LỜI CẢM ƠN

i

LỜI CẢM ƠN

Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng Vi sinh vật – Viện Sinh học Nông

Nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS

– TS. Lương Đức Phẩm nên tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này.

Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS.

Lương Đức Phẩm người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm và tận tình

chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực tập, cùng các anh chị phòng Vi

sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt

nhiệm vụ của mình.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha

Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học đã

tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những

năm học vừa qua.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện Sinh

học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và các bạn cùng

thực tập đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè

thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học

tập, nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 6 – 2009

Sinh viên

Nguyễn Thị Phương Như

ii

MỤC LỤC Trang

Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................3

1.1. Đại cương về Bacillus ...............................................................................4

1.2. Protease...................................................................................................10

1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease ......................................................10

1.2.2. Ứng dụng của protease ....................................................................12

1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt

Nam ...........................................................................................................15

Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................16

2.1 Đối tượng – Vật liệu.................................................................................17

2.1.1. Đối tượng .........................................................................................17

2.1.2. Vật liệu.............................................................................................17

2.1.2.1.Thiết bị ...........................................................................................17

2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................................18

2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy)

(g/l):........................................................................................................18

2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease................................18

2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường ..........................................................19

2.2. Các phương pháp nghiên cứu ..................................................................19

2.2.1. Phương pháp phân lập ......................................................................19

2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển ..................................................19

2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn .....20

2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc .................................20

2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống .......................................20

2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram.........................................................21

2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử ...............................22

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase..........................................22

iii

2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang

(OD620nm ) ...............................................................................................22

2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein..............................23

2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên

khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm,

BM.............................................................................................................24

2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh

trưởng của các chủng Bs, Bm, BM .............................................................25

Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................26

3.1. Phân lập chủng Bacillus ..........................................................................27

3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc...............................................................27

3.3. Đặc điểm hình thái tế bào ....................................................................28

3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase .............................................................30

3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba

chủng Bs, Bm và BM.....................................................................................31

3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên

môi trường không có chất cảm ứng ............................................................33

3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3

chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh

bột tan ........................................................................................................34

3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và

BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan...................................34

3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm

và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ..............................35

3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3 chủng

vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein...............37

3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và

BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein ..............................................37

iv

3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn

Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein .........................39

3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs,

Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .................................................41

3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu

amylaza ......................................................................................................41


proteaza......................................................................................................44

3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan.................................................47

3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của

ba chủng nghiên cứu...................................................................................50

3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế ..51

3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men..............54

Phần IV KẾT LUẬN .......................................................................................56

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................58

v

DANH MỤC HÌNH Trang

Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs .........................................................................27

Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm........................................................................28

Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM.......................................................................28

Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs..............................................................................29

Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM .....................................................................29

Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm......................................................................30

Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM ....32

Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là

tinh bột tan..................................................................................................................36

Hình 9: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là

tinh bột tan..................................................................................................................36

Hình 10: Hoạt tính enzyme amylase của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng

là tinh bột tan..............................................................................................................37

Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là

cazein..........................................................................................................................39

Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng

là cazein......................................................................................................................40

Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng

là cazein......................................................................................................................40

Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của

chủng Bs.....................................................................................................................42


chủng Bm ...................................................................................................................42


chủng BM...................................................................................................................43

Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của

chủng Bs.....................................................................................................................44

vi


chủng Bm ...................................................................................................................45


chủng BM...................................................................................................................45

Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs,

Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3.......................................................49

Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs,

Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3.......................................................50

Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm

và BM.........................................................................................................................51

Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của Bs trong

môi trường bột đậu tương có CaCO3 ..........................................................................55

vii

DANH MỤC BẢNG Trang

Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra:...............31

Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường không có

chất cảm ứng .....................................................................................................33

Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan.............34

Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan ...........34

Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan...........35

Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein.....................38

Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein ...................38

Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein...................38

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi ..........................43

trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM ..................................................43

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein

của 3 chủng Bs, Bm và BM ...............................................................................46

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs,

Bm, BM ............................................................................................................48

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs,

Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .....................................................48

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza

của ba chủng Bs, Bm, BM .................................................................................52

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 đến khả năng sinh amylaza, proteaza

trên môi trường có bột đậu tương ......................................................................53

1

MỞ ĐẦU

Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung

quanh ta: trong đất, trong nước, không khí thậm chí cả trong cơ thể con

người. Chúng có thể gây cho ta cả những bất lợi khôn lường như những

bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm,

long móng ở bò lợn... nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồn

lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục

đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn.

Từ thời xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi

của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý

nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh

vật...

Ngày nay chúng ta đang sống ở thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học kỹ

thuật thì công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ

ưu thế của mình.

Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã

được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công

nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công - nông nghiệp, y học và đời sống

của con người.

Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus… đã và đang được

sử dụng trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất

như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, y học, bổ sung vào thức ăn gia

súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế

thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản... là nhờ khả năng sinh

enzyme thủy phân amylaza, proteaza, xenlulaza của chúng.

2

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

”Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính

enzyme proteaza kiềm”. Với các nội dung sau:

1. Phân lập từ đất vườn qua trung gian là cỏ khô và khoai tây để chọn

các chủng Bacillus.

2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên

cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chọn.

3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối có hoạt tính

cao.

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Viện Sinh học Nông

nghiệp thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

3

Phần I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1. Đại cương về Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi

Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu.

Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng

hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí

không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động

bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn

tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến

trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất,

nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng

vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [ 10 ]

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại

sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid

hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và

butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu

cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết

đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 450C, nhưng cũng

có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650C [11].

Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 –

10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như

Bacillus acidocaldrius.

Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,

cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp,

trong bảo vệ môi trường, …

Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:

5

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là

Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [13] .

Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều

trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô.

Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần

gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường

nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh

trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên

liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm

có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì.

Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền

của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu

Bacillus subtilis [13].

Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước

( 3 – 5) x 0,6 m.

Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi

[13]. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc

tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều

hay ít, bám chặt vào môi trường thạch.

Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360C – 500C, tối đa khoảng

600C. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được

nhiệt khá cao.

Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo

nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng

phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh

trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên

6

có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm

[1].

Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có

những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi

khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như:

amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin [14]. Ngoài ra

nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được

chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) [12]. Đặc biệt,

B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm

chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe [15].

Bacillus megaterium

Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” [13]. Tế bào của nó khá lớn

khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 –

1,5)m có thể đến 2 m, dài từ 3 – 12 m, ở các ống nuôi già thì tế bào

ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt

nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [2].

Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1)m, bào

tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 m [13]. Chúng nằm lệch tâm

thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào.

Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi

lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền

quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục.

Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm

bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào.

Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự

B.subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp.

7

Bacillus mensentericus

Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó

có mặt chủ yếu trên khoai tây. Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis,

mảnh dài hoặc ngắn ( 3- 10 ) x ( 0,5 – 0,6 ) m, có thể đứng riêng rẽ hoặc

chuỗi dài.

Bào từ hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 m, nằm ở vị trí bất kỳ

trong tế bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào

tử.

Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi

trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có thể màu Crem, vàng nâu,

hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger ( đen ), Bacillus

mensentericus ruber (hồng).

Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ

36 – 450C tối đa 50 – 550C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển.

Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn

Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn.

Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm

làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản

phẩm giàu đường ( bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng vào

ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn

sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn khác ( như

Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin hay Irutin A, B

Bacillus cereus

Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus

mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong

đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và

có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để

8

sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực

phẩm [13].

Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)m, có khi

dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích

thước 0,9 x (1,2 – 1,5)m nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và

không bào [2]. Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi

lõm, trắng đục, mép lồi lõm [3] .

Bacillus pumilus

Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường B.pumilus có mặt trong

đất nhiều hơn subtilis.

Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của

nó gần giống tế bào B.subtilis.

Bacillus polymyxa

Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi , trơn, nhày,

lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.

Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7)m,

đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào

đó sẽ phồng lên hình quả chanh [3].

Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao.

Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6)m, nằm giữa tế bào

[13]. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng

còn có khả năng cố định đạm.

Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì

vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và

những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là

nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ

biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược.

9

Bacillus brevis

Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm.

Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng

lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc.

Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)m.

Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1)

m, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [3].

Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit

amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [13] .

Bacillus simplex

Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với bề

mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc

biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng

và tiết vào môi trường [3].

Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6m, thường đứng

riêng rẽ không kết thành chuỗi.

Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 m, nằm lệch tâm.

Bacillus lincheniformis

Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D –

glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác.

Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát

triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra

bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng

phổ biến trong công nghiệp dược [13].

10

1.2. Protease

1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease

Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid [ - CO-

NH-] giữa các loại acid amin trong phân tử protein (hay các nhóm

polypeptide). Sản phẩm thủy phân là các acid amin, sản phẩm trung gian là

các peptide có mạch dài ngắn khác nhau và peptone – sản phẩm thủy phân

không hoàn toàn của protein

H2N – CH – CO – NH – CH – CO -…- NH – CH – COOH

H2N – CH – COOH + H2N – CH – COOH + … + H2N – CH – COOH

Protease là một nhóm enzyme phân giải protein ( gồm proteinase,

peptidase, desaminase,…) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt

động ở bên ngoài tế bào.

Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng

trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống. Ngoài chức

năng xúc tác cho phản ứng thủy phân protein thành acid amin và các hợp

chất có phân tử lượng thấp mà các tế bào có thể dễ dàng hấp thu, protease

còn có vai trò quyết định trong thiết lập, duy trì sự cân bằng giữa tổng hợp

và phân giải protein. Bên cạnh đó chúng còn tham gia vào quá trình hình

thành và nảy mầm bào tử của vi sinh vật, quá trình đông tụ máu, điều chỉnh

huyết áp, biến hình các enzyme và điều hòa biểu hiện gen [4]. So với

protease động vật và protease thực vật thì protease vi sinh vật là một hệ

thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối

lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng

H2O

R1 Rx R2

R2 R1 Rx

11

nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi

sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để

và đa dạng.

Người ta cũng phân loại protease theo vùng pH hoạt động tối thích:

protease acid, trung tính và kiềm tính. Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý

nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi

enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7].

Vi khuẩn B.subtilis là một trong những nhóm vi sinh vật gây thối rữa

tạo nhiều protease ngoại bào và đây là một enzyme protease kiềm (protease

serin). Enzyme này có pH tối ưu trong vùng kiềm (9 – 11) và chứa một

nhóm serin quan trọng ở trung tâm hoạt động.

*Sự phân giải protein ( quá trình thối rữa )

Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là

thành phần quan trọng của xác động thực vật và vi sinh vật. Protein thường

chứa khoảng 15 – 17 % Nitơ (tính theo chất khô). Nếu như tổng lượng

cacbon trong cơ thể sinh vật sống trên mặt đất là khoảng 7 tỷ tấn thì tổng

lượng nitơ sinh ra cũng tới 10 – 25 tỷ tấn. Trong lớp đất sâu 30cm bao

quanh trái đất và người ta còn thấy thường xuyên có khoảng 3 – 7,5 tỷ tấn

nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Sự phân

giải các hợp chất chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nông nghiệp và đối

với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta gọi quá trình này là

quá trình amon hóa.

Muốn phân giải protein cũng như đối với các hợp chất cao phân tử

khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại

bào và làm chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử lượng nhỏ

hơn (các polypeptid và các olygopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục được

phân hủy thành axitamin nhờ các peptidase ngoại bào, hoặc được xâm nhập

12

ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành axit amin. Một

phần các axit amin này được các vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng

hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những

con đường khác để sinh ra NH3, CO2 và những sản phẩm trung gian khác.

Những vi sinh vật không có khả năng sinh ra những enzyme phân

giải protease ngoại bào rõ ràng là không có khả năng đồng hóa được các

loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng các sản phẩm thủy phân

của protease (polypeptide, oligopeptid, axit amin) [5]. Các loài thuộc giống

Bacillus (B.subtilis, B.mesentericus, B.megaterium…) có khả năng amon

các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Chúng là những vi sinh vật đầu tiên tham

gia vào quá trình phân cắt các protein để tạo thành những chất có phân tử

lượng thấp hơn cho các vi sinh vật khác dễ sử dụng.

1.2.2. Ứng dụng của protease

Trong khi cả protease từ động vật, từ thực vật được nghiên cứu và ứng

dụng từ khá lâu trong các ngành công nghiệp sản xuất phomat, thuộc da,

làm bánh mỳ, làm trong bia tươi, thủy phân các protein, làm mềm thịt… thì

protease từ vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu từ 1950, mặc dù từ 1918

– 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn

[6]. Do vậy, ngày nay protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành

công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược, nông

nghiệp…

Ứng dụng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường

Protease đã được sử dụng dưới dạng chế phẩm thô để xử lý các chất

protein tồn đọng trong môi trường. Vi sinh vật có khả năng sinh protease

cũng được ứng dụng trong lĩnh vực phân hủy sinh học.

Trong công nghiệp thực phẩm

13

Trong sản xuất thịt, protease được sử dụng làm mềm thịt nhờ sự thủy

phân một phần protein trong thịt, kết quả là làm cho thịt có độ mềm thích

hợp và tăng hương vị thịt sau chế biến. Phương pháp làm mềm thịt nhờ tác

dụng của protease cho phép nâng cao chất lượng thịt đưa vào chế biến, làm

tăng tỷ lệ thịt có thể đưa vào sản xuất và rút ngắn thời gian chín của thịt

nhiều lần.

Người ta cũng dùng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân từ các phế

liệu giàu protein như thịt vụn, da… Người ta sử dụng dịch đạm thủy phân

làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và bổ sung vào thức ăn

gia súc. Dùng protease để thủy phân thường ít bị hao hụt axit amin như khi

dùng phương pháp hóa học.

Trong công nghiệp sữa, protease được dùng để sản xuất phomat nhờ

hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Để làm đông tụ sữa có thể dùng

rennin, pepxin hoặc một số protease vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ

sữa được tách từ nấm mốc và vi khuẩn. Trong số các enzyme này, rennin là

enzyme có giá trị đặc biệt, cho phép thu được sản phẩm có chất lượng cao

nhất còn các protease vi sinh vật thì ngoài khả năng làm đông tụ sữa còn có

khả năng thủy phân sâu sắc cazein, gây ảnh hưởng xấu đến mùi vị của

phomat. Vì vậy người ta cố gắng tìm ra những chủng vi sinh vật sinh

protease có đặc tính đông tụ sữa tương tự như rennin hoặc thay thế một

phần rennin ( 25 – 50 %) [7]

Trong công nghiệp nước giải khát, protease được sử dụng để làm trong

bia, trong nước hoa quả.

Trong sản xuất các chất tẩy rửa và xà phòng

Xà phòng có bổ sung protease đang chiếm lĩnh thị trường: “xà phòng

sinh học”. Tuy tỷ lệ bổ sung protease vào xà phòng rất thấp (1g/kg) nhưng

hàng năm trên thế giới đã sử dụng tới 50.000 – 60.000 tấn protease trong

14

công nghiệp xà phòng, chất tẩy [A6]. Hiện nay, ở Châu Âu sử dụng 80 – 85

% chất tẩy rửa có enzyme.

Trong nông nghiệp

Protease được sử dụng để xử lý thức ăn thô chuyển hóa thành dạng dễ

hấp thụ, bổ sung vào thức ăn gia súc.

