Leptin-Mediated Effects of Undernutrition or Fasting on Luteinizing Hormone and Growth Hormone...

12
Leptin-Mediated Effects of Undernutrition or Fasting on Luteinizing Hormone and Growth Hormone Secretion in Ovariectomized Ewes Depend on the Duration of Metabolic Perturbation B. A. Henry, J. W. Goding,y A. J. Tilbrook,z F. R. Dunshea,§ D. Blacheô and I. J. Clarke Prince Henry's Institute of Medical Research, Clayton Victoria, Australia. yDepartment of Immunology and Pathology, Monash University Medical School, Prahran, Victoria, Australia. zDepartment of Physiology, Monash University, Clayton, Victoria, Australia. §Victorian Institute of Animal Science, Werribee, Victoria, Australia. ôAnimal Science Group, Faculty of Agriculture, University of Western Australia, Nedlands, Western Australia, Australia. Key words: fasting, food-restriction, nutritional signal and hypothalamus. Abstract We aimed to determine the importance of leptin in the regulation of luteinizing hormone (LH) and growth hormone (GH) secretion in ovariectomized (OVX) ewes. Lean and fat sheep were produced by dietary manipulation over 8 months and were then fasted for 32 h. Plasma concentrations of glucose, insulin and leptin were higher in the fat group. Fasting decreased plasma concentrations of glucose and insulin and increased concentrations of nonesteri®ed fatty acids (NEFA) in fat and lean ewes, but leptin concentrations were reduced in the fat group only. Plasma GH concentrations were higher in the lean group and LH concentrations were lower; there was no effect of fasting. These data suggested that long-term changes in plasma leptin concentrations might affect LH and GH secretion, but acute changes with fasting had no effect. OVX ewes of normal body weight were fasted for 72 h with or without intracerebroventricular (i.c.v.) infusion of leptin (4 mg/h), achieving similar metabolic effects to the 32 h fast. The 72-h fast increased LH pulse amplitude, mean GH and cortisol concentrations, but these changes were corrected towards normal by leptin treatment. Thus, leptin could attenuate fasting-induced alterations in the secretion of LH, GH and cortisol. Finally, we food-restricted OVX ewes for 4 months (lean), leading to a 20-kg reduction in body weight. Plasma concentrations of leptin and insulin were decreased, and plasma GH concentrations increased, but there was no effect on plasma concentrations of LH, glucose or NEFA. Icv infusion of leptin did not affect any endocrine or metabolic parameter in these ewes. In summary, maintenance of a lean or fat condition for a prolonged period (8 months) or an extended fasting (72 h) can affect LH and GH secretion, but short-term food restriction (4 months) affected only GH secretion and short-term fasting (32 h) had no effect on either LH or GH secretion. This is in spite of altered plasma leptin concentrations in all circumstances studied. Although leptin treatment can restore plasma concentrations of LH, GH and cortisol towards normal in sheep fasted for 72 h, some other factor(s) must signal to the brain to cause shifts in neuroendocrine function in other conditions where nutritional/metabolic status is altered. Acute and chronic under-nutrition cause various metabolic and/or endocrine perturbations. Fasting or extended food-restriction reduces plasma gonadotropin concentrations in rodents, sheep and humans (1±4). Plasma growth hormone (GH) levels are reduced by fasting in rodents (5), but increased in starved sheep and humans (3, 6). In sheep, the effects of chronic food-restriction differ slightly to those seen during fasting. Food-restricted sheep have reduced plasma concentrations of luteinizing hormone (LH) (7) and increased concentrations of GH (8), but plasma cortisol concentrations are not perturbed (9, 10). By contrast, plasma cortisol concentrations are increased by fasting in sheep (3). It is hypothesized that one or more circulating factor(s) provide the Journal of Neuroendocrinology, 2004, Vol. 16, 244±255 # 2004 Blackwell Publishing Ltd Correspondence to: Dr Belinda A. Henry, Henry Wellcome Laboratories for Integrative Neuroscience and Endocrinology (LINE), University of Bristol, Dorothy Hodgkin Building, Whitson Street, Bristol BS1 3NY, UK (e-mail: [email protected]).

Transcript of Leptin-Mediated Effects of Undernutrition or Fasting on Luteinizing Hormone and Growth Hormone...

������������ ���� �� �� ������������� �� ������ ������������� ������� � ������ ������� �� ������ ������� ������ ���� ����� �� ��� ������� ������� � !����������

�� �� ������ � �� � ����� �� � ����� �� �� �� �������� �� ������� ��� �� � �������� ����� �����!� ���"�"�"� # $������ �������� ����" � %��" ��� ���"������

���&��"'��" # �''�� � �� ��� �"� � �� $ ���� (��)����"� $������ *�� � ������ %��" ��� ���"������

���&��"'��" # ���� � �� $ ���� (��)����"� ����" � %��" ��� ���"������

�%��" ���� ���"�"�"� # ���'�� *������ �������� %��" ��� ���"������

����'�� *������ �� �& �����"� # �������"��� (��)����"� # ���"��� ���"����� +������� ���"��� ���"����� ���"������

,�� - ���. #��"��� # �/���"���"� � ��"��"� ��� ������ ��� ��& "����'���

"���� �

�� ��'�� " ��"��'��� "�� �'& �"���� # ��&"�� �� "�� ������"� � # ��"����0��� � �' �� 12�3 ��� �� -"�

� �' �� 1��3 �����"� � �� )�����" '�0�� 14%53 �-��� 2��� ��� #�" ����& -��� &� ����� �� ���"���

'���&���"� � )�� 6' �"�� ��� -��� "��� #��"�� # � 78 �� ���'� � ����"��"� �� # ���� �� ������� ���

��&"�� -��� ������ �� "�� #�" �� �&� ���"��� ��������� &���'� � ����"��"� �� # ���� �� ��� �������

��� ��������� � ����"��"� �� # � ���"���9�� #�""� ����� 1+:��3 �� #�" ��� ���� �-�� ��" ��&"��

� ����"��"� �� -��� ������� �� "�� #�" �� �& ���� ���'� �� � ����"��"� �� -��� ������ �� "�� ���� �� �&

��� 2� � ����"��"� �� -��� � -��; "���� -�� � �##��" # #��"���� ����� ��"� ������"�� "��" � ��/"��'

������� �� &���'� ��&"�� � ����"��"� �� '���" �##��" 2� ��� �� �����"� � ��" ���"� ������� -�"�

#��"��� ��� � �##��"� 4%5 �-�� # � �'�� � �� -����" -��� #��"�� # � <8 � -�"� � -�"� �"

��"�������� )��"������� 1����)�3 ��#��� � # ��&"�� 1= ��>�3 �����)��� ��'���� '�"�� ��� �##��"� " "�� 78 � #��"�

��� <8/� #��" ��������� 2� &���� �'&��"��� '��� �� ��� � �"�� � � ����"��"� �� ��" "���� �������

-��� � ����"�� " -���� � �'�� �� ��&"�� "���"'��"� ���� ��&"�� � ��� �""����"� #��"���/������� ��"���"� ��

�� "�� �����"� � # 2� �� ��� � �"�� �� ������� -� # �/���"���"�� 4%5 �-�� # � =' �"�� 1����3 ������� " �

8?/�� �����"� � �� � �� -����"� ���'� � ����"��"� �� # ��&"�� ��� ������� -��� ��������� ���

&���'� �� � ����"��"� �� ��������� ��" "���� -�� � �##��" � &���'� � ����"��"� �� # 2� ���� �� �

+:��� ��) ��#��� � # ��&"�� ��� � " �##��" ��� ��� ����� � '�"�� ��� &���'�"�� �� "���� �-��� �� ��''���

'���"������ # � ���� � #�" � ���"� � # � � &� � ���� &��� � 16' �"��3 � �� �@"����� #��"��� 1<8 �3

��� �##��" 2� ��� �� �����"� � ��" �� �"/"��' # � ���"���"� � 1=' �"��3 �##��"�� ��� �� �����"� � ���

�� �"/"��' #��"��� 178 �3 ��� � �##��" � ��"��� 2� � �� �����"� �� ���� �� �� �&�"� # ��"���� &���'�

��&"�� � ����"��"� �� �� ��� �����'�"����� �"������ ��"� ��� ��&"�� "���"'��" ��� ���" �� &���'�

� ����"��"� �� # 2� �� ��� � �"�� � " -���� � �'�� �� ����& #��"�� # � <8 � � '� "��� #��" �1�3 '��"

������ " "�� ����� " ����� ���#"� �� ���� ��� ����� #���"� � �� "��� � ���"� �� -���� ��"��"� ���>'�"�� ���

�"�"�� �� ��"�����

����� ��� ����� ���� �������� ����� ������ ��������� ������������� ������������ ������� � �������� ���� ��������������� ������ ����������� ������������� �� ������� ������� ����� ������ ����� ��!� ����� �"#� ������ �������� �$ ������� �� ������ �%�� ��� �������� �� ������ ������� ����� �&� '�� (� ����� �� ������� �� ����� ���� ���������

����� ������$ �� ���� ���� ����� �������� ���� �������� ������� ������ ������ ������������� �� �������)��� ����� �*#��+� ��� �������� ������������� �� "# �,�� ��� ������ �������������������� �� ��� ������� �-� �.�� /$ �������� ������������� ������������� �� �������� �$ ������� �� ���� �&�� (��� $������)�� ��� ��� � ��� ���������� �������� ������ ��

������� �� �������� ������� ����� ���� ��� �������

� 0..� /���1!��� �������� *��

����������� ��� 2 /������ �� #��$� #��$ 3������� *��������� �� (��������� 4���������� ��� 5����������$ �*(45�� 6�������$ �� /������ 2���$

#���1�� /�������� 3����� 7����� /����� /7� &48� 69 �� ����: /�������#��$;�����������1��

������������ ������ �� �� ���� !�� ���������� ����� �� ����� ��������� ����� ���������� ������ ��� ��� ��������� ���������(� ���� ������ �������� ������� ������� ������� ���������� ��

������ *#� �$������ ������������ ��� "# ������������� �����0�� (� ��� �������� �� ��� �� ������ �� �� ��������� �� ���������� �$���� �� ������ �� ���� ����� � ����� ���� �������� �� ���� ����� 2���� �������� ������� ������ ���������������� *# �������� �� ��� ������� ���� ���1�$� ��&� ����������� ������ �������� ��� �&�� ��� ��� �� ����� ���� ��� 1�$� ����� �������� ������� ������ �������� ���� �����<����� �� �������� �� "# � ������� �� ������ ����� �������1�$� ����� /$ �������� ������� ������������ ��=������ �������� �������� �� �������� �� �������� ��� ���� �������� �������$ �������� ������ "# ������ �� ������ �������� ��������� �&�� >� ����� �� ��=���$ �� ���� ��� �� �� ��������������������� ������������� �� ��� �� ������ �� ��������� �� ��������������� �� ������� ��� ���� ������� ������ ��������������!�� ����!� �� ������ �������������� ����� ������ ����� ��� �� ������$ �� ������� ������ ��� ��� ��� �������$ ������� �� ������� 7������ ������� ����� ���� ������� �� ������ ���� �� ������%�� ������ ������ ������������� �� ����������� <��� ��������� !�� ������ �� �� ���� �������� !�� ���������������������� �� ���� ��'�� >��� ������ ����� ��� � ����������� �� �� �������$ ����� ��+��?����� ������������� �� ������ �� ��������$ ���� ��������

����������)�� �@AB� �!�� �������� *# �������� ���� ��� ������� ��<����� *# �������� �� ����������� @AB ����� ��,�� @��� ��� ���� ������ ������ �������� �������� "# �������� ������ �������� @AB �!�� ��� ��� ����� ��,�� >��� ������� �������� � ���� ������� ���� ��� ����������� ��� ������ �������� �� �������� �� *#� ��� ��� �� �������� �� "# �&� ���#�!���� �� �������� �� ������� ��� ������ ��������� ����������� ��� �� � C��������� ��������D �� ����������� � "#�������� ��-� 0.��(� �� ����� ����$� !� ���� ��� �������� ��������������

������ �������� �� ����������� �� ��� �� ������ ���� ������������ ������� �� �� ������������ �������� �� ������� ������ ���� �������� �� ����� ����� !� ����������� �� ���� ��@AB �!�� �� ������ ���� ��� � ���� ������ ��� �.�� 3� ���������� � ��� ��� �&0 � ���� �� �� ��� ��� ���� ����� (� �������� ���������� !� ����� �� ���������� ������ ������ ��� ���������� ���� ��� ��������� ������� �� @AB �!�� �� ��������$ !���� �$ � ��� �������� �+0 � ����� >� ���� ��������� ��� �� ������� �!�� !�� �������$ ������ !�� ������ ���� ��� �� ������� �� ������� �+0 �� ������$� !� ������ ���� ����1��� @AB �!�� �� ������� ������� ������ ������ ����������������� �������� �� ������� �� ������ ������ ������������� �� *#��� "# ��������� (� ��� ������������� !� ������������ �� ��������� ���������� � ��������� ������������ �� �� �������� �� *#�"# ��� ������� ��� ���������� � ��� 0 ���$� �� ������� �� �������� ������ �� ������� �������� ������� ��� ��������E�� ����$������

����� � � ������

�� �� ��� �� !���

>�� !�1 !�� ������� �� ������� �$ �� ������ 5������������� 5����

?��������� �� F���� 6�������$ ��� A������� (�������� �� ������ 7�������

?������� �!�� !�� @AB �� ����� ����� ����� �������������� ��� � ������

������� ������� !�� ������1�� �� �� ���� �� ���������� 0 ��� & �� �������

�������� ���!������ ��� ��������� �������� �� ��������$ �������� �0���

>� ������ ��������� �� ���$ ������������ �� ���� �� ���������� � ��� & !��

����������� �� �������� ����!� 3�� ���� ��������� !�� ������� �� ��������

������� �� ���� !�� ����� �� ����� ��� !�� ��� �����������$ %.. � ������

�������$ !�� ����$ ���! �� � " ��! �� � E���� >��� ���� !�� �������

�������$ ������� ����������� �� ���� ��� ���� ��� ���� ���� ��$�� ���

������$ ���������� ��� ����� >��� �� �� ��������� �� �� ������ ������

���������� ���� !�� ��������� ��� ��� � ���� ��� �� ���������� ������� >�

��=������ !�� �� ���� �� ���$ ��������� �� �� ���� �� ���$ ���� 0 �00�� @���

���� �������� ���� ����� �� ����� !���� �&.�&% 1��� ��$ !�� ���������� ��

��� !���� �$ ����� ���������� �� �� ������ �� ���� ������� ��� �$ ��

��������� �� ���$ !���� �� �����$ ��������� F�� ��G���� !������ !��

������1�� �� ��� !�� ��$ ������� ����� � ���� �����$ ������ !����� (� ���

!�$� �� ���� !�� ����� �� � ��! ���$ !����� ��� ��� ���� !�� ���

�����������

3���� �� ���� !�� ����� �������� ��$ !�� ����� �� ������ ����� �� ������

������� !�� ��� ����� >� ���� !�� ����!�� �� � " ��! ������ �� !��� ���

!�� ��� �� �'�.. ��� ��$� >� ���������� �������� ����!� !�� ���������

���!��� @����� ��� F��� �������� �� �������� ���� �� �������$ ���� ����1�

������� �� 7�������� �0&�� ������ ���������� �� ���$ ��������� !�� �������

����� ��� ����� �� ��������� ����!� @�� ��$ ����� �� ������������ ��

��������������� ��� ������� =����� ���� !�� ���������� ��� �� �������� 1���

������ !�� ������)�� �%.6���� ������� /���� ������� !�� ��1�� ��� ��

Glucose (mM)

Pre-fast Fast0

1

2

3

4

a, b

ba

Pre-fast Fast0

2

4

6

8

10Insulin (µU/ml)

a b

a, b

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4NEFA (mM)

b

b

FastPre-fast Pre-fast Fast0

0.5

1

1.5

2Leptin (ng/ml)

aa

b

���� �� >� ������ �� ����� ������� �&0 � �� �� ��������� ����� �� �������������� �� ���� � ��������$ ��� ������ ���H �� %� � ���� �!��� ���H�� �� ������ F�������� ����� !�� �������)�� �$ �������� �� ���� ������������������� �� �������� �������� ��������E�� ����$ ����� �45��� ��� ���������� ���� �� �������� �� �� ���� ���� ��75F�� 7���������� ���������� !����������� �$ ������� ������� ����$��� �� ������� ��� �� ���� �� ��������� �����E���� ���������� �� � .�.% ��� ����� ����H � � .�.% �� � " ��! �������� ��������

