BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam melakukan diagnosa Mikrobiologi

sterilisasi sangat diutamakan baik alat maupun

medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat

atau bahan bebas dari mikroba baik dalam bentuk

vegetative maupun spora. Untuk itu sebagai pemula

dalam Mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik

sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman

(Dwidjoseputro, 1994).

Secara umum sterilisasi merupakan proses

pemusnahan kehidupan khususnya mikroba dalam suatu

wadah ataupun peralatan laboratorium. Sterilisasi

dalam Mikrobiologi adalah suatu proses untuk

mematikan semua mikroorgansime yang terdapat pada

atau didalam suatu benda. Ada tiga cara utama yang

umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan

panas, penggunaan bahan kimia, dan penyaringan

(filtrasi). Apabila panas digunakan bersama-sama dengan

uap air maka disebut sterilisasi basah, bila tanpa

kelembaban maka disebut sterilisasi kering

(Dwidjoseputro, 1994).

Untuk membutuhkan dan mengembangbiakkan mikroba

diperlukan suatu substrat yang disebut medium.

Sedangkan medium itu sendiri sebelum digunakaan

harus dalam keadaan steril artinya tidak ditumbuhi

oleh mikroba lain yang tidak diharapkan agar mikroba

dapat tumbuh dan berkembangbiak dengan baik di dalam

medium, maka diperlukan syarat tertentu yang

diantaranya bahwa didalam medium harus terkandung

semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan

dan perkembangan mikroba kemudian susunan

makanannya, tekanan osmosis, derajat, keasaman (pH),

dan temperatur (Hadietomo, 1990).  

Dalam bidang penelitian mikroorganisme ini,

tentunya menggunakan teknik atau cara-cara khusus

untuk mempelajarinya dan bekerja pada skala

laboratorium untuk meneliti mikroorganisme ini baik

sifat dan karakteristiknya, tentu diperlukan pula

tentang bagamana caranya menumbuhkan suatu mikroba

ke dalam suatu media, karena kita tahu bahwa

beragamnya persyaratan tumbuh mikroba, maka harus

dimengerti jenis-jenis nutrient yang disyaratkan oleh

mikroba dan juga macam lingkungan fisik yang

menyediakan kondisi yang optimum bagi

pertumbuhannya. Mikroba amat beragam, baik dalam

persyaratan nutrient maupun fisiknya. Jadi, media yang

digunakan harus mengandung komponen-komponen yang

dibutuhkan oleh mikroba tersebut (Hadietomo, 1990).

Untuk mengenal lebih jauh tentang penyiapan

medium untuk suatu mikroba, maka diadakanlah

praktikum ini, dimana dalam praktikum ini praktikan

diwajibkan mampu mengetahui cara-caranya mulai dari

awal sampai akhir melalui bimbingan dari kakak

asisten.

1.2 Tujuan

Adapun tujuan yang ingin dicapai oleh praktikan

dalam praktikum kali ini yaitu:

1. Mengetahui cara pembuatan media dan membedakan

berbagai media pertumbuhan mikroba.

2. Mengetahui cara dan macam-macam sterilisasi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Medium

Medium adalah substansi yang terdiri atas

campuran zat-zat makanan (nutrien) yang dipergunakan

untuk pemeliharaan dan pertumbuhan mikroorganisme.

Mikroorganisme juga merupakan mahluk hidup, untuk

memeliharanya dibutuhkan medium yang harus

mengandung semua zat yang diperlukan untuk

pertumbuhannya, yaitu antara lain senyawa-senyawa

organik (protein, karbohidrat, lemak, mineral, dan

vitamin). Medium digunakan untuk melihat gerakan

dari suatu gerakan mikroorganisme apakah bersifat

motil atau nonmotil, medium ini ditambahkan bahan

pemadat 50% (Hadietomo, 1990).

Mikroorganisme dapat menggunakan makanan dalam

bentuk padat dan dapat pula yang hanya menggunakan

bahan-bahan dalam bentuk cairan atau larutan.