Trong công nghiệp da

Protease được dùng trong công nghiệp làm mềm da, làm sạch, tách

lông,… nhờ sự thủy phân một phần protein của da. Chúng ta đã biết, chất

quan trọng của da là collagen. Phân tử của nó gồm những acid amin kết

hợp với nhau thành mạch dài vì vậy làm cho da bị cứng. Dưới tác dụng của

protease các chất nhờn bị tách ra và một liên kết trong sợi collagen bị phá

hủy. Kết quả của sự làm mềm da là loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm

cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi

thuộc da [8].

Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease khu trú trong cơ

quan tiến hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa ra các protease tách từ vi

khuẩn (là chủ yếu) vào công nghiệp da đã đem lại nhiều kết quả và dần

chiếm một vị trí quan trọng.

Trong sản xuất tơ tằm

Quá trình làm tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn. Chúng ta

đã biết tơ là sợi ngoại bào được nhả ra bởi cặp tuyến trùng của con tằm. Sợi

tơ gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin.

Sau khi tách hết xerixin thì sẽ được sợi fibroin tinh khiết. Sợi thu được khi

kéo ở kén ra thường có chứa 30% xerixin. Muốn tách xerixin thì phải nấu

tơ tằm trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 – 2 giờ. Chỉ sau khi

có sự gia công này tơ mới bắt đầu kéo chỉ. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại

trên lụa làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều

15

và khó trang trí trên lụa. Người ta đã sử dụng chế phẩm protease từ nấm

mốc, vi khuẩn để tách lượng xerixin còn lại này [8].

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, y

học:

Trong hương phẩm và mỹ phẩm: dưới tác dụng của protease trong

kem, các biểu b́ của da đã chết được tách ra, da non sẽ xuất hiện trên bề

mặt, đồng thời sự phát triển lông (tóc) cũng chậm lại.

Trong công nghiệp y học: các chế phẩm protease cũng được sử dụng

để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi

cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Chẳng hạn, môi trường dinh dưỡng để

nuôi các vi sinh vật sản xuất ra các kháng sinh kháng độc. Dĩ nhiên, các

protein có trong môi trường phải ở dạng dễ đồng hóa đối với vi sinh vật.

Do đó, phải thủy phân sơ bộ các protein bằng protease để cô đặc và tinh

khiết các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh kháng độc) [8].

1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở

Việt Nam

Ở Việt Nam protease chịu kiềm cũng đang được nghiên cứu ở Viện

công nghệ sinh học thuộc trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ

Quốc Gia, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên (Đại Học Quốc Gia Hà Nội), Đại

Học Bách Khoa Hà Nội, viện Công nghệ Thực Phẩm, viện Sinh Học Nhiệt

Đới thành phố Hồ Chí Minh và một số trường Đại Học, Viên nghiên cứu

khác.

Nhiều ứng dụng của protease đã được ứng dụng trong các lĩnh vực

và ngành nghề sản xuất ở Việt Nam như: Trong các ngành nghề công

nghiệp rượu, bia, sữa...Trong sản xuất chất tẩy rửa, trong công nghiệp

thuộc da và trong sản xuất nước tương, nước mắm...

16

Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

17

2.1 Đối tượng – Vật liệu

2.1.1. Đối tượng

Các chủng được phân lập từ đất vườn, cỏ khô quanh Viện Sinh học

Nông nghiệp trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, và khoai tây.

2.1.2. Vật liệu

2.1.2.1.Thiết bị

- Tủ cấy vô trùng - Bình tam giác - Cân điện tử - Bếp ga - Kính hiển vi quang học - Máy lắc - Tủ ấm - Máy đo OD - Tủ sấy - Tủ lạnh - Nồi hấp thanh trùng - Máy đo pH - Bình trụ - Các dụng cụ khác: Pipet, đầu típ, nồi,

đũa thủy tinh, đĩa petri, lam kính,…

2.1.2.2. Hóa chất

Các hóa chất phòng Vi sinh vật – Viện sinh học Nông nghiệp –

Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội

NaCl Cao men Agar Glucose KI Cazein Iốt Tinh bột tan Fucshin HgCl2 Cao thịt Tím gential Pepton Cồn 960

18

2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy) (g/l):

Pepton 10

Cao thịt 5

NaCl 5

Glucose 10

Agar 20

Nước cất 1000

pH = 5,5 – 7,8

Môi trường lỏng nuôi Bacillus không cho agar

2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease

Môi trường cơ sở: (g/l)

Pepton 5

Cao men 2,5

Nước 1000ml

pH = 5,5 – 7,8

Enzyme cần xác định Thành phần môi trường

Amylase Môi trường cơ sở + 1% tinh bột tan

Protease Môi trường cơ sở + 1% cazein

Tất cả các môi trường đều được hấp ở 0,8 – 1 atm trong 30 phút

Pha chế thuốc thử:

+ Pha thuốc thử Lugol: 1g I2 + 2g KI cho vào 100 ml nước cất,

khuấy cho tan hết trong phòng tối, sau đó đổ vào lọ tối màu, để nơi thiếu

ánh sáng và thoáng mát.

19

2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường

Các thành phần môi trường được hòa tan vào nước cất. Đối với môi

trường có agar cần được đun sôi quấy đều sau đó đem thanh trùng. Môi

trường được thanh trùng trong điều kiện: áp suất 1 atm ở nhiệt độ 1210C

trong 30 phút.

2.2. Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập

Lấy mẫu đất, đặc biệt ở những nơi có nhiều mùn, nhiều mẫu động

thực vật thối giữa, hòa nước thành dịch nước đất (lấy một ít đất khoảng 10g

và 90ml nước vô trùng cho vào bình tam giác 250ml).

Dùng kéo cắt ngắn cỏ khô hơi mục khoảng 1cm, cho vào bình tam

giác, cho dịch đất xâm xấp cỏ khô, có thể rắc thêm một ít bột CaCO3 lên bề

mặt cỏ. Gia nhiệt tới 850C, giữ ở nhiệt độ này trong 10 – 15 phút. Các bình

tam giác sau khi gia nhiệt ở 850C được nút bông và để vào tủ ấm ở nhiệt độ

320C trong 2 – 3 ngày đêm. Theo dõi sẽ thấy một lớp váng nhày trên bề

mặt cỏ, lấy lớp váng này cấy ra đĩa petri trên bề mặt môi trường phân lập

theo phương pháp pha loãng tới hạn và chọn các khuẩn lạc riêng biệt đặc

trưng.

Với khoai tây, không gọt vỏ, được cắt thành những thỏi dài có kích

thước 0,5 × 0,5 × 3 cm đặt vào các hộp petri. Thêm dịch đất đã ra nhiệt ở

850C, có thể thêm một ít bột CaCO3 rắc lên thỏi khoai tây. Đặt đĩa có khoai

tây vào tủ ấm ở 320C trong 2 ngày. Trên bề mặt thanh khoai tây hình thành

lớp màng nhăn nheo, lấy màng này cấy ra môi trường phân lập trong đĩa

petri.

2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển

Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi

trường thạch nghiêng là môi trường giữ giống, ở trong ống nghiệm.

20

Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để

nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy

dịch vi khuẩn phân lập đã được pha loãng bằng nước cất vô trùng, và cấy

zich zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 340C,

sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C

giữ giống.

Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân

giống.

2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn

Các chủng được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và

kính hiển vi quang học. Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá

dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình dáng, màu sắc, bề mặt và mép

khuẩn lạc.

2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc

Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường NA:

Khả năng phát triển của khuẩn lạc

Bề mặt khuẩn lạc

Màu sắc khuẩn lạc

2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống

Loại tiêu bản này dùng để xem hình dạng, kích thước và sự sắp xếp

các tế bào, khả năng hình thành bào tử, khả năng chuyển động.

Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá đỡ, nhỏ

một giọt nước sạch vô trùng lên giữa phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi

sinh vật mọc trên môi trường đặc, đặt vào chỗ giọt nước trên phiến kính,

hòa nhẹ để tạo huyền phù. Đậy nhẹ lá kính, vừa đậy vừa kéo trên giọt dịch

để tránh tạo thành bọt khí. Dùng khăn giấy lau nhẹ bề mặt lá kính cho khô.

