Les mycotoxines dans les denrées alimentaires

UNIVERSITE CADI AYYAD

FACULTE DES SCIENCES SEMLALIA

MARRAKECH*

Département de Biologie

Parcours : Biologie appliquée à la production

végétale.

Projet de fin d’études – Semestre VI

Intitulé du mémoire :

Les mycotoxines dans les denrées alimentaires :

microorganismes responsables, évaluation des risques

sanitaires et techniques d’analyse

Noms des candidats :

ELALAMI LAKHAL

ABDELOUAHED HAJBAOUI

Membres du jury :

Pr. MUSTAPHA BARAKATE (encadrant)

Pr. YEDIR OUHDOUCH (examinateur)

Pr. LAILA RAFOUK (examinatrice)

Pr. ABDELLAH YAS SIR (coordinateur)

DATE DE SOUTENANCE : Le 05 juin 2014

Remerciement

Nous tenons d’abord à adresser notre gratitudes à notre

encadrant monsieur MUSTAPHA BARAKATE qui nous a

soutenus et orientés à suivre notre travail.

Monsieur, merci pour ta gentillesse, ton soutien, ta

disponibilité, sa participation active lors de la rédaction du

mémoire et de nous donnons l’occasion à effectuer l’analyse

nécessaire pour notre travail au laboratoire.

Notre gratitude et notre profonde reconnaissance est

adressée également aux membres du jury Mr. OUHDOUCH

et Mme. RAFOUK qui ont accepté de lire et juger notre

travail. Nous adressons notre profond respect le plus

distingué à Mr. YASSIR, Qui a accepté d'être un

examinateur.

Nous souhaiterons également à remercier tous les

membres du laboratoire de la microbiologie en particulier Mr.

Ahmed Nafis pour leur aide, leur encouragement.

Résumé

Les moisissures sont des contaminants fréquents de nombreux substrats végétaux et de

certains produits d’origine animale. Leur présence peut améliorer les qualités

organoleptiques du produit les altérer en conduisant à l’accumulation des métabolites

secondaires toxiques : les mycotoxines. La toxicité des mycotoxines est variable, certaines

exerçant un pouvoir hépatotoxique (aflatoxines), d’autres se révélant œstrogéniques

(zéaralénone), immunotoxiques (patuline, trichothécènes, fumonisines), néphrotoxiques

(ochratoxine A) ou neurotoxiques (trémorgènes). Un autre aspect de leur toxicité est la prise

en compte des résidus présents dans les productions issues d’animaux ayant consommé une

alimentation contaminée. L’évaluation du risque mycotoxine demeure délicate car ce risque

est d’origine naturel, l’homme ne maîtrisant pas sa survenue. Il est pernicieux parce que la

contamination fongique est difficilement contrôlable. Devant ce problème, il convient de

poursuivre les activités de recherche pour améliorer encore nos connaissances sur la toxicité

de ces mycotoxines.

Mots-clés : mycotoxine, moisissure, aliment, toxicité, résidus.

Summary

Moulds are common contaminants of a wide variety of vegetal and animal derived

foods. Their presence can improve organoleptic properties or lead to food spoilage and

accumulation of toxic compounds: mycotoxins. The toxicity of mycotoxins varies, ranging

from hepatotoxic (aflatoxins) effects, to estrogenic (zearalenone), immunotoxic (patulin,

trichothecenes, fumonisins), nephrotoxic (ochratoxin A) and neurotoxic (tremorgens) effects.

Their toxicity can also be caused by the presence of mycotoxin residues in products deriving

from animals fed with contaminated feedstuffs. The mycotoxin risk is difficult to evaluate, as

mycotoxin are natural contaminants impossible to eliminate, fungal contaminations are

difficult to control, Consequently, further research is needed to improve current knowledge

on the toxicity of these mycotoxins.

Key words: mycotoxin, moulds, food, toxicity, residues.

Table de matière

Introduction .............................................................................................................................................................. 1

Chapitre I. Principaux microorganismes responsables de la sécrétion des mycotoxines .................................... 2

I.1. Les Deutéromycètes ................................................................................................................................... 2

a) Le genre Fusarium ............................................................................................................................ 2

b) Le genre Aspergillus .......................................................................................................................... 3

c) Le genre Penicillium .......................................................................................................................... 4

I.2. Les Ascomycètes : ....................................................................................................................................... 5

a) Le genre Byssochlamys ..................................................................................................................... 5

b) Le genre Claviceps ............................................................................................................................ 6

Chapitre II. Principaux types des mycotoxines et évaluation des risques sanitaires ........................................... 8

II.1. Les aflatoxines ........................................................................................................................................... 8

II.1.1 Découverte et définition ..................................................................................................................... 8

II.1.2 Effets toxiques d’aflatoxines : ............................................................................................................. 9

II.2. Les ochratoxines: .....................................................................................................................................10

II.2.1 Définition...........................................................................................................................................10

II.2.2 Effets toxiques de l’ochratoxine : .....................................................................................................10

II.3. Les Trichothécènes ..................................................................................................................................11

II.3.1 Définition...........................................................................................................................................11

II.3.2 Effets toxiques des trichothécènes ...................................................................................................13

II.4. La patuline : .............................................................................................................................................13

II.4.1 Définition...........................................................................................................................................13

II.4.2 Effets toxiques de la patuline ............................................................................................................14

II.5. La zéaralénone : .......................................................................................................................................14

II.5.1 Définition...........................................................................................................................................14

II.5.2 Effets toxiques de la zéaralénone .....................................................................................................15

II.6. Les fumonisines : .....................................................................................................................................15

II.6.1 Définition...........................................................................................................................................15

II.6.2 Effets toxiques des fumonisines .......................................................................................................16

II.7. les mycotoxines du genre Claviceps ........................................................................................................17

II.7.1 Découverte et définition ...................................................................................................................17

II.7.2 L’effet toxique de l’ergot...................................................................................................................17

II.8. La citrinine : .............................................................................................................................................18

II.8.1 Définition...........................................................................................................................................18

II.8.2 Effet toxiques de la citrinine .............................................................................................................19

Chapitre III. Techniques d’analyse des mycotoxines ..........................................................................................20

III.1. Principe général d’extractions des mycotoxines ....................................................................................21

III.2. Exemples des techniques d’analyses ......................................................................................................23

III.2.1 Analyses par Chromatographie en phase Liquide à Haute Performance (HPLC) ...........................23

III.2.2 chromatographie d’immunoaffinité ................................................................................................24

III.2.3 Le test ELISA .....................................................................................................................................26

III.3. Exemples d’extraction de quelque mycotoxines ....................................................................................27

III.3.1 Aflatoxines .......................................................................................................................................27

III.3.2 Ochratoxine A ..................................................................................................................................27

III.3.3 fumonisines......................................................................................................................................28

III.3.4 Patuline ............................................................................................................................................28

III.4. PARTIE PRATIQUE ...................................................................................................................................29

III.4.1 Matériels et méthodes ....................................................................................................................29

a) Matériels .........................................................................................................................................29

b) Méthodes ........................................................................................................................................30

c) Résultats .........................................................................................................................................31

Conclusion ..............................................................................................................................................................30

Bibliographie : .........................................................................................................................................................31

Webographie : ........................................................................................................................................................37

Liste des tableaux

Tableau 1 : Exemple de produits contaminés par des moisissures toxinogènes ..................................................... 7

Tableau 2: Résultat de dénombrement de colonies des levures et moisissures de différents échantillons .........32

Liste des figures

Figure 1: Fusarium graminearum sur milieu PDA..................................................................................................... 3

Figure 2 : Caractères morphologiques d’Aspergillus ................................................................................................ 4