Mikroorganisme yang menggunakan makanannya dalam

bentuk padat tergolong tipe holozoik. Mikroorganisme

yang dapat menggunakan makanannya dalam bentuk

cairan atau larutan disebut holofitik. Ada beberapa

mikroorganisme yang dapat menggunakan makanannya

dalam bentuk padatan, tetapi makanan tersebut

sebelumnya harus dicerna, di luar sel dengan bantuan

enzim ekstraseluler (Anonim, 2009).

Peran utama nutrien adalah sebagai sumber

energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor

elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang

menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan

yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi,

sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber

mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. Selain

itu, secara umum nutrien dalam media pembenihan

harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk

sintesis biologik oranisme baru (Hadietomo, 1990).

Tiap sel harus mensintesis sendiri konstituen

tubuhnya dari zat-zat sederhana yang ditemukan dalam

lingkungannya. Kebanyakan dari zat-zat ini berupa

makanan dalam bentuk suspensi atau larutan yang

ditemukan dalam air laut, sungai, danau, air

selokan, atau bahan-bahan organik lain yang

mengalami penguraian, dan sebagainya. Sifat kimia

dan fisika dari habitat ini menentukan jenis

organisme yang dapat tumbuh atau hidup di lingkungan

itu (Irianto, 2006).

Menurut Pelgzar (1996), klasifikasi medium

berdasarkan fungsinya digolongkan menjadi 7

golongan, yaitu:

1. Medium umum, media yang ditambahkan bahan-

bahan yang bertujuan menstimulasi pertumbuhan

mikroba secara umum. Contoh Nutrient Agar (NA)

untuk menstimulasi pertumbuhan bakteri, Potato

Dextrose Agar (PDA) untuk menstimulir

pertumbuhan fungi.

2. Medium khusus, merupakan medium untuk

menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan 

kemampuannya untuk mengadakan perubahan-

perubahan kimia tertentu misalnya, medium

tetes tebu untuk Saccharomyces cerevisiae.

3. Media diperkaya (enrichment media), media yang

ditambahkan bahan-bahan tertentu untuk

menstimulasi pertumbuhan mikroba yang

diinginkan. Hal ini dilakukan untuk

menstimulasi pertumbuhan mikroba yang

jumlahnya sedikit dalam suatu campuran

berbagai mikroba, contoh Chocolate media dan

Yeast-Extract-poptasium Nitrat Agar.

4. Media selektif, merupakan media yang

ditambahkan bahan-bahan tertentu yang akan

menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak

diinginkan yang ada dalam suatu spesimen.

Inhibitor yang digunakan berupa antibiotik,

garam dan bahan-bahan kimia lainnya.

5. Media diferensial, merupakan media yang

ditambahkan bahan-bahan kimia atau reagensia

tertentu yang menyebabkan mikroba yang tumbuh

memperlihatkan perubahan-perubahan spesifik

sehingga dapat dibedakan dengan jenis

lainnya.

6. Medium penguji (assay medium), yaitu medium

dengan susunan tertentu yang digunakan untuk

pengujian senyawa-senyawa tertentu dengan

bantuan bakteri misalnya medium untuk menguji

vitamin-vitamin, antibiotika dan lain-lain.

7. Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu

medium spesifik yang digunakan untuk

menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan,

misalnya medium untuk menghitung jumlah

bakteri E.coli air sumur.

2.2 Sterilisasi

Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan

semua mikroorganisme yang hidup. Adanya pertumbuhan

mikro menyatakan bahwa pertambahan bakteri masih

berlangsung dan tak sempurnanya proses sterilisasi.

Jika proses sterilisasi berlangsung sempurna, maka

spora bakteri yang merupakan bentuk paling resikan

dari kehidupan mikroba tak akan terlihat lagi.

Sterilisasi merupakan metode praktis yang dirancang

untuk membersihkan dari mikroorganisme, atau sengaja

untuk menghambat pertumbuhannya. Mikroorganisme

sangat berbeda, dalam kelemahannya terdapat berbagai

macam agen antimikroba (Suriawiria, 2005).