21

Mọi thao tác cần tiến hành bằng các dụng cụ sạch, vô trùng và phải

cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau đó đặt tiêu bản lên bàn kính quan sát với vật

kính 40X [7].

2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram

Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một

quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến

muối magie của axit ribonucleic. Khi nhuộm phức tạp muối này có phản

ứng với thuốc nhuộm loại Tryphenylmetan (Genlatin violet, Oryatan violet,

Metyl violet) chịu được dưới tác dụng của cồn, nghĩa là không bị mất màu

dưới tác dụng của cồn. Những vi khuẩn như vậy gọi là vi khuẩn Gram

dương, ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu khi xử lý như vậy

gọi là vi khuẩn Gram âm.

Cách tiến hành: Cho một giọt nước vô trùng lên phiến kính, dùng

que cấy vô trùng lấy tế bào vi khuẩn hòa vào giọt nước. Hơ phiến kính lên

ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá tế bào vi

khuẩn sẽ bị biến dạng. Để giọt nước bay hơi dần như vậy vi khuẩn sẽ bị

gắn chặt vào phiến kính.

Nhuộm màu bằng tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc tím này lên vết

bôi, giữ 1 –2 phút rồi rửa bằng nước cất.

Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút cho đến

khi thẫm lại

Đổ hết thuốc nhuộm đi và lại tráng bằng nước cất. Sau đó nhúng vào

dung dịch cồn 960 trong 30 – 40 giây.

Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi.

Nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng trong 1 – 2 phút. Rửa lại bằng

nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô. Sau đó đem đi quan sát dưới

kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.

22

Nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thi đó là vi khuẩn Gram dương. Nếu vi

khuẩn nhuộm màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm.

2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử

Để xác định sự hình thành bào tử của vi khuẩn chúng tôi tiến hành

theo phương pháp sốc nhiệt:

Vi khuẩn được nuôi trong môi trường thạch trong 72h, sau đó sinh

khối tế bào được hòa vào nước cất.

Sốc nhiệt ở 80 – 850C trong 15 phút

Sau khi sốc nhiệt gạt dịch vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa, gói đĩa

để vào tủ ấm 340C trong 24h. Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ vi

khuẩn có khả năng hình thành bào tử.

2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase

Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 nồng độ 10% lên phiến kính, dùng đầu

que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên

phiến kính. Nếu chủng vi khuẩn nào sinh enzyme catalase sẽ tạo thành bọt

khí trên phiến kính.

2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang

(OD620nm )

Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một

phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. Do vi sinh vật trong

phần lớn trường hợp là không có màu và hầu như trong suốt, vì vậy dịch

nuôi cấy của tế bào hấp phụ ánh sáng không đáng kể trong vùng quang phổ

ánh sáng thấy được. Trong giới hạn nhất định, số lượng ánh sáng bị tán xạ

do dịch nuôi cấy vi sinh vật tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Nên trong cùng

một chiều dài sóng ánh sáng đập vào mà sự tán xạ ánh sáng càng nhiều

nghĩa là môi trường càng đục tương đương với mật độ tế bào vi sinh vật

càng nhiều.

23

Lấy 3 ml dịch nuôi cấy để tiến hành đo OD ở bước sóng 620 nm trên

máy quang phổ kế với đối chứng là môi trường không chứa vi khuẩn.

2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein

Để xác định khả năng thủy phân tinh bột, protein của các chủng vi

khuẩn, chúng tôi tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa

thạch.

Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trên các môi trường lỏng chứa cazein,

tinh bột ở nhiệt độ phòng ( 30 – 320C) trên máy lắc tốc độ 125 vòng/ phút.

Sau 36h lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng.

Tiếp theo, đổ môi trường đặc có chứa tinh bột, cazein đã được khử

trùng vào đĩa petri. Chờ cho môi trường nguội và đông lại, sau đó dùng

khuyên đục lỗ (đường kính khoảng 1cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên

bề mặt môi trường tạo thành các giếng.

Dùng pipetman hút dịch đã được lọc nhỏ vào các giếng trong đĩa

petri. Để đĩa vào tủ lạnh 2 tiếng để dịch khuyếch tán đều. Sau đó để vào tủ

ấm ở nhiệt độ 340C.

Sau khoảng 24h thử bằng thuốc thử. Dùng thuốc thử đổ lên bề mặt

thạch, nếu có enzyme thì nó tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng.

Phương pháp này không cho phép xác định chính xác hoạt độ của

các enzyme amylase, protease, nhưng cho phép định tính sự có mặt của các

enzyme này nhanh và đơn giản.

Kiểm tra hoạt tính Protease trên môi trường chứa cazein:

Dùng thuốc thử HgCl2 1% đổ lên bề mặt môi trường nuôi cấy. Nếu

vi khuẩn sinh protease thì sẽ có một vòng trong suốt xung quanh giếng, do

các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các vùng

chưa phân giải sẽ có màu trắng đục mờ.

24

Kiểm tra hoạt tính Amylase trên môi trường chứa tinh bột tan:

Dùng dung dịch Lugol đổ lên môi trường nuôi cấy chứa tinh bột.

Vùng chưa bị phân giải có màu xanh mực, phần xung quanh giếng bị phân

giải trở thành trong suốt không màu.

Đánh giá khả năng sinh enzyme để tuyển chọn những chủng có hoạt

tính enzyme cao: dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D). (D – d)

càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao ( d là đường kính giếng, d =

1cm).

2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên

khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm,

BM

Chuẩn bị môi trường có các nguồn nguyên liệu khác nhau ở các nồng

độ khác nhau:

1.Tinh bột tan với các nồng độ 1,5 ; 2 và 2,5%

2.Cazein với các nồng độ 2, 3, và 4%

3.Bột đậu tương với các nồng độ 1, 2, 3 và 4%

4.CaCO3 với các nồng độ 1, 2, 3, và 4%

Cho 50 ml môi trường vào bình tam giác khử trùng ở 1 atm/ 30 phút,

để nguội sau đó cấy chủng có hoạt tính protease, amylase với tỷ lệ 1 – 2%.

Sau đó lắc ở 125 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Đo OD620nm và pH ở các thời

điểm khác nhau để đánh giá sự sinh trưởng của các chủng.

Sau mỗi lần đo lấy 0,5 ml dung dịch vi khuẩn nhỏ vào các lỗ thạch

có chứa cơ chất cảm ứng để nuôi trong tủ ấm 340C, trong 24 giờ. Xác định

khả năng phân hủy của các chủng bằng thuốc thử sau đó đo vòng phân giải

của chúng.

25

2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng

sinh trưởng của các chủng Bs, Bm, BM

Chuẩn bị các môi trường lỏng NA vào trong các bình tam giác như

nhau với các độ thông khí khác nhau là 10, 20, 30, 40%. Và các môi trường

lỏng NA với các độ thông khí khác nhau như trên nhưng có bổ sung 1%

CaCO3. Các môi trường đều được khử trùng ở 1atm / 30 phút. Để nguội,

sau đó cấy mỗi chủng vào mỗi loại môi trường, đem lắc 125 vòng/ phút ở

nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ đem đo OD620nm để xác định khả năng sinh

trưởng của các chủng.

26

Phần III

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

VÀ THẢO LUẬN

27

3.1. Phân lập chủng Bacillus

Từ các mẫu cỏ khô, khoai tây và đất vườn, chúng tôi đã phân lập

được 3 khuẩn lac, tạm kí hiệu là:

Từ cỏ khô và đất phân lập được chủng kí hiệu là Bs và Bm

Từ khoai tây và đất phân lập được chủng kí hiệu là BM

3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Các khuẩn lạc được làm sạch thuần khiết bằng cách cấy phân lập và

cấy lại nhiều lần. Sau đó đem quan sát thấy các khuẩn lạc có hình dạng

khác nhau: Chủng Bs khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mép nhăn, tạo thành

màng mịn lan trên bề mặt thạch, đường kính 2 – 3mm.

