T.C.

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BAKTERİYEL KERATİT TEDAVİSİNE YÖNELİK BESİFLOKSASİN

YÜKLÜ OKÜLER İNSERTLERİN ELEKTRO-EĞİRME YÖNTEMİ İLE

GELİŞTİRİLMESİ VE DEĞERLENDİRİLMESİ

Ecz. H. Kerem POLAT

Farmasötik Teknoloji Programı

DOKTORA TEZİ

ANKARA

2020

vi

TEŞEKKÜR

Tez çalışmalarım boyunca bilgi ve tecrübeleriyle bana yol gösteren, her

aşamada ve şartta desteklerini esirgemeyerek sabır gösteren, saygıdeğer danışman

hocam Prof. Dr. Sema ÇALIŞ’a,

Çalışmalarımı gerçekleştirirken her zaman destek ve yardımını yanımda

hissettiğim, her aşamada ve şartta desteklerini esirgemeyerek sabır gösteren

saygıdeğer hocam Prof. Dr. Sibel PEHLİVAN’a,

Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim

Dalı Ailesi olarak tez çalışmalarım sırasında her türlü imkânı sağlayarak beni aralarına

kabul eden başta Prof Dr. Levent ÖNER nezdinde Anabilim Dalı Başkanlığı’na ve

tüm değerli öğretim üyesi/elemanı Hocalarıma,

Doktora çalışmalarım sürecinde ihtiyaç duyduğum her an yardımlarını

esirgemeyerek yanımda olan başta, Dr. Öğr. Ü. Nazlı ERDOĞAR, Ecz Eren

AYTEKİN, Ecz.Fatma Betül ARSLAN ve Ecz. Nihat KURT’a

Yaşadığım her zor günümde arkamda hissettiğim, beraber çok sıkıntılar

yaşadığımız her sıkıntıda birbirimize daha çok bağlandığımız ve beni sevdiği için her

gün şükrettiğim Biricik eşim Tuba POLAT’a

Gelişi ile beni mutluluğa boğan, tarif edilemez bir sevinç yaşatan, yüzünden

gülücüğün eksik olmasını istemeyeceğim ve babasının her daim arkasında olacağı

Biricik kızım Elif Nil POLAT’a

Karşılıksız destekleri ile zor günleri aşmamı sağlayan, varlıkları ve sonsuz

sevgileriyle güç veren ve beni ben yapan değerleri kazanmamı sağlayarak her zaman

yanımda olan Sevgili Annem, Babam ve Kardeşlerime,

Üzerinde yaşadığımız toprakları Türk Milletine vatan kılan başta Gazi Mustafa

Kemal ATATÜRK ve değerli silah arkadaşlarına, bu uğurda yüzyıllardır canı pahasına

toprağa karışmış kahramanlara, gazilerimize ve kaybettiklerimize,

Sonsuz Saygı, Sevgi ve Teşekkürlerimi sunarım.

vii

ÖZET

Polat, H. K. Bakteriyel Keratit Tedavisine Yönelik Besifloksasin Yüklü Oküler

İnsertlerin Elektro-Eğirme Yöntemi İle Geliştirilmesi ve Değerlendirilmesi,

Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmasötik Teknoloji

Programı Doktora Tezi, Ankara, 2020. Bakteriyel keratit, gözde farklı patojenlerin

neden olduğu inflamasyon ile karakterize, tedavinin gerçekleşmediği durumlarda ise

ciddi görme kayıplarına ve hatta körlüğe neden olabilen bir hastalıktır. Bu tez

çalışmasında besifloksasin HCl (BH) içeren nanolif yapıda insert formülasyon grupları

bakteriyel keratit tedavisi için oküler ilaç taşıyıcı sistem olarak in vitro, ex vivo ve in

vivo olarak değerlendirilmiştir. BH içeren insert formülasyonları Poli (kaprolakton) /

polietilen glikol (PKL/PEG) polimeri kullanılarak elektro-eğirme yöntemiyle

hazırlanmıştır. Formülasyonlara mukoadezif özellik kazandırılması amacıyla insertler

sodyum aljinat (SA) veya tiyollenmiş sodyum aljinat (TSA) ile kaplanmıştır.

Siklodekstrin (Cyc)’lerin oküler penetrasyon artırıcı özelliklerinden faydalanmak

amacı ile bir grup formülasyonda BH yerine BH-Cyc kompleksi kullanılmıştır. In vitro

ilaç salım çalışmalarında, nanolif yapıda insertlerin ilk iki gün içinde bir patlama

salımı ve ardından yavaş bir salım profili gösterdiği tespit edilmiştir. İnsert

yüzeylerinin SA ve TSA ile kaplanmasıyla formülasyonların biyoadezyon

özelliklerinin arttığı belirlenmiştir. Ex vivo ilaç permeasyon çalışmalarında, geliştirilen

formülasyonlar arasında BH-Cyc kompleksi içeren formülasyonun en yüksek ilaç

geçişine sahip olduğu tespit edilmiştir. In vivo çalışmalardan elde edilen veriler Yeni

Zelanda albino tavşan gözlerinde oluşturulmuş bakteriyal keratit modelinde, hem TSA

kaplı insertlerin hem de BH-Cyc kompleksi içeren insertlerin tek doz uygulama

sonrasında bile çoklu doz uygulaması yapılan ticari göz damlası (Besivance®)’na

benzer şekilde bakteriyal keratiti etkili bir şekilde tedavi edebildiğini göstermiştir.

Anahtar Kelimeler: Bakteriyel keratit, besifloksasin HCl, nanolif yapıda insert,

oküler ilaç taşınması, PKL/PEG, Siklodekstrin

Destekleyen Kurum: TÜBİTAK Hızlı Destek Programı 1002 Projesi (SBAG,

217S126), TÜBİTAK.

viii

ABSTRACT

Polat, H.K. Development and Evaluation of Besifloxacin HCl Loaded Ocular

Inserts by Electro-Spinning Method for Bacterial Keratitis Treatment, Hacettepe

University Graduate School of Health Sciences, Pharmaceutical Technology

Programme, Ph.D Thesis, Ankara, 2020. Bacterial keratitis is a disease

characterized by inflammation caused by different pathogens in the eye and in cases

where treatment does not occur, can cause serious vision loss and even blindness. In

this thesis, nanofibrous insert formulation groups containing besifloxacin HCl (BH)

were evaluated in vitro, ex vivo and in vivo as a potential ocular drug delivery system

for the treatment of bacterial keratitis. Insert formulations containing BH were

prepared by electro-spinning method using Poly (caprolactone) / polyethylene glycol

(PKL / PEG) polymer. The inserts were coated with sodium alginate (SA) or thiolated

sodium alginate (TSA) to provide the formulations mucoadhesive properties. In order

to take advantage of the cyclodextrin (Cyc)’s ocular penetration enhancing properties,

BH-Cyc complex was used instead of BH in a group of formulations. In in vitro drug

release studies, it was determined that inserts in the nanofiber structure show a burst

release within the first two days and then a slow release profile. Coating the insert

surfaces with SA and TSA has been found to increase the bioadhesion properties of

the formulations. In ex vivo drug permeation studies, the formulation containing the

BH-Cyc complex has been found to have the highest drug passage among the

developed formulations. In the bacterial keratitis model formed in New Zealand albino

rabbit eyes in in vivo studies, both TSA-coated inserts and inserts containing the BH-

Cyc complex provide improvement in treatment scores as much as the commercial

drug (Besivance®) which was applied 3 times a day, even inserts administered one

time during treatment period.

Keywords: Bacterial keratitis, besifloxacin HCl, nanofiber insert, ocular drug

transport, PKL / PEG, Cyclodextrin

Supporting Institution: TÜBİTAK Short Term R&D Funding Program (SBAG,

217S126), TÜBİTAK.

ix

İÇİNDEKİLER

ONAY SAYFASI iii

YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv

ETİK BEYAN v

TEŞEKKÜR vi

ÖZET vii

ABSTRACT viii

İÇİNDEKİLER ix

SİMGELER VE KISALTMALAR xiv

ŞEKİLLER xvi

TABLOLAR xix

1. GİRİŞ 1

2. GENEL BİLGİLER 4

2.1. Göz ve Gözün Yapısı 4

2.1.1. Anterior Segment (Ön Oda) 5

2.1.2. Posterior Segment (Arka Oda) 9

2.2. Oküler İlaç Uygulamada Karşılaşılan Zorluklar 9

2.3. Keratit 13

2.3.1. Enfeksiyöz Keratitler 14

2.4. Bakteriyel Keratit Tedavisi 15

2.4.1. Florokinolonlar 17

2.5. Besifloksasin HCl (BH) Hakkında Genel Bilgiler 17

2.5.1. Besifloksasin HCl’nin Fiziksel Özellikleri 17

2.5.2. Besifloksasin HCl’nin Farmakolojik Özellikleri 18

2.5.3. Etki Mekanizması, Direnç, Doz ve Farmakokinetik 18

2.5.4. Antibakteriyel Aktivite 20

2.6. Göze Uygulanan İlaç Şekilleri 21

2.6.1. Sıvı İlaç Şekilleri 22

2.6.2. Yarı Katı İlaç Şekilleri 22

2.6.3. Katı İlaç Şekilleri 23

2.7. Nanolifler 30

2.7.1. Boyutları 30

x

2.7.2. Nanolif Üretim Teknikleri 31

2.8. Elektro-Eğirme Tekniği 31

2.8.1. Elektro-Eğirme Y Hazırlanan Nanoliflerde Formülasyon Bileşenleri 32

2.8.2. Elektro-Eğirme İşlemine İlişkin Parametreler 33

2.8.3. Elektro-Eğirme Yönteminde İlaç Yükleme 38

2.8.4. Elektro-Eğirme Yöntemiyle Nanolif Hazırlamak İçin Kullanılan

Polimerler 40

2.8.5. Siklodekstrin (Cyc) 43

3. GEREÇ VE YÖNTEM 45

3.1. Araç ve Gereçler 45

3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 45

3.1.2. Biyolojik Materyal 46

3.1.3. Kullanılan Cihazlar 46

3.2. Yöntem 48

3.2.1. Besifloksasin HCl’nin Fizikokimyasal Özellikleri Üzerinde Yapılan

Çalışmalar 48

3.2.2. Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının Optimizasyon

Çalışmaları 53

3.2.3. Besifloksasin HCl Yüklü Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif

Yapıda İnsertlerin Hazırlanması ve Geliştirilmesi 58

3.2.4. Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının Karakterizasyon Çalışmaları 65

3.2.5. Mikrobiyolojik Çalışmalar 69

3.2.6. Hücre Kültürü Çalışmaları 71

3.2.7. Ex vivo Kornea Geçiş Çalışmaları 74

3.2.8. In Vivo Çalışmalar 76

3.2.9. Histolojik Çalışmalar 79

3.2.10. İstatistiksel Analizler 79

4. BULGULAR 80

4.1. Besifloksasin HCl’nin Fizikokimyasal Özelliklerinin İncelenmesi 80

4.1.1. Besifloksasin HCl’nin Erime Derecesi Tayini 80

4.1.2. Besifloksasin HCl’nin DSC Analizi 80

4.1.3. Besifloksasin HCl’nin FTIR Analizi 81

xi

4.1.4. Besifloksasin HCl’nin UV Analizi 83

4.1.5. Besifloksasin HCl’nin HPLC ile Miktar Tayini 83

4.2. Besifloksasin HCl Yüklü Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının

Optimizasyon Çalışmaları 87

4.3. Sodyum Aljinat (SA) / Tiyollenmiş Sodyum Aljinat (TSA) Kaplı

Polikaprolakton / Polietilen Glikol Nanolif Yapıda İnsertlerin

Hazırlanmasının Optimizasyonuna İlişkin Bulgular 89

4.3.1. Tiyollenmiş Sodyum Aljinat’ın Sentez Sonrası FTIR Spektrumu

Analizi 90

4.3.2. İnsertlerin Kaplama İşleminin X-Işını Fotoelektron Spektroskopisi

(XPS) ile Kontrolü 94

4.4. Siklodekstrin: Besifloksasin HCl İnklüzyon Kompleksi İçeren

Polikaprolakton / Polietilen Glikol Nanoliflerinin Hazırlanmasında Faz

Çözünürlük Çalışması Bulguları 96

4.4.1. İnklüzyon Kompleksi Üzerinde Yapılan Fizikokimyasal İncelemeler 99

4.5. Optimize Edilmiş Nanolif İnsert Formülasyonlarının Belirlenmesi 103

4.6. Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının Karakterizasyon Çalışmaları 104

4.6.1. Morfolojik İnceleme Bulguları 104

4.6.2. Çap-Kalınlık Bulguları 110

4.6.3. Ağırlık Tayini Bulguları 111

4.6.4. Şişme Testine İlişkin Bulgular 112

4.6.5. In vitro Degradasyon Testi Bulguları 113

4.6.6. Enkapsülasyon Etkinliği Bulguları 115

4.6.7. In Vitro Salım Çalışmasına İlişkin Bulgular 116

4.6.8. Ex vivo Biyoadezyon Çalışmasına İlişkin Bulgular 120

4.6.9. Mikrobiyolojik Çalışma Bulguları 120

4.6.10. Hücre Kültürü Çalışmaları Bulguları 122

4.7. Ex vivo Kornea Geçiş Çalışmaları Bulguları 125

4.8. In vivo Çalışmalara İlişkin Bulgular 126

4.8.1. Bakteriyal Keratit Oluşturulması Bulguları 126

4.8.2. Bakteriyal Keratit Tedavisi Değerlendirilmesi Bulguları 127

4.8.3. Tedavinin Değerlendirilmesi Bulguları 128

xii

4.9. Histoloji Çalışmaları 128

5. TARTIŞMA 130

5.1. Besifloksasin HCl’nin Fizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi 132

5.2. Besifloksasin HCl’nin Miktar Tayini 133

5.3. Besifloksasin HCl Yüklü Poli(Kaprolakton)/Poli(Etilen Glikol) Nanolif

Yapıda İnsertlerin Optimizasyonu 134

5.4. Besifloksasin HCl Yüklü Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif

Yapıda İnsertlerin Hazırlanması ve Geliştirilmesi 136

5.4.1. Sodyum Aljinat (SA) /Tiyollenmiş Sodyum Aljinat (TSA) Kaplı

Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif Yapıda İnsertlerin

Hazırlanması 137

5.4.2. Besifloksasin HCl:Hidroksipropil-β-Siklodekstrin İnklüzyon

Kompleksi İçeren Polikaprolakton/Polietilen Glikol Nanolif Yapıda

İnsertlerin Hazırlanması 138

5.5. Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının Karakterizasyon Çalışmaları 140

5.5.1. Yüzey Morfolojisi 140

5.5.2.Çap-Kalınlık ve Ağırlık Çalışmaları 142

5.5.3. Şişme Testi Çalışmaları 143

5.5.4. In vitro Degradasyon Çalışmaları 143

5.5.5. Enkapsülasyon Etkinliği 144

5.5.6. In Vitro Salım Çalışmaları 145

5.5.7. Ex vivo Biyoadezyon Çalışmaları 147

5.6. Hücre Kültürü Çalışmaları 148

5.7. Mikrobiyolojik Çalışmalar 150

5.8. Ex Vivo Kornea Geçiş Çalışmaları 151

5.9. In Vivo Çalışmalar 152

5.10. Histoloji Çalışmaları 153

6. SONUÇ 155

7. KAYNAKLAR 157

EKLER

EK 1. Yayın Bilgisi

EK 2. Etik Kurul Kararı

xiii

EK 3. Deney Hayvanları Kullanım Sertifikası

EK 4. Turnitin Dijital Makbuz

EK 5.Tez Çalışması Orjinallik Raporu

9. ÖZGEÇMİŞ

xiv

SİMGELER VE KISALTMALAR

a/a ağırlık/ağırlık

a/h ağırlık/hacim

ARPE 19 İnsan retinal pigment epitel hücre hattı

ATCC American Type Culture Collection

BH Besifloksasin HCl

CFU Coloni forming unit

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

Cyc Siklodekstrin

DCM Diklorometan

DMF N-N Dimetilformamit

DSC Diferansiyel taramalı kalorimetre

EDAC 1-etil-3- karbodiimid hidroklorür

FDA Amerikan Gıda ve İlaç İdaresi

FTIR Fourier transform infrared

HCl Hidroklorik asit

HPLC Yüksek performans sıvı kromatografisi

HP-β-Cyc Hidroksipropil-β-siklodekstrin

LOD Saptama sınırı

LOQ Miktar tayini sınırı

MİK Minumum inhibitör konsantrasyonu

MTT Metil-tiyazol-tetrazolyum

PBS Fosfat tamponlu tuz çözeltisi

PEG Polietilenglikol

PKL Polikaprolakton

SA Sodyum aljinat

SEM Taramalı elektron mikroskobu

SS Standart sapma

TSA Tiyollenmiş sodyum aljinat

USP Amerikan farmakopesi

UV Ultraviyole

VK Varyasyon katsayısı

xv

X̄ Ortalama

XPS X-Işını fotoelektron spektroskopisi

β-Cyc β-siklodekstrin

xvi

ŞEKİLLER

Şekil Sayfa

2.1. Gözün yapısı. 4

2.2. Kornea yapısının şematik gösterimi. 6

2.3. Göze ilaç uygulanmasında karşılaşılan engellerin şematik gösterimi. 10

2.4. Bakteriyel keratite bağlı olarak oluşan kornea hasarları a)korneal delinme

b)kornea opaklaşması. 15

2.5. Florokinolon grubu antibiyotiklerin temel kimyasal yapısı. 17

2.6. BH’nin kimyasal yapısı. 18

2.7. Göze uygulanan ilaç şekilleri. 22

2.8. A)Ocusert® insertlerin şematik gösterimi B) Ocusert®’in uygulanması. 23

2.9. İnsertlerin çözünürlüklerine göre sınıflandırılması. 25

2.10. Rezervuar tipi cihazlardan salım oranının şematik gösterimi. 26

2.11. Osmotik insertin şematik gösterimi. 27

2.12. Elektro-eğirme yönteminin şematik olarak gösterimi. 32

2.13. Cyc’lerin genel yapısı. 43

3.1. Nanoliflerin elektro-eğirme yöntemi ile hazırlanmasının şematik

gösterimi. 55

3.2. BH yüklü PCL/PEG nanolif yapıda insert formülasyonlarının

hazırlanmasının şematik gösterimi. 57

3.3. a) BH yüklü nanolif görüntüsü (kesim işleminden önce) b) BH yüklü

nanolif yapıda insert görüntüsü (delgeç ile kesildikten sonra) 57

3.4. Tez çalışmalarında hazırlanacak nanolif yapıda insert formülasyonlarının

bileşimi 59

3.5. PCL/PEG insert formülasyonlarının SA veya TSA ile kaplanmasında

kullanılan daldırma yönteminin şematik gösterimi. 60

3.6. In Vitro salım deneylerinde Eppendorf tüplerin yerleştirildiği Thermomixer

Cihazı. 68

3.7. Biyoadezyon çalışmasına ilişkin görüntüler. 69

3.8. Ekstraksiyon işlemi ile ilgili bazı görüntüler. 73

3.9. MTT İşleminden a) Önce ve b) Sonra Plakların Görünümü. 74

3.10. Ex vivo geçiş çalışmaları için difüzyon odası sisteminin şematik görünümü. 75

3.11. Ex vivo kornea çalışma düzeneğinin fotoğrafı. 76

3.12. Bakteri süspansiyonu enjeksiyonu a) öncesi b) sonrası tavşan gözünün

fotoğrafı. 77

xvii

4.1. BH’nin DSC analizi sonucu. 80

4.2. BH’ye ilişkin FTIR spektrumu. 82

4.3. BH’nin distile su içinde (10 µg/mL) Ultraviyole (UV) spektrumu

(3 numaralı pik). 83

4.4. BH’nin distile su içinde (20 µg/mL) elde edilen HPLC kromatogramı. 84

4.5. BH’nin doğrusallık çalışmasından elde edilen kalibrasyon doğrusu grafiği. 85

4.6. PKL/PEG içeren nanolif yapıda insertlerin optimizasyon çalışmalarında in

vitro salım bulguları . 88

4.7. PKL/PEG içeren nanolif yapıda insertlerin optimizasyon çalışmalarında in

vitro salım bulguları. 88

4.8. FT-IR spektrumu analizi sonuçları A) L-sistein B) SA C) TSA. 93

4.9. XPS analizi sonuçları. 95

4.10. BH:β-Cyc kompleksinin su içindeki faz çözünürlük diyagramı. 96

4.11. BH:HP-β-Cyc kompleksinin distile su içindeki faz çözünürlük diyagramı. 97

4.12. FTIR spektrum sonuçları 102

4.13. DSC analizi sonuçları. 103

4.14. A’ formülasyonunun SEM görüntüleri 105

4.15. A formülasyonunun SEM görüntüleri 106

4.16. B formülasyonunun SEM görüntüleri 107

4.17. C formülasyonunun SEM görüntüleri 108

4.18. D formülasyonunun SEM görüntüleri 109

4.19. Nanolif yapıda insertlerin fotoğrafı 111

4.20. Formülasyonların şişme yüzdesi bulguları. 112

4.21. Nanolif yapıda insertlerin şişme yüzdesi bulguları. 113

4.22. Formülasyonların in vitro degradasyon çalışmasına ilişkin pH bulguları 114

4.23. Nanolif yapıda insertlerin in vitro degradasyon çalışmasına ilişkin

bulgular. 115

4.24. Formülasyonların in vitro salım profilleri. 118

4.25. Formülasyon A,B,C, D’nin in vitro salım profilleri. 119

4.26. Nanolif yapıda insertlere ilişkin biyoadezyon sonuçları 120

4.27. Nanolif yapıda insert formülasyonlarının salım örneklerinden elde edilen

MİK analizi sonuçları. 121

4.28. Nanolif yapıda insertlerin ve Besivance®’ın P.aeuroginosa’ ya karşı zon

inhibisyon çapları ölçümünün fotoğrafları. 122

4.29. Nanolif yapıda insertlerin % hücre canlılığı sonuçları (24. saat). 123

4.30. Nanolif yapıda insertlerin % hücre canlılığı sonuçları (48. saat). 123

xviii

4.31. Nanolif yapıda insertlerin % hücre canlılığı sonuçları (72.saat). 124

4.32. Nanolif yapıda insertlerin 24, 48 ve 72. saatlerde % hücre canlılığı

sonuçları. 124

4.33. Ex vivo kornea geçiş çalışması bulguları 125

4.34. Bakteriyel keratit gelişmiş tavşan gözünün örnek fotoğrafı. 127

4.35. 1. ve 7. gün sonunda tavşan gözlerine ilişkin fotoğraf örnekleri. 127

4.36. Enfeksiyon sonrası 1, 3, 5 ve 7. günlerde tavşan gözlerinin klinik

derecelendirme sonuçları. 128

4.37. Tavşan kornea kesitlerinin ışık mikroskobu fotoğraf örnekleri 129

xix

TABLOLAR

Tablo Sayfa

2.1. Oküler geçirgenliği etkileyen faktörler. 12

2.2. Oküler biyoyararlanımı artırmak için uygulanan farklı yaklaşımlar. 13

2.3. Besifloksasinin insan gözyaşındaki farmakokinetik parametreleri. 20

2.4. Osmotik insertlerin bileşenleri. 28

2.5. Çözünür insert hazırlanmasında kullanılan sentetik polimerler. 29

2.6. Biyoeriyen insert formülasyonunda kullanılan polimerler. 30

3.1. BH’nin HPLC ile miktar tayininde kullanılan kromatografik koşullar. 49

3.2. PKL nanoliflerinin optimizasyonu için kullanılan elektro-eğirme

parametreleri 54

3.3. PKL/PEG karışım nanoliflerinin optimizasyonu için kullanılan elektro-

eğirme parametreleri. 56

3.4. Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonrası belirlenen nanolif yapıda

