Acétonitrile

Gradient: A/B (10:90) pendant 1,5 min puis A/B (50:50) en 2 min, maintenir 1,5 min, puis A/B (10:90) et maintien pendant 5 min

La stabilité accrue de la phase réticulée DIOL fournit le profil de niveau de perte de phase

stationnaire ultra-faible nécessaire pour les applications en LC-MS/MS à haute sensibilité.

App

N° 1

6438

App

N° 1

6340

Rouge = Luna HILICBleu = Union


Les Colonnes: Luna 3 µm HILICLuna 5 µm HILIC

Dimension: 150 x 4,6 mmPhase Mobile: A: Acétonitrile

B: 100 mM Formate d’ammonium, pH 3,2C: Eau

Gradient: A/B/C (90:10:0) à (50:10:40) en 15 min


Température: AmbiantEchantillon: 1. PABA

2. Nicotinamide3. Riboflavin4. Nicotinic Acid5. Pyridoxine6. Thiamine


to

1 2

5

3

46

min0 2 4 6 8 10

min0 2 4 6 8 10

min0 2 4 6 8 10

45

3

21

to

1 2

3

4

5to

4

App

N° 1

6431

App

N° 1

6337

App

N° 1

6432

Résolution à la ligne de base de tous les pics

6 (Thiamine-pas élution)

6 (Thiamine-pas d’élution)

�0

Luna 5 µm HILIC

SeQuant 5 µm ZIC®-HILIC

Advantages sur le plan de la sélectivité

Conditions identiques pour toutes les colonnes


Eaus® Atlantis® 5 µm HILIC

Les Colonnes: Comme indiquéDimension: 150 x 4,6 mm

Phase Mobile: Acétonitrile/100 mM Formate d’ammonium, pH 3,2 (90:10)


Température: AmbiantEchantillon: 1. PABA

2. Nicotinamide3. Riboflavin4. Nicotinic Acid5. Pyridoxine6. Thiamine


Approche étape par étape

1e partie : Développement de la méthodeÀ l’aide d’une série de conditions génériques, déterminez rapidement l’applicabilité du mode HILIC. Passez en revue pour déterminer les meilleures conditions de départ.

2e partie : Évaluation de la méthodeÉvaluez les résultats du processus d’analyse.

3e partie : Optimisation de la méthodeOptimisation supplémentaire pour obtenir les critères désirés.

Objectifs �. Déterminer rapidement l’applicabilité du mode HILIC pour vos composés.

2. Approcher des « meilleures » conditions de séparation à l’aide d’une série de conditions qui fournissent le plus d’information dans les délais les plus courts.

3. Fournir la base d’une optimisation supplémentaire de la méthode, si nécessaire.

Ascorbinsäure

(logP=-3,13, pKa=3,52a, 8,32a)Vitamine C

HO

HO

HO

OO

HO

14,34

3,52 8,32

13,80

15,08

Cyanocobalamin

(logP=-0,90, pKa=1,59a, 6,00b, 8,93b)Vitamine B12

OO

O

OO

O

O

O

O

OOH

N

N

NH

NH2H2N

H2N

H2NH2N

OP

O

CH3

CH3

H3C

H3C

CH3

CH3 CH3

CH3CH3

HO

NH2NH2

NN

NCo

N

N

NH2

Acide folique

(logP=-0,02, pKa=2,68a, 4,12a, 8,07a, 2,90b, 2,08b)Vitamine B9

OH

HO

OH

O

O

O

NHNH N

NN

NNH

2,68

4,12

2,08

2,90

NicotinamidO

H2N N

(logP=-0,61, pKa=3,63b)Pro-Vitamine B3

3,63

Nicotinic Acid

OHO

N

(logP=0,25, pKa=3,77a, 3,01b)Niacine, B3

3,01

3,77

OH

O

H2N

(logP=0,78, pKa=4,77a, 2,69b)Vitamine B Complex

2,69b

4.77

PyridoxinOH

OH

N

(logP=0,45, pKa=5,58b, 8,60a)Vitamine B6

5,58

8,60

H3C

Riboflavin

(logP=-1,46 , pKa=7,97a)Vitamine B2

HO

HOOH

OH

O

O

NH

N N

N

H3C

H3C 7,97

Thiamin

(logP=-4,63, pKa=5,54b)Vitamine B1

OH

NH2

N

N

N+

SH3C

CH3

5,54

Profil des vitaminesLes vitamines choisies présentent un grand éventail de fonctionnalités et démontrent également les points clés de la chromatographie HILIC.