*������ �������)��� ����� ��� ��!� ����� 0�%

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

������ ��������� !�� �� ���� �������� !�� � �������� ���� � ���� *���

#$��� 69� ��� ������ !�� � ��� !�$ ���1 ���� 7������ !�� ��������� ����

������)�� ����� ��� ���������� �� � �? �� ������ ������ ��� !�� ����� ���0. �?����� ����$���

�#�� !�� �� � ���� �� "��� $ � � �� ����!� ��!�� ��������� ��� ���

� ����� � ������ �� � %�& ����

4��� @AB �!�� ������ 75F ���$ !���� %%� � 1�� !�� ������$ ������� ����

�!� ����� ��� ��� ���� � ������������ ������� ���� �� � " ��! ���� � 1� �����

���� �� !��1� � � �������� �%.. � ������ ���� �� ��$� ���� �� � ����� ��

,������ >�� ����� ����� ��������������� �� ������������ ���� !�� ����

����)�� �$ �� ������ �� ����� ����� �� �� ���� �� �������� �� ���� ��

�����E�����$ � � .�..�� �������� ���� ��75F� ���$ !����� !�� �� ��� �!��

��� %� !������ '%�0� ��& 1� ��� �� ���� �!�� ��� �� !������ &��0� .�- 1��

?����� �� ���$ ����������� !�� ������ �� ��������� !�� �� ��������

��������$� �� ��������$ ������ �� #��$ � ��� ��.�� (� ����� �� ������� ���

���� !�� ��� � � .�.�� �� �� ��� ���� ����: �%%�&� &�+ ��1� ����� ����:

�'�&� %�� ��1��� ��� �� ������� ���� ���$ ���� !�� ��!� � � .�.%� �� ���

���� ����: 0''�%� &�+ ��1� ����� ����: 0-.�%� '�. ��1���

>� �������� ��E�� ��� ��������� ������ �� ���� ���� !�� ���������

���!��� .,�.. ��� �'�.. �$ ��1��� ����� ����� ������� ����� ���$ �.���

�� , � ����� �������� #��������� !�� ������� ��� ������� �� ������ �� ��

�������� ������� �� �� ���� ����� ����� *# ��� "# ������������� !��

������� �� ���$ ������ ��� �.. �� �� ������ ��� ��� ������!�� ������ �� ��

���������� �� �������� �������� ��������E�� ����$ ����� �45���� ������� ���

������� >� ���� !�� ��� ������ �� &0 �!�� ��� ������ �� !���� ��� �� �����

�������� ������� !�� ������� �� �� E��� , �� ���� ���������� ����!���

.,�.. ��� �'�.. H 0��&0 �� �� ������� ������� >�� !�� ��������� �� �� ��

������� ���������� ����� ��� ����� �� ������� �� �� ���� ���� ������� ���

���� !�� �����$ ��������$ ���� ���������

���� 0� >� ������ �� ����� ������� �&0 � �� �� ������$ ��E�� �� �������)��� ����� �*#� ��� ��� ��!� ����� �"#� �/� �� ��� ������ ��� ��� ���� �!��� ����!��� ��� ���� �� �������� �� ����� ��75F�� >� ������$ ��E�� �� *# !�� �������)�� �$ �� ���� ������ ������������ �F����� ���� ����� �������������� ��� ������ ��������� ������� �( (�� ����$��� �� �� �������� �������� �� "#!�� ������� ����� �� 6*7�I ������ !�� �������� �� ���� ������������������ �F����� ���� ����� ��������� ������ ������ ��������� ������� �( (� ��� ������ �������� ������������ �/��������� ��� ���� !�� ����$��� ������ ������� ������� ����$��� �� ������� ��� �� ���� �� ���� ����� �����E���� ���������� �� � .�.'H � � .�.% ��� �� � .�.� ��� ����� ������

Fast0

5

10

15

20

25

30

Mea

n pl

asm

a co

rtis

ol

leve

ls (

ng/m

l)

b b

Pre-fast

���� &� >� ������ �� ����� ������� �&0 � �� �� ���� ������ ������������ ��������� �� ��� ������ ���� ��� ���� �!��� ���� ����� >� ���� ������������������ �� ������� !�� ��1�� �� �� ������ ����� ����� �, ���������1�� ���$ �.��� ���!��� .,�.. ��� �'�.. � ��� ������ �� �������� ���� ���� �� 75F�� 7���������� ����$��� !�� ������� ����� ������� ����������$��� �� ������� ��� �� ���� �� ���� ����� �����E���� ������������ � .�.% �� � " ��! ��� ����� ��������

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

0�' *������ �������)��� ����� ��� ��!� �����

�#�� !�� �� � ���� �� ������"��'��� ����� ( ���'�) ��� � ���� �� �� �

����� � ������ �� � *�& ����

������� ����� ?������� �!�� !�� �� ������ ���$ !���� �� %-�,� ��% 1� !��

������$ �������� �� ��� ����� ��� %������: ������ ��� � " ��! ��� ��� ������

!�� �������� ������ ������� �� +0 ��� ������ !�� �������� ������ ���� ������

������� �� +0 ��� ������ !�� � ��� ���������� ���� �������� /�� ������

����E���� ����������� <���� �?7�: �%.�F 4�?�� ��0�F ?�?�0� ��F F�?�0�

0�,�F 9?�� ��� ������ !�� ������� ���� �� ��� ������ �������� �� %. ��� ��+0 ����� � ���������� ����� >�� ���� �� ������ !�� ����� �� �� ������� �������

��!��� ��� � ��� !�� �� ��!��� ���� ������� �� ��������� �������$ ���� ����1��0��� >� ���������� ���� ������ !�� �$�����)�� ��� ���E�� �� ��������$

�������� �$ #��$ � ��� �0%�� 7���� ����� ������� ����� !�� ��1�� ���!���

.,�.. ��� �'�.. ���$ �.��� �� , �� �� ��$ ����� �� ����� �� ��������

�������� ��� ����� �� '��+0 �.,�.. �� �'�.. � �� ����������������H

������ ������������� �� *# ��� "# !�� ������� �� ���� �������� � ������

����� ������ ��.��� !�� ��1�� �� .-�.. �� ��� ��$ �� ������ �� ������

������������� �� �������� 45��� ������� ��� ������� ����� ������������� ��

������� !�� ����$��� ��� ��$ �$ ��1��� ����� ������� �&��� �� .-�.. � �0�..

��� �%�.. �

�#�� !�� %� � ���� �� ���'� ��� � ���� �� �� � ���� �� �� +, ��� -, �

.�/ $� ���� � ���&��! ����&���� �� ��

5��� @AB ����� ?������� �!�� !�� ������ ���$ !����� �� %&�0� ��%, 1� !��

��� � �������� ���� �� %.. ����$ �� ������ ���� �� ������� �� �� ���� ��

��������������� �� ���� �� 75F� ���$ !����� !�� &0�-� 0�+' 1�� >��

��������� !�� ������� �� �� ���� ���� �� ��������� 0H ��� �� �� � " &

��! ��� ���� �� ��������� 0 !�� ���� �� ��� ������� ������� �� �� ���� ����

�� ��������� &� 7���� ����� ������� ����� !�� ��1�� ���$ �.��� �� , �� ��

��$ ����� �������� �.,�.. �� �'�.. � ��� �� �� E��� , �� �������� �'0�+0 ��

��������H .,�.. �� �'�.. �� #��������� ��������� ��� ��� !�� �� ������ �� ���

�������� ������� �� �� ���� ����� I���������� ���� ������ �� ���� � �?7���� ������� !�� ������� ���� �� ��� ������ �������� �� %. ��� �� +0 � >������ ����� ������� !�� ���� �� �������)� �� ������$ ��E�� �� *# ��� "#