insert formülasyonları ve kodları. 65

3.5. Tedavi değerlendirme tablosu. 79

4.1. BH’nin HPLC yöntemine ilişkin doğrusallık çalışmasından elde edilen

bulgular. 85

4.2. BH’nin HPLC yöntemine ilişkin doğruluk çalışmasından elde edilen

bulgular. 86

4.3. BH’nin HPLC yöntemine ilişkin doğrusallık çalışmasından elde

edilen gün içi kesinlik bulguları. 86

4.4. BH’nin HPLC yöntemine ilişkin doğrusallık çalışmasından elde edilen

günler arası kesinlik bulguları. 86

4.5. BH’nin deney süresince stabilitesine ilişkin bulgular. 87

4.6. PKL/PEG içeren nanolif yapıda insertlerin optimizasyon çalışmalarında

enkapsülasyon etkinliği bulguları. 89

4.7. Artan HP- β –Cyc konsantrasyonuna bağlı olarak elde edilen BH

çözünürlük değerleri. 98

4.8. Artan β-Cyc konsantrasyonuna bağlı olarak elde edilen BH çözünürlük

değerleri. 98

4.9. Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonrası belirlenen nanolif yapıda

insert formülasyonları ve kodları. 104

4.10. Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonrası belirlenen nanolif yapıda

insert formülasyonlarının ortalama lif çapları. 110

4.11. Nanolif yapıda insertlerin çap-kalınlık çalışmasına ilişkin bulgular. 110

4.12. Nanolif yapıda insertlerin ağırlık çalışmasına ilişkin bulgular. 111

xx

4.13. Nanolif yapıda insertlerin enkapsülasyon etkinliği bulguları. 115

4.14. Formülasyon A’dan in vitro salınan kümülatif BH miktarı. 116

4.15. Formülasyon B’den in vitro salınan kümülatif BH miktarı. 117

4.16. Formülasyon C’den in vitro salınan kümülatif BH miktarı. 117

4.17. Formülasyon D’den in vitro salınan kümülatif BH miktarı. 117

4.18. Nanolif yapıda insertler için f1/f2 benzerlik değeri sonuçları. 119

4.19. BH’nin MİK tayini bulguları. 121

4.20. Nanolif yapıda insertlerin P.aeuroginosa’ya karşı zon inhibisyon çapı

sonuçları. 122

4.21. Ex vivo geçiş çalışmalarında hesaplanan görünür geçirgenlik katsayıları. 126

1

1. GİRİŞ

Bakteriyel keratit, gözde farklı patojenlerin neden olduğu inflamasyon ile

karakterize, tedavinin gerçekleşmediği durumlarda ise ciddi görme kayıplarına, hatta

körlüğe neden olabilen bir hastalıktır. Hastalık, vücudun direncini kaybettiği

durumlarda, immünsüpresan kullanımı ile immün sistemin baskılanması sonucu veya

kontakt lens kullanımına bağlı olarak S. aureus, P. aeruginosa gibi patojen

mikroorganizmaların etkinleşerek inflamasyona sebep olmaları ile meydana

gelmektedir. Gözde kızarma, ağrı, görmede kayıp, korneal ülser oluşumu, anterior

kısımda inflamasyon ve fotofobi hastalığın semptomları arasında sıralanabilir.

Bakteriyel keratitin güncel tedavisinde antibiyotik içeren konvansiyonel göz

damlaları tek başına veya lokal kortikosteroidlerle kombine olarak uygulanmaktadır.

Tedavide genel olarak florokinolon grubu antibiyotikler tercih edilmektedir. Bu

grubun ilk üç nesil antibiyotiklerine ciddi oranda direnç gelişmesi sonucunda şu anda

dördüncü nesil florokinolon grupları kullanılmaktadır. Son nesil florokinolonlardan

olan besifloksasin, sadece topikal uygulama için geliştirilmiş olması nedeniyle

bakteriyel keratitin etkin tedavisi için ümit vaad etmektedir.

Bakteriyel keratit gibi, oküler yüzey hastalıklarının tedavisinde, sistemik

yoldan ilaç uygulanması, gözde yer alan kan-aköz bariyeri ve kan-retina bariyeri gibi

engeller nedeniyle hedef bölgede istenen düzeyde ilaç miktarına ulaşılmasına olanak

tanımamaktadır. Hedef bölgede istenen ilaç düzeyine ulaşılabilmesi için gerekli olan

yüksek sistemik dozların uygulanması da hastada ciddi yan etkilere neden olmaktadır.

Bu nedenle, topikal yoldan oküler ilaç uygulanması bu sorunların aşılmasında önemli

bir çözüm yolu olarak görünmektedir. Ancak, topikal yoldan uygulanan konvansiyonel

damla şeklindeki ilaç formülasyonlarında, uygulamanın gözün eşsiz savunma

mekanizmaları (gözyaşı ile gözden atılma, enzimatik parçalanma, nazolakrimal

direnaj ile uzaklaştırmaları vb) nedeniyle hedeflenen başarının elde edilmesi zor olup

ileri formülasyon çalışmaları gerektirmektedir. Bu çalışmalar sonucunda elde edilen

gelişmiş/yeni ilaç taşıyıcı sistemler, topikal yol ile ilaç uygulanması ile hedef bölgede

istenen sonucun elde edilmesinde ümit vaad etmektedir. Bu sistemler ile ilacın göz

yüzeyinde kalış süresi artırılarak hedefe ulaşılması amaçlanmaktadır. Son zamanlarda,

literatürde bu amaç için geliştirilen ilaç taşıyıcı sistemler arasında lipozom, ön ilaç,

mikropartikül, nanopartikül, misel, mikro-nano emülsiyon şeklinde ilaç şekilleri ümit

2

vaad eden sonuçlar verse de, bu sistemlerin ilacın gözde kalış süresini yeterince uzun

süre sağlayamaması önemli bir sakınca olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu nedenle,

çözüm için, uzun süreli ilaç salım özellikleri ve katı yapılarına bağlı olarak yüksek

fiziksel ve kimyasal stabilite göstermeleri nedeniyle insert şeklindeki ilaç taşıyıcı

sistemler dikkat çekmektedir.

Nanolifler nanoboyutları nedeniyle yüksek yüzey alanı/hacim oranına ve

poroziteye sahip yenilikçi ilaç taşıyıcı sistemlerdir. Nanolif yapıda insertlerin

üstünlükleri; yüksek temas alanı, yüzey işlevlerinde esneklik, gözenekli yapı ve iyi

mekanik dayanıklılık, kontrollü ilaç salımı olarak sıralanabilir.

Topikal olarak uygulanan ilaç şekillerinde ilacın oküler biyoyararlanımını

artırmak için göz yüzeyinde teması uzatmanın bir diğer yolu da, hazırlanan ilaç taşıyıcı

sisteme mukoadezif özellik veya pozitif yük kazandırılması sonucu negatif yüklü

korneal yüzey ile etkileşime girerek uzun süre tutunmasının sağlanmasıdır. Buna

ilaveten siklodekstrinler gibi permeasyon artırıcı maddelerin formülasyona eklenmesi

ile topikal uygulanan ilaçların oküler biyoyaralanımının arttığı bildirilmiştir.

Bu tez çalışması kapsamında, besifloksasin içeren insert şeklinde

formülasyonlar tasarlanarak, bakteriyel keratitin etkin tedavisinde hedef bölgede uzun

süreli antibiyotik salımının sağlanması, antibiyotiğin uygulama sıklığının azaltılması

ve yan etkilerin en aza indirilmesi hedeflenmektedir. Düşük dozda ilaç uygulaması,

bir yandan istenmeyen yan etkilerin azalmasına bir yandan da küçük boyutlarda insert

formülasyonlarının hazırlanmasına olanak verdiği için hastada minimum rahatsızlık

oluşturarak hasta uyuncunu artıracaktır. Tez çalışmaları kapsamında, hazırlanan ilaç

taşıyıcı sistem mukoadezif polimerlerle kaplanarak gözde ilave bir kalış süresinin

sağlanıp sağlanmadığı ve formülasyonlarda siklodekstrin kullanımı ile artmış ilaç

penetrasyonunun ilave bir antibakteriyel etki oluşturup oluşturmayacağı da

araştırılacaktır.

Bu çalışmada elektro-eğirme yöntemi kullanılarak hazırlanacak nanolif yapıda

Poli (-kaprolakton) (PKL)-PEG bazlı üç farklı insert sisteminin geliştirilmesi

planlanmaktadır;

- Kaplı olmayan insert grubu: Sadece PKL-PEG ile hazırlanacak

formülasyonları,

3

- Mukoadezif yüzey yapısına sahip insert grubu: Sodyum aljinat veya

tiyollenmiş sodyum aljinat ile kaplanarak mukoadezif özellik kazandırılmış PKL-PEG

insert formülasyonları

- ß Siklodekstrin-ilaç kompleksi ile oluşturulmuş insert grubu: ß Siklodekstrin

ile ilaç kompleksi içeren PKL-PEG insert formulasyonları

Bu tez çalışmasının amacı, bakteriyel keratitin topikal olarak etkin tedavisi

için, uzun süre besifloksasin salımı sağlayacak, farklı yüzey özelliklerine sahip insert

formülasyonlarının geliştirilmesi, in vitro karakterizasyon ve sitotoksisite

çalışmalarının yanında ex vivo ve in vivo çalışmalar ile hazırlanan formülasyonların

etkinliğinin değerlendirilmesidir.

4

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Göz ve Gözün Yapısı

Göz, içerdiği fotoreseptörler ile çevredeki ışık enerjisini işleyerek görmeyi

sağlayan, yaklaşık olarak 2,5 cm çapında 6,5 mL hacminde özelleşmiş bir organdır (1).

Anatomik olarak; göz küresi ve göz küresi dışındaki yapılar olmak üzere iki kısımdan

oluşur.

Göz çukuru (orbita) içinde bulunan göz küreleri, aynı zamanda, bu kısımda

bulunan kemikler tarafından korunmaktadır. Göz küresinin ön-arka çapı erişkinlerde

22-27 mm, çevresi 69-85 mm civarındadır (2, 3) (Şekil 2.1).

Şekil 2.1. Gözün yapısı (4).

Kaşlar, kirpikler, göz kapakları, gözyaşı bezleri ve göz kasları göz küresi

dışında bulunan ve görme işlemini gerçekleştirirken göze yardımcı olan, aynı zamanda

gözü dış etkilerden koruyan yapılardır. Göz, yukarı aşağı, sağa sola hareketini sahip

olduğu üç çift kırmızı kas yardımı ile gerçekleştirir. Kaş, kirpik ve göz kapakları, gözü

yabancı cisimlere karşı korumakta, göz kapağı ise sürekli hareket ederek göz yüzeyinin

her zaman nemli kalmasına yardımcı olmaktadır. Gözyaşı bezinden salgılanan

5

gözyaşı, gözün kurumasını engellerken, dışardan gelebilecek tehlikelere karşı da gözü

korumaktadır (5, 6).

Göz üç tabakadan oluşmaktadır. En dış kısımda, “sert tabaka” ya da “göz akı”

(sklera) denilen kısım bulunmaktadır. Bu tabakanın, gözün ön kısmında

tümsekleşmesi ile kornea (saydam tabaka) oluşur. Beyaz bir görünüme sahip olan sert

tabaka ise gözü koruyan bir zardır. Gözün orta kısmında bulunan ve gözyuvarını tam

bir karanlık oda haline getiren çok damarlı bir bağ dokusu olan kısım damar tabakadır.

Siliyer cisimdeki (kirpiksi bölge), çok damarlı olan asıcı bağın gergin halde kalması

için kanla dolabilen küçük piramitler halinde bulunan çıkıntılarına, siliyer uzantı

(kirpiksi uzantı) denilmektedir. Siliyer cismin bir uzantısı olan, damar tabakanın renk

değişimi gösterdiği ortası delik diyaframa ise ‘iris’ denilmektedir. Kişiden kişiye farklı

renklerde olabilen iris, pupilin büyüyüp küçülmesine yarayan kas tellerini de içinde

bulundurur.

Işığa duyarlı reseptörlerin bulunduğu üçüncü tabaka ise retinadır (ağ tabaka).

Retinadaki sinirler göz küresinin arka kısmında toplanarak beyne görme iletimi

sağlarlar. Görme sinirinin göz küresinden çıktığı yere “kör nokta” adı verilmektedir.

Kör nokta ışığa duyarlı olmayan bir bölgedir ve burada herhangi bir görüntü

oluşmamaktadır. Kör noktanın üst kısmında bulunan bölgeye “sarı leke” adı verilir.

Bu bölge, alınan görüntülerin en iyi şekillendiği kısımdır. Gözün arka kısmına giren

görme siniri, damar tabaka içine doğru yayılır ve bu yayılım üç tabaka halinde bir dizi

nöronla sona erer (5, 6).

2.1.1. Anterior Segment (Ön Oda)

Kornea (Saydam Tabaka)

Kornea, gözün ön bölümünde bulunan, kubbe şeklinde ve kırıcılığı en yüksek

olan saat camı görünümündeki saydam tabakadır. Korneanın görevi, göze gelen

ışınları kırarak retina üzerine odaklanmasını sağlamak, aynı zamanda gözü dışardan

gelecek tehlikelere karşı korumaktır. Kornea, ışığın net bir şekilde kırılabilmesini

sağlamak için saydam bir yapıya sahip olmalıdır. Bu nedenle yapısında kan damarı

bulunmaz. Gerekli oksijeni ve beslenmeyi dış kısımda bulunan gözyaşı salgısı ve iç

kısımda bulunan göz içi sıvısı ile sağlar. Kornea gözün toplam kırma gücünün %70’ini

oluşturur. Refraktif indeksi 1.376’dır. Kornea; epitel, Bowman tabakası (dış sınırlayıcı

6

tabaka), stroma, Dessement membranı (iç sınırlayıcı tabaka) ve endotel olmak üzere

5 kısımdan oluşmaktadır (7, 8) (Şekil 2.2).

Şekil 2.2. Kornea yapısının şematik gösterimi (Rowsey ve ark.(9)’dan değiştirilerek).

Kornea Epiteli

50 µm kalınlığında, korneanın en dış kısmında bulunan tabakadır. Sıvı kaybına

ve toz, bakteri gibi yabancı maddelerin gözün iç kısmına sızmasına karşı bir engel

oluşturmak üzere sıkı kavşaklar ile bir arada tutulan, 4-5 kat keratinize tabakalı yassı

(skuamöz) epitel hücreleri içeren bazal bir hücre katmanından oluşur. Ayrıca, kornea

ağrıya karşı çok hassas kılan küçük sinir uçlarıyla doludur ve lipofilik yapıdadır.

Küçük moleküller için seçici bir etki gösterir. Lipofilik ilaçlar kornea epitelinden hücre

içi (transselüler), hidrofilik ilaçlar hücrelerarası (paraselüler) yol ile geçmektedir (10).

Bowman Tabakası (Dış Sınırlayıcı Tabaka)

Kornea epitelinin hemen altında bulunan kolajen adı verilen güçlü protein

liflerinden oluşan 8-15 μm kalınlığında saydam bir doku tabakasıdır. Epitel tabakasını

alttaki bağ dokusuna bağlar. Bu katmandaki kolajen liflerinin sıkı bir şekilde

7

düzenlenmesi gözü oluşabilecek travmalara karşı dirençli hale getirir, korneanın

şeklini korumasına yardımcı olur. Ancak bu tabaka enfeksiyona veya darbeye bağlı

oluşabilecek deformasyonlarda yenilenememektedir (6, 10).

Kornea Stroması

Kornea kalınlığının yaklaşık % 90'ını (500 µm) oluşturan, büyük çoğunluğu

(% 78) su, geri kalan kısmı ise korneaya güç, elastikiyet ve şekil veren kolajenden

oluşan bir doku tabakasıdır. Bu kolajen kısım, kolajen fibrilleri ve keratin sülfat

oluşturan yan zincirlere sahip tip I ve V kolajeninden oluşmaktadır. Paralel ve düzenli

bir şekilde yerleşmiş olan fibriller, travma ve deformasyona karşı oldukça dirençlidir.

Stroma, korneanın hidrasyon ve yapısal özelliklerinin düzenlenmesinde yardımcı olur

ve kornea şeffalığına katkıda bulunur (6, 10).

Dessement Membranı (İç Sınırlayıcı Tabaka)

Kornea stroması’nın arka yüzünü örten ince ve saydam yapıda olan, kornea

endoteli tarafından üretilen bir tabakadır. Dessement membranı, enfeksiyona ve

yaralanmalara karşı koruyucu bir bariyer görevi görür. Yaralanma sonrası kolayca

yenilenir. Sürekli olarak üretildiği için kalınlaşan bir tabakadır. Bu sayede enzimatik

bozunmalara ve toksinlere karşı daha dirençlidir (6, 10).

Kornea Endoteli

Korneanın en iç tabakasıdır. Dessement membranı örter. Tek tabaka halinde

yassı epitel hücrelerden oluşur. Hücreler arasında sıkı bağlar bulunmaktadır. Bu

hücreler göz içi sıvısı ile temas halindedir. Endotel tabaka, kornea stromasından sızan

fazla sıvıyı uzaklaştırırken, aköz hümörden gerekli besin ve moleküllerin alınmasını

sağlar (6, 10).

İris, pupilin kontrolünden sorumlu, ince ve dairesel bir yapıya sahip olan

dokudur. İrisin ana fonksiyonu, bir diyafram gibi, gözbebeğinin boyutunu

değiştirerek göz içine girecek olan ışığın miktarını ayarlamaktır. Pigmentli

fibrovasküler tabaka ve pigment epitel hücreleri olmak üzere iki kısımdan

oluşmaktadır. İris, göz merceği (lens) ile kornea arasını anterior segment (kornea ve

iris arasında) ve posterior segment (iris ve göz merceği (lens) arasında) olmak üzere

8

ikiye ayırmaktadır. Genetik yapıya ve iris içerisinde bulunan pigment miktarına bağlı

olarak farklı renklere sahip olabilir (11).

Pupil, ışığın retinada odaklanmadan önce geçtiği, iris içerisinde bulunan

açıklıktır. Pupilin büyüklüğünü, maruz kaldığı ışığın miktarı ile iris kaslarının

büyüklüğü kontrol eder. Maksimum daralmasında, pupilin çapı 1 mm'den daha az

olabilirken, çapının 10 katına kadar genişleyebilme kapasitesindedir. Pupilin

büyüklüğü; yaş, hastalık veya travmaya bağlı olarak değişebilmektedir (11).

Konjonktiva, sklerayı (göz akı) kaplayan ve göz kapağının içine doğru uzanan

ince bir zardır. Keratinize olmayan tabakalı epitel ve goblet hücrelerinden meydana

gelmektedir. Goblet hücreleri, müsin salgılayan tek hücreli bezlerdir. Ürettiği mukus

sayesinde gözün sürekli olarak nemli kalmasına yardımcı olur ve gözyaşı filminin

yüzey gerilimini azaltarak dayanıklı kalmasını sağlar, ayrıca, mikroorganizmaların

gözün iç kısmına girişini engeller. Korneaya sıkıca yapışık haldedir ve gözün kolay

hareket etmesini sağlayan kıvrımlara sahiptir, yapısında yoğun damar tabakası

içermektedir (11).

Siliyer cisim, göz merceğinin düzgün bir şekilde odaklanmasına yardımcı olan,

siliyer kas ve siliyer epitelden oluşan halka şeklinde kalınlaşmış bir dokudur (11).

Göz merceği (lens) pupilin arkasında, siliyer kaslarla çevrili ve ince saydam bir

kapsül içinde bulunan şeffaf bir yapıdır. Göz merceğinin boyutu, odaklanılan cismin

göze olan uzaklığına göre siliyer kaslar tarafından ayarlanabilmektedir (11).

Aköz hümör (saydam sıvı) göz içinde yer alan, jele benzeyen bir kısımdır.

Korneanın arka kısmında bulunan anterior segmentin içi aköz hümör ile doludur.

Yapısında, çok az miktarda sodyum ve klorür iyonları içermektedir. Aköz hümör,

dakikada yaklaşık 2.5 μL üretilebilmektedir (11).

Sklera, gözün en dış kısmında bulunan beyaz renkli, güçlü ve koruyucu

tabakadır. Kolajen lifler bakımında zengin, kalın bir fibröz yapıya sahiptir. Odacıklar

içindeki hidrostatik basınca karşı gözün şeklini korumasını sağlar. Skleranın ön

kısmında bulunan açıklığa kornea yerleşmiştir. Sklera, kasların ve zonüllerin (lens ile

siliyer cismin birbirlerine tutunmasını sağlayan asıcı bağların) yapışma yerlerini

bulundurur (12).

9

2.1.2. Posterior Segment (Arka Oda)

Vitröz hümör (jelatin görünüşlü camsı cisim), göz merceği ve retina arasındaki

boşluğu dolduran şeffaf, renksiz, jel kıvamında olan ve gözün %80’lik kısmını

oluşturan bir yapıdır. İçeriğini %98 oranında, su, hyalüronik asit ve kolajen fibril

oluşturmakta ve yapısında herhangi bir kan damarı bulunmamaktadır.

Koroid; bağ dokular, fibroblastlar, melanositler ve sklera ile retina arasında

kalan vasküler tabakadır ve retinaya oksijen ve besin sağlayan uveal sistemin (siliyer

cisim, iris ve koroid) arka kısmına yerleşmiştir. Isı dağılımı yoluyla gelen ışığı emerek

retinaya giden ışığın miktarının azalmasını sağlamaktadır, ayrıca, kan akışının

kontrolü ile göz içi basıncın ayarlanmasına yardımcı olmaktadır.

Retina (ağ tabaka), gözün arkasında bulunan, birbirine sıkıca sarılmış

milyonlarca hücreden oluşan ışığa duyarlı alandır. Yaklaşık 30-40 mm çapında ve 0.5

mm kalınlığında dairesel bir disk şeklindedir. Fotoreseptör hücreler, nöronal hücreler

ve glial hücreler olmak üzere üç temel tipte hücre grubuna sahiptir.

Kranial sinir olarak da bilinen optik sinir, gözü beyne bağlar. Optik sinir,

retinanın oluşturduğu sinirsel sinyalleri (impuls), gözün arkasını kaplayan sinir

tabakasına taşır. Yaklaşık 1,2 milyon sinir lifi içeren optik sinirler, retinada oluşmuş

görsel uyarıları elektriksel sinir sinyalleriyle beyne iletir (11).

2.2. Oküler İlaç Uygulamada Karşılaşılan Zorluklar

Göz, ilaç uygulamada çeşitli zorluklar oluşturan eşsiz bir koruyucu yapıya

sahiptir. Vücudun geri kalanından izole olmasına neden olan ve ilaç uygulamada

engeller oluşturan çeşitli hücre modifikasyonları geçirmiş bir organdır (3-4) (Şekil

2.3). Gözün ön veya arka kısmına ilaç uygulanırken karşılaşılan engeller aşağıdaki

gibidir;

Gözyaşı film bariyeri

Korneal bariyer

Konjonktival bariyer

Kan-aköz bariyeri

İç ve dış kan-retinal engeller (13-15).