Cara kerja sterilisasi ialah cara kerja agar

terhindar dari kontaminasi, cara steril ini

digunakan pada pembuatan media, dan pembuatan

preparat. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara:

(Anonim, 2009)

1. Fisik yang dibagi menjadi beberapa bagian:

a. Dengan hot air sterilisation oven, bahan dari gelas di

bungkus dengan aluminium foil, dengan suhu 170°-

250°C selama 2 jam.

b. Panas basah dengan tekanan suhu 121°C selama 15

menit. Alat yang digunakan adalah autoclave.

c. Pressure cooker, panaskan air mendidih, biarkan

klep uap terbuka agar keluar uap kemudian klep

uap ditutup, lihat suhu dan tekanan, bila suhu

telah 121°C dengan tekanan 1,5 atm, dijaga

konstan selama 15 menit. Kemudian buka klep uap

hingga tercapai tekanan nol, dan setelah suhu

mencapai suhu kamar, alat dan bahan

dikeluarkan.

2. Kimia, dengan menggunakan zat-zat kimia seperti

desinfektan, antiseptik.

3. Radiasi dengan sinar ultra violet, biasanya digunakan

pada ruangan dan alat – alat plastik.

4. Filter dengan membran filter dan vacum pump.

Alat-alat yang dipakai ketika penanaman, harus

dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas

dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam

seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan

dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam

bacticinerator (Irianto, 2006).

Sterilisasi dengan panas adalah unit operasi

dimana bahan dipanaskan dengan suhu yang cukup

tinggi dan waktu yang cukup lama untuk merusak

mikroba dan aktivitas enzim. Sebagai hasilnya, bahan

yang disterilkan akan memiliki daya simpan lebih

dari enam bulan pada suhu ruang. Contoh proses

sterilisasi adalah produk olahan dalam kaleng

seperti kornet, sarden dan sebagainya (Irianto,

2006).

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Mikrobiologi dengan judul Sterilisasi

dan Pembuatan Media dilaksanakan pada hari Senin,

tanggal 18 November 2013, pada pukul 13.20 WIB hingga

selesai. Praktikum ini bertempat di Laboratorium

Biologi Institut Agama Islam Negeri Raden Fatah

Palembang.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan yaitu:

1. Timbangan Analitik

2. Gelas Ukur

3. Erlenmeyer

4. Tabung Reaksi

5. Kaca Pengaduk

6. Autoklaf

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan yaitu:

1. Aquades

2. Kapas

3. Aluminium Foil

4. Alkohol

5. Kentang 200 gram

6. Dektrosa/gula

7. Agar-agar

8. Kompor Gas/Listrik

3.3 Cara Kerja

Pembuatan Media

1. Membuat media umum/konvesional untuk pertumbuhan

bakteri (Nutrient Agar):

Beef extract (ekstrak daging) ................. 10 g

Pepton...................................... 10 g

Agar-agar................................... 15 g

Aquades..................................... 100

ml

Catatan: ekstrak daging bila tidak tersedia dapat

dibuat sendiri, dengan cara sebagai berikut:

1. Buat ekstrak daging (daging 0.5 kg direbus

dalam air 1000 ml hingga volume air menjadi

setengah atau direbus selama 1-2 jam.

2. Saring ekstrak daging dengan kertas saring,

kemudian tambahkan aquades hingga volume

menjadi 1000 ml.

3. Masukkan pepton dan agar-agar, lalu diaduk

sampai homogen.

4. Biarkan diatas api sampai hampir mendidih

5. Masukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml

untuk agar miring, dan disimpan dalam

erlenmeyer

6. Semua tabung dan erlenmeyer yang berisi medium

ditutup dengan kapas dan aluminium foil.