���� �� >� ������ �� �� �������� ���� �+0 � !�� � !����� ������ �������� �� �� ��������� ����� �� ����������)�� �!��� *����� �� ���� � ������ ����E��������������� <���� �?7�� !�� ������� ������$ ���� �� ��� ������ �������� �� � ��� �� %. ��� �� �� +0 ����� �� �������� ?����� �!�� !�� ��� �� � " ��! ���������� !�� �?7� ������ ����� ������ �!�� !�� ���� ������ !�� �?7� �!��� ���� � ������ ������ ����� ��� ���� �� �������� �� ����� ��75F�� >���������� ����� !�� �������)�� �$ �� ����$��� �� �� ���� ������ ������������� �� �������� �������� ��������E�� ����$ ����� �45��� ��� ������� 7��������������$��� !�� ������� ����� �������������� ����$��� �� ������� ��� �� ���� �� ���� ����� �����E���� ���������� �� � .�.%H ��� � .�..� �� � " ��! ��� �����������H � � .�.% ������ ����� ��������

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

*������ �������)��� ����� ��� ��!� ����� 0�+

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

0�, *������ �������)��� ����� ��� ��!� �����

����� ��� ����� �� E��� , �� ��������� 7����� ����� ������� ��.��� !�� ��1��

����$ �� .-�.. �� �������� �� ������ ������������� �� �������� �������� 45���

��� �������

0��"�� � ������ �

����� ������� ������������� �� �� ���� �� ��������� � !�� ����$��� �� 0% ��������� ����� �� 87�0&.. 7>�> ��������* ������� ����$�� �8����! 7�����

(���������� @#� 67��� >� ����$ �� � ��������� ���� �� .�0-�0�������

�� ������� ��� ���������� 0 ��� &� ������ ������� ������������� !��

������� �$ � 1�� ����$ �������� %�.�: 7���� ?������ ?��� 7� *����� F@�

67��� (��� ����$ ��� ��������$ ����E������ �� �������� �?A� �� �� ������� ����$

!�� 0�-J ��� ��%J� ����������$�

����� ������������� �� ������� !�� ������� ����� � ���� ������������

��$ �I(�� 1�� ����$ �*����� F@� 67�� ��������� �� ����� ������� �� �� �������$

�0%�� >� ����$ �� � ��!� ��������� ����� �� ��%6����

����� 45�� ������������� !�� ����$��� ����� �� ��)$����� 1�� ����$

�3�1�� 2������ >B� 67�� ��������$ �������� �$ 7���� � ��� �0'�� >� ����$

�� � ��!� ��������� ����� �� %. ��� (��� ����$ ��� ��������$ ����E������ ��

�������� �?A� !�� ��+J ��� %�,J� ����������$�

�� ������ �������������� ������ ������� ��.. ��� !�� ����$�� �� ���������

����� �� ������ �������$ I(� ��������� �$ /���� � ��� ��'�� >� ����������$ ��

�� ����$ !�� �.. ����� ��� �� ���� ����$ ?A !�� ��&J �� .�+ ����� ��� +�+J ��

��� ������ �� �!� ����$�� �� ��������$ ?A !�� ,�.J�

1�� � !!��������� ��� +,� -, ��� ���� ���

����� ������� ��..��� !�� ����$��� �� ��������� �� *# �����!��� �� ����� ��

*�� � ��� �0+�� �� �& ����$�� �� ������ ����������$ !�� .�0 ������ �� ���� ����$

����E����� �� �������� �?A� !�� ���� ��� �.J ���!��� ��� ��� �+�+ ����� ��� ��

��������$ ?A !�� ���&J�

�� "# ����$���� ������ ������� �0.. ��� !�� ����$�� �� ��������� �����!����� ����� �� >���� � ��� �,� ����� �� ������� 4(229 �"# ( �� �� �. ����$��

�� ������ ����������$ !�� .�' ������ �� ���� ����$ ?A!�� ���� ��� �.J ���!���

%�& ��� �'�+ ����� ��� �� ��������$ ?A !�� �,�&J�

�� ������� ����$���� ������ ������� ��.. ��� !�� ����$�� �� ��������� �����! ��� �� ����� �� /��1��� � ��� �0,�� �� ��� ����$�� �� ������ ����$ ����������$

!�� .�% ������ �� ���� ����$ ?A!�� ���� ��� +�+J ��� �� ��������$ ?A!�� �J

�� - ����� ��� %J �� �� ������

2��� �� ��� ������ �

>� ������$ ��E��� �� *# ��� "# !�� �������)�� ����� ��������$ ������

����� ����$��� �����G���� >� *# ������ !�� ����$��� ����� �� ����� �� ?��1�

�0-� ��� �� "# ������ !�� ��E��� �$ �� >6I/@ 6*7�I ����� ����� ��

�������� �� ��������$ �������� �0%�� 7���������� ����$��� !�� ������� �����

�� 7 77 ���1��� �7 77 (���� ?������ (*� 67��� ��� ���� !�� ���1�� ��

���������$ �� ������� ��� �� �����!��� �������� !�� ���=����� �� ���

������������H ��������� �: �������� 45�� ��� "# ��������� �������� �����

���� 0: �������� ���� ������ "# ������������� "# ��������� �������� "#

�������� ������������� *# ��������� ������� ��� ��������� &: �������� "# ����

������������� "# ����� ���������� "# �������� ������������ ��� *# �����

���������� ��� ���� !�� ����$��� ����� � ������� ������� ����$��� �� �������

��4@A��� 2���� ���������� ���!��� ����� !�� ���� ����� �� ���� ��

��������� ����� �����E���� �����������

#��� ��

�#�� !�� �� � ���� �� "��� $ � � �� � ����� �

������ �� � %�& ���� � .�/ $�

����� ������������� �� �������� �������� ��� ������ !�� ���� � .�.%� �� �� ��� ���� !��� �� ������ ������������� ��45�� !�� ������ �� �� ���� ��� ��� ������

����� ������� �&0 � �������� � � .�.%� �� ������ ������ ������� �� ������� ��� ������� �� ��� ��� ���� ����� ��� ��� ��E�����$ �������� � � .�.%� ������ ������ ������������� ���$�� �� ��� ���� ����� ��� ����� 45�� ������������� !���������� � � .�.%� �$ �� &0 ���� �� ��� �� ��� ��� �������� ����� ���>� ������ ������������� �� *# ��� "# !�� ������ ��

��������� !�� �� ������ �� ��������$ �� �� ��� ��� ���� ��������� 0�� (� ��������� *# ������������� !�� ��!� � � .�.'���� "# ������������� !�� ��� � � .�.%� �� �� ���� �����>� ���� ������ ������������ �� ������� !�� ������ �� �� ������ ���� ���� ����� &�� ������� �������� �� ������ �������� ����� �� ������� �� ��� ��� ��� ���� ����� ��� ��� !�� �������E���� ������ �� ���� ���������� �� �� �������� �� *# � "#����� 0 ��� &��

�#�� !�� �� � ���� �� ������ ��� � ���� �� �� �

���� �� �� +,� -, ��� ���� ��� � .�/ $� �������� *�

����� ������������� �� ������� ������� ��� ������� !�� ��!���� � .�.%� �� ������ ��� ������ ������ ���� 0� ��� �, ������ ������������ �� ������� !����� �� +0 � ������� ��� �������������������� !�� �����E�����$ ��!� � � .�.%� ���$ �� �������� �!�� ������� !�� ������ ����� ��� >� ������ �������� ����� �� 45�� !�� �������� � � .�.�� �$ ������� �� ��� ������������� �0�� �, ��� +0 � �������� �� �������� ������� � ������������ ��� ����� ������������� �� *#� �� *# ��������� ������� ��� ��

������� ���� !�� ������ �� �� ������ ��� ������ ���� ������ !�� �� �����E���� ������ �� ������ �������� �� ���� ��� ����� ����� %�� #�!���� �� ���� *# ����� ��������� !����� � � .�.%� �� �� ������ ������ ������ �!��� ��� ��� ���� ������ ������ ������ �!�� ������� �� ������ �!�� ����� %��F��� ������ "# ������������� !�� ��� � � .�.%� �� �������� ������ ������ �!��� ��� ������ �������� ������)�� "#������������� �� �� �G�������� �� ���� �� �� ������ ������� ��� " ��! ��� ������� ����� % ��� '�� >�� !�� �� �����E���� �������� ������� � ������ �������� �� ���� "# ����� ������������������� ������� � �������� ������������ ����� �� +0 ������� ������� ����� % ��� '�� >� ������ ������������� �� �������!�� ��� � � .�.%� �� .-�.. �� �� ������ ������ �!�� �����, ��� +0 �� �������� !���� ��� ������ !�� ��� ���� �� �������� ������ ������ �!�� ����� +��

�#�� !�� %� � ���� �� ���'� ��� � ���� �� �� �

���� �� �� +, ��� -, � .�/ $� ��"3��� ���!��� � �� ����&���� �� ��

����� ������������� �� ������� ��� ������ !�� ��!� � � .�.���� �� ���� ���� ��� �� �� ��&� " ��! ��� ����� ��� �� ������������������� �� ������� ��� 45�� !�� ��� �����E�����$ ��� ����� ���!��� �� ��� ����� ����� ,�� ���� ���������

���� %� >� ������ �� �� �������� ���� �+0 � !�� � !����� ������ ������ �������� �� �� ������$ ��E�� �� ��!� ����� �"#� ����� ������� ��� �������)�������� �*#� ���� �������� ��� ���� �� �������� �� �� ���� �� 75F�� ?����� �!�� !�� ��� �� � " ��! ��� ������� !�� ������ ����E���� ����������� <�����?7�� ������ ����� ������ �!�� !�� ���� ������� !�� �?7� �!��� ���� � ������ ������ ����� >� ������$ ��E�� �� "# !�� �������)�� �$ �� ���������$��� ����� 6*7�I� !�� ����$��� �� ���� ������ ������������ �F����� �� ���� ����� ��������� ������ �� ���� ��������� ������� �( (� ��� ������ �������� ������������ �/��������� >� ������$ ��E�� �� *#!�� ����$��� �$ �� �������)����� �� �� ���� ������ ������������ �F����� �� ���� �������������� ������ �� ���� ��������� ������� �( (� ��� �� ���� ������� ���� � � ����� ������ ����$��� !�� ������� ����� ������� ������� ����$��� ��������� ��� �� ���� �� ��������� ���� ����� �����E���� ����������: �� � .�.% �� � " ��! ��� ����� ��������

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

*������ �������)��� ����� ��� ��!� ����� 0�-

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Control

0

5

10

15

20

25Fasted + Vehicle

0

2

4

6

8

10

12

14

Fasted + Leptin

0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Pre-infusion/fast 72-h infusion/fasting

Pla

sma

GH

con

cent

ratio

n (n

g/m

l)

Hour of sampling

���� '� I������������ ������$ ��E��� �� ������ ��!� ����� �"#� ������������� �� ���� ���� ��� �� �� � " ��! ���� ��� ������� !�� ������ �?������������� �� +0 ��� ������ !�� ������ �������� ������� � ������ �� +0 ��� ������ !�� ���� ������ �� �� ������� ����� �������� �������� 7���� ����� �������!�� ��1�� ���$ �.��� �� �� ��$ ����� ������� � � ����� ��� ����� ���� +0 �� ������� ��� �������� �+0 ����������� ���������� 4��� ��� �� ���� �������� ���������� �� "# ������ ������� ��� ��� ������ !�� �������� �$ �� ������ �������� ������ ��������

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

0%. *������ �������)��� ����� ��� ��!� �����

�������� � � .�.�� �� ���� ������������ �� "#� "# �������������� ��� �� "# �������� ������������� ��� ��� ��� ��� ��E�����$ ��<����� �� "# ��������� ������� ����� -�� >�� !���� �����E���� ������ �� ���� ��������� �� ��$ �� �� ��������������� �� *# ����� -�� >�� !�� �� �����E���� ������ �� ������������ �������� �� ������ ������������� �� �������� ��������45�� � ������ ����� ,�� �� !�� ��� ��$ �����E���� ������ �������� �� �� ������$ ��E�� �� *# � "# ����� -��

��� ������

I�������� �� ���$ !���� ���������� �� �� � �������� ��������������� ������ ������������� �� ������� ������� ��� ����������� ��� ������ 45�� �������������� ����� ������������� �������� �� ���������$ �������� !�� ��������� ���$ ���� ������� �&.� ��� ���� ��.� �'�� #$�������������� ��� $�� ��$������ ���� !�� ����������� �� ������$ ��� ������ �� ������� ���� �&��� ������ �� ��� ���� �������� ��� ������� �� ���� ����� ��������� �������� ������� ��� �������� !�� ������ �� ���� �� ����$ �������� ����� 45��������������� ������� ����� ���� ��������� ��� ������� !������$ ����1� ����� ����������� �&0� &&�� (� �� ������ ����$���� !�� �� �����E���� ������ �� ��������$ �� ������ 45���������������� ������ �� ������������� !�� ������$ ����� �� ��� �!��� >��� �� �� ��� ��� ���� ����� � ����� ����������� ������ ���������� ������� ������� ��� �������� ���������� ����� � �� ����������� ����� �� ���������� �� ������ ��*# ��� "# ���������7�� ��� ������� �&0 � ������ ������ ������� ��� �������

������������� �� ��� ��� ���� �!��H ������ ������������� �������� !�� ������ �� ���� ��� ��� �� ���� ����� >�� !������������� ������� �� ���� �!�� �� ��$ ��! ��� ����� ��.��2���� ��� ��� ��� ����� ����� � ������� �� ������ ������

������� �� �������� ������� ��� ������� �� �� ������� �� ������45�� �������������� ���� �� ��$ ����� �� �� �������� �� *# �"#� ���������� ��� ���� ������ �� ��� �������� ������������� ������������ ��������� >�� �� ���������� !�� ������������ �� ��������� ����� ������ �� 0, �&�� ��� ���� �������� 0� �&%�� ��� �� !�� ����������� ��� ��!��� ������������ ������������� ��� ��� ����� �� ��������� �� �� �������� ��*#� �7# � "#� /$ �������� *# ����� ��G����$ !�� ����������� � �, ���� �� �� ������� ����� �� ����������� !�� ��������� �� ������ ������ ������ �&'�� >�� ��������� ��� � ����������� ���� ���� ����� �� ������$ ��E�� �� *#� ��� ���� ������������ !�� ����������� �� ���� �!���(� �� ���� ��������� ��� ������ �� �� ������� �������������

!���� �� ���� ��$ ������ *# �������� ��-�� ��� ������ ������������� ������ �$ ������� !���� ��� ����� �� ��! *# �������� ������ ����� �� �� ��� ����� *# ������ !�� ����� �� ������� ����.� ��� ������ ������� ������������� !����� �� ��$����� ������������� ���H ��� �� ������ !�� ��� ����� ����� ��������� ���� !�� ��� ��� �� �� �� ��$ ������� "������ ���������� ������ ��!� �� ��������� �� ���������� ����� ������� �������������� �� "�I#�*# ��� 0� &+����� #�!���� �� ����� ���� ���� ���� �� ��� ���� ����� �� &0 ���� !�� ������$ �����E ����� �� �� �� �����G������ (� �������� �� �� ������ �� �������������� ������� ��� ������ �������������� �� &0 ���� �������������� 45�� ������������� �� ��� ��� ��� ���� �!��� ������������� ��� ��!� ��� �������� �� ��� ����$ ����� ����� "#�������� ���� ��� *# ��������� �� ���� ��0�� (� ����� �� ���� �������� �������� ��� �������� 45�� ������������� ����� � &0 ���� !�� ��� ���������� !�� ��$ ����� �� "# �������� �� ������� � ���� ����� 5��� ���� �� ������ ������������� �� �������������� ��� ������� �� �� ��� ���� !�� ��!��� �$ �� &0 ����������� !�� ����� ��� ��� ���� �� �� ���� ����� >��� ��� ��� ������� ��$ ��� ����� ������� ������������� �� ����

0

10

20

30

40

50

am12.00

pm am12.00

pm am12.00

pm am12.00

pm

Day 1 (0 h) Day 2 (24 h) Day 3 (48 h) Day 4 (72 h)

Pla

sma

leve

ls o

f cor

tisol

(ng

/ml)

bb

Time of day (h)

���� +� >� ������ �� �� �������� ���� �+0 � !�� � !����� ������ �������� �� �� ���� ������������ �� ������� �� �� ����������)�� �!�� 7����� ����� �������!�� ��1�� ��� ����� � ��$ �� .-�.. � �0�.. ��� �%�.. �� �� ��$ ����� �� ���� ���$ �� . � ��� �� ��� ��$ �� �� & ��$ ���� ���$ 0� 0� H ��$ &� �, H ��$ �H+0 �� ��� ���� �� �������� �� ���� ��75F�� /�� ������ ��� ������ ������ !�� ������� ������$ ���� �� ��� ������ �������� �� � ��� �� %. ���� ?������!�� !�� ��� �� � " ��! ��� ������� ������ ����E���� ����������� <���� �?7�� �������� ������� �������� ������ �!�� !�� ���� ������ !�� �?7� ����������� ������� � ������ ������� ���������� ����$��� !�� ������� �$ ������� ������� ����$��� �� ������� ��� �� ���� �� ���� ����� �����E���� ������������ � .�.% �� � " ��! ��� ����� ��������

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

*������ �������)��� ����� ��� ��!� ����� 0%�

������ ����! � ������� ����� ��� ���� �� ���������� !�� ���������� ��������?������ ������������� !�� ������ �$ �� ���� �&0 � �� ���

�� ��� ��� �� ���� ���� �� ��������� �� 3$ ��� � �������������� �� ���E���� �� �������� ��� �� ������� ������ ����� ������� ��� ����� �� ���� ������ ��� ���������� �� ��� ������������� ����� ��� ������ @� �� ��� ���� �� �� ����������� �� ����������� �������� �� ������� ��� ������� ������ ��� ������� �� ��� ������� �� ������� ��������� � ������ ����� !���������� �� �������� �������� ������ ���� ����� ������ �������� ������� ������ ��������� ������ �� ���� !�� ���������� �� ���� ��� !�� ������ ��� ����� ������ �&�� >������� �� !�� ������ ������ ����� ��������� ������ ��� ������ ��$��������� �������$ ������ ���� ����� ������� �� ������������ ����!�5�������� 0 ������������ !��� ������ !���� ��������� ��

������� �� ������� �� �� �������� �� *#� "# ��� �������� ��������� +0 ��� �� � ���������� �������� �� ������� ������� ��� �������������������� ��� �������� 45�� ������������� �&� �.� �,�� ����� "# ������������� !�� �������� ��� ��� ������ !���������� �$ ������ ��������� >�� �� �� ������� �� �� ������ ������

�� ������ �� ��������$ ���� �������� @AB �!�� � �!� ����� ����,� ��� �� ��������� @AB �!�� ���� >��� �� � ����� �� ���� �� ���������� �+0 �� �� ��������� ���������� �� "# �������� �������$ �������� �� ��� �� ���� ��� ���� �������� ������� ��!�� ������ ���������� "# �������� ��� �,�� >� ������ ����������� ��� ������ ���� �������$ �� ����� "# �������� ������������� ����� !�� �������� !�� ������ �� ���� �&�� ������������� ������ �������� ����� ��� ������� ������ ���������@� ���� �� �� ��������� !�� �� $������� ��� �� ������� ������� ������� �� "# �������� ��$ �� ��� �� ������ �������������������� #�!���� �� �� �������� �� ���� ��� �� ������������ �� ������� ��� ������� !�� ��!� �� �� ������� ������ ������ ���� ��� �� �� ������� ������ ������ ����� @��� ��������� �� �� ������� �� �� ���� ��� �������� ������ ������ ��!�� ������� ������ ������� ������� ��� �� ������������� ��������� !�� ��� ���� �������� �$ ������� ������������� �������� �&�� F����� � ��� ��,� ��� ��� E�� ��$ ��������� �������� ������� ������������� �� ���� �������� @AB �!��������� !�� ���� ������ � ������� >��� �������� �� "#�������� �$ ������ ��$ ������� ������ ������� ����� ������������� �� �������

���� ,� >� ������ �� ������������������ �������� �� ������ �� �� ��������� ����� �� ���� ���=����� �� ��� ��� ���� ��������� ��������� *����� �� ���� ������� ����E���� ����������� <���� �?7�� !�� ������� ���� �� ��� �������� �� +0 � ?����� ���� !�� ��� �� � " ��! ��� ������� �?7� ������ ����� �������� !�� ���� ������ !�� �?7� �!��� ���� � ������ ������ ����� ��� ���� �� �������� �� ���� �� 75F�� ����$��� !�� ������� ����� ������������������$��� �� ������� ��� �� ���� �� ���� ����� �����E���� ���������� ��� � .�.� �� � " ��! ��� ����� ������

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

0%0 *������ �������)��� ����� ��� ��!� �����

>� +0 ���� ��� �� �� ������� �� *# ����� ���������� ��������� �$ ���� �� �������� ���� �������� ���� ���� ��&��@� �� ��� ���� �� ����� �� �������� �� ��� �������� ���������� ������ �������� ���� ����� !�� ������� �����E

�����$ ������ *# ����� ��G����$ �� !��� �� ��������� �������������� �&�� (� �� ������� ��� �� ���1����� �� �������������1� �� ������ �� ������� �� � ����� ������ ��� ��� ���� ���� ��������� �������� ������ ����� >�� �� � ������ ������

���� -� >� ������ �� ������ ������ �� �� ������$ ��E��� �� �������)��� ����� �*#� ��� ��!� ����� �"#� �� ���� ���=����� �� ��� ��� ���� ������������������ >� ������$ ��E�� �� "# ����� ������� !�� �������)�� ����� �� 6*7�I ������ !�� ������� �� �� ������ �� �����!��� ��������: ���������� ������������ �F����� ���� ����� ��������� ������ ���� ��������� ������� �( (� ��� �� ���� �������� ������������ �/��������� >� ������$ ��E�� ��*#!�� �������� �$ �������)��� �� ���� ������ ������������ �F����� ���� ����� ��������� ������ ���� ��������� ������� �( (� ��� �� ���� ������� ����� � ����� ������ ?����� ���� !�� ��� �� � " ��! ��� ������ !�� ���E���� ����������� <��� ��?7�� ������ ����� ���� ���� !�� ���� ������ !�� �?7��!��� ���� � ������ ������ ����� ��� ������ �� �������� �� ���� �� 75F�� ����$��� !�� ������� �$ ������� ������� ����$��� �� ������� ��� �� ���� �� ���� ����� �����E���� ���������� ��� � .�.� �� � " ��! ��� ����� ������

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

*������ �������)��� ����� ��� ��!� ����� 0%&

���������� ���!��� *# ����� ��������� ��� ����� ��G����$����� ������ ���� *# ��������� ������� !�� ����� �� �������� ���� ��� �� ��������� � ������ ������ ������ ����� ��������� ��� ��� ������ ����������� �����E������ 4������������������ ����� ��������� �� ���������� !�� � ���� ��!����������� ����� ��G����$� >� ������ �� ����� ��������� !��������� ��!��� ����� �$ ������ �������� ��� ��� �� ����������!�� �� ���� �� 4������� � ��� �&� ��� �� ������� ���� ��!������ ������ ��� ����� ��������� *# �������� �� ���� ������������ ���� ?��������� ��������� ������ ���� �� �������� ���� ��������� � ������� �� �� ����� +0 � ��!�� ������ ��������������!�� �� C���������D �$ �� ������� "�I# �$���� ��� ���������� ������ *# �������� ��� �� �������$� >� ������ �� ������������ C�����D ��� �� ������� �$ ������� �&� � ������������������� �� �������(� ��������� 0� ������ ������ �� ������� !�� �������� ��

.-�.. �� �� ������ ���� ��� �, ��� +0 �� �������� ��� ��������� !�� �������� �$ ������ �������� ���������� !�� ���������� �� ���� �&�� 3���1� � ��� ��%� ��� ��!� ��� ���������������� �� # � ���� �� ����� ���$ !�� ������ ������� �� ����!�� ��� ������� ����� >�� ����� �� G������� �� �� �! ��������$ �������� � C��$���������D ������� >� ������ ������ ������� �� � ������ �� ����������� �������� ����� ����� ��'��+�� ������� ������ �� �� ���� ��� �� ������ �� ������ �� �� # ����� ��������� �� �� $��������� ���������� ��������� �� ,����� ���������� �� ������ ������

*# ������ ��� �������� ������ "# ������� !���� ��������� �������� ���������� &� ��� ��� ��������� *# ��������� >��!�� ������� ������ ��������� �� ���$ !���� ����� ������� ����� ����������� ��� ��������� ������ �� �� ������ ��� ���������� �� �������� ������� ��� ������� >�� ������ �� ������� ��������� ��������� �� ��� ���� ������ ��������$� ��� �� ���������� E����� ������� �� ������� � ����� !�� "# ��� ���������� �� ������ ��� *# ������������� �� ���� ���� ���� ������ �� ������ ������������� �� �������� ������� ��������� ��� � ����� �� ������ �� �����$ ��� ���� �� ������ *#������������� ��������� �� ������ �������� "# ������ �� ������

!�� ������ ������ ������� $�� ������ �������� �� ������ ��� �������� "# ������������� �� ������ (� ��� ���������������� ������ ������ ������������� �� ��� ������� �� �������� ���� �� "# ��������� ���� ��� �������� ������������� �'������� � ������ ������� �� "# �������� ������������� ��� ������ �������� �� ���� �� ������ "# ���������0'�� ������ �$ ���� ���������� >��� ������� �� ���� ���� ���� �� �� �������� ����� ������� !��� ������ ������� "#���������3���� $��������� ������������ ����� ��� �������$ ������

���� ������� ������ ������� ��,� �-�� ��� ������ ��� ���������$������� �� �������� �� "# ��� ����� ���������� ��+�� ������� �$ !�� ������ �������� "# �� ����� ������� ?������������� �� ������ ���� ��� ����� "# �������� �� ���� ��� ���� ����� ������ �� ���� ����� *# ��������� (� ����� ������������ �������� ���������� "# �������� �� ��� ������ ������ �$ ������ �������� ���� >�� ������� ����� ���������� ��� ��������� ��� ��� ������ ���� �� ���������� �� �� ������ �� "#�������� ��� �� ������� �$ ����� ���� ���������� � ��1��$����� �� ����� ������� ������ ������������� �� �������� !�������� ���$ !���� �� ����� �%.� ��� ����� ���������� "#�������� �%���

>��� ������� ���� ������ �� �� ������ ������ �� *#� "#��� ������� �� ������� �� ���� ��� � ��� ��� ���������� �������� ������ ������ ��� ��� ��������� ������� �� !��� �� ������������������ �$ ������ ��������� F���������� �� � ���� � ������������ �� � �������� ����� �,������ � �� �������� �����+0 � ��� ������ *# ��� "# ��������� ��� ���$ ������ "#������������� ������ �� �� ���� !�� ��� ��� ��������������>�� �� �� ����� �� ������ �� ������ ������ ������������� �� ���������������� ������ ������ �������� ��� ����� ������������������� �� *#� "# ��� ������� ��!��� ����� �� ���������� �� +0 � ���� ��� �������� ���� ������ ���$ ��������� ���� ���� �� ����� ����� �� ������������ �������� �� �� ������������� !�� �������������������� ������ �� �������

" $��� ��������

3� ���1 F /��� 2������ ��� F� 9��� /����� �� ������ ���� F� K����

?���!�1� ��� F� F������ (����� �� ���������� !�� ��������������$� ���

���� #��$D� (�������� �� F������ I����� �� ������� ������ �� /���#�

#����� ������� !�� �������� �$ �� 4������� #����� ��� ������$ ����

�� 4(2292� >�� !�1 !�� �������� �$ �� 4������� #���� ��� F������

I����� ?������ �� ���������

�������� , K����$ 0..�

#������ ��

� /���� >F� *$�� 5�� ��� #� 5������ �� ������� �� �������)��� ������$������ �� �� ���� ��� � ��� ����� ���� ��������

0 ?����� K*� 3���)�� >5� F�?���� ?� #������ 2*� 9�$� 3#�7��!��� �� ��������� �������)��� ����� �������� �� ��� ���� ���$ ���� ��� �� �������� � �� � ������ ��� 0��" ����� ��� ����

& 4������� 7� L��� 8� 9����� 2#� ����� 2*� K���� ?�� *����� ����������������� �������)��� ����� ��� ��!� ����� �������� �� �� ����������� ������ ����� ���� � ������

� #��$ /�� "����� K3� >�����1 �K� 2����� �I� ?��1� (K� (����� ������������ �������� �� ������ �������� �� �������� �� ����������������!����� ��������� ���� ����1� �� ���� ��� ���� �������� �������� �������� ��!� ����� ���������� �� ���$!����� � ������ �������� ���� �����

% >��������� "7� I����� @� /�)��� � 5������ �� �������� �������������� �� �� �������� ��!� ����� $�� ��� ������������������������� ������ ������ �� �� ��� ������ ������ ����� ��� �������

' #� 98� A������ K2� K����� F*� ��������� I� 5���� 37� ������ 9"�>��� F@� ������� ������� ��!� ����� �������� ��� �����E���� ������� $��� �� ��!� ����� �������� �� ���� � �� � 4�'������� ��� � ������

+ ����� 2*� @���� 2#� 5����� �� �������� �������� �� �����$ ���� ����: ������� �� ����� �������)��� ����� �*#� ����������� ���������$ �� �� *# ���� �$����� ������ ������ ����� ����������

, >���� "/� F��� K5� 9����� >� I�� �� ?������ K>� ?��1� (K� 5������� �������� ������� �� �� ������������� �� ��!� ����� �"#��������������� ��� �������� � I*� �� ������� ��� �� �� ������� ���������� ���������� ���� �� "#� ����������� ��������� ��� I* ���� �������$ ������ �� ����� ����������)�� �!��� ������ ������ �������� � ��� ��

- (D����� #� M���� 5#� 3��� I(� 5������ /"� ����� 2*� ������ ������� $�������������� �� �� ��!� �������� ������ ����� 5 ��1���� ���� �� �����

�. #��$ /�� >�����1 �K� 2����� �I� I�� �� /���� 2� F���� "/�?��1� (K� *��� ��� ���������� �� ��������$ ������ �� ��������� ��������� ������������ ����� ��� ��1������ ��� ��� ������������ ����� �� �� $��������� �� ����������)�� �!��� ������ ������ ��������� ��� �����

�� ?�� 5� 7����� I� ?�������� IA� ?�������� ��� 2�����) ?� I����������� �� ���� ��!� ����� �������� �$ ������� ������ ������ ����� ����������� �

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

0%� *������ �������)��� ����� ��� ��!� �����

�0 ����I7� ���1��� 2�F���)��� ?� M�2� *�!��� /�F����� ���� 5����� K7� I��� �� ������ �� �� ������������ ������� �� �������� ������� � ��� ��������

�& ���� 2� ?�������� FK� �� 98� 7���� #"� ?������ 29� 7����� I��>� ���������$ ������ �� ������ �� �� ������������ ���������� ������ �� ���1�$� ������ ������ ����� ���� ��� ��

�� *��� ����� K� #��1�� KI� ?���� >*� A������ K2� #��$ 2F� 4����I*� 4����������� �����G������ �� ������� �� ����� ���� ����G���:������� �� ���������� ���� ����G�� ������ ��������� �������� &������ ����� ��� �� �����

�% 2$� ?K� 7������ KF�F����� I*� 9����� 2#� *����� ������ �I4� ���������� �� �!� ������ �������$ ��� ������� ������� ��� �� ������������$�������� �� $��������� ������ �� !��� ��� ��� ���� �������� �!���6�!�� 7� ! ������ ��� ����� ��� ��������

�' /���� 2� >����� I*� ?���� *F� /���1��$ F�� A���� 5� F����"/� *���� �� �������� ������� ������ ������������� �� ������ �������������� <��� �� ����� � ������ ��� ����� ���� ��� ��

�+ I� 7� ?��1� (K� B� I� "����� K3� *������� 9� ?�� ?� >� �� ���������� �� ������ �� ����� ��� ��!� ����� �������� ����� ����� ����� ��!� ����� �������� ��� �� ����� �������$ ������ ����&���� ������ ����� ��� �� �

�, F����� ?2� 2����� K�� #������ /K� 2=���� K� I��� 4� "���� ��9����� 2#� ?����� �������� �� ������ ���� !��� ��� ��� ������������!� ������ ������� �� ���� ����1� ��� ���� ������������� �� ��!������ ��� �������)��� ������ � ������ ��� ����� ���� �����

�- F���� 23� /���� 2� F���� "/� >� ��� �� ���������� ������� �� �������� �� �������� �� ����������� �������� �� ����� ���� ����� ������� ��� ����� ���� ������

0. K���� ?�� #������ /3� 2����� ����� I� (������ $����$����� �����!� ����� �������� �� ����: � ������ ��������� 7! � 8 �� ������� ��� ���������

0� /�1� "��� F*� 7���� ?K� /�����1 K#� ?��1� (K� >� ��� �� ������� ���� 8 �4 8� �� �� ������ �� *# �������� �� �� �!� !�� ������ ��������� 4 8 ������ ����$�� ��� �� ���� �� ������ �� �� $����������� ������ ��� ����� ���� � ������

00 K������ /?� /��$ ������ ��� ��� ��� �� ����������� 9��!�� � 7�� ������ �� �� ������

0& ?��1� (K� 7���� ?K� I�� �� ������ 7� /�1� "��� F*� 7������������� �� �� ��������� �� ����������� 8 ��� �� ����������������I4� �� �� ������ ������� �� �� ����������)�� �!�: ���������� ���� �������� �������� ��� ������� �$����� � �������� ��� ����� ������������

0� ?��1� (K� >�����1�K� >��� �(� 2������ /3� "����� K3� 7��� ��� ����� ���� �� �� ���� ������� �� ��� ��� ������ �� �� ������� ������� ���������$ ����������� ������ �� ����� ������ ������ ����� ��� ����������

0% #��$ /�� "����� K3� �������� 37� >�����1 �K� ?���$ /K� 2������� I�� �� F������ �� ?��1� (K� ?����� ������������� �� ������ ������������)�� �!�� ������� ���� ����1� !����� ��������� �� ���������� ������ ��� �� �������$ �����: �������� �� � ������������ ��������� �� �������� ��� ������������ ��������� ������ ������ �������� ����������

0' 7���� 7K� 2����� �I� /����� 25� 7���������� �� ��������� ��!�:������ �� ������� �� ��������� ��� �������� 7! � 8 �� �� ����� �������������

0+ *�� A3� ?������ (�� �� 9���� 2F� ������$ K9� #����� /� 9��� 5K�I��������� �� ����������� �������� �� ��� ��� ��� �� ������������$� (� ����� *#� �7# ��� ����������� ������� � 1���� :�� ���� � ��� �� �

0, /��1��� �2� F�F����� (?� #����� I� >���� "2� 5����� �� ������������ ����� <�! �� ����� ��� ������� �������� � 6' 8 �� �� ��� � ��������

0- ?��1� (K� A������ ������� �� ����������� �������� ����� ������������� �� ������� ������� �������)��� ����� ���� �� ����������)���!��� ������ ������ ���� ���� � ��� ��

&. ?�������� IA� 7��� F9� #����� F*� 9��������� �� 7������ >3�4$�� FI� @�������� K � F��� ??� F�9�� *K� /��� >*� 7���������������� ������ ������������� �� ����� !���� ��� ����������� ���� � 0� ��� � ���� ��������

&� F�?��� K � /����� 54� /������ 2#� 2$����� ��� ������ ����� ������� �����$ ������$ �� ����� ���� ����1��� �����������$ ��� ��������� ���� ������� ������������ � ��� ����� �� � �����

&0 2����� �I� /��� �3� >��� >5� I�������� ���!��� ������ ��� ���� �E�� ����$ ���� ���������� ��� ���$ ������ ������)����� ����� ����������������� �� ������ 5� � ��� ����� �� � �

&& 2����� �I� /��� �3� >��� >5� 4�� �����E�� ����$ ���� ��� ��$����1������� ��� ����$ ���� � �����E������ �� ����� ����� ���$ ���������� 5� ���� ����� ��� �����

&� /�� ?I� /���� K/� 9������ II� I������1 "/� 7��� ������ ��� ����������� �������)��� ����� ��� ��!� ����� �������� ��������� ��� ��������� ���� ��������� �� �� �������� ����� 6�!�� 7� !������ ��� ����� � �� �

&% F�F���� ?K� ���)����� / � 5������ �� � ������ ��$ �� ���� ��������� �������� �� ���� ������� ������������� ��������� �������������� �� ������� $���� ����� 6�!�� 7� ! ������ ��� ����� ��� ����

&' ��������� F� "���� FI� 3������� 73� 7���1� I*� 4�)����1� 75�F����� ?2� 9����� 2#� 3������� "*� *����� ���� ���������� ���� ������ ������� ��� �������)��� ����� ����������$ �� ������$ ��������� ����� ��� ������� �� ��������� �����: ����������� �� ����������������� ��� ������� ��1� ��!� ����� ( ���� 5 �� 1���� ����� ���������

&+ ����� 2*� 5����� �K� F��1� ��� A������� *�� /�����) 2?� 3��� I(�7����� KF� ����� 25� F�������� ��������� ���!��� ��!� ��� ��� �������� (� 4��������� ���������� �� ������������ ��������� ��� ��!������ �������� �� �� ��!� ������� ������ ����� ������ ����������� ��� �����

&, 4������� 7� >������ I?� ����� 2*� �������� �� ��������������������� �� ������������ �������� �$ ������ ���� ��� ����� ����G����$ �������)��� ����� ������ �� ���� � �������� ��� �������� ������

&- 4������� 7� >��1���� #� F����� 9� /�����) 2?� ����� 2*� F����9� ����������� ����������� ������ �������� ���������� ������ ���� �� ��������� �������)��� ����� ��������� ������ ������ ��� � ��������� �

�. @1�� 7� >���1� >� 4������� 7� /�����) 2?� >��1���� #� F���� 9������ 2*� ?������ ��� ��� �������� ������� ������� ���� ����� ������� ���������� ���������� �� ��������� �������)��� � ���� �������� �� �� ����� ������ ������ ����� ���� ������

�� >��1��� 7� >��1����#� ����� 2*�F���� 9(� 5����� �� ����������� �������� ����� ���������� �� �������� ��������� ���������� ��� ������� �� �������)��� ����� �������� �� ������ ���� � ������&�� ��� ����� ��� ��������

�0 5�������FK� 7����� 99� "���F�� /����� K�� ��� ����$ ����� ���������!� ������ ��� ��� �������)��� ������ �������� �� ����� ����&�� ������ ����� ��� ������

�& ���� ?*� ������$ �� 9$�� ?5� 8���� � F��� K"� 5����� �� ��������� ��������� �� ��������� �������)��� ����� �������� ��� $���� ����� ����������� 8 ���� ��������� �� ������� ���� ����� � ����&�� ��� ����� ��� �����

�� ?��1� (K� ?������ K>� ������$ K9� /���� 9K� 2������ /3� 5�������� ������ �������)��� ����� ��� �������� ����������� ����� ����$��� �� ��G����$ ��� ��������� �� ����������� �������� ����������� �� ����������)�� �!�� !�� $�������� �������$ ���������������������� ������ ���� ��� �������

�% 3���1� 2� 4��)���� K� 7����� �� /���1 7� ���� ���������� ��� ������ ����� ������� ��� �� ��������� ������ !�� � ������������������$ �� ���������� �� �������� �� ����� �������� 8 �� �� 5 �'����� ��� ������

�' #�1������ F*� /�!� #� "����� 4� 71��� I?� F����� /� *����������� ��������������$ �� ��������$ ��E��� ����� ������ �� ��$���������� � ����� ����� ��� ��������

�+ (G��� K� ������ 7� F��1��� >� "��)���� 5� 7�1��� >� F����� /�?��1� (K� (���������������� �������)����� �� ������)����� �� ���� ��� ������ ������ �@/ I�� �� ������������$ ��E��� ����� �� ������� $���������� 5�� � 1� ����� �� ��� �

�, (G��� K� ������ 7� ?�������� IA� ?��1� (K� *�����)����� �� ������������ ��1� ��������������$ �� �� ������������ ������������ �������������� �� �� ����� ������ �������$� ������ ������ ����� ��������������

�- (G��� K� ������ 7� F��1��� >� ?��1� (K� *�����)����� �� ���� ��������� ������ �� �� ������������ ���������� ������ �� �� ����$���������� 5�� � 1� ����� ���� �� �

%. @��� /� ?���) 6� ������ 5� 3�!��� I� ���!��)�$ ?� I���� I*�#����� F*� *���� � ����� F� >���� F� 3���� ���� ���������������� ������ ����� ������������� �� �������� !�� ������� ���������� � ������ ��� ����� ���� �� ��

%� 9�=��� F� #����� #� 2��� 8� 4�1�)��� F� F����� #� 9����!� 9�"���� �� � ��!� ����� �������� ��$����� ������� ��� ����������� ����� �� � � ��

� 0..� /���1!��� �������� *��� ������� �� �������� ������� ��� 0���0%%

*������ �������)��� ����� ��� ��!� ����� 0%%