10

Şekil 2.3. Göze ilaç uygulanmasında karşılaşılan engellerin şematik gösterimi

(Janagam ve ark.(16)’den değiştirilerek).

Gözün anterior segmentine, topikal veya sistemik olarak ilaç uygulanabilir.

Hem topikal hem de sistemik uygulamalarda, oküler engeller ilacın etkinliğini

azaltmaktadır.

Gözyaşı filmi, topikal ilaç şekillerinin karşılaştığı ilk engeldir. En dışta bir lipit

tabaka, ortada daha kalın bir sulu tabaka ve en içteki müsin tabakası olmak üzere üç

kısımdan oluşur. Gözyaşı, yaklaşık 0,5-2,2 μL/dak olacak şekilde 7- 30 μL toplam

hacme sahiptir ve 2- 3 dakikalık hızla gözyaşı bezleri tarafından üretilir. Gözyaşı

filminin sürekli olarak üretilmesi, uygulanan ilacın hızlı bir şekilde göz yüzeyinden

uzaklaştırılmasına neden olur (16).

Kornea, topikal ilaç şekillerinin karşılaştığı ikinci oküler bariyerdir. Beş

tabakadan oluşmaktadır. İlaç penetrasyonunda, önemli engeller oluşturan kornea

tabakaları, epitel ve stroma’dır. Kornea epitelinin hidrofobik yapısı ve epitel hücreleri

arasındaki sıkı bağlantı hidrofilik ilaçların kornea içine nüfuz etmesini engeller.

Kornea stroması ise hidrofilik yapısından dolayı lipofilik ilaçların korneadan

penetrasyonunu kısıtlamaktadır (16).

11

Konjonktiva da sahip olduğu kan ve lenfatik akış nedeniyle suda çözünen

ilaçların hızlı bir şekilde eliminasyonuna neden olarak göz içine nüfuz etmesini

zorlaştırmaktadır (16).

Anterior segmente sistemik olarak ilaç uygulanırken kan-aköz bariyeri

uygulanacak ilacın geçişini ciddi anlamda etkilemektedir. Kan-aköz bariyeri, ilaç

geçişini etkileyen iki tabakadan oluşmaktadır. Her iki tabaka da sahip oldukları sıkı

kavşaklar nedeniyle kandan aköz hümöre ilaç geçişini engellemektedir. Aköz hümörde

terapötik doza ulaşabilmek için yüksek dozda ilaç uygulanması gerekir, bu doza bağlı

olarak da ciddi sistemik yan etkiler oluşabilir (16).

Posterior segmente ilaç uygulama yolları incelendiğinde oküler

biyoyararlanımın düşük olması nedeni ile topikal ilaç şekilleri tercih edilmemektedir.

Bu nedenle, intravitreal enjeksiyonlar gibi ilaç uygulamaları öne çıkmaktadır. Ancak,

girişimsel olan bu uygulamalar, intraoküler basıncın artması ve retinal ayrılma gibi

önemli sorunlara yol açabilmektedir. Ayrıca, kan-retina bariyeri nedeniyle de sistemik

uygulanan ilacın gözün posterior segmente ulaşması büyük oranda engellenmektedir

(17, 18).

Yukarıda belirtilen anatomik ve fizyolojik engeller, göze ilaç uygulamada

karşılaşılan anatomik zorluklardır. Bunların yanı sıra, ilacın molekül büyüklüğü ve

şekli, yükü, iyonlaşma derecesi, çözünürlüğü ve lipofilikliği göze penetrasyonunu

etkileyen parametrelerdir. P-glikoproteinler (P-gp) gibi korneal akış proteinleri ve

çoklu ilaç direnci ile ilişkili proteinler, etkin ilaç tutulmasını önleyerek ilaç

moleküllerinin kornea epitelinden dışarı atılmasına yol açar. Oküler geçirgenliği

etkileyen faktörler Tablo 2.1’de özetlenmiştir.

Oküler terapötik sistemlerde etkin ilaç konsantrasyonun sağlanması için, ilacın

hedef bölgede yeterli süre istenen terapötik etkinlik ile kalabilmesi gerekmektedir.

İdeal bir topikal formülasyondan beklentiler; uygulanmasının kolay olması, iyi tolere

edilebilmesi, sistemik absorpsiyondan kaçınılması ve gözde kalış süresinin artırılmış

olmasıdır (19-22).

12

Tablo 2.1. Oküler geçirgenliği etkileyen faktörler (23).

Membran İlaç Formülasyon

Absopsiyon bölgesi

engelleri (kornea veya

sklera)

Konsantrasyon Etki bölgesinde kalış süresi

Kalınlık Çözünürlük pH

Porozite durumu Partisyon katsayısı Tonisite

Kıvrımlı yapısı Molekül ağırlığı Viskozite

Lipofilik/hidrofilik dengesi pKa Salım süresi

En yaygın oküler ilaç uygulama yöntemi, gözün cul-de-sac (konjonktival kese)

kısmına topikal damlaların uygulanmasıdır. Genel olarak, “topikal olarak uygulanan

ilacın % 5'inden daha azı” korneadan geçer ve göz içi dokularına ulaşabilir, geri kalan

dozun çoğu genellikle sistemik olarak nazolakrimal kanal veya konjonktiva yoluyla

gözden uzaklaştırılır. Göz damlasının uygulamasının kolay olmasına rağmen hedef

dokulara geçebilen ilaç miktarı uygulanan dozun çok altında kalmaktadır. Tahriş edici

etkiye sahip ilaçlar veya cihazlar gözyaşı salgılanmasını artırdığı için prekorneal

alandaki ilaç kaybının artmasına neden olmaktadır. İstenilen terapötik dozu elde

edebilmek için yapılan sık ve yüksek doz ilaç uygulaması ise hem lokal hem de

sistemik yan etkilerde artışa yol açmaktadır. İlaçların, gözün ön kısmından arka

bölümlerine geçişi, gözün sahip olduğu anatomik yapıdan dolayı sınırlıdır. Bu nedenle,

oküler yüzeye uygulanan ilaçlar genellikle posterior segmente yeterli terapötik

konsantrasyonda ulaşamaz. Çözüm olarak, formülasyonlarda, siklodekstrinler gibi

geçirgenlik artırıcıların kullanılması veya viskozitenin artırılması gibi çeşitli

seçenekler denenmesine rağmen istenilen başarı elde edilememiştir (24, 25). Oküler

biyoyararlanımı artırmak için kullanılabilecek farklı yaklaşımlar Tablo 2.2’de

verilmiştir.

13

Tablo 2.2. Oküler biyoyararlanımı artırmak için uygulanan farklı yaklaşımlar (26).

Penetrasyonun artırılması Formülasyonun iyileştirilmesi

Kimyasal modifikasyon

-Ön ilaç

-Penetrasyon artırıcılar

-İyon çiftleri

Farklı ilaç taşıyıcıları kullanmak

-Merhemler

-Biyoadezif taşıyıcılar

-Viskoz taşıyıcılar

-In situ jel

Farmasötik modifikasyon

-Siklodekstrin kullanımı Kolloidal sistemler

-Süspansiyonlar

-Lipozomlar

-Nanopartiküler sistemler

-Emülsiyonlar

Fiziksel modifikasyon

-İyontoforez uygulanması Katı polimerik sistemler veya tıbbi

cihazlar

-Biyoparçalanır implantlar

-Biyoparçalanır olmayan implantlar

-Kontakt lensler

-Kolajen plakalar

-İmplant cihazlar

2.3. Keratit

Kornea, yapısında bulunan antikorlar ve sahip olduğu refleksler ile kendisini

koruyabilen, çok hassas bir dokudur. Buna rağmen, tüm diğer dokularda olduğu gibi,

hastalık yapan birçok farklı etmenden kolaylıkla etkilenebilmektedir. Bu etmenler,

doğumsal veya edinsel kaynaklı olabilir. Korneada doğuştan var olabilen sorunlar

arasında, korneanın büyük veya küçük olması, eğriliğinin çok veya az olması gibi

durumlar sıralanabilir. Edinsel olanlar ise, kornea enfeksiyonlarıdır. Bu

enfeksiyonların kaynağı virüsler, bakteriler, mantarlar veya protozoalar olabilir.

Oluşan bu enfeksiyonlara bağlı olarak akıntı üretimi artar, görsel netlik azalır ve

korneada delinmeler meydana gelebilir (27, 28).

Ayrıca, epitel lezyonlarına neden olan travmalar, göz kapağı iltihabı (blefarit),

kuru göz, kontakt lensler ile topikal ve sistemik bağışıklık baskılayıcı

(immünosüpresif) maddeler korneada enfeksiyon riskini artırabilen faktörlerdir.

Korneada oluşan enfeksiyonlar 3 gruba ayrılır:

Enfeksiyöz keratitler (bakteriyel, viral, fungal, akantamoeba )

İntersitisyel (doku arası) keratitler

Non-enfeksiyöz keratitler

14

2.3.1. Enfeksiyöz Keratitler

Bakteriyel Keratit

Bakterilerin yol açtığı bir kornea hastalığıdır. Özellikle kontakt lens

kullanımına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Bunun yanı sıra, refraktif cerrahi ile

ilişkili travmalarda, A vitamini eksikliğinde veya korneaya uygulanan anestezi

sonrasında görülebilmektedir (29). Kontakt lens kullanımındaki artış ile beraber

hastalığın görülme sıklığının arttığı belirlenmiştir. Yapılan bir çalışmada (30)

Amerika’da 1950’li yıllarda kontakt lens kullanımına bağlı gelişen kornea ülseri

vakasına rastlanmaz iken, 1990’lı yıllarda bu vakaların görülme oranı %55’e kadar

yükselmiştir.

Bakteriyel keratit, şiddetli ağrı, görmede azalma, gözde sulanma, kızarıklık,

ışığa karşı hassasiyet ve gözde akıntı ile karakterize olan bir enfeksiyondur. Bakteriyel

keratite bağlı olarak stromal apse oluşumu, anterior segment enflamasyonu, korneayı

çevreleyen ödem ve son aşamada korneal ülserasyonu görülmektedir (Şekil 2.4). Ülser

genellikle yuvarlak veya oval, keskin kenarlı ve düzensiz bir haldedir. Bazı bakteriler

o kadar etkili olurlar ki kırk sekiz saat içinde kornea yıkımı oluşabilir (31).

S. aureus, S.epidermidis, S. pneumoniae, S. pyogenes, enterokoklar,

P.aeruginosa, P. mallei, P. fluorescens, P. stulzeri, M. morganii, K. pneumoniae, S.

marcescens, E. coli, A. hydrophila, M. lcunata, A. calcoaceticus, N. gonorrhoae, B.

catarrhalis, B. laterosporus, B. brevis, C. diphtheriae, C. tetani, Haemophilus türleri,

T. pallidum, M. tuberculosis, M. chelonei, Nocardia türleriyle C. trachomatis gibi

mikroorganizmaların keratit etkeni olabileceği bildirilmektedir (32).

Keratit vakalarından en çok izole edilen iki mikroorganizma P. aeruginosa ve

S. aureus’dur. Bu iki bakteri, korneada ciddi enfeksiyonlara neden olabilmektedir (31).

Yirmi dört saat içinde tedavi edilmezlerse ürettikleri ekzotoksin ve proteinlerle

korneada delinmelere bile neden olabilirler (33-35). Özellikle kontakt lens kullanımına

bağlı gelişen bakteriyel keratitin yaklaşık %90’ının P. aeruginosa’dan kaynaklandığı

bildirilmiştir (36). Bu bakterinin gözde oluşturduğu ülser, diğer bakterilerin

oluşturduğu ülserlerden daha şiddetlidir ve tedavi edilmesi çok daha zordur (37).

Ayrıca, bu bakterinin antibiyotiklere karşı dirençli olması ve yüzeylere tutunabilme

15

kabiliyeti, hasarlı olan korneal epitel yüzeylerden içeri girmesini kolaylaştırmakta ve

kornea stromasında birikmesine yol açmaktadır (38-41).

Şekil 2.4. Bakteriyel keratite bağlı olarak oluşan kornea hasarları a)korneal delinme

b)kornea opaklaşması.

Viral Keratit

Genellikle Herpes simplex 1 virüsünün neden olduğu korneal bir hastalıktır.

Özellikle 6 ay-5 yaş arasındaki çocuklarda viral keratit vakaları görülmektedir. Altı

aydan küçük çocuklarda görülmemesinin nedeni anne sütünden alınan immün

globülinlerdir (42, 43).

Fungal Keratit

Uzun süreli steroid tedavisi görmüş ve buna bağlı olarak vücut direnci düşmüş

kişilerin kornealarında Candida aspergillus kaynaklı gelişen bir korneal hastalıktır

(42, 43).

Akantamoeba Keratit

Akantamoeba türleri sulu ortamlarda yaşayan bir protozoan türüdür. Kontakt

lensi ile havuza giren veya lens temizlenmesini çeşme suyu ile yapan kişilerde görülme

riski yüksektir. Tedavisi oldukça uzun sürer. Hastada ciddi göz ağrısı ve fotofobi

gözlemlenir (42, 43).

2.4. Bakteriyel Keratit Tedavisi

Kornea hasarlarını önlemek ve ilerleyen aşamalarda oluşabilecek görme

kayıplarının önüne geçmek için hızlı bir şekilde tedaviye başlanması gerekmektedir.

a) b)

16

Tedavide amaç, ilk olarak bakteri üremesinin önüne geçmek, daha sonra oküler iltihabı

azaltmak ve son olarak da korneayı tekrar saydam haline getirmektir. Tedavide ilk

olarak geniş spektrumlu antibiyotikler tercih edilmektedir, hastalık etkeni

belirlendikten sonra spesifik tedavi uygulanmaktadır.

Görmeyi tehdit eden şiddetli bir durum ortaya çıkmış veya hastanın tedavi

uyumu problemli ise (göz damlasının istenilen sıklıkta uygulanmaması) hastaya

sistemik tedavi uygulanması gerekebilir, bu durumda da gözetim altında tedavi

zorunlu olabilir.

Tedavide oluşabilecek problemler korneada kalıcı lekelenmelere yol açabilir.

Kalıcı lekenin önlenmesi için erken tedavi çok önemlidir, eğer tedaviye rağmen kalıcı

leke görülüyorsa kornea nakli (keratoplasti) gerekebilir (42, 44-46).

Enfeksiyona Karşı Kullanılan İlaçlar

1.Antibakteriyel

2.Antimikobakteriyel

3.Antiviral

4 Antifungal

5.Antiparazitik ilaçlar olmak üzere beş grup altında toplanabilir.

Antibakteriyel İlaçların Sınıflandırılması

Antibakteriyel ilaçlar sekiz grup altında sıralanabilmektedir.

Beta laktam antibiyotikler

Makrolid grubu antibiyotikler

Amfenikoller

Tetrasiklinler

Aminoglikozidler

Sülfonamidler

Dar spektrumlu polipeptid yapılı antibiyotikler

Florokinolonlar (siprofloksasin, ofloksasin, levofloksasin,

moksifloksasin, besifloksasin )

17

2.4.1. Florokinolonlar

Florokinolonlar, bakteriyel keratit tedavisinde en çok tercih edilen 6-fluoro-4-

kinolonkarboksilik asit türevi antibiyotik grubudur (Şekil 2.5). Bu grup

antibiyotiklerin 7 numaralı konumunda piperazin halkası bulunmaktadır. 1,5,7 ve 8

numaralı konumlarda bulunan yapıların değiştirilmesi sureti ile birçok yeni

florokinolon grubu antibiyotik elde edilmiştir.

Bu grup antibiyotikler, bakteri sitoplazması içine girerek, gram-negatif

bakterilerde DNA giraz enzimini, gram-pozitif bakterilerde ise topoizomeraz IV

enzimlerini inhibe ederek deoksiribonükleik asidin (DNA) süper sarmalını bozarlar.

Böylece, DNA replikasyonu ve DNA transkripsiyonu engellenir. Antimikrobiyal

etkilerine göre ‘kuşak’ olarak sınıflandırılmaktadırlar. İkinci kuşak florokinolonların

ve dördüncü kuşak florokinolonlardan besifloksasinin gözün bakteriyel

enfeksiyonlarında geniş kullanımı söz konusudur (47, 48).

Şekil 2.5. Florokinolon grubu antibiyotiklerin temel kimyasal yapısı.

2.5. Besifloksasin HCl (BH) Hakkında Genel Bilgiler

2.5.1. Besifloksasin HCl’nin Fiziksel Özellikleri

BH, beyaz-açık kahverengi arası, hemen hemen kokusuz bir tozdur. BH’nin

kimyasal yapısı Şekil 2.6’da gösterilmektedir. Suda çözünürlüğü pH'ya bağlı olarak

değişmektedir. pH değeri 3’e yaklaştıkça çözünürlüğünün maksimum düzeye ulaştığı

görülmüştür. pH 3,54 iken çözünürlüğü 10.63 mg/mL, pH 7 iken çözünürlüğü 0,08

mg/mL’dir. Metanolde ise çözünürlüğü 9.898 mg/mL’dir. Etanoldeki çözünürlüğü

18

1.122 mg/mL’dir. BH asetonitril ve isopropil alkolde çözünmemektedir. BH -20° C'de

ve sıkıca kapalı hava geçirmeyen kaplarda saklanmalıdır (49).

NN

O

OH

O

F

Cl

H2N

H Cl

Şekil 2.6. BH’nin kimyasal yapısı (49).

Kapalı formülü: C19H21ClFN3O3

Kimyasal adları: {7-[(3R)-3- aminoheksahidro- 1H-azepin-1-yl]-8-kloro-1-

clyclopropyl-6-floro-1,4-dihidro-4-okso-3-

kinolinokarboksilik asit}.

Molekül ağırlığı: 430.30 g/mol

CAS no: 1398566-43-2

2.5.2. Besifloksasin HCl’nin Farmakolojik Özellikleri

BH geniş spektrumlu, hem gram-pozitif hem de gram-negatif bakterilere karşı

etkili olan dördüncü kuşak florokinolon grubu bir antibiyotiktir (48, 50).

2.5.3. Etki Mekanizması, Direnç, Doz ve Farmakokinetik

BH, hücre bölünmesi üzerinde etkili olan topoizomeraz II (DNA giraz) ve

topoizomeraz IV bakteriyel enzimlerini inhibe eder. Bakterilerde, DNA molekülü

bakteri hücresine sığabilmek için “ süpersarmal ” olarak adlandırılan aşırı bir kıvrılma

durumu halindedir. Ancak bu aşırı kıvrılmış DNA’nın replikasyon ve transkripsiyon

yapması mekanik olarak mümkün değildir. Topoizomeraz II enzimi, DNA’nın

replikasyon ve transkripsiyonu gerçekleştirmesi için onu kırar, “ negatif sarmallaşma”

dediğimiz duruma getirir, işlem bittikten sonra yapıyı tekrar birleştirerek süpersarmal

19

haline gelmesini sağlar. Topoizomeraz IV ise bölünme sırasında kardeş

kromozomların, bölünme sonrasında oluşan hücrelere ayrılmasından sorumludur.

BH’nin topoizomeraz enzimlerini inhibe etmesiyle DNA replikasyonu ve bakteri

bölünmesi engellenmiş olur. Bunun sonucunda, bakterilerin normal olmayan bir

şekilde uzaması ve ölümü gerçekleşir (51, 52).

Mikroorganizmalar, DNA giraz ve topoizomeraz IV enzimini kodlayan

genlerde nokta mutasyonlar gerçekleştirerek ve membran dışa atım (efflux)

pompalarında değişiklikler yaparak florokinolonlara karşı direnç geliştirebilirler.

Bununla birlikte, BH’nin diğer florokinolonlara göre bu konuda bazı üstünlükleri

vardır. Bu üstünlüklerden birisi, DNA enzimlerinden yalnızca birine karşı afinitesi

olan florokinolonların aksine, BH’nin söz konusu iki DNA enzimine karşı da yüksek

afiniteye sahip olmasıdır. Bu durum, bakterilerin direnç geliştirebilmek için bu iki

enzimin alt birimlerini kodlayan genlerde oluşturabilecekleri mutasyon olasılığını

azaltmaktadır. Bunun yanı sıra, BH’nin sadece topikal uygulanıyor olması ve buna

bağlı olarak direnç gelişme riskinin azalması diğer bir üstünlüğüdür. Ayrıca

bakterilerde var olan ilaç dışa atım pompaları, hem gram pozitif hem de gram-negatif

mikroorganizmalarda antibiyotik direncine yol açabilen sistemlerdir. Ancak, bu direnç

mekanizmasının, BH duyarlılığı üzerinde önemli bir etkisinin olmadığı bildirilmiştir

(53, 54).

Yapılan bir çalışmada, topoizomeraz II ve topoizomeraz IV'ü kodlayan

genlerdeki mutasyonların sayısı artıkça, test edilen tüm florokinolonlar için

(besifloksasin, moksifloksasin, gatifloksasin, siprofloksasin ve levofloksasin)

‘Minimum İnhibitör Konsantrasyon’ (MİK) değerlerinin arttığı; bununla birlikte,

besifloksasin için bu artışın büyüklüğünün diğer florokinolonlarla karşılaştırıldığında

en az olduğu belirlenmiştir (1024 ila 2048 kat) (55, 56).

BH içeren Besivance® bakteriyel konjonktivit tedavisinde beş gün boyunca

günde üç kez (sekiz saatte bir) kullanılan bir göz damlasıdır. Tıbbi kriterlere bağlı

olarak yedi gün boyunca da kullanılabilmektedir. Bunun aksine, siprofloksasin,

gatifloksasin, levofloksasin ve ofloksasin gibi diğer florokinolonlar sadece beş gün

süre ile kullanılabilmektedir. Ayrıca, diğer florokinolonlar ilk iki gün her iki saatte bir

1-2 damla ve daha sonraki günler günde en az 4 kez 1-2 damla olmak üzere uygulama

20

gerektirirken, BH aynı etkiyi sekiz saatte bir yapılacak uygulama ile

sağlayabilmektedir (57, 58).

İlaçların farmakokinetik özellikleri, in vivo etkinlikleri için önemli bir

parametredir. Proksch ve ark. (59) altmış dört sağlıklı insan üzerinde yaptığı bir

çalışmada, gözyaşında besifloksasinin farmakokinetik parametrelerini

değerlendirmiştir. Besifloksasinin, bir defa topikal uygulamasından on dakika sonra

gözyaşındaki maksimum konsantrasyonu 610 ± 540 µg/g olarak tespit edilmiştir.

Yirmi dört saat boyunca alınan gözyaşı örneklerinden elde edilen değerlerin grafiğe

geçirilmesi sonucunda, gözyaşındaki besifloksasine ilişkin AUC0-24h değeri 1,232

µg.h/g olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, gözyaşında bulunan besifloksasinin, 3,4 saatlik

bir yarılanma ömrü ile uzaklaştığı görülmüştür. Topikal uygulamadan sonra plazma

üzerinden yapılan sistemik ölçümlerde kandaki maksimum besifloksasin değerinin 0,5

ng/mL olduğu belirlenmiştir (Tablo 2.3).

Tablo 2.3. Besifloksasinin insan gözyaşındaki farmakokinetik parametreleri (59).