7. Sterilkan dengan autoklaf.

8. Setelah disterilkan tabung reaksi yang berisi 5

ml dimiringkan untuk media agar miring dan di

erlenmeyer disimpan dalam inkubator/water bath.

2. Membuat media umum untuk jamur (Potato Dectrosa Agar)

Kentang .................................... 200

gr

Dektrosa/gula .............................. 10 gr

Agar-agar .................................. 15 gr

Aquades .................................... 1000

ml

Cara Kerja:

1. Bersihkan kentang lalu dipotong kecil-kecil.

Kemudian dimasak dalam 500 ml aquades. Biarkan

mendidih selama 1 jam, jaga volume agar tetap.

2. Saring ekstrak kentang, ambil fitratnya.

3. Tambahkan dektrosa/gula sambil dipanaskan

dengan menggunakan api sedang.

4. Tambahkan agar-agar, panaskan dan aduk hingga

homogen. Setelah mendidih diangkat dan

dimasukkan ke dalam botol/erlenmeyer.

5. Tutup dengan kapas dan aluminium foil, kemudian

sterilisasi dengan autoklaf.

Sterilisasi Fisika (Autoklaf)

1. Sebelum dihidupkan periksa alat Autoclave-Pressure

Steam Sterilizers, sudah bersih atau belum.

2. Isi air dalam alat sebatas saringan.

3. Masukkan bahan-bahan yang akan di sterilisasi,

sebelumnya diberi indikator tanda sudah steril

atau belum dengan autoclave tape.

4. Tutup covernya dengan mencocokkan dengan tanda

kuncinya.

5. Rapatkan kunci-kunci secara diagonal sampai rapat

betul. Posisi alat pada high.

6. Tekan Power/ON dengan menutup katup agar uap air

tidak keluar.

7. Bila tekanan sudah sampai pada tanda 15 (tekanan

sudah mencapai 121° C) atau caution.

8. Tekan timer selama 15 menit.

9. Bila sudah 15 menit, maka katup dibuka. Bersamaan

dengan itu matikan power.

10. Bila alat sudah dalam posisi 0, maka buka

katup. Biarkan alat dingin dahulu.

11. Buka metal to metal secara diagonal.

Ambil hasil sterilan, lihat indikator autoclave tape-

nya.

Sterilisasi cara Kimia

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di

dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian

mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk)

dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.

2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan

alkohol terlebih dahulu lalu dibakar.

3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus

ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan

tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat

transfer panas yang terjadi.

4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi

steril didekatkan ke bagian api.

5. Jika kerja di safety cabinet tidak perlu memakai

pembakar bunsen tetapi jika diluar safety cabinet

maka semakin banyak sumber api semakin terjamin

kondisi aseptisnya.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Hasil akhir dari proses sterilisasi sesuai

dengan petunjuk praktikum yang kita dapatkan setelah

menginkubasi alat dan bahan ke dalam autoklaf pada

suhu 121℃ selama 15 menit, alat dan bahan tersebut

menjadi steril (matinya mikroorganisme yang terdapat

pada alat dan bahan).

Nama

MediumFungsi

Pengamatan

Sebelum

Pengadukan

Pengamatan

Sesudah

Pengadukan

PDA

Sebagai

tempat

pembiakan

mikroba

Warnanya

bening, agak

keruh, cair

Kuning

keruh, dan

sedikit

kental

4.2 Pembahasan

Medium merupakan bahan yang digunakan untuk

menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya,

medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara

lain adalah harus mengandung semua zat hara yang

mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai

tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang

sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan

ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat

menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam

keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang

di tumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Hadioetomo,

1993). Percobaan kali ini yaitu pembuatan medium NA

dan PDA.