Les vitamines choisies pour nos essais se caractérisent par :

• Une plage étendue de valeurs pKa

• Une variété de groupes fonctionnels

• Une plage étendue de logP (5,4 unités)

Molécules d’essai :1. 3.2. 4.

5. 6. 7.

8. 9.

Acide p-aminobenzoïque Nicotinamide Riboflavine Acide nicotinique

Pyridoxine Thiamine Acide ascorbique

Cyanocobalamine Acide folique

��

strAtégie pour le de développement de méthodes hilic


1e partie : Développement de la méthode

Les solutions tampons recommandées en 2A et 2B ont été sélectionnées en fonction des caractéristiques suivantes :

• Le pH souhaité pour réaliser les séparations avec les analytes polaires basées sur la liaison hydrogène

• La haute solubilité des éluents avec une forte concentration en acétonitrile

• La compatibilité avec la détection par MS

1

�2

2A �00 mM de formiate d’ammonium, pH 3,2 : pesez environ 6,3� g de formiate d’ammonium et dissolvez-les dans � litre d’eau (MQ). Ajoutez �0,5 mL d’acide formique et mélangez bien. Prenez �0 mL de l’aliquote et mesurez le pH de l’aliquote.

2B �00 mM d’acétate d’ammonium, pH 5,8 : pesez environ 7,7� g d’acétate d’ammonium et dissolvez-les dans � litre d’eau (MQ). Ajoutez 0,5 mL d’acide acétique et mélangez bien. Prenez �0 mL de l’aliquote et mesurez le pH de l’aliquote.

Utilisez un gradient inversé en démarrant à 90 % d’Acétonitrile1A Maintenez le taux de 90 % d’acétonitrile en mode isocratique pendant 2,5 min - (cette

période de temps permet de déterminer si un composé est faiblement retenu en mode HILIC)

1B La partie gradient du profil d’élution est la zone d’élution idéale. Si un composé s’élue pendant le mode gradient, alors il y a une flexibilité maximale lors de l’ajustement de la sélectivité

1C Maintenez les 2,5 dernières minutes en mode isocratique avec 50 % d’acétonitrile. (Cette période de temps permet de déterminer si un composé est fortement retenu en mode HILIC)

Considérations pratiques pour le gradient HILIC :• Procédez à trois (3) injections pour tester l’équilibrage

• Équilibrage ~ 10 volumes de colonne à 90 % d’acétonitrile

Étape 1. Choisissez les conditions de la phase mobile

12 min108642040

50

60

70

80

90

100

1A

1B

1C

Étape 2. Préparez les solutions tampons

Analyse des conditions des phases mobiles acides et basiques

2A

2B

Considérations pratiques pour le tamponnage HILIC :• Les valeurs de pH utilisées ici sont des

valeurs de pH en phase aqueuse

• Les pKa des composés acides augmentent avec l’augmentation des substances organiques

• Les pKa des composés basiques diminuent avec l’augmentation des substances organiques


Luna HILIC pH 3,2

Luna HILIC pH 5,8


App

N° 1

6435

App

N° 1

6430

App

N° 1

6433

App

N° 1

6434

App

N° 1

6436

App

N° 1

6437

1

�3

1e partie : Développement de la méthode

Étape 3. Passez en revue des colonnes aux chimies différentes dans les deux solutions tampons

Zwitterion

Silice

Zwitterion

Silice

• Il existe de grandes différences de sélectivité entre les colonnes HILIC. Appliquez un gradient de départ générique, analysez les trois colonnes avec les deux solutions tampons.


pH 3,2Luna HILIC

(Diol réticulée)

pH 5,8

3A

3B

3C

(3A) Luna 5 µm HILIC(3B) SeQuant 5 µm ZIC® - HILIC

(3C) Luna 5 µm Silice (2)

Les Colonnes:

3A

3B

3C

Luna HILIC (Diol réticulée)

6-Pas d’élution


Phase Mobile: A: AcétonitrileB: EauC: 100 mM Formate d’ammonium, pH 3,2

Gradient: A/B/C (90:5:5) pendant 2,5 min puis A/B/C (50:45:5) en 7,5 min, maintien pendant 2,5 min. Ré-équilibrez à A/B/C (90:5:5) pendant 7,5 min