2.5.4. Antibakteriyel Aktivite

Florokinolonlarda, bir kuşaktan diğerine geçildiği zaman öncelikle gram-

pozitif aerob ve anaerobiklere karşı bakterisit etkiyi artırmak için kinolon omurgasında

modifikasyonlar yapılmaktadır. İlk kuşak florokinolonların çekirdeğinde bulunan C-6

ya florin ilavesi veya C-7’ye siklik diamin piperazin eklenmesi gram-pozitif

stafilokoklara karşı aktivite sağlamış, sonrasında gatifloksasin gibi yeni nesil

florokinolonların C-8 pozisyonuna metoksi ilave edilmesi ile gram-pozitif ve

anaerobik bakterilere karşı aktivite artışının gerçekleştiği saptanmıştır (51, 60).

Parametre Değerler

Cmaks, ortalama ± SS 610 ± 540 µg/g

Tmaks 10 dakika

AUC0–24h 1,232 µg.s/g

Yarılanma ömrü 3,4 saat

Sistemik Cmaks 0.5 ng/mL

21

BH molekülü gatifloksasine benzer bir yapıya sahiptir ancak C-8 pozisyonunda

klor (gatifloksasin için C-8 de metoksi grubu bulunmaktadır) ve C-7 de amino-azepinil

grubu (gatifloksasin için metil-piperazinil bulunmaktadır) bulunması bakımından

farklılık göstermektedir. 8-kloro ve 7-azenepil sübstitüentlerinin kombinasyonu

BH’nin bakterisit etkisini diğer florokinolonlara oranla çok daha üstün hale getirmiştir

(55, 61).

2.6. Göze Uygulanan İlaç Şekilleri

Göze uygulanan ilaç şekilleri, tercihen göz küresi veya konjonktivaya

uygulanan veya konjonktival keseye yerleştirilen sıvı, yarı katı, katı veya kolloidal

özelliklerde olan steril ürünlerdir. Oküler preparatlarda istenilen etkiyi sağlamak için

bir veya daha fazla etken madde ayrıca etken maddenin stabilitesini veya etki gücünü

artırmak için de yardımcı maddeler kullanılabilmektedir. Gözde oluşabilecek

rahatsızlıkları tedavi edebilmek için sıklıkla çözelti, jel veya merhem tipi

formülasyonlar tercih edilmektedir. Ancak, bu uygulama şekillerinin gözde kalış

sürelerinin kısa olması, tekrarlanan uygulamalara ihtiyaç duyulması ve tekrarlanan

uygulamalara bağlı yan etki oluşturma gibi sıkıntıları vardır. Bu nedenle, özellikle

2000’li yılların başından itibaren farklı ilaç şekilleri üzerinde çalışmalar yapılmaya

başlanmıştır (62). Oküler hastalıkların tedavisinde kullanılan ilaç şekilleri Şekil 2.7’de

gösterildiği gibidir (37, 63-65).

22

Şekil 2.7. Göze uygulanan ilaç şekilleri (37).

2.6.1. Sıvı İlaç Şekilleri

İçerisinde, izotoni ayarlayıcı, tamponlayıcı, viskozite artırıcı, çözünürlük

artırıcı ve stabilize edici yardımcı maddeler içerebilen, bir veya daha çok etken madde

kullanılarak hazırlanan steril ürünlerdir (37).

Kolay uygulanabilmesi gibi bir üstünlüğe sahip olmasına rağmen, gözde kalış

süresinin kısa olması, ilaç stabilitesinin düşük olması, düşük biyoyararlanıma sahip

olması (yaklaşık %5) ve koruyucu kullanılması gerekliliği sıvı ilaç şekillerinde

karşılaşılan ciddi problemlerdir (66).

2.6.2. Yarı Katı İlaç Şekilleri

Bir veya daha çok etken maddenin, uygun bir sıvağ içerisinde çözülmesi veya

dağıtılması ile hazırlanan preparatlardır. Lokal bir etki elde etmek amacı ile

hazırlanırlar. Basit ve bileşik sıvağlar kullanılarak hazırlanabilirler (19). Polivinil alkol

(PVA), Karbopol gibi polimerler kullanılarak hazırlanan viskoz jeller basit sıvağlar ile

23

hazırlanan preparatlara, yağ/su veya su/yağ emülsiyonlar şeklinde hazırlanan sistemler

bileşik fazlı preparatlara örnek olarak verilebilir (37, 67).

2.6.3. Katı İlaç Şekilleri

Oküler İnsertler

Şekil 2.8. A)Ocusert® insertlerin şematik gösterimi B) Ocusert®’in uygulanması

(68).

Oküler insertler; gözde konjonktival keseye veya korneaya uygulanabilen

taşıyıcı platform olarak polimerlerin kullanıldığı, steril, katı veya yarı katı

preparatlardır (Şekil 2.8) (28).

Geleneksel sistemlerin uygulama sırasında oluşturduğu problemlerin ortadan

kaldırılması için kullanılırlar (69). Oküler insertlerin asıl amacı, topikal tedaviye

uygun olacak şekilde sürekli bir salım sağlamak ve etken maddenin konjonktival doku

ile temas süresini artırmaktır .

Oküler insertlerin üstünlükleri şu şekilde sıralanabilmektedir;

Oküler temas süresi uzadığı için geleneksel sistemlere oranla oküler

biyoyararlanımı ve ilaç aktivitesini artırır,

Yavaş ve kontrollü bir ilaç salımı sağlar,

Geleneksel sistemlerde görülen dozlama problemlerinin önüne geçerek

hasta uyuncunu artırır,

İlacın sistemik absorpsiyonunun azalmasını sağlar,

A) B)

24

Formülasyonlarında koruyucu kullanılmaması nedeni ile olası istenmeyen

etkileri minimuma indirir,

Yeni kimyasal yaklaşımların kullanılmasına olanak sağlar, (örneğin

ilaçların lipofilik özelliği modifiye edilerek ön ilaç formu hazırlanıp

inserte yüklenmesi ile korneadan geçişi artırılabilir)

Etken maddelerin yarılanma ömrünü uzatır (68, 70, 71).

İnsertler doğal, yarı sentetik ve sentetik polimerler kullanılarak hazırlanabilir

(72). Kullanılan polimerler gözde parçalanır veya parçalanmadan kalabilir.

Biyoparçalanır olmayan polimerlerin kullanıldığı durumlarda ilaç salımı bitince insert

gözden uzaklaştırılır. İnsert üretiminde kullanılacak polimerler, iritasyon yapmamalı,

istenmeyen etki ve immünojenik reaksiyona neden olmamalıdır (73). İnsertlerin,

geleneksel sistemlere göre en büyük üstünlüğü, oküler temas süresini uzatarak

biyoyararlanımı artırmasıdır (70). Üstündağ ve ark. (74) yapmış oldukları bir

çalışmada, bakteriyel keratit tedavisinde kullanılmak üzere ofloksasin yüklü kitosan

insertler hazırlamışlardır. Yapılan in vivo çalışma sonucunda, insertlerin yirmi dört

saat süre ile gözde kaldığı ve piyasa preparatına oranla Cmaks değerini altı kat artırdığı

görülmüştür. Ayrıca, insertlerin gözde kalış süresini daha fazla uzatmak amacıyla

insert formülasyonlarına biyoadezif bir polimer ilavesi yapılabilir. Yapılan bir

çalışmada (75) hidrofilik polimer olarak hidroksipropil selüloz (HPC), hidrofobik

polimer olarak etil selüloz (EC) ve biyoadezif polimer olarak çapraz bağlı poliakrilik

asit türevleri (Karbopol) kullanılarak hazırlanan insert matriksi içerisine fluoresein

sodyum disperse edilmiş, tavşanlarda iritasyon ve gözden eliminasyon incelemeleri

yapılmıştır. Formülasyonda, % 4 Karbopol (a/a) ve % 40 EC (a/a) bulunması

durumunda gözde iritasyon oluştuğu, % 2’nin üstünde Karbopol içeren insert

formülasyonlarının gözden atılamadıkları saptanmıştır (75).

25

İnsert Çeşitleri

Çözünürlüklerine göre insertler; çözünmeyen, çözünen ve eriyebilen olarak

sınıflandırılmaktadır (Şekil 2.9).

Şekil 2.9. İnsertlerin çözünürlüklerine göre sınıflandırılması (76).

Çözünmeyen İnsertler

Çözünmeyen insertler difüzyonel sistemler, osmotik sistemler ve kontakt

lensler olmak üzere üç gruptan oluşur. İlk iki grubun içerisinde yer alan ilaç taşıyıcı

insertler, iç kısmında gerekli zamanda salımı gerçekleştirmek üzere ilaç dolu bir

rezervuara sahiptir. Bu rezervuar sıvı, jel, kolloid, yarı katı veya katı bir matriks

olabilir. Bu sistemlerde hidrofobik, hidrofilik, organik, inorganik, doğal veya sentetik

maddelerden taşıyıcılar tercih edilebilir. Kontakt lensleri içeren üçüncü sınıf ise,

çözünmeyen oftalmik cihazların özel bir grubudur (77). Kontakt lens üretiminde

polimer olarak, polimetil metakrilat (PMMA) ve türevleri, hidroksietil metakrilat

(HEMA) ve polivinil alkol (PVA) kullanılmaktadır (78, 79).

26

Difüzyonel İnsertler

Difüzyonel sistemler, yarı geçirgen bir zardan veya mikrogözenekli

membranlardan oluşan bir rezervuardan kesin olarak belirlenmiş bir oranda ilaç salımı

gerçekleştiren sistemlerdir (80). Bu sistemlerde kullanılan membranlar salım hızında

görülebilecek ani bir düşüşün önüne geçebilmek amacıyla sabit kalınlıktadır.

Difüzyonel sistemlerde, ilaç salımı hızı, membrandan geçen gözyaşı sıvısı ile kontrol

edilir, yeterli iç basınç sağlandığında, rezervuardan ilaç salımı başlar. Difüzyonel

mekanizma ile hazırlanmış insertlerde, salım mekanizması Şekil 2.10’da görüldüğü

gibi üç periyotta gerçekleşmektedir. İlk olarak rezervuar ile göz yüzeyi arasında

dengenin kurulmasına karşılık gelen ve hızlı bir ilaç salımının gerçekleştiği Bölge A,

bunu takiben salım hızının ilk bölgeye oranla azaldığı fakat sabit bir hızda devam ettiği

Bölge B, son olarak rezervuarda ilacın tükenmesine karşılık gelen ve azalan bir salımın

gözlendiği Bölge C görülmektedir. Piyasada, ilaç olarak pilokarpinin, polimer olarak

etilen-vinil asetatın (EVA) kullanıldığı insert formülasyonu bulunmaktadır

(Ocusert®). Ocusert® difüzyonel prensiplere uygun bir şekilde üretilmiş, yedi gün süre

ile salım yapan ve glokom tedavisinde kullanılan bir inserttir (81).

Şekil 2.10. Rezervuar tipi cihazlardan salım oranının şematik gösterimi (77).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120

Bölge B Bölge C

Bölge A

% S

alı

m m

ikta

rı

Zaman

27

Osmotik İnsertler

Osmotik insertler, genellikle yarı geçirgen bir polimer ile çevrili olan merkezi

bir yapıdan oluşur (Şekil 2.11). Merkezi kısım tek veya iki ayrı hazneden oluşabilir.

Tek hazneden oluşan sistemlerde, polimerik bir matriksin içinde dağılmış ve osmotik

basınç oluşturan bir madde ile ilaç birlikte bulunurken iki hazneden oluşan sistemlerde

ise ilaç ve osmotik çözünen maddeler iki ayrı bölmede bulunur. Bu şekilde ilacın

elastik bir geçirgen zar ile osmotik maddenin ise yarı geçirgen bir zar ile kaplanması

mümkün olur (77).

Şekil 2.11. Osmotik insertin şematik gösterimi (82).

Osmotik insertin göze uygulanmasını takiben, gözyaşı sıvısı, dış çevreyi

kaplayan polimerik membrana yayılır, polimer ıslanmaya başlar ve çözünme

indüklenir. Bu çözünmüş depoların oluşturduğu hidrostatik basınç ile ilacın

çevresindeki polimerde kopmalar başlar ve insertte delikler oluşur, bu deliklerden ilaç

salımı gerçekleşir (82, 83). Osmotik insertlerin üretiminde kullanılan bileşenler Tablo

2.4’te verilmiştir (84).

28

Tablo 2.4. Osmotik insertlerin bileşenleri (84).

Su geçirgen matriks Etilen-vinil ester kopolimerleri, plastikleştirilmiş

polivinil klorür, polietilen, polivinil pirolidon

Yarı geçirgen membran Selüloz asetat türevleri, etilen vinil asetat, akrilik ve

metakrilik asit poliesterleri

Osmotik madde İnorganik - magnezyum sülfat, sodyum klorür,

potasyum fosfat dibazik, sodyum karbonat ve

sodyum sülfat.

Organik - kalsiyum laktat, magnezyum süksinat ve

tartarik asit.

Karbonhidratlar - sorbitol, mannitol, glukoz ve

sukroz.

Kontakt Lensler

Kontakt lensler, kovalent olarak çapraz bağlanmış hidrofilik veya hidrofobik

polimerden oluşabilen üç boyutlu bir ağ veya matriks yapısına sahip oftalmik

cihazlardır.

Kontakt lenslere farklı şekillerde ilaç yüklenebilir. Bu yöntemlerden birisi,

kontakt lensin ilaç çözeltisine batırılarak ilacın emdirilmesidir. Bu yöntemin en

önemli sıkıntısı ilaç salımının çok hızlı olmasıdır (85). Bir başka yöntem ise, kontakt

lensin üretimi sırasında ilacın polimerler arasına homojen olarak dağıtılmasıdır (86).

Bu yöntem sayesinde, ilaç salımında yaşanan sıkıntılar aşılabilir. Ayrıca, polimer

kimyasındaki ilerlemeye bağlı olarak, bu yöntem ile üretilmiş kontakt lens grubu

insertlerde de önemli gelişmelerin olabileceği düşünülmektedir. Ancak, kontakt

lenslerin kullanımı ile ilişkili kornea hasarı ve enfeksiyon riskinden dolayı, ilaç taşıyıcı

sistem olarak kullanılabilmesi konusunda daha ileri Ar-Ge çalışmaları gerekmektedir.

Henüz piyasaya çıkmış ilaç yüklü bir kontakt lens ürünü bulunmamaktadır (87).

Çözünebilen Oküler İnsertler

Çözünebilir insertler, oküler hastalıkların tedavisinde kullanılan en eski insert

modelidir (88). Gözyaşında çözündükleri için etken maddenin salım süresi bittikten

sonra gözden çıkarılma işlemine ihtiyaç duyulmaz. Bu durum, çözünür insertlerin en

önemli üstünlüğüdür. Bu grup insertler doğal polimerler ve sentetik polimerler

kullanılarak hazırlanan insertler olarak iki alt başlıkta sınıflandırılmaktadır (77).

29

Doğal Polimerler

Çözünür oküler insertler üretmek amacıyla kullanılan doğal polimerler tercihen

kolajen ve kitosan türevleridir. Bu polimerler kullanılarak hazırlanan insertlere ilaç

yüklemek için insert, ilaç çözeltisine daldırılır ve ilacı emmesi sağlanır, bu işlem

bittikten sonra kurutulur. Göze uygulamadan önce ise tekrar sulandırılır ve uygulama

yapılır. İnsertlere yüklenen ilacın miktarı, mevcut olan bağlayıcı maddenin miktarına,

bileşiğin ıslatıldığı ilaç çözeltisinin konsantrasyonuna ve ıslatma süresine bağlıdır. Bu

tarz insertlerde, ilaç, polimerin çözünmesi ile oluşan polimer arası boşluklardan salınır

(89).

Sentetik Polimerler

Bu polimerler kullanılarak hazırlanan insertler, kolayca işlenebilen ve oküler

kullanıma iyi uyum sağlamış sistemlerdir. Bu insertlerde, ilaç salımı iki ayrı aşamada

gerçekleşir. Birinci aşamada, gözyaşı insert içine nüfuz eder ve yüksek bir ilaç salımı

gerçekleşir takiben insertin çevresinde bir jel tabakası oluşur. İkinci aşamada ise

çekirdeğin etrafını saran bu jel tabakasından, difüzyonla kontrol edilen ilaç salımı

gerçekleşir (90, 91).

Tablo 2.5. Çözünür insert hazırlanmasında kullanılan sentetik polimerler (84).

Çözünebilir sentetik polimerler Selüloz türevleri

Polivinil alkol

Etilen-vinil asetat kopolimeri

Hipoksi alkil akrilat türevleri

Biyoeriyen (Bioerodible) İnsertler

Biyoeriyen insertlerde, ilaç matriks içerisinde homojen olarak dağıtılmıştır. Bu

insertler hazırlanırken kullanılan polimerlerin sahip olduğu kimyasal bağlar,

uygulamadan sonra gözyaşı ile hidroliz olurlar ( Biyoerozyon, göz çevresinde uzun bir

periyot sonunda oluşan hidrolizle, polimerin birim yapısında meydana gelen güvenli

parçalanma veya bozunma olarak tanımlanabilir). Bu hidroliz süresine bağlı olarak

sistemin salım özellikleri değişmektedir. Bu sistemlerin, en büyük üstünlüğü,

polimerlerin sentezi sırasındaki, elde edilecek ürünün son yapılarının değiştirilmesi ile

30

biyoerozyon oranlarının farklılaştırılabilmesidir. Biyoeriyen insertlerin en önemli

problemleri ise salım özelliklerinin hastanın fizyolojisine ve lakrimasyon hacmine

bağlı olarak değişmesi ve polimer parçalanma ürünlerinin gözde toksik etki

oluşturabilmesidir. Yeni biyoeriyebilen polimerlerin (poli (ortoesterler) ve poli

(ortokarbonatlar) vb.) geliştirilmesi ile bu sorunların aşılabileceği bildirilmektedir

(92). Tablo 2.6’da biyoeriyen insert formülasyonunda kullanılan polimerler

gösterilmektedir.

Tablo 2.6. Biyoeriyen insert formülasyonunda kullanılan polimerler (77).

Biyoeriyen polimerler Poliester türevleri poli (ortoesterler),

Polikarbonat türevleri,

Poli (karboksi) asit türevleri

İnsert Üretim Yöntemleri

İnsertler farklı yöntemler ile üretilebilmektedir (93). İnsert üretim teknikleri

aşağıdaki gibidir.

Çözücü uçurma

Liyofilizasyon

Sıcak eriyik ekstrüzyon

Katı dispersiyon ekstrüzyon

Yuvarlama yöntemi

Nanofiber (Nanolif) Yöntemi

2.7. Nanolifler

2.7.1. Boyutları

Nanolifler, boyutları (lif çapları) 3-5000 nm arasında değişebilen, yüksek

yüzey alanı/hacim oranına ve poroziteye sahip ve özellikle son yıllarda kontrollü ilaç

salım sistemleri olarak kullanılması amacıyla çalışmaların yoğun olarak

gerçekleştirildiği ilaç taşıyıcı platformlardır (94-96). Oldukça esnek yapıda olan

nanolifler, aynı anda birden fazla ilaç yüklenebilme kapasitesine sahiptir. Üretilen

polimerik nanoliflerin etkinliğini belirleyebilmek için, kütle (kimyasal yapı ve

31

morfoloji veya nanoyapı) ve yüzey (kimyasal gruplar, pürüzlülük, yüzey enerjisi)

özelliklerinin iyi bir şekilde anlaşılması gerekmektedir. İstenilen özelliklerde, işlevsel

liflerin geliştirilebilmesi kütle ve yüzey özelliklerinin çok iyi kontrol edilmesine

bağlıdır (97). Nanolif teknolojisinin üstünlüklerinden birisi, lif çaplarının boyutunun

küçük olmasına rağmen, ağırlık veya hacme oranla yüzey alanının ciddi bir şekilde

artırılabilmesidir. Bu geniş yüzey alanı sayesinde nanolifler, yüksek miktarda madde

tutma kapasitesine sahip olur (98).

2.7.2. Nanolif Üretim Teknikleri

Farklı teknikler (99) kullanılarak nanolif üretimi yapılabilmektedir. Bu

yöntemlerin bazıları ile laboratuvar ölçeğinde üretim yapılabilirken (100, 101) bazıları

ile endüstriyel boyutta da üretim yapılabilmektedir (101). Örneğin nanolif üretimi

açısından yeni kullanılmaya başlanan elektro-eğirme tekniği ile hem laboratuvar, hem

de endüstriyel ölçekte nanolifler üretilebilmektedir (102). Nanolif üretiminde

kullanılan yöntemler aşağıda sıralanmıştır (99).

Çekme yöntemi

Yüzeyler arası polimerizasyon yöntemi

Eriyik üfleme yöntemi

Faz ayrımı yöntemi

Kendiliğinden birleşme yöntemi

Şablon sentez yöntemi

Şablon eriyik ekstrüzyonu yöntemi

Mekanik eğirme yöntemi

Elektro-eğirme tekniği (102)

2.8. Elektro-Eğirme Tekniği

Elektro-eğirme, iletken bir tüpün ucundaki polimerik çözelti veya eriyiğin

üzerine elektrik kuvvetinin uygulanmasıyla, içi boş veya katı, mikro / nanometre

boyutunda, polimerik liflerin oluşturulması işlemidir. Elektro-eğirme, otuz yılı aşkın

bir süredir yoğun bir şekilde kullanılmaktadır (103). Son 10-15 yıldır ilaç taşıyıcı

sistem olarak kullanılmak üzere nano boyutta lif üretimi için en sık tercih edilen

yöntemdir. Elektro-eğirme sistemi, polimer çözeltisini eritmek veya şeklini

32

değiştirmek için yüksek gerilim uygulayabilecek bir güç kaynağı, topraklayıcıya sahip

bir toplayıcı ve bir şırınga pompasından oluşur (Şekil 2.12) (104). Elektro-eğirme

işleminde, şırınga ile toplayıcı arasına bir potansiyel (kV) uygulanır. Uygulanan

elektrik alanı damlacıkların yüzey gerilimini aştığında, yüklü bir polimer solüsyon jeti

iğnenin ucundan çıkar. Jet, çözücü buharlaşmasına bağlı olarak polimerin

katılaşmasıyla sonuçlanan artan yüksek çaplı halka ile daha uzun ve daha ince bir

şekilde büyür. Katılaşmış nanolifler daha sonra hedef üzerinde toplanır. Elektro-

eğirme işlemi, uygulama yapacak kişinin güvenliği için atmosferik etkiye sahip bir

koruma alanı içinde yapılmalıdır. Bu yöntem ile klasik yöntemle üretilen liflerden yüz

kat daha küçük yarıçapta lifler elde edilmektedir (104, 105).

Şekil 2.12. Elektro-eğirme yönteminin şematik olarak gösterimi –(Rim ve

ark.(104)’dan değiştirilerek).

2.8.1. Elektro-Eğirme Y Hazırlanan Nanoliflerde Formülasyon

Bileşenleri

Polimerler, çözücüler, etken maddeler ve diğer yardımcı maddeler nanoliflerin

hazırlanmasında kullanılan bileşenlerdir.