Figure 3 : Caractères morphologiques du Penicillium .............................................................................................. 4

Figure 4 : Byssochlamys nivea sur milieu M2 ........................................................................................................... 5

Figure 5 : Grains contaminés par Claviceps purpurea .............................................................................................. 6

Figure 6 : Différentes structures chimiques des aflatoxines .................................................................................... 8

Figure 7 : Effet des aflatoxines sur le foie de la volaille ........................................................................................... 9

Figure 8 : Structure chimique de l’ochratoxine A ...................................................................................................10

Figure 9 : Structures chimiques des trichothécènes du groupe A (a) et du Groupe B (b, c et d) ...........................12

Figure 10 : Structure chimique de la patuline ........................................................................................................14

Figure 11 : Structure chimique de la zéaralénone ..................................................................................................15

Figure 12 : Structure chimique des fumonisines ....................................................................................................16

Figure 13 : Structure chimique de l’ergoline ..........................................................................................................17

Figure 14 : Structure chimique de la citrinine ........................................................................................................19

Figure 15 : Schéma générale de l’extraction des mycotoxines à partir d’un matériel biologique .........................22

Figure 16 : Description du système HPLC ...............................................................................................................23

Figure 17 : Extraction et purification d’un échantillon par chromatographie d’immunoaffinité ..........................25

Figure 18 : ELISA type « sandwich » .......................................................................................................................26

Figure 19 : Aspergillus niger sur un milieu Sabouraud ...........................................................................................29

Figure 20 : Penicillium sur un milieu Sabouraud ....................................................................................................29

Figure 21 : Isolat appartenant à l’ordre des mucorales développé sur un milieu Sabouraud…............................29

Liste des abréviations

AF Aflatoxine

AFSSA Agence française de sécurité sanitaire des aliments

CCM Chromatographie sur couche mince

CIT Citrinine

CLPH Chromatographie liquide de haute performance

DAS Diacétoxyscirpénol

DON Déoxynivalénol

ELEM Equine LeukoEncephaloMalacia

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

ESI Ionisation par electrospray

FB1 Fumonisine B1

IAC Extraction sur colonne d’immunoaffinité

IARC international agency for research on cancer

LC-MS Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

LLP Partage liquide-liquide

M2 milieu aux extraits de malt et de levures

MBTH Méthyl-3-benzothiazolinone-2-hydrazone chlorhydrique

Mg Milligramme

Ml Millilitre

OMS Organisation mondiale de la santé

OTA Ochratoxine A

PDA Potatoes dextrose agar

QSP Quantité suffisant pour

SPE Extraction sur phase solide

µl microlitre

UFC Unité formant colonie

ZEA Zéaralénone

1

Introduction

Lors de la croissance des végétaux et de leur stockage, les aliments peuvent

être un substrat pour le développement de moisissures qui souvent sous certaines

conditions d’humidité peuvent produire des mycotoxines. Les mycotoxines sont des

métabolites secondaires produits par une grande variété de moisissures

principalement les genres Fusarium, Aspergillus et Penicillium. Ces derniers se

développent sur différents types d’aliments et dans des situations écologiques très

diverses. Du fait de leur transfert dans la chaîne alimentaire végétale et animale,

elles se retrouvent dans l’alimentation humaine (Medjdoub, 2012).

De plus, les mycotoxines ont des propriétés chimiques et biologiques diverses

leurs effets toxiques sont extrêmement variables. Ces effets concernent en général la

cancérogénicité, la génotoxicité, la tératogénocité, la néphrotoxicité, l’hépatotoxicité

et l’immunotoxicité (Creppy, 2002).

Par ailleurs, les mycotoxines non seulement dangereuses pour la santé du

consommateur, mais elles altèrent aussi la qualité marchande des denrées

alimentaires contaminés entrainant ainsi de fortes pertes économiques. Parmi les

pays concerné on trouve le Maroc car il est entouré par l’océan Atlantique et par la

mer Méditerranéenne, caractérisé par un climat chaud et humide favorisant la

croissance des moisissures dans les zones côtières abritant environ 70% de la

population totale. Ces conditions climatiques sont probablement favorables pour

la croissance des moisissures et la production des mycotoxines.

L’objectif de notre travail est de mettre une synthèse d’évaluation des risques

sanitaires des mycotoxines sécrétés par certaines moisissures et techniques d’analyse

pour tracer un bilan de connaissances actuelles sur la contamination des denrées

alimentaires.

2

Chapitre I. Principaux microorganismes responsables de la sécrétion des

mycotoxines

Les champignons, ou les mycètes, sont des organismes eucaryotes uni- ou

pluricellulaires, incluant des espèces macroscopiques et d’autres microscopiques

d’aspect filamenteux ou levuriforme. Ces derniers peuvent devenir visibles lorsque

leur développement est important sont appelés couramment « moisissures »,

véritables agglomérats de filaments mycéliens et d’organes fructifères capables de

coloniser des substrats très divers qui sont des organismes hétérotrophes et

ubiquistes, Ils peuvent se multiplier et produire des mycotoxines avant ou après la

récolte, pendant le stockage, le transport, ou la transformation des matières

premières et des aliments (Tabuc, 2007). Les principaux genres des moisissures

producteurs de mycotoxines sont classés dans les deux groupes des Deutéromycètes

et les Ascomycètes :

I.1. Les Deutéromycètes

Les Deutéromycètes réunissent le plus grand nombre d’espèces pathogènes

pour l’homme, plantes et les animaux. Cette division, très hétérogène, englobe toutes

les espèces de champignons, pour lesquelles la reproduction sexuée n’est pas

connue. La majorité de Deutéromycètes sont des champignons filamenteux septés,

ils se reproduisent uniquement par voie végétative au moyen de spores asexuées ou

par simple fragmentation du mycélium (Tabuc, 2007).

La subdivision des Deutéromycètes a été supprimée de la classification des

champignons. Mais, bien qu'artificiel, ce groupe continue souvent à être étudié

comme tel, car de nombreuses espèces couramment rencontrées comme contaminant

des produits alimentaires ou autres ne sont connues que sous leur forme asexuée. De

ce fait les critères de classification des Deutéromycètes sont utilisés comme

éléments d'identification de ces contaminants (Web 1). Parmi les genres de ce

groupe les plus contaminant des denrées alimentaires :

a) Le genre Fusarium

Fusarium est un champignon qui appartient à la classe des Sordariomycètes,

l’ordre des Hypocreales et la famille des Nectriaceae. Le genre Fusarium a été décrit

pour la première fois par Link en 1809. Il regroupe plusieurs espèces pathogènes

3

pour les plantes, l’homme et les animaux (Leslie et al., 2005). F. graminearum

(Fig.1) est l’espèce la plus représentée sur le blé et également le maïs, dont la zone

de présence géographique est la plus étendue (Cromey et al., 2001).

Figure 1: Fusarium graminearum sur milieu PDA (Web 2)

b) Le genre Aspergillus

Aspergillus est un champignon comprend environ 180 espèces, réparties en 18

sections. Les formes parfaites (téléomorphes) de certaines d'entre elles sont connues

et appartiennent à l'embranchement des Ascomycètes. Les Aspergillus sont

caractérisés par la présence de conidiophores dressés, terminés par une vésicule

supportant, soit une seule rangée de phialides (structure unisériée), soit une rangée

de phialides et une rangée de cellules sous-jacentes appelées métules (structure

bisériée) (Fig2). Ce sont des contaminants fréquents de nombreux substrats, tels que

les grains et les produits dérivés (farines, aliments composés pour animaux et

l’homme). Certains espèces sont pathogènes, et/ou produisent des métabolites

toxiques pour les mammifères, telle que A.flavus et A. fumigatus (Web3).