Débit: 2 mL/minDétection: UV à 260 nm

Température: Ambiant Echantillon: 1. PABA, 2. Nicotinamide, 3. Riboflavin, 4. Nicotinic Acid, 5. Pyridoxine,

6. Thiamine, 7. Ascorbic Acid, 8. Cyanocobalamin, 9. Folic Acid


Phase Mobile: A: AcétonitrileB: EauC: 100 mM Acétate d’ammonium, pH 5,8

Gradient: A/B/C (90:5:5) pendant 2,5 min puis A/B/C (50:45:5) en 7,5 min, maintenir pendant 2,5 min. Ré-équilibrez à A/B/C (90:5:5) pendant 7,5 min.

Débit: 2 mL/minDétection: UV à 260 nm

Température: Ambiant Echantillon: 1. PABA, 2. Nicotinamide, 3. Riboflavin, 4. Nicotinic Acid, 5. Pyridoxine,

6. Thiamine, 7. Ascorbic Acid, 8. Cyanocobalamine, 9. Folic Acid

100 mM Formate d’ammonium, pH 3,2


2e partie : Évaluation de la méthode

Classez les meilleurs résultats de votre procédure d’analyse

• Recherchez le ou les composés critiques qui sont importants pour réaliser vos objectifs de séparation

• La reproductibilité, la disponibilité et la robustesse revêtiront de l’importance à l’avenir, gardez tous vos objectifs à l’esprit

strAtégie de développement de méthodes lunA hilic

App

N° 1

6430

App

N° 1

6433

App

N° 1

6437

2

�4

N°1

Classement

N°2

N°3Considérations pratiques pour l’évaluation de la méthode :• Si les résultats satisfont vos critères en termes

de temps de rétention, sélectivité et efficacité, il se peut que vous ayez votre méthode finale.

• Si des ajustements s’avèrent encore nécessaires, reportez-vous à la section suivante consacrée à l’optimisation de la méthode.

Dans cet exemple, les colonnes Luna HILIC offrent la meilleure performance en termes de rétention, sélectivité et forme des pics

Luna HILIC pH 5,8

Zwitterion pH 5,8

Silice(2) pH 3,2


3e partie : Optimisation de la méthode

La colonne qui convient le mieux et la solution tampon à utiliser auront montré des signes favorables de rétention, sélectivité et forme des pics – recherchons maintenant comment nous pouvons encore les améliorer.

Les critères caractéristiques de la performance sont représentés ci-dessous. Temps de rétention k’>� pour réduire la suppression d’ions k’<�0 pour un cycle rapide Sélectivité �,� < Rs < �,5 optimale pour la MS Efficacité/ Forme des pics Maximiser N 0,8 < Asym < �,5

Pour obtenir ces critères de performance en mode HILIC, nous recommandons

Considérations importantes pour assurer l’optimisation de la méthode

1. L’ajout d’un modificateur organique

2. L’ajustement de la force ionique

3. L’ajustement du pourcentage initial du modificateur organique

Considérations importantes pour l’ajout d’un modificateur organique :• Il peut produire certains résultats inattendus

• L’addition d’acétate d’éthyle augmente la rétention et la sélectivité de certains composés

• L’ajout de THF réduit généralement la rétention et la sélectivité de tous les composés

Considérations importantes pour l’ajustement de la force ionique :• La force ionique peut être un paramètre efficace pour

l’ajustement de la sélectivité, de la rétention et de l’efficacité

• Commencer avec un tampon minimum de 5 mM pour obtenir les meilleurs résultats

Considérations importantes pour le pourcentage initial du modificateur organique :• L’impact d’une hausse de 5 % est très perceptible

• L’équilibrage entre les surfaces est un processus relativement lent

strAtégie de développement de méthodes lunA hilic

3

�5


Si votre colonne Luna ne vous fournit pas une séparation au moins équivalente à celle obtenue avec une colonne concurrente de granulométrie, phase et dimensions similaires, envoyez vos données comparatives dans les 45 jours suivant votre achat et gardez la colonne Luna SANS FRAIS.