Elektro-eğirme yönteminde doğal veya sentetik polimerler kullanılarak nanolif

üretimi gerçekleştirilebilir. Polimer tercihinde biyouyumlu, biyoparçalanır özellikte

ancak sitotoksik olmayanlar öne çıkmaktadır. Kullanılan polimerin mekanik

33

direncinin de üretime uygun olması önemli bir ölçüttür. Üretim sırasında tek tip bir

polimer kullanılabileceği gibi birden fazla çeşitte polimerler kullanılabilmektedir.

Doğal ve sentetik polimer karışımından üretilen nanoliflerde kullanılan doğal

polimerler ile ilaç taşıyıcı platformun biyolojik uyumu artırılırken, sentetik polimerler

ile mekanik direnci artırılmaktadır (106).

Su, biyouyumlu olması nedeniyle en çok tercih edilen çözücülerden birisidir

ancak kullanımı sadece hidrofilik polimerlerle kısıtlıdır. Elektro-eğirme yönteminde

en sık kullanılan organik çözücüler ise; diklorometan, metanol, etanol, asetik asit,

dimetilformamid, aseton, etil asetat, trifloroetanol, tetrahidrofuran ve formik asittir.

Optimum çözelti viskozitesi, uygun yüzey gerilimi ve çözücü uçuculuğunu elde

edebilmek için gerektiğinde iki ya da daha fazla çözücü karışımı kullanılabilir (107).

İlaç taşıyıcı sistemlerde amaç; istenen süre boyunca etken maddenin kontrollü

bir şekilde salımını sağlamaktır. Nanolifler geniş yüzey alanına sahip olduğu için

özellikle çözünürlüğü az olan etken maddelerin çözünürlüğünü ve çözünme hızlarını

artırarak hızlı bir şekilde salınmalarını sağlar (108).

Elektro-eğirme ile nanolif oluşumunda üretim prosesini iyileştirmek,

verimliliği artırmak ve boncuk oluşumunu azaltıp daha homojen nanolifler elde etmek

amacıyla polimer çözeltilerine tuzlar ve yüzey aktifler eklenebilir (104).

2.8.2. Elektro-Eğirme İşlemine İlişkin Parametreler

Elektro-eğirme yönteminde, ilk olarak polimerlerin uygun çözücülerde

çözündürülmesi veya ısıyla eritilmesi gerekmektedir. Bu şekilde hazırlanan polimer

çözeltileri, cam bir pipete veya şırıngaya yerleştirilerek elektro-eğirme cihazında

kullanılabilir. Bu cihazda ilk olarak şırınga içine yerleştirilen polimer çözeltisi, şırınga

pompası yardımı ile besleme ucuna gönderilir, aynı anda besleme ucuna bağlı olan ve

yüksek gerilim uygulayabilen bir güç kaynağı ile elektriksel alan oluşturulur. Güç

kaynağından çıkan elektriksel kuvvet (gerilim) artırıldığında, besleme ucundaki

çözeltinin viskoelastik kuvvetleriyle elektriksel kuvvet arasında oluşan mücadeleye

bağlı olarak şırınga içerisinde bulunan sıvının şeklinde değişme meydana gelir.

Zamanla, bu kuvvetler arasındaki dengelenme ile şırınganın uç kısmında bulunan sıvı,

Taylor konisi olarak da adlandırılan konik bir şekle dönüşür ki, bu anda sisteme

uygulanan gerilime ‘kritik gerilim’ denir. Bu gerilim ile besleme ucunda fıskiye

34

şeklinde bir jet oluşumu meydana getirir. Bu sırada, polimer çözeltisinde var olan

kıvrılma/bükülme gibi kararsızlıklar ortadan kalkar ve çözücüde buharlaşma meydana

gelir. Sonuçta, toplayıcıya doğru ilerleyen parçacıkların çaplarında mikro veya nano

ölçülere kadar azalma gözlemlenir. Bu sayede istenen özellikte ürünlerin geliştirilmesi

sağlanmış olur (109-111).

A) Elektro-Eğirme İşleminde Prosese İlişkin Parametreler

Elektro-eğirme yöntemi göreceli olarak kullanım kolaylığı sahip olmasına

rağmen, lif oluşumunu ve oluşan liflerin yapısını etkileyebilecek bir dizi işlem

parametresine sahiptir. Elektro-eğirme işlem prosesine etki sırasına göre gruplanan bu

parametreler; uygulanan gerilim, polimer akış hızı ve kılcal toplayıcı mesafesidir

(112).

Uygulanan Gerilim

Elektro-eğirme yöntemiyle üretim yapabilmek için çözeltiye belirli bir gerilim

değerinin uygulanması yöntemin kilit noktalarından bir tanesidir. Sistemde var olan

yüksek gerilimli elektrik akımına bağlı olarak polimer çözeltisi elektrik yüklenir ve

çözelti topraklanmış olan toplayıcıya doğru bir jet halinde ilerlemesine neden olan

elektrostatik kuvvetlerin etkisi altına girmiş olur. Çözeltiye etki eden bu elektrostatik

kuvvet, çözeltinin sahip olduğu yüzey gerilimi kuvvetlerini yendiği zaman elektro-

eğirme süreci başlar ve bu uygulanan gerilime göre lifin boyutu, boncuk oluşumu veya

jet oluşumu değişebilmektedir (113).

Proses içinde bulunan parametreler birbiri ile bağlantılıdır. Uygulanan

gerilimin yükselmesi jet yüzeyindeki yük miktarının artmasına neden olur ve buna

bağlı olarak iğne ucundan daha fazla hacimde çözelti çekilir ve jetler hızlanır, ayrıca

Taylor konisi küçülür ve dayanıksız hale gelebilir. Aslında, lif çapını etkileyecek

faktörlerden birisi de jetin havada kalış süresidir. Uzun bir uçuş süresi ile jet plakaya

ulaşmadan önce daha çok uzar ve gerilir. Bütün bu bilgilerin ışığında, lif çapı ve

morfolojisini istenilen şekilde ayarlayabilmek için kritik gerilim değerinin

belirlenmesi gerekmektedir (114, 115).

35

Akış Hızı

Elektro-eğirme işlemi sırasında etkili parametrelerden biri de polimer

çözeltisinin akış hızıdır. Çekilen hacme bağlı olarak, uçuş süresi sırasında liflerde

bulunan çözücünün buharlaşması için gerekli zaman değişebilmektedir. Çekilen hacim

artırıldığında çözücünün buharlaşması için gerekli zaman uzar buna bağlı olarak jet

üzerinde kalan bu çözücü, liflerin toplanmaya başlamasından sonra buharlaşmaya

başlayacağı için liflerin birbirleri ile temas noktalarında yapışmalara neden

olabilmektedir. Bu durum liflerin çapını, şeklini ve gözenekliliğini doğrudan etkiler,

aynı zamanda elektrostatik kuvvetlerle çözeltinin toplayıcı plakaya çekilme hızı,

kaynaktan beslenme hızından daha yüksek olursa Taylor konisin stabilitesi bozulabilir

ve boncuk oluşumu gözlemlenebilir. Bu nedenle akış hızının standardize edilmesi

önemlidir, akış hızı, jetlere havada kurumaları için gerekli zamanı tanımalıdır (114,

116).

Toplayıcı Tipi

Elektro-eğirme işlemi için toplayıcı ile çözelti beslenme ünitesi arasındaki

kısımda elektrik alan varlığı gereklidir. Genellikle işlemin gerçekleşeceği düzenekte

elektrik alanı sağlayabilmek için toplayıcı kısmında alüminyum folyo kullanılır ve bu

toplayıcı topraklanır. Bu sayede, stabil ve kararlı bir potansiyel fark oluşur.

Alüminyum folyonun yanı sıra, metal ızgaralar, dönen tambur, dönen disk, üçgen

çerçeve ve sıvı banyosu, elektrostatik çekim kuvveti oluşturabildikleri için elektro-

eğirme işlemi sırasında toplayıcı olarak kullanılabilir (117).

İğne Çapı

Çözeltinin çekim bölgesinde beslendiği iğne, pipet gibi kılcalların iç çapı işlem

için önemli bir yere sahiptir. İç çapın boyutunda küçülme oldukça damlacık boyutu da

küçüleceğinden damlacığın yüzey gerilimi artar. Buna bağlı olarak aynı gerilimde jetin

ivmesinde bir düşme gerçekleşir. Dolayısı ile jetin havada kalış süresi uzadığı için

daha ince lifler meydana gelir. Ancak, küçük iğne çapları çözeltinin püskürtülmesini

zorlaştırarak tıkanmaların artmasına neden olur ve buna bağlı olarak da boncuk

oluşumu gözlemlenebilir (117).

36

Kılcal-Toplayıcı Arası Mesafe

İğne ucu ile toplayıcı arasında mesafe çözücünün buharlaşıp jetin kalınlık

boyutunun oluştuğu bölgedir. Şırınga ucu ile toplayıcı arasındaki mesafenin artması

elektro-eğirme işlemi sırasında liflerin havadaki uçuş süresini uzatmaktadır. Sürenin

uzaması daha kuru ve küçük çaplarda lif oluşumuna yol açarken, sürenin kısalması ise

ıslak ve boncuklu yapıda liflerin oluşmasına neden olacaktır (118, 119).

B) Çözelti ile İlgili Elektro-Eğirme Parametreleri

İşlem parametrelerine ek olarak, bir dizi çözelti parametresi de lif oluşumu ve

morfolojisi üzerinde rol oynamaktadır. Elektro-eğirme işlemi üzerindeki etkili olan

çözelti parametreleri polimer konsantrasyonu, molekül ağırlığı, çözücü uçuculuğu ve

çözücü iletkenliğidir (112).

Çözelti Konsantrasyonu

Bir çözeltinin elektro-eğirme yönteminde etkin bir şekilde kullanılıp

kullanılmayacağını belirleyen, viskozite ve yüzey gerilimi üzerinde etkili olan en

önemli faktör, çözelti veya eriyik halde bulunan çözeltinin konsantrasyonudur. Yüzey

gerilimi, düşük konsantrasyonlu bir çözeltide baskın bir faktördür (düşük viskozite, <1

poise), ve bu konsantrasyonda, lif yerine damlacık oluşumu gözlemlenebilir. Daha

yüksek bir konsantrasyonda ise (viskozite> 20 poise), çözeltinin akışı kontrol edilemez

ve korunamaz. Düşük polimer konsantrasyonu ve yüksek yüzey gerilimine sahip

çözeltiler, elektriksel kuvvetin itici etkisine maruz kaldıkları zaman, jet yapısının

damlacıklara parçalandığı görülmüştür. Konsantrasyon belli bir noktaya kadar

yükseldikçe, çözeltinin sahip olduğu viskoelastik kuvvet parçalanmayı önler, bu

sayede istenilen nanoliflerin oluşması sağlanır (120).

Molekül Ağırlığı

Çözelti viskozitesini etkileyen faktörlerden biri, polimerin molekül ağırlığıdır.

Uygulanacak işlemden istenilen sonucu alabilmek için polimer çözeltisinde kullanılan

polimerin molekül ağırlığının uygun olması gerekmektedir. Çünkü elektro-eğirme

yönteminde, oluşan liflerin morfolojisi, molekül ağırlığına bağlı olarak değişen

değişkenlerle (viskozite gibi) bağlantılıdır (121). Ayrıca, molekül ağırlığının etkilediği

37

bir diğer faktör ise, elektro-eğirme işlemi sırasında Taylor konisinden ayırılıp

toplayıcıya doğru ilerleyen polimer jetinde oluşacak uzama ve gerilmelerdir. İşlem

sırasında, polimer jetinde oluşacak kopmaları önleyen ve sürekli bir çözelti jetinin

oluşmasını sağlayan molekül zincirinin karmaşık yapıda olmasıdır (115).

Çözelti Viskozitesi

Viskozite, polimer çözeltisinin lif oluşturma yeteneğini etkileyen faktörlerden

bir diğeridir (120, 122). Sürekli olarak pürüzsüz lifler elde edebilmek için viskozitenin

optimum değerde olması gerekmektedir. Düşük viskoziteye sahip bir çözeltide yüzey

gerilim kuvvetinin artmasına bağlı olarak iğne şeklinde lif oluşumu yerine boncuk

şeklinde küre oluşumu gerçekleşir. Viskozitenin artması ile beraber boncukların

yapısında küreselden iğ benzeri bir şekle doğru kademeli bir değişim gözlemlenir fakat

artan viskozite ile beraber jetin üzerindeki yüzey gerilimi azalır ve kat edebileceği

mesafe kısalır, buna bağlı olarak da liflerin çaplarında bir artış gözlemlenir (123).

Ayrıca çok yüksek viskoziteye sahip çözeltilerin, şırınga ucundan çıkış yapması

zorlaşmaktadır (124).

Çözeltinin Yüzey Gerilimi

Elektro-eğirme sırasında lif üretiminin gerçekleşebilmesi için elektrostatik

kuvvetlerin yüzey gerilim kuvvetini yenmesi gerekir. Yüzey gerilimi, çözeltinin

konsantrasyonu ile ters orantılı, viskozitesi ile doğru orantılı olarak artıp azalmaktadır.

İstenilen değerde yüzey gerilimi elde edebilmek için, optimum viskozitede çözeltilerin

hazırlanması gerekmektedir (113, 125).

İletkenlik ve Yüzey Yükü

Elektro-eğirme işleminde, iletkenlik ve yüzey yükü yoğunluğu önemli

parametrelerdir. Polimer çözeltisinin elektrik alan içerisinde çekilebilmesi için belli

bir iletkenlik değerine sahip olması gerekmektedir. Lif jetinin yarıçapı, çözeltinin

iletkenliğinin küp kökü ile ters orantılı olarak değişir. Çözeltinin iletkenliğinde bir

artış, nanoliflerin çapında önemli bir azalmaya neden olur bunun yanı sıra çok yüksek

iletkenlik değerlerinde ise Taylor konisi ve jet oluşumu yerine çoklu jet oluşumu

gerçekleşebilir. İletkenliği olmayan polimer çözeltileri elektrik akımı

oluşturmayacakları için lif üretimine uygun değildir (126, 127)).

38

Çözelti Uçuculuğu

Lif jeti, şırıngadan toplayıcıya doğru ilerlerken bir faz ayrımı gerçekleşir, bu

faz ayrımının gerçekleşmesi ve liflerin şekillenebilmesi açısından çözücü uçuculuğu

kritik bir önem sahiptir. Aynı zamanda çözücü uçuculuğunun, lif gözenekliliği

üzerinde de ciddi bir etkisi bulunmaktadır (116).

C) Ortam Değişkenleri

Nem, liflerin yapısını etkilemektedir. Nem oranı yükseldikçe ortamdaki su

moleküllerinin lif üzerinde yoğunlaşmasına bağlı olarak liflerin gözenek yapısında

değişiklikler meydana gelir ayrıca gözenek boyutu ve derinliğinde de artmalar

gözlemlenir. %50 nem oranın altında yapılan elektro-eğirme işlemlerinden daha

düzgün lifler elde edildiği görülmüştür (115).

2.8.3. Elektro-Eğirme Yönteminde İlaç Yükleme

Elektro-eğirme yöntemi, kolay ve uygun maliyette üretim yapılması, çeşitli

malzemelerin kullanılmasında sağladığı esneklik ve yüksek ilaç yükleme kapasitesine

sahip olmasından dolayı son yıllarda ciddi bir ilgi görmektedir. Literatürde (128-130)

bu sistemlerin kullanılması ile farklı organ veya dokuların hedeflendiği, farklı

fizikokimyasal özelliklere sahip ilaçlarla ile ilgili çalışmaların olduğu görülmektedir.

Bu çalışmalarda, taşıyıcı olarak kullanılacak polimerik ana taşıyıcılara farklı

yöntemler kullanılarak ilaç yüklenebilmektedir. Bu yöntemler; karıştırma (blending),

yüzey modifikasyonu, eş eksenli üretim yöntemi ve emülsiyon yöntemi olarak

sıralanabilir (131).

Karıştırma

Karıştırma yöntemi, elektro-eğirme ile üretilen nanoliflere, ilaç yükleme

yöntemleri arasında en çok tercih edilen yöntemdir (131). Bu yöntemde, ilaç polimer

çözeltisi içinde çözündürülür veya dağıtılır. Bu yöntem, diğer yöntemlere göre daha

basit olmasına rağmen, istenen sonuçları elde edebilmek için bazı gereksinimlere

ihtiyaç duyulmaktadır. İlaç salım özellikleri, ilacın liflerin içinde dağılımına ve liflerin

morfolojik yapısına bağlı olarak değişiklikler göstermektedir. Bu amaçla, liflere ilaç

yükleme yapılırken polimerin fizikokimyasal özellikleri ve bu polimerler ile ilaç

39

molekülleri arasındaki etkileşimlerin tam olarak belirlenmesi gerekmektedir. Başka bir

deyişle, ilacın ve polimerin hidrofobik-hidrofilik özellikleri benzer olmalıdır. İlacın

polimer çözeltisinde çözünürlüğünün olmaması, çözelti içinde dağılmasına yol açar.

Bu durumda üretilen liflerde bulunan ilaçlar yüzeye doğru göç eder ve bunun doğal

sonucu olarak liflerde bir patlama salımı gözlemlenir. Araştırmacılar, bu sistemlerde

sürekli salımı sağlayabilmek için hidrofilik-hidrofobik polimerlerin harmanlanarak

kullanılmasının daha etkili olabileceğini tespit etmiştir. Bu durumda, ilaç salım

sürelerinin arttığı ve patlama etkisinin azaldığı bildirilmiştir (132-134).

Yüzey Modifikasyonu

Bu yöntem, nanoliflerin biyomoleküller yardımı ile modifiye edilmesi ve bu

sayede biyolojik işlevsellik kazanabilmesini sağlayan umut vaat edici bir yöntemdir.

Bu teknikte kullanılan terapötik madde, lif yüzeylerine bağlanır, nanolif yapısal olarak

doğal dokuya benzer hale gelir. Bu yöntem ile hem ilaç salım süresi uzatılabilir hem

de yüzeyi hareketsizleştirilmiş olan biyomoleküllerin işlevselliği korunabilir. Bu

strateji ile patlama etkisi ve kısa salım süresi problemlerinin önüne geçilebilmektedir.

Hedef biyomolekül yüzeyinin sabit hale getirilmesi liflerden yapılan salım süresini

uzatmaktadır. Bu nedenle, terapötik maddenin yavaş ve uzun süreli salınmasının

gerekli olduğu gen veya büyüme faktörlerinin uygulanabilmesi için tercih nedeni

olmaktadır (135, 136).

Eş Eksenli Üretim Yöntemi

Çekirdek-kabuk morfolojisi olarak bilinen bu yöntem ile modifiye edilmiş lif

üretimi sağlanabilir. DNA gibi biyomoleküllerin polimer çözeltisi ile karıştırılması

sonucunda üretilen liflerde etken madde liflerin içine girmek yerine belirli

bölgelerinde lokalize olur. Bu problemin önüne geçmek ve biyomoleküllerin

işlevselliğini artırmak için eş eksenli elektro-eğirme yöntemiyle ilaç yüklemesi

yapılmıştır. Bu yöntemde biyomoleküller iç jeti oluştururken polimer dış jeti

oluşturmakta ve bu şekilde ikili bir elektro-eğirme yapılmaktadır. Dış kısımda bulunan

kabuk polimer hem terapotik maddenin sürekli ve uzun süreli salım yapmasını

sağlarken hem de ana bileşenin biyolojik çevreye doğrudan maruz kalmasını

önlemektedir. Bu yöntemde yaygın olarak kullanılan elektro-eğirme cihazının ana

40

üstünlüğü liflerin iki ayrı çözeltide üretilebilmesi, su bazlı biyolojik molekül ile

polimerin çözündüğü organik çözücülerin etkileşiminin en aza indirilmiş olmasıdır.

Bu sayede, sadece kararsız biyolojik moleküllerin biyoaktivitesi korunur. Ancak bu

yöntemde, başarılı bir şekilde yükleme yapılabilmesi için kabuk polimer

konsantrasyonu, çekirdek polimer konsantrasyonu, ilaç konsantrasyonu ve molekül

ağırlığı gibi çeşitli parametreler dikkatli bir şekilde ayarlanmalıdır. Ayrıca, kabuk ve

çekirdek çözeltilerinin akış hızları da yükleme verimliliğini etkileyen parametreler

arasındadır (137-139).

Emülsiyon Yöntemi

Sürecin tasarımı ve karmaşıklığı eş eksenli elektro-eğirme yönteminin en

önemli problemidir. Bu yöntemde, eğirme parametreleri yüzeylerarası gerilimleri ve

hazırlanan çözeltilerin viskoelastik özellikleri kontrol edilmeli ve kritik noktalar

belirlenmelidir. Bu sıkıntılar çözülse bile yöntemin üretim verimliliği çok düşüktür.

Bu problemleri aşmak içi emülsiyon yöntemi kullanılmaya başlanmıştır. Emülsiyon

tekniğiyle ilaç veya protein, bir polimer çözeltisi içinde dağıtılır ve tercihen bu yağ

fazını oluşturur, bu sayede üretim sırasında ilaçlar yüzeye kaçmak yerine liflerin içine

enkapsüle edilmiş olur. Bu yöntemin, geleneksel yöntemlere göre potansiyel

üstünlüğü, ilacı ve polimer çözmek için kullanılacak ortak çözücü gereksiniminin

ortadan kalkmış olmasıdır. Bu sayede, çeşitli hidrofilik-hidrofobik ilaçlar ve polimer

kombinasyonları için organik çözücü ile minimal temas süresi ile üretim yapılabilir.

Sahip olduğu üstünlüklerin yanısıra emülsifikasyon ve ultrasonikasyon gibi

prosedürler üretimde kullanılan proteinlerin bozulmasına neden olabilmektedir (140-

142).

2.8.4. Elektro-Eğirme Yöntemiyle Nanolif Hazırlamak İçin Kullanılan

Polimerler

Polikaprolakton (PKL)

PKL, elektro-eğirmede yaygın olarak kullanılan bir polimerdir (111). 1930’ lu

yılların başında sentezlenen sentetik petrol bazlı bir polimer olmasına rağmen

mikroorganizmaların etkisi ile parçalandığı için biyopolimer sınıfında değerlendirilen

ve toksik olmayan bir poli esterdir (143).

41

PKL, ɛ-kaprolakton halkalı monomerlerden halka açma polimerizasyonu

yöntemi ile üretilir. Yarı kristalize, hidrofobik bir homopolimerdir. Camsı geçiş

sıcaklığı (Tg) -60 °C dir. Erime noktası 59 °C ile 64 °C arasındadır. Kristalize yapısı,

erime derecesinin düşüklüğü ve kolay şekil alabilmesi ilaç taşıyıcı platformlarda çok

tercih edilmesine neden olmaktadır. Farklı molekül ağırlıklarına sahip türevleri vardır

(3000 g/mol ile 100000 g/mol), fakat molekül ağırlığı artıkça kristal yapısında azalma

olur (144).

PKL’nin farklı çözücülerde farklı çözünürlüğü vardır; kloroform,

diklorometan, karbon tetraklorür, benzen, toluen, siklohekzan ve 2-nitropropan gibi

çözücülerde yüksek çözünürlüğe sahipken, aseton, 2-butanon, etil asetat,

dimetilformamid ve asetonitril gibi çözücülerde düşük çözünürlük göstermektedir.

Alkol, petrol eteri ve dietil eter gibi çözücülerde ise çözünmemektedir (143).