4

Figure 2 : Caractères morphologiques d’Aspergillus (D’après Samson et al., 1981 in Nguyen Minh Tri, 2007)

c) Le genre Penicillium

Penicillium est un champignon comporte diverses espèces, dont l'extrémité du

mycélium présente la forme d'un pinceau de couleur verdâtre. Le thalle est formé par

des filaments mycéliens septés et hyalins, porte des conidiophores lisses ou

granuleux, simples ou ramifiés qui se terminent par un pénicille. Les conidiophores

peuvent être isolés, groupés en faisceaux lâches ou agrégés en corémies bien

individualisés (Fig.3). Les espèces de ce genre se développent normalement dans des

milieux où l’activité de l’eau est plus élevée que celle permettant la croissance des

Aspergillus, à des températures plus basses. Il s’agit de contaminants fréquents des

régions tempérées (Tabuc, 2007).

Figure 3 : Caractères morphologiques du Penicillium (a) Pinceau monoverticillé (b) biverticillé (c) biverticillé fourchu (furcatum) (d) terverticillé (D’après Raper et Thom, 1968 ;

Pitt 1979 in Nguyen Minh Tri, 2007)

5

I.2. Les Ascomycètes :

La classe des Ascomycètes comprend un grand nombre d’espèces pathogènes

pour l’homme et les animaux (levures ascosporées ou champignons filamenteux).

L’appareil végétatif est un thalle à mycélium septé. Les Ascomycètes présentent une

structure caractéristique appelée asque, formé au cours de la reproduction sexuée,

qui renferme un nombre défini d’ascospores. Ce sporocyste, globuleux, cylindrique

ou plus ou moins claviforme, avec une paroi simple ou double représente un

important critère d’identification (Tabuc, 2007).

Parmi les genres qui possèdent un pouvoir toxinogènes on distingue :

a) Le genre Byssochlamys

Le genre Byssochlamys (Fig.4), dont le principal représentant est le B.

nivea, est une moisissure blanche. La patuline est la principale toxine produite

par cette espèce, elle est régulièrement retrouvée dans les ensilages en

concentrations parfois très élevée (Escoula, 1977).

Figure 4 : Byssochlamys nivea sur milieu M2 (Web 4)

b) Le genre Claviceps

Les champignons du

graminées fourragères (Fig.5)

s’agglomèrent en un tissu dense

violacée visible à l’œil nu et remplace les grains. Les sclérotes des espèces de

moisissures du genre Claviceps

produisent environ 40 alcaloïdes. Ils peuvent être divisés en ergopeptides

dérivés de l’acide lysergiques (ergotamine et ergocristine) et les dérivés de l’acide

isolysergique (ergotamine) et les dérivés du diméthylergoline (cla

l’argoclavine) (Pfohl-leszkowicz

Figure 5 : Grains contaminé

laviceps

genre Claviceps peuvent contaminer les céréales et les

(Fig.5) dans tous les pays du monde. Dont les filaments

s’agglomèrent en un tissu dense : le sclérote. Celui-ci est recouver


Claviceps (C. purpurea, C. paspali, C. africana, C. fusiformis

produisent environ 40 alcaloïdes. Ils peuvent être divisés en ergopeptides


isolysergique (ergotamine) et les dérivés du diméthylergoline (clavi

leszkowicz, 1999).

contaminés par Claviceps purpurea (Brihoum et

6

peuvent contaminer les céréales et les

Dont les filaments

ci est recouvert d’une écorce


africana, C. fusiformis)

produisent environ 40 alcaloïdes. Ils peuvent être divisés en ergopeptides qui sont


ines, par exemple

et al., 2003)

7

Cette diversité des agents producteurs capables de produire divers mycotoxines comme il montre le tableau suivant :

Tableau 1 : Exemple de produits contaminés par des moisissures toxinogènes

(Pfohl-Leszkowicz, 1999)

Denrées Espèces toxiques contaminants Mycotoxines probables

Blé, farine, pain,

maïs, chips

Aspergillus flavus, A. ochraceus,

A. versicolor, Penicillium citrinum,

P. citreoviiride, P. cyclopium,

P. martensii, P. patulum, P. pubertum

Fusarium moniliforme

Aflatoxines, ochratoxine,

stérigmatocystine, acide

pénicillique, patuline,

déoxynivalénol, zéaralénone,

fumonisine.

Arachide, noix A. flavus, A. ochraceus, A. vericolor

P. citrinum, P. cyclopium, P. expansum


stérigmatocystine, trichothécènes, cytochalasines, patuline.

Tourte à la viande, viande cuite, fromage, cacao, houblon

A. flavus, P. viridicatum, P. roqueforti,

P. patulum, P. commune

Aflatoxines, stérigmatocystine,

ochratoxine, patuline, acide

pénicillique

Viandes, porc salé, fromage

A. flavus, A. ochraceus, A. versicolor,

P. viridicatum, P. cyclopium.


stérigmatocystine, patuline, acide pénicillique, penitrem

Poivre noir et rouge, pâtes A. flavus, A. ochraceus Aflatoxines, ochratoxine

Fèves, orge, maïs, sorgho, soja

A. flavus, A. ochraceus, A. versicolor,

Altenaria, F. moniliforme, P. cyclopium,

P. viridicatum, P. citrinum, P. expansum,

P. islandicum, P.urticae


stérigmatocystine, alternariol,

griséofulvine, acide pénicillique,

citrinine, patuline

Patisserie réfrigérée ou

Congelée

A. flavus, A.versicolor, P. viridicatum,

P. cyclopium, P. citrinum, P. martensii,

P. citreoviride, P.palitans, P. puberulum,

P. roquefort, P.urticae

Aflatoxines, stérigmatocystine,

ochratoxine, patuline, acide pénicillique, citrinine, penitrem

Denrée alimentaire (stockage domestique)

Penicillium, Aspergillus, F. oxysporum Aflatoxine, acide kojique,

ochratoxine, penitrem, patuline,

acide pénicillique, trichothécènes

Pomme et produits dérivés de pomme

P. expansum Patuline

8

Chapitre II. Principaux types des mycotoxines et évaluation des risques

sanitaires

II.1. Les aflatoxines

II.1.1 Découverte et définition

L’investigation menée lors de la « Maladie X du dindon », qui a sévi en 1960

en Angleterre, a permis de mettre en évidence la présence d’une toxine dans la

nourriture de ces volailles, qui comporte des tourteaux d’arachide. Les études

conduites sur la matière première qui avait été contaminée par une moisissure du

genre Aspergillus ont aboutit à la caractérisation des aflatoxines (Asao et al., 1963 in

AFSSA, 2009)

Les aflatoxines (AF) sont des métabolites secondaires produites par la

moisissure Aspergillus flavus et certaines souches voisines. Certaines espèces sont

aptes à produire l'une ou l'autre ou encore quelques-unes des 6 aflatoxines : B1, B2,

M1, M2, G1 et G2 (fig.6) (Web 5).

Figure 6 : Différentes structures chimiques des aflatoxines (Web 6)

9

II.1.2 Effets toxiques d’aflatoxines :

Les effets des aflatoxines sur la santé animale varient suivant l'espèce, l'âge, le

sexe, l'état physiologique de l'animal, le mode d'administration et la composition de

l'alimentation (Tabuc, 2007).

L'AFB1 est la plus toxique, suivie par ordre décroissant de toxicité, par

l'AFM1, l'AFG1, l'AFB2 et l'AFG2. La toxicité des aflatoxines G1, B2 et G2 sont

respectivement 50, 80 et 90 % moindre que celle de l'AFB1 (Cole et Cox, 1981).

Ingérée en grande quantité, l’aflatoxine peut être responsable de toxicités aiguës.