Chủng Bm có khuẩn lạc tròn, lồi ở giữa, màu trắng đục, mép trơn,

đường kính 2 – 3 mm.

Chủng BM khuẩn lạc màu xám nhạt, không lan ra môi trường, đường

kính 2 – 3 mm.

Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs

28

Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm

Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM

3.3. Đặc điểm hình thái tế bào

Các chủng Bs, Bm, BM được làm tiêu bản sống và quan sát trên kính

hiển vi ta thấy là trực khuẩn hình que, chuyển động, kích thước từ 3 – 5

29

µm, Bm có kích thước tế bào lớn hơn cả, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc

kết thành chuỗi dài hay ngắn khác nhau.

Khi nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000

lần, nhận thấy cả 3 chủng đều bắt màu tím, tức cả 3 chủng đều là vi khuẩn

Gram dương.

Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs

Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM

30

Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm

Qua nghiên cứu hình thái khuẩn lạc và tế bào chúng tôi sơ bộ bước

đầu định tên cho 3 chủng này như sau: Bs – Bacillus subtilis, Bm – Bacillus

megatherium, BM – Bacillus mesentericus.

3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với cả 3 chủng vi khuẩn nghiên cứu:

Cấy từng chủng vi khuẩn ra đĩa và nuôi trong tủ ấm ở 340C. Sau khi thấy

khuẩn lạc mọc lên thì nhỏ lên khuẩn lạc một giọt H2O2 10%. Kết quả cho

thấy ở khuẩn lạc của cả 3 chủng đều có phản ứng dương tính với thuốc thử.

Điều này chứng tỏ cả 3 chủng Bs, Bm, BM đều có khả năng tạo enzyme

catalase và như vậy chúng là những chủng vi khuẩn hiếu khí.

2 H2O2 2 H2O + O2

Phản ứng dương tính được nhận thấy ở trên chính là do các phân tử

oxy sinh ra làm xuất hiện bọt khí chứng tỏ cả hai chủng này đều có hoạt

tính catalase phân hủy H2O2 và giải phóng oxy. Chính vì vậy trong quá

trình nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng máy lắc: bình trụ 250 ml chứa

Catalase

31

50 ml môi trường được bổ sung một vòng que giống đưa đi lắc ở 125 vòng/

phút trong 24 – 36 giờ.

3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của

ba chủng Bs, Bm và BM

Ở nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên các môi trường

đặc: môi trường thạch - tinh bột, môi trường thạch - cazein. Để thử hoạt

tính enzym chúng tôi thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch. Nhỏ dịch

nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng có cơ chất cảm ứng và đã được lọc vi

khuẩn vào giếng, sau 35 giờ tiến hành thử thuốc thử theo dõi xem có vùng

phân giải xung quanh giếng không và đo đường kính phân giải của các

enzym quanh giếng. Kết quả đo thể hiện ở bảng 3.1:

Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra:

Môi trường Chủng (D – d) mm Enzym thuỷ phân

Bs 9 Amylase

Bm 8 Amylase Tinh bột

BM 10 Amylase

Bs 17 Protease

Bm 15 Protease Cazein

BM 15 Protease

(d là đường kính giếng, d = 10 mm)

Qua kết quả bảng 3.1 cho thấy, cả 3 chủng đều có khả năng sinh

enzym amylase, protease. Trong đó, đường kính phân giải ở môi trường

cazein lớn hơn. Có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau hoặc hoạt tính

enzym protease cao, hoặc lượng enzym vi khuẩn sinh ra nhiều, chúng tôi

đưa ra điều kiện để nghiên cứu tiếp. Ở đây chúng tôi mới định tính của các

enzym amylase, protease. Vậy 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm, BM đều có khả

32

năng sinh enzym amylase và protease, đây là cơ sở cho việc sản xuất

enzym công nghiệp để ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau.

Hoạt tính protease Hoạt tính amylase

Chủng

Bs

Chủng

Bs

Chủng

BM Chủng

BM

Chủng

Bm

Chủng

Bm

Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs,

Bm và BM

Từ các thí nghiệm trên tôi thấy, 3 chủng nghiên cứu Bs, Bm, BM là 3

chủng đều có khả năng sinh enzym amylase, protease trên môi trường có cơ

33

chất cảm ứng. Khi các chủng này gặp môi trường chứa tinh bột, cazein

chúng sẽ phát huy tác dụng của nó là sinh ra các enzym tương ứng để phân

huỷ các cơ chất này. Hơn nữa, chúng dễ nuôi cấy, để tồn tại trong môi

trường đất, nước, nhất là những nơi chứa nhiều chất hữu cơ.

3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM

trên môi trường không có chất cảm ứng

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với môi trường lỏng NA. Mỗi chủng

giống được cấy vào trong các bình trụ chứa 40ml môi trường với lượng như

nhau, nuôi lắc với vận tốc 125 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Cứ sau 6 giờ

chúng tôi lại tiến hành theo dõi sự sinh trưởng của chúng bằng cách đo OD

ở bước sóng 620nm. Kết quả được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường

không có chất cảm ứng

Chủng vi

khuẩn

OD620nm

sau 24 giờ

nuôi cấy

OD620nm

sau 30 giờ

nuôi cấy

OD620nm

sau 36 giờ

nuôi cấy

OD620nm sau

42 giờ nuôi

cấy

Bs 0,3 0,54 0,53 0,34

Bm 0,7 0,85 0,86 0,85

BM 0,35 0,90 0,84 0,78

Từ kết quả ở bảng 3.2 chúng tôi thấy, 3 chủng vi khuẩn sinh trưởng

nhanh, mức sinh trưởng cao (từ 0,54 đến 0,90), thời gian đạt tối đa sinh

trưởng ngắn (khoảng 30 – 36 giờ).

34

3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3

chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh

bột tan

3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm

và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan

Chúng tôi tiến hành nuôi chủng trong môi trường cơ sở với chất cảm

ứng là tinh bột tan ở các nồng độ khác nhau, lắc với vận tốc 125 vòng/phút

ở nhiệt độ phòng. Đánh giá sự phát triển của các chủng bằng cách tiến hành

đo mật độ quang ở OD620nm ở các thời điểm khác nhau.

Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan

Môi trường Nồng độ tinh bột tan (%)

OD620nm sau 24h nuôi cấy

OD620nm sau 30h nuôi

cấy


cấy


Đối chứng (môi trường

NA)

0

0,3

0,54

0,53

0,50

1,5 0,34 0,71 0,70 0,60

2 0,52 0,97 0,85 0,83 Môi trường

cơ sở + Tinh bột tan 2,5 0,42 0,85 0,85 0,82

Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan

Môi trường Nồng độ tinh bột tan (%)





Đối chứng (môi trường NA) 0 0,70 0,85 0,85 0,79

1,5 0,66 0,68 0,60 0,55

2 1,05 1,1 1,05 0,88 Môi trường cơ sở +Tinh bột tan

2,5 0,75 0,90 0,85 0,80

35

Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan

Môi trường Nồng độ tinh bột tan

(%)




cấy


cấy


NA)

0 0,35 0,90 0,84 0,79

1,5 0,38 0,45 0,38 0,36

2 0,8 1,05 1,05 0,97

Môi trường cơ sở + Tinh bột

tan 2,5 0,7 0,90 0,82 0,78

Từ kết quả ở các bảng 3.3 , 3.4 và 3.5 chúng tôi thấy cả 2 môi trường

NA và môi trường có bổ sung tinh bột tan đều thích hợp để 3 chủng vi

khuẩn Bs, Bm, BM sinh trưởng. Đặc biệt môi trường có bổ sung tinh bột

tan ở nồng độ 2% thì sự sinh trưởng của 3 chủng là tối đa.