NA (nutrient agar) digunakan sebagai media

pertumbuhan bakteri. Pembuatan medium percobaan ini

dengan menggunakan NA (nutrient agar), dimana dalam

pembuatannya terlebih dahulu dengan cara menimbang

bahan yang akan digunakan kedalam neraca analitik

sesuai dengan jumlah yang diperlukan kemudian

memasukkan bahan kedalam erlenmeyer 250 ml, dimana

bahan tersebut adalah aquades 250 ml, NA 3,75 dan

agar 7 gram setelah itu dipanaskan diatas hot plate

440oC di ikuti oleh pengadukan dengan menggunakan

magnetic stirrer, tujuan dari pemanasan dan pengadukan

ini adalah untuk menghomogenkan NA dengan aquades,

dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan

dari NA dan aquades. Setelah dipanaskan beberapa

menit larutan berubah warna dari keruh menjadi

kuning kecoklatan hal ini menandakan larutan telah

homogen. Kemudian dimasukkan kedalam autoklaf

dengan mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas dan

dilapisi kertas aluminium diluarnya. Tujuan dari

penutupan ini agar meminimalkan kontaminasi.

Pembuatan NA berdasarkan konsistennya termasuk

medium padat dan menurut kegunaannya termasuk medium

umum.

PDA (Potato Dextrose Agar) digunakan untuk

menumbuhkan fungi atau jamur. Pembuatan medium pada

percobaan ini dengan menggunakan PDA (Potato Dextrose

Agar) dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu

dengan cara memasukkan 200 ml aquades dan 50 ml

ekstrak kentang, 3,75 deglucose dan 7 gr agar

kemudian dipanaskan diatas hot plate 440 oC diikuti

oleh pengadukan dengan tujuan dari pemanasan dan

pengadukan ini untuk menghomogenkan PDA dengan

aquades, dan pemanasan bertujuan mempercepat

pelarutan dari PDA. Setelah dipanaskan beberapa

menit larutan berubah warna dari keruh menjadi

kuning tua, hal ini menunjukkan larutan telah

homogen. Setelah itu dimasukkan kedalam autoklaf

tetapi sebelum dimasukkan mulut erlenmeyer ditutup

dengan kapas dan kemudian dibungkus dengan kertas,

hal ini bertujuan agar meminimalkan kontaminasi. PDA

termasuk medium nonsintetik karena termasuk medium

padat sedangkan menurut fungsinya termasuk medium

umum.

Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk

sterilisasi. Autoklaf termasuk dalam teknik

sterilisasi secara fisika dengan prinsip arus uap

dan tekanan. Alat ini sering digunakan dalam teknik

pensterilan karena tingkat koefisien dan sifat alat

yang tidak merusak kandungan dalam media pertumbuhan

yang dipakai yaitu NA, PDA, MEA dan LB (Suriawiria,

2005).

Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk

menghindari kontaminasi, yaitu masuknya

mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi

merupakan suatu proses (kimia dan fisika) yang

membunuh semua bentuk hidup terutama mikroorganisme

(Suriawiria, 2005). Sterilisasi yang digunakan dalam

percobaan ini adalah secara fisika yaitu menggunakan

panas, dimana panas yang digunakan adalah bersama

uap air yang biasanya disebut sterilisasi basah.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan

semua mikroorganisme yang hidup. Cara kerja

sterilisasi ialah cara kerja agar terhindar dari

kontaminasi, cara steril ini digunakan pada

pembuatan media, dan pembuatan preparat. Sterilisasi

dapat dilakukan dengan cara fisik, kimia, radiasi

dan filter. Medium adalah substansi yang terdiri

atas campuran zat-zat makanan (nutrien) yang

dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan

mikroorganisme.

5.2 Saran

Sebaiknya pada saat praktikum praktikan sudah

bisa menguasai teknk-teknik atau cara kerja dari

praktikum yang akan dilaksanakan sehingga tidak akan

terjadi kekeliruan yang bisa menghambat jalannya

praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2009. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Universitas

Indonesia: Jakarta.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan:

Jakarta.

Hadioetomo, R. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium

Mikrobiologi. Gramedia: Jakarta.

Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya:

Bandung.

Pelgzar & Reid. 1958. Mycrobiology. Mc Graw-Hill Compan:

Tokyo.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar

Sinanti: Jakarta.