PKL’nin önemli üstünlüklerinden birisi de birçok farklı polimerlerle birlikte

kullanılabilmesidir. Polimerik yapısı farklı polimerler ile birarada kullanılmasıyla

çeşitlendirilebilir, bunun yanı sıra enzimatik ve mikrobiyal olarak bozunabiliyor

olması, bu bozunma süresinin uzun ve yavaş olması ve biyouyumluluğunun yüksek

olması ayrıca, etken maddelerin kolaylıkla yüklenebilmesi, uygulamadan sonra ilacı

yüksek oranda geri salabiliyor olması, vücuttan tamamen atılabilmesi, sitotoksitesinin

düşük olması ve biyobozunma süresinin uzun olması bir çok alanda kullanılmasına

imkan sağlar. PKL’nin medikal aletler ve ilaç salım cihazlarının üretiminde

kullanılması yapılan geniş çaplı in vitro ve in vivo testler ile FDA tarafından

onaylanmıştır (145, 146).

Polietilen Glikol (PEG)

PEG, etilen oksit monomerlerinden oluşan ve birçok alanda kullanılabilen

polieter türevi bir polimerdir. Çeşitli molekül ağırlıklarına sahip türevleri vardır (200

g/mol-300000 g/mol) (25). Yüksek biyouyumluluk gösterdiği için birçok farklı

medikal alanda kullanılabilmektedir.

PEG, yarı kristalize ve oldukça hidrofilik yapıda bir polimerdir. Farklı molekül

ağırlığına sahip türevleri bulunmaktadır. Molekül ağırlığına bağlı olarak viskozitesi

değişmektedir, molekül ağırlığı arttıkça viskozite artmaktadır. Ayrıca hidrofilik yapısı

da molekül ağırlığına bağlı olarak değişmektedir. Suda çözünürlüğünün iyi olmasının

42

yanı sıra organik çözücülerde de yüksek bir çözünürlüğe sahiptir. Bu durum katı

dispersiyoların hazırlanması konusunda büyük üstünlük sağlamaktadır (147).

Molekül ağırlığı ne olursa olsun PEG’in erime noktası 65 °C’nin altındadır aynı

zamanda yarı kristalize bir katı olmasından ötürü, camsı geçiş sıcaklığı da düşüktür.

Erime derecesinin düşük olması da katı dispersiyonların hazırlanmasında bir üstünlük

sağlamaktadır (147, 148).

PKL-PEG beraber elektro-eğirme yönteminde kullanılarak ilaç taşıyıcı bir

platform oluşturulabilir. PKL-PEG karışımını içeren ilaç bu platform sayesinde salım

süresi istenilen şekilde ayarlanabilir, ayrıca PEG’in ilavesi ile platformun iritasyonu

azaltılmış ve stabilitesi artırılmış olur.

Yapılan bir çalışmada (149), PKL ve PEG’in polimerik karışımının

kullanıldığı, terapötik maddenin bu polimerler içine enkapsüle edildiği ve sürekli

salımını sağlayacak birleşik modelli nanoliflerden oluşan bir iskele elde edilerek ilaç

taşınmasının sağlandığı görülmüştür.

Sodyum Aljinat (SA)

Aljinat, su yosunlarından elde edilen bir polisakkarit türevidir. Aljinat α-L-

guluronik asit (G) ve β-D-mannuronik asidin kopolimerinden oluşur (150).

Biyolojik olarak uyumlu, parçalanabilen ve bitkisel kökenli bir yapıdadır, bu

nedenle eczacılık ve tıp alanında, yiyecek ve içecek endüstrisi, tekstil ve kâğıt

sanayinde, tarımda ve kozmetik gibi birçok alanda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Yapılan araştırmalarda (150) vücutta zamanla birikmediği ve herhangi bir toksik etki

oluşturmadığı görülmüştür. Fakat enzimlere karşı dayanıksız olması, kullanılması

sırasında sıkıntı oluşturabilmektedir (151).

Tiyomer (Tiyollenmiş Polimerler)

Tiyollenmiş polimerler tiyomer adı verilen özel çok fonksiyonlu polimerlerdir.

Polimer omurgasında tiyol grupları bulunduran hidrofilik yapıya sahip

makromoleküllerdir. Tiyomerler, mukozal membranı örten mukus içerisinde bulunan

sistein aminoasitleri ile disülfit bağları oluşturabilirler. Bu sayede sodyum aljinat ve

kitosanın mukoadezif özellikleri artırılır. Ayrıca, tiyomerler polimerik ağ içerisinde,

43

zincir içi ve zincirler arası disülfit bağları yapabilir. Bu durumda da ilaç taşıyıcı

sistemlerinin. biyoadezif özelliklerini ve stabilitelerini arttırır (152).

2.8.5. Siklodekstrin (Cyc)

Şekil 2.13. Cyc’lerin genel yapısı (153).

Nişastanın enzimatik parçalanması ile oluşan ve 100 yıldan uzun süredir

üzerinde çalışılan moleküllerdir (Şekil 2.13) (154-156). Farmasötik olarak, sudaki

çözünürlüğü artırmak, biyoyararlanımı iyileştirmek, kontrollü ilaç taşıyıcı olarak,

gastrointestinal sistem veya oküler iritasyonu azaltmak, oküler ilaç geçirgenliği

artırmak ve ilacın fiziksel ve kimyasal stabilitesini iyileştirmek için kullanılmaktadır

(157). Farmasötik açıdan önem taşıyan Cyc türevleri α, β ve γ-Cyc’lerdir (158). Cyc-

ilaç kompleksleri hidrofilik yapı göstermelerine rağmen β-Cyc’nin suda çözünürlüğü

çok düşük miktardadır. Bu yüzden doğal Cyc’lere farklı gruplar eklenmesi ile yeni Cyc

türevleri elde edilmiştir. Bu şekilde daha dayanıklı kompleksler elde edilmiş, Cyc-ilaç

komplekslerinin çözünürlükleri ve biyolojik membranlardan geçişi artırılmış ve ilaç

salım özellikleri değiştirilmiştir (159). Özellikle β-Cyc’e hidroksipropil veya metil

gruplarının eklenmesi ile oküler olarak daha uygun formda komplekslerin oluştuğu

belirlenmiş ve bu komplekslerin çözünürlüğü ve oküler geçişi önemli oranlarda

artırdığı tespit edilmiştir (160).

İlaç:Cyc İnklüzyon Kompleksleri

Cyc sahip oldukları önemli özelliklerden dolayı çok geniş bir kullanım alanına

sahiptir (161). Hidrofobik yapıya sahip ilaçları apolar iç kısım içine alır ve

fizikokimyasal özelliklerini değiştirir. Bu sayede çözünürlük artar, stabilite iyileşir,

44

lokal iritasyon azalır, bölgesel geçişler ve buna bağlı biyoyararlanımda artış

gözlemlenir (162).

İlaç-Cyc kompleks oluşumu kovalent olmayan bağlanmalar ile

gerçekleşmektedir (163). Bu durum, ilaç molekülünün kompleksin içerisine dahil

olduğu ve kompleksten ayrıldığı devamlı bir süreçtir. En olası bağlanma şekli, ilaç

molekülünün daha az polar yapıya sahip kısma girmesi, daha polar ve çoğunlukla

yüklü olan grubun ise kavitenin daha geniş kısmının hemen dışındaki çözücü grubuna

yönelmesidir. Hangi tip bir kompleks oluşacağı, Cyc’nin iç kavitesine, konuk

molekülün büyüklüğüne ve konuk molekülün lipofilikliğine göre değişmektedir (164).

Cyc veya ilaç molekülün büyüklüğüne göre, 1 ilaç molekül 1 veya 2 Cyc molekülü ile

etkileşime girebilirken (1:1 veya 1:2 kompleksler), 1 veya 2 ilaç molekül 1 Cyc

molekülü (1:1 veya 2:1 kompleksler) ile etkileşime girebilir (163).

45

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1. Araç ve Gereçler

3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler

Besifloksasin HCl (BH) Sigma Aldrich, ABD

Polietilen glikol (PEG) Sigma Aldrich, ABD

β-Siklodekstrin (β-Cyc) Sigma Aldrich, ABD

Hp-β-Siklodekstrin (Hp- β-Cyc) Sigma Aldrich, ABD

Sodyum aljinat (SA) Sigma Aldrich, ABD

Diklorometan (DCM) Sigma Aldrich, ABD

N-N-Dimetil formamid (DMF) Sigma Aldrich, ABD

Fosfat tamponu tableti Sigma Aldrich, ABD

Asetonitril (HPLC grade) Sigma Aldrich, ABD

Metanol (HPLC grade) Sigma Aldrich, ABD

Etanol (HPLC grade) Sigma Aldrich, ABD

Sodyum klorür Sigma Aldrich, ABD

Potasyum dihidrojen fosfat Sigma Aldrich, ABD

Potasyum klorür Sigma Aldrich, ABD

Orto-fosforik asit Merck,Almanya

Sodyum hidroksit Sigma Aldrich, ABD

Hidroklorik asit Sigma Aldrich, ABD

Sodyum bikarbonat Sigma Aldrich, ABD

46

3.1.2. Biyolojik Materyal

L-Sistein Sigma Aldrich, ABD

Penisilin-Streptomisin Sigma Aldrich, ABD

Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Sigma Aldrich, ABD

Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)

Fetal sığır serumu (FBS) Sigma Aldrich, ABD

Sodyum dodesil sülfat (SDS) Sigma Aldrich, ABD

Sıvı tiyoglikonat Sigma Aldrich, ABD

Triptik soy buyyon Sigma Aldrich, ABD

Metiltiyazoliltetrazolyum (MTT) Merck, Almanya

Trietanolamin Sigma Aldrich, ABD

Dimetilsülfoksit (DMSO) Sigma Aldrich, ABD

Tripsin-EDTA Lonza, İsviçre

3.1.3. Kullanılan Cihazlar

Yüksek gerilim kaynağı Gamma High Voltage

Research, Model ES40P-

20W, ABD

Şırınga pompası NE-1000 Family of

Programmable Syringe Pumps

Model NE-4000, ABD

HPLC cihazı enjeksiyon ve pompa ünitesi Agilent 1200, ABD

HPLC cihazı kolon ünitesi Agilent 1200, ABD

HPLC cihazı dedektör ünitesi Agilent 1200, ABD

Santrifüj aleti Hermle Z383K, Almanya

47

UV spektrofotometre Shimadzu, Japonya

Ex vivo geçiş çalışması aparatı Warner-Instruments, ABD

Vizkometre Brookfield DV2R-RV, Kanada

Hassas terazi Mettler Toledo, İsviçre

Liyofilizatör Hirayama, Japonya

Isıtıcılı manyetik karıştırıcı IKA, Almanya

Çok noktalı manyetik karıştırıcı Variomag Telesystem, Almanya

Ultra saf su cihazı Millipore, ABD

Vorteks IKA, Almanya

Mikropipetler Eppendorf, Almanya

DSC cihazı TA Instruments, ABD

FTIR cihazı Perkin Elmer FTIR System

Spectrum BX,ABD

Biyoadezyon ölçümü Texture Analyzer XT plus, ABD

Verniyeli Kumpas Mitutoyo, Japonya

XPS PHI 5000 VersaProbe, Japonya

Eppendorf karıştırıcı Eppendorf, Almanya

ELISA Okuyucu Molecular Devices, Spectra Max

Plus, ABD

İnkübatör Sanyo, Japonya

Laminar hava akımlı kültür kabini Faster, İtalya

48

3.2. Yöntem

3.2.1. Besifloksasin HCl’nin Fizikokimyasal Özellikleri Üzerinde Yapılan

Çalışmalar

Erime Derecesi Tayini

BH’nin fizikokimyasal özelliklerinden biri olan erime noktasının belirlenmesi

amacıyla bir miktar toz etkin madde numunesi kılcal tüp içine yerleştirilmiş ve Thomas

Hoover Melting Point Apparatus cihazı ile erime derecesi belirlenmiştir. Cihaz BH’nin

beklenen erime derecesinin 10 ̊ C altına kadar ısıtıldıktan sonra, içerisinde BH bulunan

kılcal tüpler cihaza yerleştirilmiştir. Cihazın standart ısıtma hızına göre sıcaklığı

yükseltilerek, BH’nin erimeye başladığı sıcaklık ile erimenin tamamlandığı sıcaklık

aralığı tespit edilmiştir.

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Analizi

BH’nin, termal analizi için DSC Q 100 diferansiyel taramalı kalorimetre

kullanılmıştır. Alüminyum numune kabı içine yerleştirilen numunenin (5 mg) 10 –

400˚C aralığında azot atmosferi altında DSC termogramı çekilmiştir. Analiz sırasında,

referans olarak alüminyum boş numune kapları kullanılmıştır. Analiz işlemleri

20°C/dk sıcaklık artışı ve 20 mL/dk azot akış hızında gerçekleştirilmiştir.

Fourier Transform Infrared Spektroskopisi (FTIR) Spektrumu

BH’nin FTIR analizi 400 – 4000 cm-1 dalga sayısı aralığında Perkin Elmer

FTIR System Spectrum BX spektrometresi ile çekilmiş ve sonuçlar değerlendirilmiştir.

Besifloksasin HCl’nin Ultraviyole (UV) Analizi

5 mg BH 50 mL distile su içerisinde çözüldükten sonra bu çözeltiden

mikropipet yardımı ile 1 mL alınarak distile suyla tekrar 10 mL’ye tamamlanmıştır.

Hazırlanan bu çözeltinin 200-400 nm dalga boyları arasında taramalı UV

spektrofotometre yardımı ile maksimum absorbans verdiği dalga boyu tespit

edilmiştir.

49

Besifloksasin HCl’nin Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile

Miktar Tayini

Tez çalışması kapsamında, BH’nin miktar tayinini yapabilmek için güvenilir

ve yüksek hassasiyette bir yöntem olması nedeniyle yüksek basınçlı sıvı

kromotografisi (HPLC) yöntemi kullanılmıştır.

BH’nin HPLC ile miktar tayinini yapabilmek için Sadhana ve ark. (165)

tarafından geliştirilen yöntem modifiye edilerek kullanılmıştır. Etken maddenin HPLC

ile miktar tayinini gerçekleştirebilmek ve kalibrasyon doğrusunu elde edebilmek için

BH’nin distile su içinde100 μg/mL konsantrasyonda hazırlanan stok çözeltisinden

hareketle 8 farklı konsantrasyonda (0.6, 0.75, 1, 2.5, 5, 10, 15 ve 20 μg/mL) olacak

şekilde distile su ile seyreltmeler yapılmış ve 297 nm’de analiz gerçekleştirilmiştir.

Mobil faz olarak; pH 3 fosfat tamponu: asetonitril: metanol (50:25:25) karışımı

kullanılmıştır. Çözeltilerin konsantrasyona karşı elde edilen pik alanları kullanılarak

doğru denklemi hesaplanmıştır. BH’nin HPLC ile miktar tayininde kullanılan

kromatografik koşullar Tablo 3.1’de gösterilmiştir.

Tablo 3.1. BH’nin HPLC ile miktar tayininde kullanılan kromatografik koşullar (165).

BH’nin HPLC Koşulları

Mobil Faz Asetonitril:Metanol: pH 3 Fosfat Tamponu (25:25:50)

Enjeksiyon hacmi 20 μL

Akış hızı 1 mL.dk-1

Dedektör UV Dedektör

Dalga boyu 297 nm

Kolon C8 (250mmx4,6mmx5µm)

Sıcaklık 25 ̊ C±1 ºC

50

Mobil Fazın Hazırlanması

Mobil fazın oluşturulması için öncelikle, pH 3 fosfat tamponu hazırlanmıştır.

Bunun için, 4,08 g potasyum dihdrojen fosfat tartılmış, 1 mL trietanolamin ilave

edilerek 1000 mL’ye distile su ile tamamlanmış ve %18 o-fosforik asit (h/h) çözeltisi

ile pH’sı 3’e ayarlanmıştır. Hazırlanan tampon çözeltisi, Nutche erleni üzerine

yerleştirilmiş 0,45 μm membran filtreden (HVHP, Millipore) vakum uygulanarak

süzülmüştür. Sonra, asetonitril:metanol:pH 3 fosfat tamponu (25:25:50) karışımından

oluşan mobil faz 5 dk manyetik karıştırıcıda karıştırılmış, HPLC sistemine verilmeden

ultrasonik banyo kullanılarak 15 dk boyunca gazlarından arındırılmış ve oda

sıcaklığına getirilmiştir (165).

Kromatografik Koşullar

Analizlerde UV dedektörlü HPLC cihazı ve ters faz C8 kolon

(250mmx4,6mmx5µm) kullanılmıştır. UV dalga boyu 297 nm ve mobil fazın akış hızı

1 ml/dk olarak ayarlanmıştır. Örnekler sisteme 20 μL enjeksiyon hacminde

uygulanmış ve analiz boyunca kolon oda sıcaklığında tutulmuştur. Bu koşullarda

BH’nin alıkonma zamanı 5,5 dk olarak saptanmıştır (165).

In Vitro Miktar Tayin Yönteminin Validasyonu

Analitik yöntem validasyonu için incelenen parametreler aşağıda sıralanmıştır

(166):

Doğrusallık (Linearity)

Doğruluk (Accuracy)

Kesinlik (Precision)

Duyarlılık (Sensitivity)

Özgüllük (Specificity)

Stabilite (Stability) (etken maddenin teşhis ve tayin aşamasında)

51

Doğrusallık (Linearity)

Doğrusallık, bir analitik yöntemin belirli bir aralıkta, analizi yapılan maddenin

konsantrasyonu ile deney sonuçlarının doğrudan orantılı olmasını sağlama özelliğidir.

Analitik yöntemin çalışılan konsantrasyon aralığı boyunca ölçülen pik alanları ile

doğrusal bir ilişki gösterip göstermediğinin değerlendirilmesi amacıyla BH’nin 100

μg/mL konsantrasyonda distile suda hazırlanan stok çözeltisinden yola çıkarak 8 farklı

konsantrasyonda (0,6, 0,75, 1, 2,5, 5, 10, 15 ve 20 μg/mL) çözeltiler hazırlamak için

distile su ile gerekli seyreltmeler yapılmıştır. Analiz sonucunda, çözeltilerin

konsantrasyona karşı elde edilen pik alanları kullanılarak doğru denklemi hesaplanmış

ve korelasyon katsayısının önem kontrolü yapılmıştır.

Yöntemin doğrusallığı, verilen konsantrasyon aralığında, analizi yapılan

maddeyi değişik konsantrasyonlarda içeren örneklerin elde edilen pik alanları ile

doğru orantılı olması ile değerlendirilmiştir (166).

Doğruluk (Accuracy)

Analitik yöntem ile bulunan deney sonuçlarının gerçek değerlere olan yakınlığı

belirlenmiştir. Kullanılan yöntemin doğruluğunun değerlendirilmesi için distile suda

hazırlanan stok çözeltiden (100 μg/mL) üç farklı konsantrasyon (0,75, 5 ve 15 μg/mL)

elde edilecek şekilde 6 seri hazırlanan BH örneklerinin analizi ile bulunan değerler

kalibrasyon doğrusunda yerine konularak ortalama % geri kazanılan değerler

hesaplanmıştır (166).

Kesinlik (Precision)

Bir yöntemin birbirini takip eden ölçümleri arasındaki yakınlığın derecesini

ifade eden kesinlik parametresi standart sapma (SS) veya varyasyon katsayısıyla (VK)

ifade edilir. Kesinlik, normal çalışma koşullarında analitik yöntemin tekrar

edilebilirlik (repeatability) veya tekrar elde edilebilirlik (reproducubility) derecesinin

bir göstergesidir.

Analitik yöntemin kesinliğini göstermek için tekrarlanabilirlik ve tekrar elde

edilebilirliğin incelenmesi, aynı konsantrasyona sahip örneklerde miktar tayini

yapılarak ortalama X̄, SS, VK değerleri hesaplanarak gerçekleştirilmiştir (166).

52

i. Tekrarlanabilirlik (Repeatability):

Yöntemin tekrarlanabilirliğini göstermek amacıyla aynı konsantrasyonda

hazırlanan örnek arka arkaya 6 kez uygulanarak elde edilen pik alanlarının X̄, SS ve

VK değerleri hesaplanmıştır. Çalışma, distile suda hazırlanan stok çözeltiden (100

μg/mL) üç farklı konsantrasyon (0.75, 5 ve 15 μg/mL) elde edilecek şekilde hazırlanan

çözeltilerin distile su içerisinde seyreltilip ölçümlerin yapılmasıyla

gerçekleştirilmiştir. Analitik yöntemin tekrarlanabilirliğinin uygunluğunun

gösterilmesi için VK’nın %2’den küçük olması gerekmektedir.

ii. Tekrar elde edilebilirlik (Reproducibility):

Yöntemin gün içi tekrar elde edilebilirliğini göstermek için aynı

konsantrasyonda 6 farklı örnek hazırlanarak HPLC’ye uygulanmış ve elde edilen pik

alanlarının X̄, SS ve VK değerleri (%) hesaplanmıştır. Çalışma, distile suda hazırlanan

stok çözeltiden (100 μg/mL) üç farklı konsantrasyon (0,75, 5 ve 15 μg/mL) elde

edilecek şekilde, çözeltilerin su içerisinde seyreltilmesiyle gerçekleştirilmiş ve ilgili

ölçümler yapılmıştır.

Yöntemin günler arası tekrar elde edilebilirliğini göstermek amacıyla 0,75, 5

ve 15 μg/mL konsantrasyonlarda 6 farklı örnek hazırlanarak birbirini takip eden 3 gün

ayrı ayrı ölçümler yapılarak, X̄, SS ve VK değerleri hesaplanmıştır. Çalışma, distile

suda hazırlanan stok çözeltiden (100 μg/mL) üç farklı konsantrasyon (0,75, 5 ve 15

μg/mL) elde edilecek şekilde, çözeltilerin distile su içerisinde seyreltilmesiyle

gerçekleştirilmiştir. Tekrar elde edilebilirlik çalışmalarında VK değerinin %2’den

küçük olması beklenmektedir.

Özgüllük (Specificity):

Özgüllük, bir analitik yöntemin amaçlanan maddeyi spesifik olarak tayin

edilebilmesidir (166). Çalışmalarımızda, hazırlanan formülasyonlarda kullanılan

yardımcı maddelerin (PKL, PEG, SA, TSA, HP-β-Cyc) formülasyonlarda bulunan

konsantrasyonlardaki çözeltileri hazırlanmış ve etken madde ile aynı koşullarda pik

verip vermedikleri incelenmiştir.

53

Duyarlılık (Sensitivity)

i) Miktar Tayini Sınırı (Limit of Quantitation)

Kullanılan analitik yöntemin belirlenen şartlarda, analizi yapılan maddenin

kabul edilebilir kesinlik ve doğruluk değerleri ile kantitatif olarak tayin edilebildiği en

düşük konsantrasyon olarak tanımlanır. Bu değer, sinyal:gürültü oranının 10:1 olduğu

konsantrasyon ile ifade edilmektedir (166).

ii) Saptama Sınırı (Limit of Detection)

Analizi yapılan maddenin kalitatif olarak saptanabildiği en düşük

konsantrasyondur. Bu değer, sinyal:gürültü oranının 3:1 olduğu konsantrasyon ile

ifade edilmektedir (166).

Stabilite (Stability)

BH’nin deney süresince stabil kaldığının gösterilmesi amacıyla, distile suda

hazırlanan stok çözeltiden (100 μg/mL) üç farklı konsantrasyon (0,75, 5 ve 15 μg/mL)

elde edilecek şekilde 6 seri olmak üzere çözeltiler hazırlanmış, örnekler hemen, 24. ve

48. saatlerde analiz edilmiştir.