3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm

và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan


ứng là tinh bột tan ở các nồng độ khác nhau, lắc với vận tốc 125 vòng/phút

ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thử hoạt tính amylase ở các thời điểm

khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch.

36

Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất

cảm ứng là tinh bột tan

Hình 9: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bm trên môi trường có chất


37

Hình 10: Hoạt tính enzyme amylase của chủng BM trên môi trường có chất


Như vậy qua ba bảng 3.3 , 3.4, 3.5 và ba hình 8, 9, 10 chúng tôi nhận

thấy trong môi trường có nồng độ tinh bột là 2% tức 20g tinh bột tan cho 1

lít môi trường thì cả quá trình sinh trưởng và sinh enzyme ngoại bào

amylaza của 3 chủng Bs, Bm và BM là tối đa, nhưng chủng BM thì khả

năng sinh enzyme ngoại bào cao hơn ở nồng độ tinh bột tan là 2,5%. Với cả

hai nồng độ thì đều chứng tỏ tinh bột là chất cảm ứng với amylaza rõ rệt.

Do vậy muốn thu enzyme amylase nhất thiết trong môi trường nuôi cấy

phải có tinh bột. Cả 3 chủng đạt mức sinh trưởng cao nhất ở thời điểm 30

giờ nuôi cấy, nhưng sinh tổng hợp enzyme ở 36 giờ mới đạt mức tối đa.

3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3

chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là

cazein

3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm

và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein

Chúng tôi tiến hành nuôi các chủng nghiên cứu trong môi trường cơ

sở với chất cảm ứng là cazein ở các nồng độ khác nhau, nuôi lắc ở nhiệt độ

38

phòng với vận tốc là 125 vòng/phút. Đánh giá sự phát triển của các chủng

bằng cách tiến hành đo mật độ quang OD620nm ở các thời điểm khác nhau.

Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein

Môi trường Nồng độ cazein (%)


cấy


cấy



Đối chứng (môi trường NA)

0 0,3 0,54 0,53 0,34

2 0,8 0,90 0,86 0,80

3 1,09 1,25 1,21 1,15

Môi trường cơ sở + cazein

4 0,98 1,12 1,08 1,00

Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein



cấy




cấy


NA)

0 0,7 0,85 0,86 0,85

2 0,66 0,80 0,70 0,62

3 0,70 1,00 0,72 0,65


4 0,83 0,85 0,85 0,80

Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein



cấy


cấy


cấy


cấy

Đối chứng (môi trường NA)

0 0,35 0,90 0,84 0,78

2 0,61 0,67 0,67 0,63

3 0,80 0,87 0,83 0,80


4 0,70 0,73 0,68 0,62

39

Qua ba bảng 3.6, 3.7, 3.8 chúng tôi nhận thấy, ở nồng độ cazein là

3% thì thích hợp cho sự sinh trưởng của cả 3 chủng Bs, Bm và BM. Sự

sinh trưởng đạt tối đa trong khoảng 30 đến 36 giờ.

3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi

khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein


ứng là cazein ở các nồng độ khác nhau, lắc với vận tốc 125 vòng/phút ở

nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thử hoạt tính proteaza ở các thời điểm

khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch.

Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất

cảm ứng là cazein

40

Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất


Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất


Qua ba hình 11, 12, 13 chúng tôi nhận thấy trong môi trường có

nồng độ cazein là 3% (30g cazein/ 1lít môi trường) thì quá trình sinh

enzyme ngoại bào proteaza của cả 3 chủng Bs, Bm và BM là tối đa. Điều

này chứng tỏ cazein là chất cảm ứng với proteaza rõ rệt.

41

Quan hệ giữa sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme proteaza ngoại

bào cũng tương tự như ở trường hợp sinh amylaza: sinh trưởng đạt mức tối

đa ở 30 giờ, còn enzyme ở mức 36 giờ nuôi cấy.

3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng

Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus pH môi trường thường

giảm làm cho môi trường axit và như vậy sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng

của vi khuẩn. Muốn vi khuẩn phát triển tốt ta cần giữ pH môi trường lớn

hơn 6,5. Muốn vậy, trong môi trường có bổ sung CaCO3 thì CaCO3 ở đây

chỉ đóng vai trò là chất trung hòa môi trường và đưa pH về vùng trung tính

để cho vi khuẩn Bacillus phát triển và sinh enzyme tốt hơn.


amylaza

Từ môi trường cơ sở chúng tôi cộng thêm 2% tinh bột tan, CaCO3

được khử trùng riêng, khi lên men mới được bổ sung vào

+ Bổ sung CaCO3 vào môi trường với nồng độ 1, 2, 3, 4%

+ Tiếp một vòng que giống rồi nuôi lắc ở nhiệt độ phòng với chế độ

lắc là 125 vòng/ phút.

+ Lấy 0,5 ml dịch nuôi cấy trên cho vào giếng thạch sau đó đưa đi

nuôi tiếp trong tủ ấm 350C, 24 giờ rồi đổ thuốc thử lên và quan sát vòng

phân giải của chúng. Tiến hành đánh giá sự phát triển của chúng thông qua

OD620nm. Kết quả được thể hiện ở các hình và bảng dưới đây:

42

Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh

bột tan của chủng Bs


bột tan của chủng Bm

43


bột tan của chủng BM

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi

trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM

Chủng vi khuẩn

Nồng độ CaCO3 (%) Khả năng sinh trưởng (OD620nm)

Sau 24h Sau 30h Sau 36h Sau 42h 0 0,34 0,71 0,7 0,6 1 1,15 1,21 1,2 1,18 2 1,25 1,32 1,3 1,27 3 1,1 1,2 1,1 0,92

Bs 4 1,3 1,4 1,35 1,00 0 0,66 0,68 0,60 0,55 1 1,00 1,02 1,1 0,91 2 0,50 0,63 0,57 0,51 3 1,22 1,25 0,9 0,82

Bm 4 1,20 1,00 0,9 0,84 0 0,38 0,45 0,38 0,36 1 1,2 1,15 1,10 1,02 2 1,1 1,25 1,27 1,22 3 1,15 1,20 1,08 1,00

BM 4 1,1 1,21 1,2 1,17

44

Qua các hình 14, 15, 16 và bảng 3.9 chúng tôi nhận thấy ở nồng độ

CaCO3 2% thì thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh amylaza của 2 chủng

Bs và BM, còn ở chủng Bm là CaCO3 3%. Khả năng sinh trưởng và sinh

enzyme cao hơn ở môi trường không bổ sung CaCO3. Sự sinh trưởng tối đa

xảy ra trước (24-30 giờ) khi sự sinh enzyme đạt tối đa (30-36 giờ).

3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu proteaza

Từ môi trường cơ sở chúng tôi cộng thêm 3% cazein, CaCO3 được

khử trùng riêng, khi lên men mới được bổ sung vào.

+ Bổ sung CaCO3 vào môi trường với nồng độ 1, 2, 3, 4%

+ Tiếp một vòng que giống rồi nuôi lắc ở nhiệt độ phòng với chế độ

lắc là 125 vòng/ phút.