Elle se caractérise généralement par la mort rapide des animaux qui présentent alors

un foie décoloré et augmenté de volume (hépatotoxicité) (fig. 7) ; les reins

présentent des signes de glomérulonéphrite, les poumons sont congestionnés et

malformations d’embryon (tératogènes) (Arora et al., 1981). L'effet tératogène est

bien décrit chez les embryons de poulet pour lesquels on note un retard de

développement, une microcéphalie, une anophthalmie, un palais fendu (bec de

lièvre) et une déformation des maxillaires (Vesely et al., 1983). Toutefois, la

propriété toxique majeure de l’AFB1 est son pouvoir cancérigène. En effet, cette

molécule est responsable de l’apparition d’hépatocarcinomes chez les hommes et les

animaux. Pour cette raison, elle est classée dans le groupe I des molécules

cancérigènes chez l’homme par le IARC (Autrup et al., 1991 ; Vainio et al., 1992).

Figure 7 : Effet des aflatoxines sur le foie de la volaille (Web 7)

II.2. Les ochratoxines:

II.2.1 Définition

Les ochratoxines sont des mycotoxines constituées d’une molécule

d’isocoumarine attachée à une molécule de phénylalanine (

de dix ochratoxines connues, l’ochratoxines A (OTA)

naturel le plus abondant dans les produits alimentaires (

1981). Il a été isolée pour la première fois à partir

par van der Merwe Par la suite, elle a été identifiée comme contaminant du maïs

aux USA en 1969, puis dans l'ensemble du monde (

AFSSA, 2009).

Figure 8 : Structure chimique d

II.2.2 Effets toxiques de l’ochratoxine

L’organe cible pour l’OTA est le rein.

mycotoxine peut varier en fonction de l'espèce, du sexe

d'administration. Di Paolo et

inhalation d'Aspergillus ochraceus

tubulonécrose) (Marquardt et Frohlich

aussi très facilement et rapidement absorbée par le tractus respiratoire (

al., 1995).

D’une part, des études effectuées au Danemark, en

en Pologne, ont montré que l'OTA peut jouer un rôle majeur dans l’étiologie de la


d’isocoumarine attachée à une molécule de phénylalanine (Davis, 1981

de dix ochratoxines connues, l’ochratoxines A (OTA) (Fig.8) est le contaminant

naturel le plus abondant dans les produits alimentaires (Chu et Butz

été isolée pour la première fois à partir d'Aspergillus ochraceus

ar la suite, elle a été identifiée comme contaminant du maïs

aux USA en 1969, puis dans l'ensemble du monde (Weindenburner

: Structure chimique de l’ochratoxine A (Web 8)

Effets toxiques de l’ochratoxine :

our l’OTA est le rein. Toutefois, la toxi

mycotoxine peut varier en fonction de l'espèce, du sexe

Paolo et al., (1993) ont décrit un cas d'intoxication aiguë par

d'Aspergillus ochraceus, ayant provoqué une atteinte rénale (oligurie et

Marquardt et Frohlich, 1992 ; Pohland et al., 1992

aussi très facilement et rapidement absorbée par le tractus respiratoire (

es études effectuées au Danemark, en Hongrie, en Scandinavie et


10


1981). Parmi plus

est le contaminant

Chu et Butz, 1970 ; Davis,

d'Aspergillus ochraceus en 1965

ar la suite, elle a été identifiée comme contaminant du maïs

Weindenburner, 2001 in

(Web 8)

Toutefois, la toxicité de cette

et de la voie

1993) ont décrit un cas d'intoxication aiguë par

, ayant provoqué une atteinte rénale (oligurie et

., 1992). L’OTA est

aussi très facilement et rapidement absorbée par le tractus respiratoire (Breitholz et

, en Scandinavie et


11

néphropathie porcine et des lésions rénales chez le poulet ont aussi été associées à

l'ingestion de cette mycotoxine (Hamilton et al., 1982).

D’autre part, l'OTA administrée à divers animaux provoque des effets

variables au niveau de la moelle osseuse et de la réponse immunitaire. Elle peut être

à l'origine de lymphopénie, de régression du thymus et de suppression de la réponse

immunitaire (Luster et al., 1987 ; Lea et al., 1989 ; Singh et al., 1990).

De plus, l'OTA est tératogène chez l'animal. Elle provoque des anomalies

morphologiques diverses chez le rat, la souris, le hamster, le porc et les embryons de

poulet. Ces anomalies entraînent une mortalité fœtale augmentée, des malformations

fœtales, une perte de poids des fœtus et une proportion anormale de fœtus présentant

des hémorragies (Pfohl-Leszkowicz, 2001).

II.3. Les Trichothécènes

II.3.1 Définition

Le groupe des trichothécènes (Fig.9) compte approximativement 60 molécules

biologiquement actives. Les trichothécènes sont produites principalement par des

espèces du genre Fusarium qui contaminent les céréales et particulièrement le maïs

(Tabuc, 2007).

Chimiquement, ce sont des sesquiterpènes caractérisés par un groupement

époxyde entre les carbones en positions 12 et 13 qui leurs confère la toxicité. Ils sont

divisés en deux classes : les trichothécènes macrocycliques et les trichothécènes

non-macrocycliques (Chu, 1998).

Ueno, (1977) a proposé une classification des trichothécènes en 4 groupes en

fonction de la position du carbone :

Groupe A : constitué par les trichothécènes dépourvus de fonction cétone en

C8 ; la toxine T-2, la toxine HT-2 et le diacétoxyscirpénol (DAS) en font partie.

Groupe B : constitué par les trichothécènes possédant une fonction cétone en

C8 ; le nivalénol, le déoxynivalénol (DON) et la fusarénone-X en font partie.

12

Groupe C : constitué par les trichothécènes possédant un époxyde

supplémentaire entre C7 et C8 comme la crotocine.

Groupe D : constitué par les trichothécènes possédant un macrocycle entre C4

et C15 ; les verrucarines, les roridines et les satratoxines en font partie.

Figure 9 : Structures chimiques des trichothécènes du groupe A (a) et du Groupe B (b, c et d) (Web 9)

13

II.3.2 Effets toxiques des trichothécènes

L’étude de l’impact des trichothécènes sur le système immunitaire a fait

l’objet de nombreux articles généraux (Rotter et al., 1996 ; Pestka et al., 2004 ;

Pestka, 2008). Plusieurs cas de mycotoxicoses chez l’homme et des animaux

d’élevage ont été attribués à la consommation de céréales contaminées par du DON

au Japon, c’est la mycotoxine la plus répandue (Morooka et al., 1972).

Le DON module l’activité des transporteurs intestinaux qui affecte l'absorption

des nutriments dans les cellules intestinales épithéliales humaines, l'inhibition de la

synthèse protéique et l'induction de l'apoptose sont les principaux mécanismes de la

toxicité de DON (Maresca et al., 2002). Une fois que la mycotoxine a traversé

l'épithélium intestinal, le DON va cibler le système immunitaire. Il peut modifier

de manière significative l'immunité humorale ainsi que l’immunité à médiation

cellulaire dans une variété de cellules eucaryotes et chez les modèles animaux

expérimentaux (Tryphonas et al., 1986 ; Pestka et al., 1990).

II.4. La patuline :

II.4.1 Définition

La patuline (Fig.10) est une mycotoxine incluse dans un groupe de composés

couramment connus sous le terme de lactones toxiques. Ce toxine est un composé

cyclique qui n'est pas fluorescent associée en particulier aux pommes manifestant la

"pourriture brune" (Web 10).

Figure 10 : Structure chimique de la patuline

II.4.2 Effets toxiques de

La patuline a des pouvoirs carcinogène et mutagène entraînent des syndromes

nerveux. Chez les ruminants notamment

gastriques qui est à l’origine des troubles de l’ingestion et de la digestion.