3.2.2. Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının Optimizasyon

Çalışmaları

Polikaprolakton Nanoliflerinin Hazırlanması ve Optimizasyonu

BH içeren nanolif yapıları geliştirmek için öncelikle etkin madde içermeyen

(boş) formülasyonlar üzerinde çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, ilk olarak

PKL’nin lif hazırlanabilecek konsantrasyonu belirlenmiştir. Nanolif hazırlanmasında,

literatürde bildirilen oranlar dikkate alınarak (111, 167) formülasyon optimizasyon

çalışmalarında denenecek polimer oranları %8, %10 veya %13 olarak belirlenmiştir.

Bunun için PKL %8, %10 veya %13 (a/h) konsantrasyonlarda 3 mL diklorometan

(DCM):N-N-dimetil formamid (DMF):metanol (9:1:5) (h/h/h) içinde (39,40) oda

sıcaklığında, 400 rpm’de 24 saat boyunca manyetik karıştırıcıyla karıştırılarak

homojen çözeltileri elde edilmiştir. Karıştırma işlemi, çözücünün buharlaşmasına

engel olmak amacı ile ağzı sıkı kapalı kaplarda gerçekleştirilmiştir.

54

Nanolifler, literatürde (130, 168, 169) sıklıkla tercih edilen elektro-eğirme

yöntemi ile üretilmiştir (Şekil 3.1). Belirlenen konsantrasyonlarda hazırlanan PKL

çözeltisinden 3 mL alınarak 5 mL’lik plastik enjektöre aktarılmıştır. Metalik iletken

enjektörün ucu (0,70 mm x 32 mm) bıçkı kullanılarak düzlenmiş ve 0-30 kV (doğru

akım, DA) voltaj üreten yüksek voltaj dönüştürücünün pozitif (+) elektroduna

bağlanmıştır (41,42). Alüminyum folyo ile kaplanmış dikdörtgen bir metal plaka

enjektörün ucu ile arasında belirli bir mesafe olacak şekilde yerleştirilmiş ve yüksek

voltaj dönüştürücünün negatif (-) elektroduna bağlanmıştır.

Elektro-eğirme ile hazırlama yapılırken aynı zamanda proses parametrelerinde

değişiklik yapılarak (polimer konsantrasyonu, elektriksel potansiyel gücü, polimer

çözeltisinin akış hızı ve şırınga ucu ile metal plaka arasındaki mesafe) lif oluşabilen

optimum koşullar tespit edilmiştir. Bu amaçla üç farklı konsantrasyonda hazırlanmış

olan PKL çözeltileri için farklı koşullarda (elektriksel potansiyel gücü 10 veya 15 kV,

polimer çözeltisi akış hızı 0,01 veya 0,05 mL/saat ve şırınga ucu ile metal plaka

arasındaki mesafe 10 veya 20 cm) elektro-eğirme işlemi gerçekleştirilmiştir. PKL

nanoliflerinin optimizasyonu için kullanılan elektro-eğirme parametreleri Tablo 3.2’de

verilmiştir.

Tablo 3.2. PKL nanoliflerinin optimizasyonu için kullanılan elektro-eğirme

parametreleri

Parametreler Kullanılan Değerler

PKL konsantrasyonu % 8, 10, 13 (a/h)

Uygulanan gerilim 10, 15 kV

Enjektör ucu-plaka arası mesafe 10, 20 cm

Polimer çözeltisi akış hızı 0,01, 0,05 mL/dk

Elektro-eğirme işlemi, oda sıcaklığında ve %18 bağıl nem koşullarında

gerçekleştirilmiştir. Elde edilen nanolifler alüminyum plakada toplanmıştır. PKL

nanoliflerinin oluşup oluşmadığının görsel olarak değerlendirilmesi amacıyla,

alüminyum plaka üzerine bir lam yerleştirilmiş ve lam üzerinde toplanan örnekler ışık

mikroskobu ile incelenmiştir. Bu şekilde, boncuk oluşumu gerçekleşmeden, sprey

55

formunda yapılar oluşmadan, düzgün ve homojen liflerin oluşup oluşmadığı

gözlenmiştir.

Şekil 3.1. Nanoliflerin elektro-eğirme yöntemi ile hazırlanmasının şematik gösterimi.

Besifloksasin HCl Yüklü Polikaprolakton/Polietilen Glikol Nanolif

Yapıda İnsertlerin Optimizasyonu

PKL nanoliflerinin hidrofilik özelliğini ve oküler uygulamalarda büyük önemi

olan yüzey pürüsüzlüğünü artırmak amacıyla hidrofilik ve biyouyumlu bir polimer

olan PEG’in formülasyonlara ilave edilmesine karar verilmiştir (170). Yapılan

araştırmalarda (170-172) PKL içeren formülasyonlara PEG ilavesi sonucunda

formülasyonların ilaç yükleme ve in vitro salım profillerinde değişiklik olduğu

bildirildiği için optimizasyon çalışmalarında farklı polimer ve BH oranları kullanılarak

bu etki değerlendirilmiştir. Yapılan ön denemeler sonucunda %13’lük (a/h) polimer

çözeltilerinde PKL:PEG oranları 2:1, 1,75:1,25, 1:1, 1:2, (a:a) olarak, %10’luk (a/h)

polimer çözeltilerinde ise 2:1, 1,75:1,25 (a:a) olarak belirlenmiştir. Belirlenen oranlar

için, toplam katı polimer miktarının %2,5’i (a/a) olacak şekilde etkin madde

metanolde çözülerek BH çözeltisi hazırlanmıştır. Bunun için lipofilik özellikte olan

BH (log P: 0,54), ilk olarak polimer çözücüsü karışımının %50’si kadar hacimde

metanol içinde çözülmüştür (koşulllar: 30 dk, 400 rpm). Sonra, bu etkin madde

çözeltisi olası çökmeleri önlemek amacıyla, oda sıcaklığında 400 rpm’de manyetik

karıştırıcıda karıştırılan PKL/PEG polimer karışımlarına damla damla eklenmiştir. Bu

56

şekilde hazırlanan ve BH içeren polimer karışımları gece boyunca oda sıcaklığında

400 rpm’de karıştırılmaya devam edilmiştir (Şekil 3.2).

Farklı oranlarda polimer ve BH (%2.5 a/a) (102, 173, 174) içeren çözeltilerin

her biri için 15 kV gerilim, 20 cm enjektör ucu-plaka arası mesafe ve 0,05 mL/dk

polimer çözeltisi akış hızı koşullarında elektro-eğirme işlemi gerçekleştirilmiştir.

PKL/PEG karışımı nanoliflerin optimizasyonu için kullanılan elektro-eğirme

parametreleri Tablo 3.3’de verilmiştir. Elektro-eğirme işlemi, oda sıcaklığında ve %18

bağıl nem koşullarında gerçekleştirilmiştir. Elde edilen nanolifler alüminyum plakada

toplanmıştır. PKL nanoliflerinin oluşup oluşmadığının görsel olarak incelenmesi

amacıyla, alüminyum plaka üzerine bir lam yerleştirilmiş ve lam üzerinde toplanan

örnekler ışık mikroskobu altında değerlendirilmiştir.

Tablo 3.3. PKL/PEG karışım nanoliflerinin optimizasyonu için kullanılan elektro-

eğirme parametreleri.

*%13 (a/h) polimer içeren formülasyonlarda PKL/PEG oranı (2:1, 1,75:1,25, 1:1 veya 1:2 (a/a))

**%10 (a/h)polimer içeren formülasyonlarda PKL/PEG oranı (2:1 veya 1,75:1,25, (a/a))

Parametreler Kullanılan Değer

PKL-PEG konsantrasyonu %10, %13 (a/h)

BH konsantrasyonu Toplam polimer miktarının % 2,5 (a/a)

oranında

PKL/PEG karşım oranı 2:1, 1,75:1,25, 1:1 veya 1:2, (a:a) (%13)

(a/h)*

2:1 veya 1,75:1,25 (a:a) (%10) (a/h)**

Uygulanan gerilim 15 kV

Enjektör ucu-plaka arası mesafe 20 cm

Polimer çözeltisi akış hızı 0,05 mL/dk

57

Şekil 3.2. BH yüklü PCL/PEG nanolif yapıda insert formülasyonlarının

hazırlanmasının şematik gösterimi.

Alüminyum plakada toplanan BH yüklü nanoliferden delgeç (173) yardımı ile

dairesel parçalar (3.5 mm2) kesilerek nanolif yapıda insert formülasyonları hazırlanmış

ve optimum ilaç yükleme ve in vitro salım özelliklerini gösteren formülasyonun tespiti

için yapılacak analizlerde kullanılmıştır (Şekil 3.3).

Şekil 3.3. a) BH yüklü nanolif görüntüsü (kesim işleminden önce) b) BH yüklü

nanolif yapıda insert görüntüsü (delgeç ile kesildikten sonra)

a) b)

58

i) Formülasyon Optimizasyonunda Enkapsülasyon Etkinliği Çalışmaları

Enkapsülasyon etkinliği çalışmaları, nanolif yapıda insert formülasyonlarına

yüklenen BH miktarını bulmak amacıyla yapılmıştır. Hazırlanan insertler ilk olarak 1

mL DCM:DMF (9:1) içinde çözülmüş üzerine 1 mL PBS ilave edilerek bir gün süre

ile bekletilmiştir. 24 saat sonra 13500 rpm’de santrifüjlendikten sonra 1 mL PBS

enjektör yardımı ile alınmıştır (n=3). Alınan 1 mL örnek içindeki etken madde miktarı,

HPLC ile belirlenmiştir.

ii) Formülasyon Optimizasyonunda İn Vitro Salım Çalışmaları

Farklı oranlarda polimer karışımı ve BH (%2.5 a/a) içeren nanolif yapıda

insertler, in vitro salım deneyleri için 2 mL’lik Eppendorf tüplere konmuş (n=6) ve

üzerlerine 1,5 mL PBS çözeltisi eklenmiştir. Aynı şekilde hazırlanan 6 salım hücresi,

sıcaklığı (göz yüzeyi sıcaklığına benzer şekilde) 32±0,5°C’de sabit tutulan yatay

çalkalayıcılı su banyosuna (Eppendorf Thermomixer R) yerleştirilmiştir. Belirli zaman

aralıklarında (1, 3, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168. saatlerde) ortamın tümü alınarak

1 mL’lik kısmı 0,45 μm por çapına sahip membran filtrelerden süzülmüş ve HPLC

kolonuna enjekte edilmiştir. Alınan örneğin yerine 1,5 mL PBS ilave edilmiş ve salım

hücreleri yeniden yatay çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirilmiştir (175).

3.2.3. Besifloksasin HCl Yüklü Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif

Yapıda İnsertlerin Hazırlanması ve Geliştirilmesi

Yapılan değerlendirmeler sonucunda Bölüm 4.2.2’de görüleceği üzere %13

(a/h) polimer içeren, PKL-PEG oranı 2:1 (a/a) olan ve % 2.5 (a/a) oranında BH içeren

formülasyon, uygun bulunan ilaç yükleme kapasitesi ve in vitro salım özellikleri

nedeniyle optimum formülasyon olarak belirlenmiştir. Buna ilaveten Şekil 3.4’te

görüldüğü üzere bu temel (kaplanmamış) formülasyondan yola çıkarak in vitro

karakterizasyon, ex vivo ve in vivo değerlendirmelerde kullanılmak üzere farklı

özelliklere sahip formülasyonların geliştirilmesine karar verilmiştir.

59

Şekil 3.4. Tez çalışmalarında hazırlanacak nanolif yapıda insert formülasyonlarının

bileşimi

Temel formülasyonun hazırlanması için PKL ve PEG ( sırasıyla 260 ve 130

mg) polimerleri (toplamda 390 mg) %13 (a/h) olacak şekilde tartılmış. 2 mL DCM-

DMF ile 9:1 oranındaki çözücü karışımında çözülmüştür. Sonra, etken madde 10 mg

tartılarak 1 mL metanol içerisinde çözülmüştür. Son olarak; ilaç çözeltisi, polimer

çözeltisinin üzerine karıştırıcıda damla damla eklenmiş ve karışım 400 rpm’de 24 saat

süre ile homojen oluncaya dek karıştırılmıştır. Hazırlanan bu çözelti için 15 kV

gerilim, 20 cm enjektör ucu-plaka arası mesafe ve 0,05 mL/dk polimer çözeltisi akış

hızı koşullarında elektro-eğirme işlemi gerçekleştirilmiştir (174).

Sodyum Aljinat (SA) /Tiyollenmiş Sodyum Aljinat (TSA) Kaplı

Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif Yapıda İnsertlerin

Hazırlanması

Sodyum Aljinat Kaplı Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif Yapıda

İnsert Formülasyonlarının Hazırlanması

Nanolif yapıda insert formülasyonlarını kaplamak amacıyla daldırma yöntemi

kullanılmıştır (176). Bu amaçla, 2 g SA tartılmış ve 50 mL deiyonize suda

60

çözülmüştür. Hazırlanan SA çözeltisine nanolif yapıda temel insert formülasyonları

(kaplanmamış) 3 dakika süre ile daldırılmıştır. Sonra, bu nanolif yapıda insertler, oda

sıcaklığında sabit bir hızla daldırma çözeltisinden çıkarılmış ve 40 °C’de

kurutulmuştur. Kurutma işlemi bittikten sonra nanolif insertler, çapraz bağlanmayı

sağlamak amacı ile %5 kalsiyum klorür çözeltisine daldırılıp hemen çıkarılmıştır.

Sonrasında, deiyonize su ile 3 kez yıkanmış ve 37 °C’de etüvde sabit ağırlığa kadar

kurutulmuştur (Şekil 3.5) .

Şekil 3.5. PCL/PEG insert formülasyonlarının SA veya TSA ile kaplanmasında

kullanılan daldırma yönteminin şematik gösterimi.

Tiyollenmiş Sodyum Aljinat Kaplı Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif

Yapıda İnsert Formülasyonlarının Hazırlanması

Nanolif yapıdaki insertlerin TSA ile kaplanması için öncelikle SA’dan TSA

sentezlenmesi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, Bernkop Schnürch ve ark. (177)

tarafından geliştirilen yöntem kullanılmıştır. Bu yönteme göre, 10 g SA tartılarak 1 L

deiyonize suda çözünene dek karıştırılmış daha sonra SA’nın karboksilik asit

kısımları, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDAC) eklenerek

aktive edilmiştir. Bu reaksiyon süresinin 45 dakika ile sınırlı kalmasına dikkat

edilmiştir. SA:L-sistein, 2:1 (a/a) oranda olacak şekilde karışıma eklenmiş ve pH’sı

61

1M HCl ile 4’e ayarlanarak oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmiştir. Sonra

ortamın pH’sı 6’ya yükseltilerek reaksiyon bir saat daha sürdürülmüştür. Elde edilen

aljinat-sistein konjugatı, 10 °C’de 1 mM HCl kullanılarak diyaliz yoluyla ayrılmıştır.

Son olarak, elde edilen yapı %1 NaCl içeren 1 mM HCl çözeltisi ile iki kere yıkanmış

ve -30° C’de dondurulurak liyofilizasyonla kurutulmuştur. TSA sentezinin kontrolü

için FTIR analizi yapılmıştır. Bunun için TSA, SA ve L-Sistein’in spektrumları, 400

– 4000 cm-1 dalga sayısı aralığında Perkin Elmer FTIR System Spectrum BX

spektrometresi ile çekilmiş ve sonuçlar değerlendirilmiştir.

Nanolif yapıda insert formülasyonlarını TSA ile kaplamak amacıyla SA ile

kaplamada kullanılan daldırma yöntemi kullanılmış benzer prosedür takip edilmiştir

(176).

X-Işını Fotoelektron Spektroskopisi (XPS) ile Yüzey Özelliklerinin

Belirlenmesi

SA ve TSA kaplama işlemlerinin kontrolü amacıyla XPS değerlendirilmesi

yapılmıştır.

XPS, katı materyallerin yüzeyleri hakkında kimyasal bilgi elde etmek için

kullanılan gelişmiş bir yüzey analiz tekniğidir (178). PHI 5000 VersaProbe cihazı

kullanılarak kaplanmamış veya kaplanmış nanolif yapıda insertlerin yüzeylerindeki

element içeriklerinin ve kimyasal durumlarının belirlenmesi ve elementlerin bağlanma

enerjilerinin ölçümü gerçekleştirilmiştir. Bu şekilde hazırlanan nanolif yapıda

insertlerin yüzeylerindeki kaplama işleminin gerçekleşme durumu tespit edilmiştir.

Siklodekstrin (Cyc):Besifloksasin HCl İnkülüzyon Kompleksi İçeren

Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanoliflerinin Hazırlanması

Siklodekstrin Türevleri ve Besifloksasin HCl Kullanılarak İnklüzyon

Kompleksinin Oluşturulması

BH ve Cyc türevleri (Hidroksipropil-β-Siklodekstrin (HP-β-Cyc) veya-β-

Siklodekstrin (β-Cyc)) arasındaki kompleks oluşumunu tespit etmek amacı ile ilk

olarak çözünürlük çalışması yapılmıştır.

62

Faz-Çözünürlük Çalışması

Çözünürlük çalışmaları, Higuchi ve Connors (179) tarafından belirlenmiş

yönteme göre gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, aşırı miktarda BH (sudaki çözünürlüğü

0,08 mg/ ml değerinin üstünde olacak şekilde belirlenmiştir (49)) tartılmış ve farklı

molar oranlarında hazırlanan HP-β-Cyc ve β-Cyc’nin (0, 20, 40, 60, 80 ve 100 mM)

distile sudaki çözeltisine ilave edilmiştir. Elde edilen karışımlar, oda sıcaklığında

çoklu yatay karıştırıcı ile 400 rpm’de 7 gün boyunca ışıktan korunarak karıştırılmıştır.

7. günün sonunda karıştırma işlemi sonlandırılarak her bir karışım 0,22 µm’lik

membran filtreden süzülmüş, elde edilen her bir süpernatant için Bölüm 3.2.1’de

anlatılan HPLC yöntemi kullanılarak BH miktarı tayini yapılmıştır. Elde edilen

(Bölüm 4.4.1) faz-çözünürlük grafiğinden yola çıkarak HP-β-Cyc, β-Cyc ve BH

arasındaki etkileşimin göstergesi olan kompleks stabilite sabiti (K1:1) hesaplanmıştır

(Eşitlik 3.1).

K1: 1 =𝐸ğ𝑖𝑚

𝑆0(1−𝐸ğ𝑖𝑚) (3.1) (180)

S0= İlacın gerçek (intrinsik) çözünürlüğü

S0 BH’nin gerçek (intrinsik) çözünürlüğü olup değeri 0,116 mM’dır (37). Eğim

ise, faz çözünürlük diyagramının doğrusal bölümünden elde edilen eğimin değeridir.

Kompleksleşme etkinliğinin tayini ise aşağıdaki denklem yardımı ile

yapılmıştır (180, 181) (Eşitlik 3.2).

Kompleks Etkinliği =Eğim

(1−Eğim) (3.2) (180)

BH formülasyonu için optimal BH:HP-β-Cyc oranı aşağıdaki denkleme göre

belirlenmiştir (Eşitlik 3.3).

Optimal BH: HP − β − Cyc Oranı = 1/(1 +1

Kompleks etkinliği) (3.3) (180)

63

Bölüm 4.4.1’de yer alan faz-çözünürlük çalışmaları sonuçlarına göre BH ile

inklüzyon kompleksi oluşturmak için HP-β-Cyc uygun bulunmuş, BH:HP-β-Cyc

molar oranı 1:1 olarak belirlenmiştir. Komplekslerin hazırlanması için yapılan ön

denemelerin sonuçlarına göre birlikte dondurarak kurutma (co-lyophilization)

yönteminin çalışmalarımızda kullanılmasına karar verilmiştir (182). Faz-çözünürlük

çalışmaları kapsamında, BH ve HP-β-Cyc’nin fiziksel karışımı, 1 mM BH ve 1 mM

HP-β-Cyc flakonda ezilmeden karıştırılarak hazırlanmıştır (BH:HP-β-Cyc fiziksel

karışımı) (157, 183).

Birlikte Dondurarak Kurutma Yöntemi ile Komplekslerin Hazırlanması ve

Analizleri

BH:HP-β-Cyc 1:1 molar oranında inklüzyon komplekslerinin hazırlanması için

eşit molar oranda BH, HP-β-Cyc hesaplanarak tartılmış, HP-β-Cyc’nin sudaki, BH’nin

metanol içindeki çözeltileri hazırlanmıştır. Daha sonra, BH çözeltisi damla damla HP-

β-Cyc çözeltisi üzerine eklenmiş ve 24 saat süre ile karıştırılmıştır. Son olarak,

rotavapor yardımı ile organik çözücü uzaklaştırılmış ve 72 saat süre ile

koliyofilizasyon yapılarak kompleks toz halde elde edilmiştir (183). Kompleksleştirme

işleminin doğrulanması amacıyla, elde edilen numunelerin FTIR ve DSC analizleri

yapılmıştır. Bunun için komplekslerin 400 – 4000 cm-1 dalga sayısı aralığında Perkin

Elmer FTIR System Spectrum BX spektrometresi ile spektrumları çekilmiş ve sonuçlar

değerlendirilmiştir. Bunlara ilaveten komplekslerin termal analizi, DSC Q 100 model

diferansiyel taramalı kalorimetre kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Alüminyum

numune kabı içine yerleştirilen örneğin (5 mg) 10˚C/dk hızda, 10 – 400˚C sıcaklık

aralığında azot atmosferi altında DSC termogramları çekilmiştir.

Besifloksasin HCl:Hidroksipropil-β-Siklodekstrin İnklüzyon Kompleksi

İçeren Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif Yapıda İnsertlerin

Hazırlanması

PKL ve PEG ( sırasıyla 260 ve 130 mg) polimerleri (toplamda 390 mg) %13

(a/h) olacak şekilde tartılmış 2 mL DCM-DMF ile (9:1) oranındaki çözücü

karışımında çözülmüştür. İkinci aşamada; hazırlanmış olan BH:HP-β-Cyc inklüzyon

kompleksinden 35 mg tartılarak 1 mL metanol içerisinde çözülmüştür. Son aşamada

64

ise; ilaç çözeltisi, polimer çözeltisinin üzerine manyetik karıştırıcıda damla damla

eklenmiş ve 400 rpm’de 24 saat boyunca homojen oluncaya dek karıştırılmıştır.

Hazırlanan bu çözelti için 15 kV gerilim, 20 cm enjektör ucu-plaka arası mesafe ve

0,05 mL/dk polimer çözeltisi akış hızı koşullarında elektro-eğirme işlemi

gerçekleştirilmiştir. Alüminyum plakada toplanan BH yüklü nanoliferden delgeç

yardımı ile dairesel parçalar (3.5 mm2) kesilerek insert formülasyonları elde

edilmiştir.