+ Lấy 0,5 ml dịch nuôi cấy trên cho vào giếng thạch sau đó đưa đi

nuôi tiếp trong tủ ấm 350C, 24 giờ rồi đổ thuốc thử lên và quan sát vòng

phân giải của chúng. Tiến hành đánh giá sự phát triển của chúng thông qua

OD620nm. Kết quả được thể hiện ở các hình và bảng dưới đây:

Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein

của chủng Bs

45


của chủng Bm


của chủng BM

46

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có

cazein của 3 chủng Bs, Bm và BM

Chủng vi khuẩn

Nồng độ CaCO3 (%)

Khả năng sinh trưởng (OD620nm)

Sau 24h Sau 30h Sau 36h Sau 42h

0 0,8 0,9 0,86 0,8

1 1,2 1,27 1,3 1,24

2 1,05 1,15 1,05 1,0

3 1,1 1,2 1,3 1,15

Bs

4 1,1 1,2 1,15 1,08

0 0,66 0,67 0,66 0,6

1 0,65 0,7 0,66 0,61

2 1,25 1,4 1,35 1,32

3 1,2 1,4 1,33 1,29

Bm

4 0,7 1,19 1,3 1,2

0 0,51 0,57 0,57 0,53

1 0,97 0,97 1,09 1,0

2 0,95 1,07 0,87 0,80

3 1,19 1,22 1,2 1,17

BM

4 1,18 1,2 1,2 1,16

Qua hình 17, 18, 19 và bảng 3.10 chúng tôi nhận thấy trong môi

trường cazein có bổ sung CaCO3 thì ở nồng độ CaCO3 3% thích hợp nhất

cho sự sinh enzyme proteaza của 2 chủng Bm và BM, với chủng Bs thì ở

nồng độ CaCO3 2%. Khả năng sinh trưởng và sinh enzyme cao hơn ở môi

trường cazein không bổ sung CaCO3. Sự sinh trưởng và sinh enzyme

proteaza ngoại bào cũng tương tự như trường hợp sinh amylaza: sinh

trưởng đạt mức tối đa (30 giờ) xảy ra trước khi sinh enzyme đạt mức tối đa

(36 giờ).

47

Như vậy CaCO3 có vai trò điều chỉnh pH của môi trường, làm cho

pH của môi trường nằm trong vùng hoạt động tối thích của chủng vi khuẩn

Bacillus, làm cho chủng vi khuẩn Bacillus sinh trưởng và sinh enzyme tốt

hơn.

3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan

Nồng độ oxy hòa tan trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá

trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên ảnh

hưởng này có khác nhau tùy từng loài, hầu hết là làm tăng tốc độ sinh

trưởng , rút ngắn pha tiền phát, nâng cao lượng sinh khối nhưng trong một

vài trường hợp thì thiếu oxy tuy có kìm hãm sinh trưởng nhưng lại gia tăng

quá trình sinh tổng hợp enzyme.

Đối với 3 chủng Bs, Bm, BM, chúng tôi nghiên cứu nhu cầu sử

dụng lượng oxy hòa tan thông qua thí nghiệm nuôi lắc riêng rẽ 3 chủng ở

nhiệt độ phòng trong 24 giờ với độ hiếu khí khác nhau từ 10 đến 40%. Độ

hiếu khí được tính qua tỷ lệ thể tích môi trường lên men (v) so với thể tích

bình chứa (V): . Kết quả thể hiện ở các bảng sau:

( càng nhỏ thì độ hiếu khí càng lớn )

48

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3

chủng Bs, Bm, BM

Độ hiếu khí (%)

Chủng vi khuẩn

10 20 30 40

Bs 0.84 0.72 0.56 0.44

Bm 0.7 0.56 0.5 0.35

BM 0.76 0.66 0.56 0.48

Ba chủng Bs, Bm, BM đều thuộc loại hiếu khí. Trong các thí nghiệm

đối với các độ hiếu khí khác nhau, cả 3 chủng đều dao động. Cả 3 chủng

Bs, Bm và BM đều phát triển mạnh ở độ thông khí dao động từ 10 – 20 %

với OD620nm dao động từ 0,56 – 0,84 , nhưng phát triển

Ba chủng Bs, Bm, BM đều thuộc loại hiếu khí. Trong các thí

nghiệm đối với các độ hiếu khí khác nhau, cả 3 chủng đều dao động. Cả 3

chủng Bs, Bm và BM đều phát triển mạnh ở độ thông khí dao động từ 10 –

20% với OD620nm dao động từ 0,56 – 0,84, nhưng phát triển mạnh nhất ở tỉ

lệ 10% với OD620nm là 0,84 ở chủng Bs, OD620nm là 0,7 ở chủng Bm và 0,76

với chủng BM.

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3

Trên môi trường có bổ sung CaCO3 mật độ tế bào thể hiện rất cao

và đều hơn ở 3 chủng. Ở cả 3 chủng mật độ tế bào thể hiện cao ở độ thông

Độ hiếu khí (%)

Chủng vi khuẩn

10 20 30 40

Bs 0,90 0,84 0,68 0.60

Bm 0,82 0,71 0,65 0,57

BM 0,89 0,72 0,64 0,57

49

khí 10 – 20%, cao nhất ở độ thông khí là 10% với OD620nm là 0,9 với chủng

Bs, OD620nm là 0,82 với chủng Bm và 0,89 với chủng

Trên môi trường có bổ sung CaCO3 mật độ tế bào thể hiện rất cao và

đều hơn ở 3 chủng. Ở cả 3 chủng mật độ tế bào thể hiện cao ở độ thông khí

10 – 20%, cao nhất ở độ thông khí là 10% với OD620nm là 0,9 với chủng Bs,

OD620nm là 0,82 với chủng Bm và 0,89 với chủng BM.

Xác định hoạt tính enzyme của các chủng ở các độ thông khí khác

nhan trên môi trường có cơ chất cảm ứng bằng phương pháp đục lỗ thạch.

Kết quả được thể hiện ở hình sau:

Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3

chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3

50

Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3

chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3

Từ hai hình 3.20 và 3.21 chúng tôi nhận thấy hoạt tính enzyme thể

hiện càng cao ở độ hiếu khí càng lớn.

Vậy độ hiếu khí thích hợp để nuôi cấy 3 chủng là 10 – 20%

3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển

của ba chủng nghiên cứu

Ba chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM sau 24 giờ nhân giống trên môi

trường cơ sở đươc cấy vào môi trường có pH thay đổi 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 với

tốc độ lắc 125 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 36 giờ kiểm tra đánh giá

khả năng phát triển của chúng bằng cách đo OD620nm. Kết quả thu được

dưới h́nh sau:

51

Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các

chủng Bs, Bm và BM Từ hình 22 cho thấy khi pH dao động từ 4 – 5 thì cả 3 chủng phát

triển yếu: OD620nm thấp, chỉ đạt 0,34 ở Bm; 0,41 ở chủng Bs và 0,45 ở

chủng BM. Khi pH tăng từ 6 – 8 đặc biệt ở khoảng giữa 7 – 8 thì cả 3

chủng bắt đầu phát triển mạnh, mật độ tế bào đạt giá trị cao nhất tại pH = 7

với OD620nm lần lượt là 0,80 và 0,81 của chủng Bs và BM, ở pH = 8 thì

OD620nm là 0,80 của chủng Bm. Ba chủng phát triển có phần ổn đinh ở pH =

9, nhưng tới 10 thì hầu như yếu dần OD620nm dao động từ 0,41 tới 0,47.

Như vậy pH ban đầu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cả ba

chủng là từ 7 – 8.

3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay

thế

Từ môi trường cơ sở chúng tôi bổ sung bột đậu tương ở các nồng

độ: 1, 2, 3, 4% và được cấy 1-2% chủng vi khuẩn rồi đưa đi lắc ở vận tốc

125 vòng/phút, nhiệt độ phòng, với thời gian là 36 giờ . Tiến hành đục lỗ

52

thạch rồi quan sát đo vòng phân giải của hai enzyme chúng tôi thu được kết

quả như sau:

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza,

amylaza của ba chủng Bs, Bm, BM

Chủng vi khuẩn Nồng độ bột đậu tương (%)

Hoạt tính enzyme (D-d)mm

Proteaza Amylaza

1 21,5 13

2 20 13

3 26 14

Bs 4 21 13,5

1 6 6

2 8 6

3 16 12

Bm

4 11 7

1 13 8

2 12 8

3 14 8,5

BM

4 10 7,5 Từ bảng trên chúng tôi nhận thấy nồng độ bột đậu tương mà tại đó 3

chủng nghiên cứu cho hoạt tính enzyme cao nhất là 3% tức là 30 g/lít môi

trường.