Ces troubles ont des effets

A l’échelle moléculaire, il semblerait que la patuline agisse en altérant la

perméabilité ionique et/ou la communication intracellulaire. Ceci engendrerait

un stress oxydatif et la mort cellulaire. De plus, la patuline possède des

propriétés antibiotiques vis

ruminale. (Riley, 1998 ; Yiannikouris

II.5. La zéaralénone :

II.5.1 Définition

La zéaralénone (ZEA) à

est une lactone macrocyclique dérivée de

C18H22O5 et illustrée dans la figure

mycotoxine produite principalement par le

ainsi que des études ont montré que cette toxine peut être produite à des hautes

concentrations dans les graines de maïs destinées à l'alimentat

stockage (Pittet, 1998).

: Structure chimique de la patuline (Web 11)

toxiques de la patuline

ouvoirs carcinogène et mutagène entraînent des syndromes

Chez les ruminants notamment induit une paralysie des réservoirs


Ces troubles ont des effets néfastes sur la production laitière et la croissance.



et la mort cellulaire. De plus, la patuline possède des

propriétés antibiotiques vis-à-vis antibactériennes qui pourraient perturber la flore

Yiannikouris et Jouany, 2002).

La zéaralénone (ZEA) à été isolé pour la première fois en 1962

est une lactone macrocyclique dérivée de l'acide résorcyclique, de formule brute

et illustrée dans la figure 11 (Mirocha et al., 1971). La ZEA

mycotoxine produite principalement par les espèces du genre Fusarium


concentrations dans les graines de maïs destinées à l'alimentation animale pendant le

14

11)

ouvoirs carcinogène et mutagène entraînent des syndromes

une paralysie des réservoirs


néfastes sur la production laitière et la croissance.



et la mort cellulaire. De plus, la patuline possède des

vis antibactériennes qui pourraient perturber la flore

été isolé pour la première fois en 1962, sa structure

l'acide résorcyclique, de formule brute

. La ZEA est une

Fusarium au champ,


ion animale pendant le

15

Figure 11 : Structure chimique de la zéaralénone (d’après Bennett et Klich, 2003 ; Alexander et al., 2009)

II.5.2 Effets toxiques de la zéaralénone

La ZEA est responsable d’une réponse œstrogénique chez les ruminants

entraînant des troubles de la reproduction et des modifications physiques des

organes génitaux diverses (Yiannikouris et Jouany, 2002) : des Œdèmes et

hypertrophie des organes génitaux des femelles prépubères. La diminution du

taux de survie de l’embryon chez les femelles en gestation, une réduction des

quantités de LH et de progestérone produites engendrant une diminution de

production laitière et des troubles de la morphologie des tissus utérins, une

féminisation des jeunes mâles par la diminution de la production de testostérone,

l’infertilité et la mortalité.

La ZEA n'est pas considérée comme tératogène ; les doses modérées

provoquent quelques malformations mineures du squelette, dues essentiellement à

un retard d’ossification, à des doses supérieures aux contaminations naturelles. Chez

le porc, on peut mettre en évidence un effet tératogène caractérisé par une altération

du développement des membres (Diekman et Green, 1992).

II.6. Les fumonisines :

II.6.1 Définition

Les fumonisines sont un ensemble de toxines produites par les espèces

du genre Fusarium comme F. verticillioides (ou F. moniliforme) et F. proliferatum

(Creppy, 2002).

16

Les fumonisines sont un groupe d'au moins 15 mycotoxines étroitement liées.

La plus importante est la fumonisine B1 (FB1). Leurs structures chimiques se basent

sur une longue chaîne hydrocarbonée hydroxylée, comportant des groupes méthyle

et amines, deux groupes hydroxyles sont estérifiés avec des acides tricarballyles

(propane-1, 2, 3-tricarboxylique), Les fumonisines B2 ne comportent pas de groupe

hydroxyle en position 10, par rapport aux fumonisines B1, La structure générale de

cette famille est donnée dans la figure 12 (Web12).

Figure 12 : Structure chimique des fumonisines

(d’après Bennett et Klich, 2003 ; Alexander et al., 2009)

II.6.2 Effets toxiques des fumonisines

La FB1 est une mycotoxine phytotoxique, elle endommage les membranes

cellulaires et réduit la synthèse de la chlorophylle. Elle perturbe la biosynthèse des

sphingolipides chez les plantes (Creppy, 2002). Elle inhibe la croissance cellulaire et

altère le métabolisme lipidique chez Saccharomyces cerevisiae (OMS, 2000). Chez

l’homme, il n’y a aucune confirmation de la toxicité aiguë des fumonisines.

Cependant une corrélation entre l’exposition aux fumonisines en Afrique du Sud et

le cancer de l’œsophage a été suggérée (Norred et Voss, 1994).

17

II.7. les mycotoxines du genre Claviceps

II.7.1 Découverte et définition

La « maladie de l’ergot » ou « ergotisme » est plus spécifiquement lié à

l’ingestion d’ergot du seigle (C. purpurea). Celui-ci est connu pour être responsable

des « feux de Saint Antoine » ou « mal des ardents » observés chez l’Homme surtout

du 8ème au 16ème siècle en Europe où cette affection provoque la mort des centaines

de milliers de personnes. Les temps ont changé ensuite et les animaux sont

aujourd’hui les principales victimes de l’ergot. Les symptômes mais aussi les

impacts de cette affection sont variables selon l’espèce du genre Claviceps

contaminant la denrée consommée (AFSSA, 2009).

L’ergoline est une molécule tétracyclique (Fig.13), constitue la structure de base de tous

les alcaloïdes de l’ergot, dont la quantité d’alcaloïdes dans un sclérote varie de 0,01 à 0,5 %

(Lorenz, 1979 in AFSSA, 2009).

Figure 13 : Structure chimique de l’ergoline (Web 13)

II.7.2 L’effet toxique de l’ergot

Les alcaloïdes de Claviceps purpurea tels que l’ergotamine ou l’ergométrine,

provoquent la stimulation des muscles lisses en inhibant les récepteurs α et β

adrénergiques. Cela induit une vasoconstriction des tissus périphériques. Le flux

sanguin chute alors brutalement conduisant à une gangrène des extrémités. De plus,

18

les ergopeptides, en agissant comme des agonistes de la dopamine, induisent une

diminution du taux de prolactine sérique. Ceci entraîne des effets spécifiques comme

une agalactie chez la mère et une diminution du gain de poids corporel chez le

nouveau-né (AFSSA, 2009).

Les alcaloïdes trémorgènes de C. paspali se fixeraient au niveau des canaux

chlorures des récepteurs GABAA du système nerveux central, inhibant de ce fait

leur fonctionnement (Grant et al., 1998 in AFSSA, 2009). L’inhibition des canaux

chlorures en modifiant le potentiel membranaire rendrait les cellules plus excitables

ce qui pourrait expliquer les convulsions observées. Expérimentalement, des

tremblements sévères ont été observés chez les bovins ayant ingéré 1g d’ergot/kg

pendant au moins 4 jours (Mantle et al., 1977 in AFSSA, 2009). Les symptômes

diffèrent d’un animal à l’autre comme exemple:

Chez les bovins, la lactation est diminuée, une enflure des pieds et une boiterie

peuvent être les premiers signes visibles de toxicoses, une diarrhée, et une

hypersalivation excessive accompagnée de soif intense. Par ailleurs, les ovins

possèdent des difficultés respiratoires, une hyper-salivation, des diarrhées voire des

saignements digestifs sont rapportés et Le taux de gestation est également diminué

(AFSSA, 2009).