informAtions relAtives Aux commAndes

Colonnes 3 µm de petits diamètres (mm) Cartouches SecurityGuard™

50 x 2,0 100 x 2,0 150 x 2,0 4 x 2,0 mm pour DI: 2,0-3,0 mm

Prix

HILIC 00B-4449-B0 00D-4449-B0 00F-4449-B0 AJ0-8328

Prix

Silice(2) 00B-4162-B0 00D-4162-B0 00F-4162-B0 AJ0-4347

C8(2) 00B-4248-B0 00D-4248-B0 00F-4248-B0 AJ0-4289

C18(2) 00B-4251-B0 00D-4251-B0 00F-4251-B0 AJ0-4286

CN 00B-4254-B0 00D-4254-B0 00F-4254-B0 AJ0-4304

Phenyl-Hexyl 00B-4256-B0 00D-4256-B0 00F-4256-B0 AJ0-4350

NH2 00B-4377-B0 00D-4377-B0 00F-4377-B0 AJ0-4301

SecurityGuard™ nécessite l’utilisation d’un support de cartouches, référence: KJ0-4282

Colonnes 3 µm analytiques (mm) Cartouches SecurityGuard™

50 x 3,0 150 x 3,0 100 x 4,6 150 x 4,6 4 x 2,0 mm pour DI: 2,0-3,0 mm 4 x 3,0 mm pour DI: 3,2-8,0 mm

Prix

HILIC 00B-4449-Y0 00F-4449-Y0 00D-4449-E0 00F-4449-E0 AJ0-8328 AJ0-8329

Prix

Silice(2) — 00F-4162-Y0 00D-4162-E0 00F-4162-E0 AJ0-4347 AJ0-4348

C8(2) 00B-4248-Y0 00F-4248-Y0 00D-4248-E0 00F-4248-E0 AJ0-4289 AJ0-4290

C18(2) 00B-4251-Y0 00F-4251-Y0 00D-4251-E0 00F-4251-E0 AJ0-4286 AJ0-4287

CN 00B-4254-Y0 00F-4254-Y0 00D-4254-E0 00F-4254-E0 AJ0-4304 AJ0-4305

Phenyl-Hexyl 00B-4256-Y0 00F-4256-Y0 00D-4256-E0 00F-4256-E0 AJ0-4350 AJ0-4351

NH2 00B-4377-Y0 00F-4377-Y0 00D-4377-E0 00F-4377-E0 AJ0-4301 AJ0-4302

Colonnes 5 µm analytiques (mm) Cartouches SecurityGuard™

150 x 3,0 100 x 4,6 150 x 4,6 250 x 4,6 4 x 2,0 mm pour DI: 2,0-3,0 mm

4 x 3,0 mm pour DI: 3,2-8,0 mm

Prix

HILIC 00F-4450-YO 00D-4450-E0 00F-4450-E0 00G-4450-E0 AJ0-8328 AJO-8329

Prix

Silice(2) — 00D-4274-E0 00F-4274-E0 00G-4274-E0 AJ0-4347 AJ0-4348

C5 00F-4043-Y0 00D-4043-E0 00F-4043-E0 00G-4043-E0 AJ0-4292 AJ0-4293

C8 00F-4040-Y0 00D-4040-E0 00F-4040-E0 00G-4040-E0 AJ0-4289 AJ0-4290

C8(2) 00F-4249-Y0 00D-4249-E0 00F-4249-E0 00G-4249-E0 AJ0-4289 AJ0-4290

C18 00F-4041-Y0 00D-4041-E0 00F-4041-E0 00G-4041-E0 AJ0-4286 AJ0-4287

C18(2) 00F-4252-Y0 00D-4252-E0 00F-4252-E0 00G-4252-E0 AJ0-4286 AJ0-4287

CN 00F-4255-Y0 00D-4255-E0 00F-4255-E0 00G-4255-E0 AJ0-4304 AJ0-4305

Phenyl-Hexyl 00F-4257-Y0 00D-4257-E0 00F-4257-E0 00G-4257-E0 AJ0-4350 AJ0-4351

NH2 00F-4378-Y0 00D-4378-E0 00F-4378-E0 00G-4378-E0 AJ0-4301 AJ0-4302

SCX — 00D-4398-E0 00F-4398-E0 00G-4398-E0 AJO-4307 AJ0-4308

Colonnes 5 µm de petits diamètres (mm)