Trên môi trường cơ sở chúng tôi đã thay glucose bằng bột đậu tương

3% sau đo cho thêm CaCO3 ở các nồng độ khác nhau: 1, 2, 3 và 4% làm

chất điều chỉnh pH.

Giống được tiếp với tỉ lệ 1-2%, đưa đi lắc ở 125 vòng/phút trong 36

giờ. Sau đó tiến hành đục lỗ thạch rồi quan sát đo vòng phân giải của hai

enzyme chúng tôi thu được kết quả như sau:

53

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 đến khả năng sinh amylaza,

proteaza trên môi trường có bột đậu tương

Chủng vi khuẩn Nồng độ CaCO3 (%)

Hoạt tính enzyme (D-d)mm

Protease Amylase

0 26 14

1 18 16

2 26 15

3 25 19

Bs

4 20 14

0 16 12

1 18 10

2 18 10

3 22 14

Bm

4 11 11

0 14 8,5

1 23 8

2 25 8

3 21 12

BM

4 18 7,5 Qua 2 bảng 3.13 và 3.14 chúng tôi nhận thấy ở nồng độ CaCO3 2%

thích hợp cho sự sinh proteaza của 2 chủng Bs và BM, nồng độ CaCO3 3%

thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng Bm. Hoạt tính amylaza đạt cực đại

ở nồng độ CaCO3 3% đối với cả 3 chủng Bs, Bm và BM. Hoạt tính 2

enzyme đều thể hiện cao hơn ở môi trường chỉ có bột đậu tương. Tuy vậy

CaCO3 ở nồng độ cao sẽ ức chế quá trình sinh enzyme của cả 3 chủng.

Cũng qua bảng trên chúng tôi nhận thấy chủng vi khuẩn Bs là có hoạt

tính mạnh nhất, thích hợp nhất với bột đậu tương.

54

Bột đậu tương có hàm lượng protein chiếm khoảng 30 – 35% và có

khoảng 40% là tinh bột. Vì vậy bột đậu tương đóng vai trò là chất cảm ứng

của hai enzyme amylaza và proteaza. Kết quả thí nghiệm cho thấy trên môi

trường có bột đậu tương thì sự sinh trưởng và biểu hiện hoạt tính 2 enzyme

amylaza và proteaza là lớn nhất.

Nuôi Bs, Bm và BM trên môi trường (thành phần dưới đây cho 1 lít

môi trường) sẽ thu được cả hai enzyme amylaza và proteaza. Trong thực tế

sản xuất công nghiệp chúng ta có thể dùng bột đậu tương làm nguồn

nguyên liệu cơ bản để sản xuất enzyme.

Bột đậu tương 30 g

Peptone 5 g

Cao men 2,5 g

CaCO3 2%

pH = 7 – 8

3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men

Từ các nghiên cứu trên, chúng tôi tổng hợp về sự sinh trưởng, sinh

enzyme proteaza và sự thay đổi pH của chủng Bs trên môi trường bột đậu

tương có bổ sung CaCO3

55

Enzyme

(mm)

OD

620nm pH

30 2.0 8.0

1.9 7.8

25 1.8 7.6

1.7 7.4

20 1.6 7.2

1.5 7.0

15 1.4 6.8

1.3 6.6

10 1.2 6.4

1.1 6.2

5 1.0 6.0

0

Sau 24h sau 30h sau 36h

: Hoạt tính enzyme ( D- d) mm

: Sự sinh trưởng OD620nm

: pH

Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của

Bs trong môi trường bột đậu tương có CaCO3

56

Phần IV

KẾT LUẬN

57

Qua thời gian thực tập tốt nghiệp, tôi đã cơ bản hoàn thành nội dung đề

tài được giao. Kết quả cụ thể như sau:

1. Từ đất vườn phân lập qua trung gian là cỏ khô và khoai tây đã phân lập

được 3 khuẩn lạc có hoạt tính enzyme amylase và protease.

2. Nghiên cứu hình thái tế bào, khuẩn lạc và một vài đặc điểm sinh học

thấy 3 chủng này là:

+ Trực khuẩn, sinh bào tử, Gram dương, hiếu khí, nhiệt độ thích hợp

cho sinh trưởng và sinh enzyme ngoại bào là 25 – 370C

Chủng Bs – trực khuẩn cỏ khô có thể là Bacillus subtilis

Chủng Bm – trực khuẩn cỏ khô có thể là Bacillus megaterium

Chủng BM –trực khuẩn khoai tây có thể là Bacillus mensentericus

3. Nghiên cứu nuôi cấy 3 chủng này với các cơ chất cảm ứng khác nhau

đều thấy:

- Tinh bột và bột đậu tương là chất cảm ứng cho 3 chủng sinh amylase

- Cazein và bột đậu tương là chất cảm ứng cho 3 chủng sinh protease.

Trong môi trường có bổ sung CaCO3 đều thấy khả năng sinh protease

của 3 chủng cao hơn so với không bổ sung CaCO3. Như vậy CaCO3

đóng vai trò điều chỉnh pH của môi trường

- Protease thu được của 3 chủng Bs, Bm và BM đều thấy hoạt động ở

vùng pH kiềm (9 -11).

Với các kết quả thu được hoàn toàn làm cơ sở cho việc nghiên cứu sâu

về phân loại và sinh tổng hợp enzyme của ba chủng này để có thể áp dụng

vào sản xuất enzyme, sản xuất bột giặt, thủy phân bột cá, trong công nghiệp

dày da hay bảo vệ môi trường

58

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1. Nguyễn Thành Đạt, thực hành vi sinh, 1990, NXB Nông Nghiệp

2.Lương Đức Phẩm. Chế phẩm sinh học dung trong chăn nuôi và nuôi

trồng thủy sản, 2007. NXB Nông nghiệp

3.Nguyễn Lân Dũng (Dịch). Thực hành vi sinh vật học, 1983. NXB Đại

Học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.

4.Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, NXB Khoa học và kỹ thuật,

2001]

5.Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học,

NXB Giáo Dục, 2000

6. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Phạm Trân Châu Châu, Nguyễn Lân Dũng,

enzyme vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

7.Nguyễn Trọng Cẩn ( chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần

Thị Luyến, Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp – Thành phố Hồ Chí

Minh, 1998]

8. Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh,

Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa

học và Kỹ thuật Hà Nội, 2002.

9. Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp

Tài liệu tiếng Anh

10. Priest, F.G and Grigorova, R. (1991) Method for studying the ecology

of endospore – forming bacteria. Method in microbiology 22, 565 – 591.

Todar , K. Ph. D (2008) Bacillus and related endospore – forming bacteria.

Todar’s online textbook ò bacteriology.

59

11. Rosovitz, M. J., Voskuil, M. I., Chambliss, G. H. (1998) Bacillus. In:

A. Balows and B. I. Duerden (Eds), Systematic Bacteriology. Arnold Press,

London: 709 – 720.

12. Schallemey, M., Singh, A. and Ward, O. P. (2004) Developments in the

use of Bacillus species for industrial production. Can. J. Microbiol. 50, 1 -

17.

Trang web điện tử

13. http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus

14. www.epa.gov/opptintra/biotech/fra/fra009htm.

15. http://cynosura.org/index.php)

16. http://vietsciences.org

PHỤ LỤC

Hình thể hiện hoạt tính amylase của Bm trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h

Hình thể hiện hoạt tính protease của Bm trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h

Hình thể hiện hoạt tính amylase của BM trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h

Hình thể hiện hoạt tính protease của BM trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h

Hình thể hiện hoạt tính amylase của Bs trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h

Hình thể hiện hoạt tính amylase của Bs trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h

Hình giữ giống của 3 chủng Bs, Bm và BM

LỜI CẢM ƠN

Documents

Transcript of LỜI CẢM ƠN