Chez les volailles, ont été observés une diminution de la croissance et du taux

de ponte ainsi qu’une forte mortalité des poussins et une gangrène de la crête, de la

langue et du bec pourrait également se produire (AFSSA, 2009).

II.8. La citrinine :

II.8.1 Définition

La citrinine (CIT) est un polyacétate, fluorophore naturel. Elle est composée

d'une unité coumarique (Fig. 14). C’est un métabolite fongique qui a été isolé pour

la première fois à partir de Penicillium citrinium (Hetherington et Raistrick, 1931).

Les premières études menées sur cette molécule ont mis en évidence une action

antibactérienne : bactériostatique et bactéricide contre les bactéries Gram positives

(Raistrick et Smith, 1941 ; Timonin et Rouatt, 1944).

19

La CIT a été utilisée comme antibiotique mais ses propriétés toxiques ont

interdit toute utilisation en thérapeutique (Ambrose et DeEds, 1945, 1946).

Figure 14 : Structure chimique de la citrinine (Web 14)

II.8.2 Effet toxiques de la citrinine

La CIT provoque des lésions rénales au niveau des tubules proximaux,

caractérisées par l'apparition de protéinurie, glycosurie et d'infiltration de leucocytes.

Ces altérations rénales seraient liées à une perturbation de l’homéostasie calcique,

avec une accumulation du calcium au niveau cortical. Elle modifie aussi les

fonctions rénales chez le chien, le poulet, le lapin et le rat. La CIT agit sur le

métabolisme hépatique en diminuant le glycogène hépatique et en augmentant le

glucose sanguin (Tozlovanu, 2008). Des études menées in vivo par Endo & Kuroda,

(1980) ont montré, l’effet inhibiteur de la CIT sur la biosynthèse des triglycérides et

du cholestérol au niveau du foie de rat.

La CIT est négative avec le test classique d'Ames sur Salmonella. Par contre,

elle induit des cassures simple et double brins au niveau de l’ADN d’Escherichia

coli (Martin et al., 1986). La CIT induit des aberrations chromosomiques après une

activation métabolique par des hépatocytes de rat (Sabater et al., 1999) et des

fragmentations acentriques des chromatides au niveau des cellules de la moelle

osseuse chez les souris (Jeswal, 1996).

20

Chapitre III. Techniques d’analyse des mycotoxines

Les techniques d’analyse des mycotoxines sont fondées sur plusieurs facteurs. Aucune

méthode n’est directement applicable à tous les types de mycotoxines. Les paramètres

primordiaux dans un schéma analytique sont la nature chimique de la ou des mycotoxines

d’intérêt, ses groupes fonctionnels mais aussi le type de matrice dans laquelle elles sont

recherchées.

Les aspects majeurs de l’analyse comprennent l’extraction à partir de la matrice, la

purification et la concentration de l’extrait, la détection qualitative et quantitative des

mycotoxines. De manière générale, la première étape d’extraction de la mycotoxine à partir de

la matrice broyée, s’effectue dans un solvant organique aqueux (Scott, 1995). Les solvants

utilisés dans l’extraction des mycotoxines peuvent être le méthanol, l’acétone, l’acétonitrile,

l’acétate d’éthyle et le chloroforme (Betina, 1993 in Medjdoub, 2012). L’utilisation d’un

mélange d’eau et de solvant organique permet en humidifiant le substrat d’augmenter la

pénétration du solvant. La phase aqueuse est généralement acidifiée afin de casser les

interactions entre la ou les toxines et les constituants de l’échantillon tels que les protéines.

L’utilisation de sels inorganiques permet de diminuer la formation d’émulsion durant

l’extraction. D’autres composés peuvent être présents et interférer, par la suite, dans l’analyse

chromatographique des mycotoxines. Une étape de purification à partir de l’extrait filtré est

alors d’autant plus nécessaire que l’on cherche à atteindre des seuils de quantification bas.

Cette étape peut être réalisée soit par :

- Partage liquide-liquide (LLP).

- Extraction sur phase solide (SPE).

- Extraction sur colonne d’immunoaffinité (IAC).

La dernière étape est l’analyse par chromatographie des échantillons. Plusieurs techniques

peuvent être utilisées :

- Chromatographie en couche mince (CCM).

- Chromatographie liquide à haute performance (CLPH).

- Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) ou HPLC couplée

à l’ionisation par electrospray (ESI).

21

La CCM présente l’intérêt de pouvoir détecter plusieurs toxines simultanément, mais les

limites de détection sont trop élevées pour détecter des teneurs définies par les

réglementations. Les techniques LC-MS ou ESI sont actuellement peu utilisées car ces

technologies sont très coûteuses tant par l’acquisition de l’appareillage que par son entretien.

La technique, la plus employée est l’HPLC (CAST, 2003), couplée à un détecteur UV

[détection de la patuline et de l’acide pénicillique] (Hurst et al., 1987).

III.1. Principe général d’extractions des mycotoxines

Quel que soit le matériel utilisé (organe, urine, sang, surnageant cellulaire), le

principe de la technique est fondé sur une extraction chloroformique acidifiée en

présence du chlorure de magnésium, le schéma général de l’extraction est illustré

dans la figure 15.

L’acidification et la force ionique de la solution d’extraction permettent de

rompre en partie les liaisons des toxines aux constituants de la matrice et favorisent

ainsi leur extraction. L’extrait chloroformique obtenu est évaporé et filtré. Une

méthode de purification est en place au laboratoire et consiste à réaliser une

extraction de l'extrait chloroformique par du bicarbonate suivie d'une extraction au

chloroforme supplémentaire (Tozlovanu, 2008).

Figure 15 : Schéma générale

: Schéma générale de l’extraction des mycotoxines à partir d’un

biologique (Dragacci et al., 2005)

22

tion des mycotoxines à partir d’un matériel

23

III.2. Exemples des techniques d’analyses

III.2.1 Analyses par Chromatographie en phase Liquide à Haute

Performance (HPLC)

La Chromatographie en Phase Liquide Haute Performance ou HPLC (fig.16)

est une technique analytique qui permet la séparation d’un ou de plusieurs composés

contenus dans un mélange. Le système permettant d’effectuer cette séparation est

appelé système de phases et est composé de la phase stationnaire et de la phase

mobile. La méthode de chromatographie HPLC utilisée pour la séparation et la

caractérisation des mycotoxines est la chromatographie d’adsorption en phase

inverse. La phase stationnaire utilisée est constituée de groupements C18 greffés sur

un support de silice.

La phase mobile alimente le chromatographe en permanence : elle est délivrée dans le

système par une pompe dont le débit est modulable. Les composés à séparer, en suspension

dans un solvant, sont prélevés grâce à une seringue puis chargés dans le chromatographe par

l’injecteur au niveau de la boucle d’injection. Les molécules sont entraînées par la phase

mobile vers la colonne chromatographique contenant la phase stationnaire. Un détecteur

fluorimétrique suit en permanence l’élution du composé et le signal obtenu est enregistré au

niveau de l’ordinateur. Une bonne séparation des composés d’intérêt, grâce à l’utilisation de

phases mobiles et stationnaires adaptées à ceux-ci, permettra d’observer au niveau de

l’intégrateur un pic isolé, L’enregistrement et l’analyse des chromatogrammes sont effectués

par un logiciel adapté (Normasoft) (Tozlovanu, 2008).

Figure 16 : Description du système HPLC (Medjdoub, 2012)

24

III.2.2 chromatographie d’immunoaffinité

� Principe de la chromatographie d’immunoaffinité

Le principe de cette technique repose sur l’utilisation de l’anticorps comme

réactif d’affinité. L’anticorps antimycotoxine est tout d’abord immobilisé sur un

support qui a souvent l’apparence d’un gel remplissant une microcolonne,

conditionné à l’aide d’un tampon.