Cartouches SecurityGuard™

100 x 2,0 4 x 2,0 mm pour DI: 2,0-3,0 mm

Prix

HILIC 00D-4450-B0 AJ0-8328

SecurityGuard™ nécessite l’utilisation d’un support de cartouches, référence: KJ0-4282 Caractéristiques de colonnes

Dénomination

Forme / Granulométrie

(µm)Porosité

(Å)

Surface Spécifique

(m2/g)

Taux de Carbone

%End

CappingGamme de

pH

Luna HILIC Sphérique 3, 5 200 200 5,7 Non 1,5-8,0

Luna C5 Sphérique 5, 10 100 440 12,5 Oui 1,5-10

Luna C18(2)-HST Sphérique 2,5 100 400 17,5 Oui 1,5-10

Luna C18(2) Sphérique 3, 5,10,15 100 400 17,5 Oui 1,5-10

Luna C8(2) Sphérique 3, 5, 10, 15 100 400 13,5 Oui 1,5-10

Luna Phenyl-Hexyl Sphérique 3, 5, 10, 15 100 400 17,5 Oui 1,5-10

Luna Silice (2) Sphérique 3, 5, 10, 15 100 400 — Non —

Luna CN Sphérique 3, 5, 10 100 400 7,0 Oui 1,5-7,0

Luna NH2 Sphérique 3, 5, 10 100 400 9,5 Non 1,5-11

Luna SCX Sphérique 5, 10 100 400 0,55 % de taux de soufre

Non 2,0-7,0

* Prix hors taxe (HT).

�6

Avec une reproductibilité démontrée depuis plus de 10 ans, vous pouvez avoir confiance dans votre capacité de développer des méthodes sur les colonnes Luna


€ 419 € 460 € 430 € 179/10u € 419 € 520 € 460 € 520 € 179/10u € 179/10u

€ 425 € 179/10u

€ 449 € 425 € 449 € 495 € 179/10u € 179/10u

€ 435 € 399 € 435 € 450 € 179/10u € 179/10u

€ 290 € 410 € 445 € 179/10u € 290 € 445 € 410 € 445 € 179/10u € 179/10u

Protégez votre colonne Facile à utiliser

Bon rapport coût/efficacité

Adaptation universelle sur les colonnes de pratiquement tous les fabricants

Aucun changement en chromatographie

Autres produits de qualité :

Sélecteurs de colonne• Passez en revue jusqu’à 6 colonnes HPLC • Développez, optimisez et validez plus rapidement vos méthodes

Fours à colonnes• Améliore la chromatographie • Augmente le nombre de résultats reproductibles • Élimine les variations de température dans les colonnes

Filtres de seringue• Filtration rapide • Grande qualité • Disponibles avec 6 types de membrane

produits complémentAires

Pour plus d’informations : www.phenomenex.com/SecurityGuard

Luna est une marque déposée de Phenomenex, Inc. La marque SecurityGuard appartient à Phenomenex, Inc. Atlantis est une marque déposée de Eaus Corp. ZIC est une marque déposée de SeQuant AB. © 2008 Phenomenex, Inc., Tous droits réservés. Soumis aux termes standards de Phenomenex et aux conditions qui sont consultables sur www.phenomenex.com/TermsAndConditions.

25 à 90 ̊C

�7

«Je considère SecurityGuard comme une nécessité, pas comme un accessoire»V. Agarwal - Connecticut, USA


558�

_fr

France

01 30 09 21 1001 30 09 21 [email protected]

tél.:fax:

email:

tél.:fax:

email:

Allemagne

[email protected]

Australie

[email protected]

Etats-Unis

(310) 212-0555(310) [email protected]

Irlande

01 247 5405+44 [email protected]

Italie

051 6327511051 [email protected]

Autriche

[email protected]

Canada

(800) 543-3681(310) [email protected]

Danemark

4824 80484810 [email protected]

Nouvelle Zélande

[email protected]

Puerto Rico

(800) 541-HPLC(310) [email protected]

Royaume-Uni

[email protected]

www.phenomenex.comLes produits de Phenomenex sont disponibles dans le monde entier. Pour identi�er le distributeur le plus proche, n’hésitez pas à contacter notre département international par téléphone, fax ou émail: [email protected]

Prix hors taxe (HT).

Luna HILIC NOUVEAU L'héritage Luna - Phenomenex

Documents

Transcript of Luna HILIC NOUVEAU L'héritage Luna - Phenomenex