La chromatographie par immunoaffinité se réalise en plusieurs étapes comme

le montre la figure 17. L’extrait est appliqué sur la microcolonne où la mycotoxine

(antigène) est spécifiquement retenue par les anticorps fixés sur le gel par formation

du complexe antigène-anticorps. Après lavage pour éliminer les impuretés, la

mycotoxine est spécifiquement éluée au moyen d’une solution organique appropriée,

ce qui dissocie le complexe antigène-anticorps. La mycotoxine est recueillie et sa

quantité est estimée par différents moyens physico-chimiques simples

(microcolonne de visualisation) ou complexes par CCM ou par HPLC (Dragacci et

al., 2005).

Figure 17 : Extraction et purification d’un échantillon par chromatographie d’immunoaffinité

: Extraction et purification d’un échantillon par chromatographie d’immunoaffinité(Dragacci et al., 2005)

25

: Extraction et purification d’un échantillon par chromatographie d’immunoaffinité

26

III.2.3 Le test ELISA

Le test ELISA repose sur la révélation du complexe antigène/anticorps

spécifique par une réaction enzymatique chromogène:

� ELISA type « sandwich » : La couleur développée (=activité enzymatique)

est proportionnelle à la quantité de molécules à détecter présente dans

l’échantillon (fig.18). (Verdon-Delor et Raimbault, 2006).

Figure 18 : ELISA type « sandwich » (Verdon-Delor et Raimbault, 2006)

27

III.3. Exemples d’extraction de quelque mycotoxines

III.3.1 Aflatoxines

L’analyse des aflatoxines comprend une extraction en milieu organique suivie

d’une immunopurification sur colonne d’immunoaffinité enrichie en anticorps

antiaflatoxines. Après solubilisation d’une mouture de grains de céréales en

présence, par exemple, de 70 % de méthanol ou d’acétonitrile, l’extrait est dilué

avec de l’eau afin de ramener la proportion de solvant. Pour les produits laitiers issus

des animaux qui consomment les céréales contaminés, en particulier pour les

fromages, donc une extraction est combinée en solvant organique suivie d’une

immunopurification puis d’une analyse par HPLC. Ainsi, 10 g de fromage ou 10 g

de yaourt sont additionnés de 80 ml de dichlorométhane, de 1 ml de la solution

saturée en NaCl et de 10 g de silice diatomée. Après broyage à grande vitesse et

filtration sur papier-filtre, le dichlorométhane est évaporé à 30-40 °C. Le résidu est

ensuite dissous avec 1 ml de méthanol, 50 ml de n-hexane puis 30 ml d’H2O. Après

agitation vigoureuse et décantation, la phase aqueuse est recueillie puis

chromatographiée sur colonne d’immunoaffinité. À la suite de

l’immunopurification, l’éluat concentré est analysé par HPLC (Dragacci et al.,

2005).

III.3.2 Ochratoxine A

Pour le dosage de l’ochratoxine A, il existe des colonnes d’immunoaffinité

pour la purification spécifique de cette mycotoxine avant analyse par HPLC :

l’échantillon broyé finement (50 g) est agité vigoureusement en présence de NaCl

(5g) et du méthanol 80 % (100 ml). Après filtration et/ou centrifugation, l’extrait est

dilué puis chromatographié sur colonne d’immunoaffinité. Après un double lavage à

l’eau de la colonne, l’ochratoxine est éluée par de l’acétonitrile ou du méthanol ou

encore par une solution légèrement basique. Dans tous les cas, il est impératif de se

conformer aux prescriptions des fournisseurs de colonnes. Un aliquote partie de

l’éluat peut être analysé par un système HPLC approprié à la quantification

fluorimétrique de l’ochratoxine A. Il existe deux types de méthodes pour confirmer

la présence sans équivoque de l’ochratoxine A : une méthode chimique de formation

du dérivé méthylester de l’ochratoxine et une méthode enzymatique par dégradation

de l’ochratoxine par la carboxypeptidase (Dragacci et al., 2005).

28

III.3.3 fumonisines.

Les fumonisines sont au mieux extraites de l’échantillon (50 g) à l’aide de 100

ml du mélange du méthanol et l’eau (75% + 25%, v/v). La purification de l’extrait se

poursuit par une chromatographie sur microcolonnes d’échange d’anions forts, avec

un débit constant de 1 ml/min et le pH de l’extrait ne devant pas être inférieur à 5,8.

L’élution spécifique des fumonisines est assurée par le passage de 14 ml d’une

solution d’acide acétique, diluée à 14 % dans du méthanol. Ces colonnes d’échanges

d’ions peuvent être régénérées par lavage du support avec 5 ml d’acide

chlorhydrique à 0,1 M suivi de 8 ml d’eau (Dragacci et al., 2005).

Les dérivés des fumonisines (à partir des étalons ou des extraits) s’obtiennent

de la façon suivante : l’OPA (40 mg) est dissous dans 1 ml de méthanol puis dilué

dans 5 ml de tétraborate de sodium 0,1 M (pH 9-10) et additionné de 2-mercapto-

éthanol (50 μl). 225 μl de cette solution de dérivation sont mélangés à 25 μl de la

solution étalon de Fumonisine ou de l’extrait de l’échantillon. La dérivation est

immédiate et les dérivés doivent être analysés immédiatement pour HPLC car ils

sont peu stables. La phase mobile se compose du méthanol et du

dihydrogénophosphate de sodium 0,1 M (68% + 32%, v/v) ajusté à pH 3,35 avec de

l’acide ortho-phosphorique (Dragacci et al., 2005).

III.3.4 Patuline

Pour la recherche de la patuline, la méthode d’analyse comprend tout d’abord

une étape d’extraction de la patuline à partir des fruits contaminés (particulièrement

jus de la pomme) à l’aide d’acétate d’éthyle suivie de lavages successifs en présence

d’une solution de carbonate de sodium à 1,5 %. Après évaporation de la phase

organique et acidification par de l’acide acétique, la patuline est dosée par CLHP

couplée à un détecteur UV réglé à 254 ou 276 nm. La chromatographie s’effectue en

phase inverse sur colonne C18, avec a phase mobile ayant la composition suivante :

eau/tétrahydrofuranne (100/0,8, v/v) ou bien eau/acétonitrile (90/10, v/v).

La confirmation de l’identification de la patuline dans les extraits par CCM

bidimensionnelle nécessite l’emploi du méthyl-3-benzothiazolinone-2-hydrazone

chlorhydrique (MBTH). La première dimension de la chromatographie sur couche

29

mince de gel de silice (sans indicateur de fluorescence) s’effectue dans une cuve

contenant un mélange de toluène/acétate d’éthyle/acide formique 90 % (5/4/1,

v/v/v). La seconde dimension chromatographique (perpendiculaire à la première) se

réalise en utilisant comme phase mobile le mélange éther diéthylique

anhydre/hexane (3/1, v/v). À la fin de la migration et après évaporation du solvant

sous hotte, une solution de MBTH à 0,5 % est pulvérisée sur la plaque de CCM,

laquelle est placée dans un four à 130 °C pendant 15 min environ. La patuline

apparaîtra sous forme d’un spot jaune-brun lors de l’examen de la plaque sous

lumière UV à 366 nm (Dragacci et al., 2005).

III.4. PARTIE PRATIQUE

III.4.1 Matériels et méthodes

a) Matériels

� Les échantillons à analyser :

Les condiments de type Gingembre et Cumin (conditionné et non

conditionné) ont fait l’objet de cette partie pratique.

� Matériel :

Autoclave pour la stérilisation de milieu de culture.

Agitateur à 28-30°C

Micropipette et des cônes de 0,1 et 1 ml pour la préparation et l’ensemencement des

dilutions.

Bec bunsen pour une zone aseptique.

Seringue et Filtre de 0,45 µm permettant la stérilisation de la solution d’antibiotique ;

Oxytétracycline.

Balance de précision et balance pour peser les différents échantillons.

Boites de Pétri et tubes à essais pour la culture et la dilution.

Vortex pour l’agitation des tubes lors de la préparation des dilutions.

Etuve pour l’incubation des Boites de Pétri ensemencées.

30

Pipette pasteur sert à l’étalement.

Flacon de 1000 ml pour la préparation du milieu de culture

� Milieu de culture OGA :

Composition pour un litre (avec Oxytétracycline)

Extrait de levure déshydraté………………………………...5 g

Glucose…………………………………………………... 20 g

Agar……………………….………………………………15 g

Oxytétracycline……………………….………………….0,1 g

Eau distillée stérile (QSP)…………………………...1 000 ml

pH du milieu prêt à l’emploi à 25°C : 6,6 ± 0,2.

b) Méthodes

� Isolement des moisissures

- Préparation du milieu de culture :

Nous avons mis en suspension 40 g de milieu de base en poudre dans un litre

d’eau stérile qui sera porté lentement à ébullition sous agitation. Une fois tous les

ingrédients sont dissouts ; le milieu est mis dans un flacon de 1000 ml puis stériliser

à l’autoclave à 120°C pendant 20 minutes et à la pression de 2 bars.

Après autoclavage, le milieu est refroidi dans un bain marie à 45°C puis

additionné stérilement de 1 ml d’une solution stérile d’Oxytétracycline (par filtration

au filtre de 0,4 µm) afin d’obtenir une concentration finale de 100 mg/l. Le milieu de

culture ainsi préparé est répartie dans des boîtes de Pétri stériles à raison de 25-30

ml, puis laissé solidifier, sur une surface froide et plane.

- Préparation des échantillons et réalisation des dilutions :

Un gramme de chaque échantillon est pesé puis transféré dans un tube à essai

contenant 9 ml d’eau physiologique stérile (tube10��), qui nous avons préparé une

série de dilution jusqu’à la dilution de 10��

par la technique de suspension-dilution.

Remarque : Nous avons effectué une seule répétition.

31

- Ensemencement et incubation :

Pour chaque échantillon et à l’aide de la technique d’étalement par râteau,

nous avons ensemencé 0.1 ml de chaque dilution dans des boîtes de pétri contenant

le milieu de culture gélosé, puis incubé dans l’étuve à 25°C pendant 3 jours.

- Dénombrement, reconnaissance et purification des colonies de

champignons :

Après incubation, nous avons effectué un dénombrement des colonies de

champignons qui cultivent sur le milieu sélectif.

La reconnaissance des différents isolats de moisissures a été réalisée après

purification successive sur milieu de culture sans antibiotique et en se basant des

bases théoriques acquises au niveau du module phytopathologie et développement

des plantes.

- Mise en culture des isolats purifiés dans le milieu liquide :

Dans le but de l’extraction et la caractérisation du type de mycotoxine élaboré

par les isolats de moisissures sélectionnés ; un disque de gélose d’une culture pure a

été ensemencé dans le milieu Sabouraud liquide.

c) Résultats

Le tableau 2 montre les résultats de dénombrement des levures et des

moisissures sur le milieu sélectif OGA.

Nous constatons que les résultats obtenus sont variables en fonction du type et

la nature de l’échantillon analysé et des champignons recherchés. Ainsi, les

concentrations de levures et de moisissures les plus élevés ont été obtenues pour les

échantillons du gingembre non conditionné et du cumin conditionnés. Nous

constatons aussi que le cumin non conditionné est exempte de champignons.

L’absence de moisissures au niveau du cumin non conditionné pourrait

s’expliquée par son effet antifongique décrit au niveau de plusieurs études (Zinedine

et Idrissi, 2007), alors que leur présence au niveau du cumin conditionné pourrait

s’expliquée par la possibilité d’altération de l’activité antifongique lors du

32

conditionnement ou par la nature différente du cumin utilisé ou par la possibilité

d’une post contamination par les manipulateurs.

La reconnaissance des isolats purifiés a pu montrer qu’il s’agit d’espèces

appartenant au genre Aspergillus (fig. 19) et Penicillium (fig. 20) qui sont des

souches sécrétrices des mycotoxines, nous avons obtenus aussi un isolat appartenant

à l’ordre des mucorales (fig. 21) responsable de la pourriture moules des fruits et

légumes.

Il faut signaler que la mise en évidence de la production des mycotoxines à

partir des cultures réalisées n’a été pas faite par manque de kit adéquat à ce propos.

Tableau 2: Résultat de dénombrement de colonies des levures et moisissures de

différents échantillons

Nombre moyenne des

levures

Nombre moyenne des

moisissures

Gingembre

Non

conditionné

27x10� UFC/g 10

� UFC/g

Conditionné 33x10� UFC/g 0

Cumin

Non

conditionné

0 0

Conditionné 29x10� UFC/g 10

� UFC/g

UFC : Unité formant colonie

29

Figure 19 : Aspergillus Niger sur un milieu Sabouraud

Figure 20 : Penicillium sur un milieu Sabouraud

Figure 21 : Isolat appartenant à l’ordre des mucorales développé sur un milieu Sabouraud

30

Conclusion Tout au long de la chaîne alimentaire, depuis le champ jusqu’à l’assiette du

consommateur ou la mangeoire de l’animal, tel ou tel groupe de moisissures est

susceptible de se développer et de produire des toxines si les conditions écologiques,

notamment l’humidité et la température, lui sont favorables. La contamination des

aliments ou des graines peut avoir lieu avant ou pendant le stockage. La plupart des

moisissures toxiques poussent sur l'aliment, diffusent dans la masse de l'aliment,

élaborent des mycotoxines.

Malgré la toxicité des mycotoxines, la patuline est entraîné son introduction en

thérapeutique vétérinaire et humaine. Elle fut ainsi utilisée avec succès dans la

brucellose bovine (Rossi et Bruyère, 1950 in AFSSA, 2009) et contre les agents des

rhumes et bronchites mais sa neurotoxicité l’a fait abandonner chez l’homme, en

dépit de quelques succès dans le traitement local de plaies infectées et pour la

cicatrisation des blessures de la cornée (Dulong, 1952 in AFSSA, 2009).

La population marocaine n’est pas à l’abri du danger causé par ces

mycotoxines du fait qu’un ensemble de denrées alimentaires était fortement

contaminés par ces substances, et que le niveau de contamination a parfois dépassé

les limites réglementaires fixées par la réglementation européenne en vigueur. Cette

contamination a lieu du fait de l’absence de contrôles de routine par les autorités

compétentes et de l’absence de standards de qualité et de sécurité sanitaire des

aliments, de bonnes pratiques de production, dans les unités industrielles marocaines

et les unités d’importation pour le contrôle de la croissance des moisissures et la

production des mycotoxines pendant les périodes de récolte, de distribution et de

stockage.

Dans l’avenir, il faudra donc étudier plus en détails les effets engendrés par ces

présences multiples, dans le but de définir avec plus de précision les doses sans

effet. Ces études devraient permettre d’affiner les législations ainsi que les

recommandations pour les nourritures animales au Maroc.

Finalement, un programme de surveillance des mycotoxines est devenue une

priorité nationale et ce pour la protection des consommateurs nationaux et étrangers

généralement inconscients des effets néfastes provoqués à long terme par ces

substances.

31

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Les mycotoxines dans les denrées alimentaires

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