Formülasyonların Sterilizasyonu

Kaplama işlemi yapılmamış (temel), kaplanmış, inklüzyon kompleksi içeren

formülasyonların veya aynı formülasyonların ilaç içermeyen gruplarının

sterilizasyonu için, üretilen nanolif yapıda insertler steril petri kapları içinde, UV

lamba (254 nm) altında, her bir yüzey için 24 saat olmak üzere toplamda 48 saat

bekletilmiştir (184). Bu işlemin bitmesi ile beraber UV lamba altından alınan nanolif

yapıda insertler sterilizasyon kontrolüne tabi tutulmuştur. UV lamba yardımı ile

sterilize edilmiş nanolif yapıda insertler belirli miktarda steril distile su içinde 24 saat

inkübe edildikten sonra 1 ml örnek alınarak tüp içindeki sıvı tiyoglikolat ve triptik soy

buyyon besiyerlerine ekilmiştir. 24 saat sonra tüplerdeki sıvılardan 1’er mL örnek

alınarak üreme kontrolü için P.aeuroginosa (ATCC 27853) standart kökeninden 100

CFU birimde süspansiyonlar hazırlanmış aynı plaklara ekim yapılmıştır. Tüm plaklar

37 ºC’de 48 saat inkübasyona bırakılarak süre sonunda besiyerlerindeki üreme

sonuçları incelenmiştir (184).

Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonucunda enkapsülasyon etkinliği, in

vitro salım özelliği parametreleri göz önünde bulundurularak daha ileri çalışmalar için

uygun bulunan formülasyonlar belirlenmiştir. Bu formülasyonların kodları ve

özellikleri Tablo 3.4’ de sunulmuştur.

65

Tablo 3.4. Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonrası belirlenen nanolif yapıda

insert formülasyonları ve kodları.

Kod PKL/PEG

konsantrasyonu

(%)

SA

kaplama

(%2)

TSA

kaplama

(%2)

BH

miktarı

(mg)

BH: HP-β-

Cyc

kompleksi

Formülasyon A 13 - - 10 -

Formülasyon A’ 13 - - 0 -

Formülasyon B 13 + - 10 -

Formülasyon B’ 13 + - 0 -

Formülasyon C 13 - + 10 -

Formülasyon C’ 13 - + 0 -

Formülasyon D 13 - - 10 +

Formülasyon D’ 13 - - 0 +

3.2.4. Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının Karakterizasyon

Çalışmaları

Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonucunda belirlenen, kaplama işlemi

yapılmamış, kaplanmış veya inklüzyon kompleksi içeren formülasyonların

karakterizasyon çalışmaları kapsamında; SEM görüntüleme, çap-kalınlık, ağırlık,

şişme testi, in vitro degredasyon testi, enkapsülasyon etkinliği, in vitro salım

çalışmaları ve ex vivo biyoadezyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir.

Morfolojik İnceleme

Formülasyonların yüzey morfolojileri, değişik büyütme oranları kullanılarak

nanolif yapıda insertlerin görüntülenmesi için uygun olan alan emisyonlu taramalı

elektron mikroskobu (SEM, FEI-QUANTA FEG 450) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

İnsertlerin yüzeyinde elektrostatik yük oluşumunu önlemek ve daha iyi görüntü

alabilmek için analiz öncesinde çok ince altın film tabakası ile kaplanmıştır. Elde

edilen görüntüler ile nanolif insertlerin yüzey morfolojileri değerlendirilmiştir.

66

İnsert yapısındaki liflerin ortalama çaplarını belirleyebilmek için Image J

programı kullanılarak her bir formülasyon için rastgele 100 adet lifin çapı ölçülmüş ve

sonrasında ortalama çap dağılımını gösteren histogram grafikleri çizilmiştir.

Çap-Kalınlık

Hazırlanan nanolif yapıda insert formülasyonların çap ve kalınlık ölçümleri

verniyeli kumpas kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, 3 adet insertin verniyeli

kumpasta ayrı ayrı ölçümleri alınmış, çap kalınlık tayini için gerekli istatistiksel

analizler yapılarak sonuçlar elde edilmiştir. (n=3, X̄±SS) (185).

Ağırlık Tayini

Hazırlanan nanolif yapıda insertlerin ağırlık tayini için, 3 adet insertin hassas

terazide ağırlıkları ayrı ayrı ölçülmüş, gerekli istatistiksel analiz gerçekleştirilerek

sonuçlar elde edilmiştir (n=3, X̄±SS) (185).

Şişme Testi

Şişme yüzdesi tayini için, insert formülasyonları, 37±0,5 °C’ye ayarlanmış su

banyosuna yerleştirilmiş, Eppendorf tüplerde bulunan 1,5 mL pH 7,4 PBS ortamına

bırakılmış ve 1, 3, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 ve 168. saatlerde tüplerden insertler

alınarak üzerindeki ortamın fazlası uzaklaştırıldıktan sonra tartılarak ve başlangıçta

belirlenen ağırlıklarına göre şişme yüzdeleri Eşitlik 3.4 kullanılarak hesaplanmıştır

(74).

% Şişme İndeksi = (𝑉𝑡−𝑉𝑜

𝑉𝑜) ∗ 100 (3.4) (13)

𝑉𝑡 = t zamandaki ağırlık

𝑉𝑜= başlangıçtaki ağırlık

In Vitro Degradasyon Testi

Nanolif yapıdaki insertlerin hazırlanmasında kullanılan PKL su ile temas ettiği

zaman parçalanmaya uğramaktadır. Bu parçalanmaya bağlı olarak ortamın pH’sı aside

67

kayabilmektedir. Oluşabilecek bu pH değişikliğinin gözde olası iritasyon riskini

belirleyebilmek amacıyla belirli zaman aralıklarında pH ölçümü yapılmıştır. Bu

amaçla; nanolif yapıda insertler, 37±0,5 °C’ye ayarlanmış su banyosuna yerleştirilmiş

Eppendorf tüplerde bulunan 1,5 mL pH 7,4 PBS ortamına bırakılmış ve 1, 3, 5, 8, 24,

48, 72, 96, 120, 144 ve 168. saatlerde pH metre ile ortamın pH’sı ölçülmüştür (n=3)

(186).

Enkapsülasyon Etkinliği

Enkapsülasyon etkinliği tayini, nanolif yapıda insertlere yüklenen BH

miktarını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla, hazırlanan nanolif yapıda

insertler ilk olarak 1 mL DCM:DMF (9:1) karışımı içinde çözülmüş ve üzerine 1 mL

PBS ilavesinden sonra bir gün süre ile bekletilmiştir. Bekleme süresinden sonra

numuneler 13500 rpm’de santrifüjlenmiş ve 1 mL PBS ortamdan enjektör yardımı ile

alınmıştır (n=3). Örnekteki BH miktarı HPLC yöntemi ile tespit edilmiştir.

In vitro Salım Çalışmaları

Nanolif yapıda insertler, in vitro salım deneyleri için 2 mL’lik Eppendorf

tüplere alınmış (n=6) ve 1,5 mL PBS çözeltisi ilave edilmiştir (175). Aynı şekilde

hazırlanan 6 salım hücresi, sıcaklığı 32 ± 0.5 °C'de sabit tutulan yatay çalkalayıcılı su

banyosuna (Eppendorf Thermomixer R) (Şekil 3.6) yerleştirilmiştir (173). Belirli

zaman aralıklarında (1, 3, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 ve 168. saatlerde) ortamın tümü

alınmıştır. Alınan bu ortamın 1 mL’lik kısmı 0,45 μm por çapına sahip membran

filtrelerden süzülerek HPLC kolonuna enjekte edilmiş, kalan 0,5 mL’lik kısmı ile MİK

analizi yapılmıştır. Alınan örneğin yerine 1,5 mL PBS ilave edilmiş ve salım hücreleri

yeniden yatay çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirilmiştir.

Nanolif yapıda insertlerin in vitro salım profillerini karşılaştırmak için farklılık

faktörleri (f1) ve benzerlik faktörleri (f2) hesaplanmıştır. Farklılık faktörü, f1, Eşitlik

3.5 ile benzerlik faktörü, f2 ise Eşitlik 3.6 ile hesaplanmıştır(187). 0 ile 15 arasındaki

f1, 50 ile 100 arasındaki f2 değerleri, iki salım profilinin benzer olduğunu

göstermektedir.

𝑓1 = {∑|𝑅𝑡 − 𝑇𝑡|/ ∑𝑅𝑡}𝑥100 (3.5) (187)

𝑓2 = 50𝑙𝑜𝑔{(1 + 1/𝑛 ∑(𝑅𝑡 − 𝑇𝑡) ) −0,5𝑥100} (3.6) (187)

68

Şekil 3.6. In Vitro salım deneylerinde Eppendorf tüplerin yerleştirildiği Thermomixer

Cihazı.

Ex vivo Biyoadezyon Çalışması

Ex vivo biyoadezyon çalışmalarında 2-3,5 kg ağırlık aralığında erkek veya dişi,

albino, Yeni Zelanda tavşanları kullanılmıştır. Deneyler, Hacettepe Üniversitesi

Deney Hayvanları Merkezinde uzman göz hekimi gözetiminde etik kurul kararına

uygun olarak yürütülmüştür (Protokol onayı Hacettepe Üniversitesi Hayvan Deneyleri

Etik Kurulundan alınmıştır (No: 2018/69 -08)).

Ex vivo biyoadezyon çalışmasından önce tavşan gözleri çıkartılmış ve kornea

ve konjonktiva dokusu ayrılmıştır. Analiz, taze kornea ile hemen yapılmıştır.

Biyoadezyon ölçümü software kontrollü penetrometre (Texture Analyser TA.XT plus

C) ile gerçekleştirilmiştir. Kornea, cihazın alt aparatına yerleştirilmiş ve sabitlenmiştir

(188). Nanolif yapıda insert de cihazın üst probuna (P 10 Perspex, Ɵ: 10mm) bir

yüzeyinden yapıştırılarak sabitlenmiştir (Şekil 3.8). Bu üst prob (P 10 Perspex, Ɵ:

10mm), test süresince 1 mm.sn-1 sabit hız ile hareket ettirilmiştir. Proba yerleştirilmiş

olan nanolif yapıda insert ve korneanın, 0,05 N’luk temas kuvveti ile 60 sn boyunca

temasta kalması sağlanmıştır. 60 sn sonunda prob 2,5 mm.sn-1 hızla korneadan

uzaklaştırılmış ve yukarı çıkartılmıştır. Elde edilen kuvvet (N)-mesafe (mm)

eğrisinden ayrılma kuvveti (F) ve eğri altı alandan da biyoadezyon hesaplanmıştır

(n=3) (74). Çalışmada kullanılan test parametreleri aşağıda belirtilmiştir:

69

Test parametreleri:

Prob=Perpex (10 mm çap)

Test öncesi probun hızı = 1 mm/sn

Test esnasında probun hızı = 0,5 mm/sn

Test sonrası probun hızı = 2,5 mm/sn

Probun geri dönüş mesafesi = 20.000 mm

İnsert ile korneanın temas süresi = 60 sn

İnsert ile korneanın ilk temas kuvveti = 0,05 N

Şekil 3.7 Biyoadezyon çalışmasına ilişkin görüntüler.

3.2.5. Mikrobiyolojik Çalışmalar

Besifloksasin HCl’nin Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MİK)

Tayini

MİK testi, gram-negatif bakteri olan P.aeuroginosa (ATCC 27853) için CLSI

(Clinical and Laboratory Standards Institute) tarafından önerildiği şekilde yapılmıştır.

Mikroorganizmalar, Mueller Hinton II Agar besiyerinde 37 °C’de 17 saatlik

inkübasyon sonunda türbidite 0,5 McFarland’a eşdeğer olacak şekilde steril tuz

çözeltisinde (%0.85) süspande edilmiştir. MİK’in belirlenmesi için 96 kuyucuklu

mikroplakalar kullanılmış ve 0,1 g/mL BH konsantrasyonu ile çalışılmıştır. Her

kuyucuğa 100 µl steril Mueller Hinton II Broth (Becton), 100 µL mikroorganizma

süspansiyonu ve hazırlanan BH konsantrasyonları seri halde dilüsyonlar yapılarak

(başlangıç konsantrasyonu 100 µL) aktarılmış ve mikroplakalar 37 °C’de 24 saat

70

inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda bulanıklığın gözlenmediği ilk

konsantrasyon MİK değeri olarak kabul edilmiştir (184, 189).

Geliştirilen Formülasyonların In Vitro Antibakteriyal Etkinlik Tayini

Disk difüzyon testi, gram-negatif bir bakteri olan P.aeuroginosa (ATCC

27853) kullanarak gerçekleştirilmiştir. Mikroorganizmalar bulanıklık 0,5

McFarland’a eşdeğer olacak şekilde steril tuz çözeltisinde (%0,85) süspande

edilmiştir. McFarland standartları, sıvı bir besiyerinde bulunan bakteri sayısını tespit

etmek için geliştirilmiştir. McFarland’ın baryum klorür ve sülfürik asit kullanarak

geliştirdiği standart bulanıklık tüpleri, sıvı bir besiyerine ekilen bakterinin miktarına

eşdeğer bulanıklık derecelerini içerir. Disk difüzyon yöntemi, CLSI ((Clinical and

Laboratory Standards Institute) tarafından bildirilen şekilde yapılmıştır. Hazırlanan

bakteri süspansiyonlarından 100 µL alınarak steril Mueller Hinton II Agar petri

yüzeyine steril Drigalski spatülü yardımı ekilmiştir. Sonra agar üzerine aseptik

koşullarda (Class II laminar hava kabinlerinde) 6 mm çapında steril kağıt diskler

yerleştirilmiştir. İnsert formülasyonları katı oldukları için, enkapsülasyon etkinliği

çalışmasında kullanılan yöntemle BH, PBS çözeltisi içine çekilerek ekstrakte edilmiş

ve bu çözeltiden 10 µl alınarak steril kağıt disklere emdirilmiştir. Benzer şekilde, ticari

preparattan (Besivance®) da 10 µl alınmış ve agar üzerinde bulunan 6 mm çapında

steril kağıt disklere emdirilmiştir (n=3). Bu çalışmada kullanılan gruplar aşağıda

verilmiştir (74, 184).

Grup 1: Formülasyon A

Grup 2: Formülasyon B

Grup 3: Formülasyon C

Grup 4: Formülasyon D

Grup 5: Besivance®

71

3.2.6. Hücre Kültürü Çalışmaları

Hücre kültürü çalışmaları, daha önceden belirlenmiş olan Formülasyon A, B,

C, D ve bunların BH içermeyen formülasyonlarının (A’, B’, C’, D’) sitotoksik

etkilerini incelemek için yapılmıştır.

MTT testi, in vitro şartlarda hücrelerin canlılığına dayanan ve sitotoksisiteyi

tespit etmek için uygulanan kantitatif, kolorimetrik bir testtir (190). Bu test; hızlı,

kolay ve yüksek oranda doğru sonuç veren bir yöntemdir. Bir tetrazolyum tuzu olan

MTT (3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür) sarı renkli bir

maddedir. MTT’nin çözeltisi kültürdeki hücrelere eklenince aktif bir metabolizmaya

sahip olan canlı hücreler, MTT’yi suda çözünmeyen formazan kristallerine çevirirler.

MTT’nin formazana indirgenmesinin hücresel mekanizması henüz tam

anlaşılmamıştır ancak NADH ve benzer indirgeyici moleküllerin MTT’ye elektron

transferi gerçekleştirmesini içeren bir reaksiyon sonucu gerçekleştiği

düşünülmektedir. Formazan kristalleri, DMSO veya HCl içeren saf izopropanol gibi

organik çözücülerde rahatlıkla çözünmektedir. Çözünmüş olan bu kristallerin,

konsantrasyonuna bağlı olarak spektrofotometrik yöntemle görünür dalga boylarında

ölçülebilen bir absorbans elde edilmektedir (191).

Kullanılan Ortamlar

ARPE-19 insan retina pigment epitel hücreleri (ATCC CRL-2302) ile

gerçekleştirilen çalışmalarda, kültür ortamı olarak fetal sığır serumu (FBS) (%10),

penisilin G (50 ünite.mL-1) ve streptomisin (50 µg.mL-1) içeren Dulbecco's Modified

Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) tercih edilmiştir. MTT çözeltisi

5 mg.mL-1 konsantrasyonda fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) içerisinde

hazırlanmıştır. Formazan kristallerini çözmek için %23 (a/a) sodyum dodesil sülfat

(SDS), % 45 (v/v) dimetilformamit içeren sulu çözelti (pH 4.7) kullanılmıştır.

ARPE-19 İnsan Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Hazırlanması

Hücre kültürü çalışmalarında, ARPE-19 insan retina pigment epitel hücreleri

kullanılmıştır. Bu amaçla, ARPE-19 hücreleri -180 °C’de sıvı nitrojen tankı içinden

alınarak, içinde hücre kültürü ortamı bulunan 75 cm2’lik flasklarda çoğaltılmıştır.

Sonra bu flasklar %5 CO2 içeren 37 °C’lik inkübatörün içine yerleştirilmiştir. ARPE-

72

19 insan retina pigment epitel hücrelerine, deney öncesi tripsin-EDTA çözeltisi (%

0,25 tripsin-%0,03 EDTA) iki dakika süre ile muamele edilerek, hücrelerin flask

yüzeyinden ayrılması ve hücre süspansiyonunun hazırlanması sağlanmıştır. Elde

edilen hücre süspansiyonuna kültür ortamı eklenerek 2000 rpm’de 5 dakika

santrifüjlenmiştir. Sonra, süpernatan uzaklaştırılmış ve 15 mL taze kültür ortamı

eklenmiştir. Bu hücre süspansiyonları 25’er cm2’lik yeni flasklara alınarak çoğalmaları

için inkübatöre yerleştirilmiştir. ARPE-19 hücrelerinin canlılık kontrollerinin takibi

tripan mavisi ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, hücre vasatı ile süspande edilmiş

hücrelerden 30 µL alınarak üzerine 30 µL tripan mavisi eklenmiştir. Elde edilen

süspansiyonda bulunan hücrelerin sayımı Thoma lamı kullanılarak optik mikroskop

yardımı ile yapılmıştır. Hücre kültürü deneylerinde büyüme aşamasındaki hücreler

tercih edilmiştir.

Sitotoksisite Testinde Kullanılan Besifloksasin HCl Yüklü

Formülasyonların Deney İçin Hazırlanması

Sitotoksisite çalışmaları için, boş insert formülasyonları ve aynı

formülasyonların BH yüklü olanları kullanılmıştır. İnsertlerin hazırlanması Yöntem

3.3’te anlatıldığı gibi yapılmış, sonra Amerikan Farmakopesi 42 (USP 42)’ de (192)

yer alan yönteme göre nanolif insertlerin ekstratları elde edilmiştir (Şekil 3.8). Bu

amaçla, hazırlanan insertler 7 gün süre ile hücre kültürü ortamında kalmış (salım süresi

ile benzerlik sağlaması amacıyla) ve 7. günün sonunda insertler ortamdan

uzaklaştırılmıştır. Süpernatan, sterilizasyonu sağlamak amacı ile aseptik ortamda 0,22

µm açıklığında filtreden süzülerek steril Eppendorf tüplerine alınmıştır.

73

Şekil 3.8. Ekstraksiyon işlemi ile ilgili bazı görüntüler.

MTT Yöntemi ile In Vitro Hücre Canlılığının İncelenmesi

(Sitotoksisite)

ARPE-19 insan retina pigment epitel hücreleri üzerinde hazırlanan boş ve ilaç

yüklü insert formülasyonlarının sitotoksik etkilerinin ölçülebilmesi için Hansen M.B.

ve ark. (24) tarafından geliştirilen MTT yöntemi farklılaştırılarak kullanılmıştır.

ARPE-19 insan retina pigment epitel hücreleri, 100 µL kültür ortamı içinde 96

kuyucuklu plaklara 5x103 hücre/kuyucuk olacak şekilde ekilmiş ve 37 °C’de

karbondioksitli etüvde bir gece bekletilmiştir. Ertesi gün kuyucuklarda var olan ortam

uzaklaştırılmış ve boş insertlerden elde edilen ekstraksiyonlar (Formülasyon A’, B’,

C’ ve D’), BH yüklü formülasyonların ekstraksiyonları (Formülasyon A, B, C ve D)

ve kontrol olarak hücre kültürü ortamı, plaklarda bulunan kuyucuklara mikropipet

yardımı ile eklenmiştir. Bu plaklar; 24, 48 ve 72 saat süreliğine 37 °C’de %5 CO2

içeren inkübatöre yerleştirilmiştir. İnkübasyon bittikten sonra 25 µL MTT solüsyonu

(5 mg/mL) kuyucuklara ilave edilerek 4 saat karanlıkta etüvde 37 °C’de inkübasyon

işlemi sürdürülmüştür. 4 saat sonra, 80 µL %23 (a/a) SDS, % 45 (v/v)

dimetiflformamit içeren sulu çözelti (pH 4.7) kuyucuklara eklenmiştir ve plakalar

inkübatöre alınarak bir gece bekletilmiştir (Şekil 3.9). Ertesi gün mikroplaka

okuyucuda 570 nm dalga boyunda absorbans (optik dansite, OD) değerleri

okunmuştur. Aynı şartlarda insert ekstraktı içermeden inkübe edilen hücreler kontrol

olarak kullanılmıştır. Kontrol grubundan alınan absorbans değerlerinin %100 olduğu

kabul edilmiş, ekstraktlarla etkileştirilmiş kuyucuklardan alınan değerler ile

74

karşılaştırılarak hücre canlılık oranı (uygulanan nanolif insertin sitotoksisitesi) tespit

edilmiştir (n=3) (193, 194).

Şekil 3.9. MTT İşleminden a) Önce ve b) Sonra Plakların Görünümü.

3.2.7. Ex vivo Kornea Geçiş Çalışmaları

Ex vivo oküler çalışmalarında 2-3,5 kg ağırlık aralığında erkek veya dişi,

albino, Yeni Zelanda tavşanları kullanılmıştır. İlgili deneysel çalışmalar, Hacettepe

Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezinde uzman göz hekimi gözetiminde etik kurul

kararına uygun olarak yürütülmüştür (Protokol onayı Hacettepe Üniversitesi Hayvan

Deneyleri Etik Kurulundan alınmıştır (No: 2018/69 -08)). Çalışmada kullanılacak

kornea, taze tavşan gözlerinden izole edilmiştir. Doku, nakil odalarının alıcı tarafında

bulunan iğnelerin üzerine yerleştirilmiş, daha sonra haznelerin verici tarafı sızdırmaz

hale getirilmiştir. Difüzyon odası sisteminin şematik gösterimi Şekil 3.11'de

verilmiştir. Dokular sırası ile odacıklara yerleştirilmiş, sonrasında alıcı odaları sağ

tarafta kalacak şekilde, odalar sisteme yerleştirilmiştir. Sonra termostat 37 °C’ye

sabitlenmiş, ayrıca sistem havası %5 CO2 içerecek şekilde ayarlanmıştır (n=3)(195).

BH yüklü nanolif yapıda insert formülasyonları, ticari preparat (Besivance®)

veya ilaç çözeltisi (% 0,0035 a/h olacak şekilde distile su içinde) verici odasına

yerleştirilmiş, alıcı odası PBS ile doldurulmuş ve orta kısma da kornea yerleştirilmiştir

(Şekil 3.12). Her iki odada toplam ortam miktarı 4 mL olacak şekilde ayarlanmıştır.

15, 30, 60, 120, 240 ve 360. dakikalarda alıcı odadaki tüm numune toplanmış ve yerine

4 mL taze PBS eklenmiştir.

a b

75

Ortamın pH’sı, deneyin başlangıcında ve sonunda pH çubukları kullanılarak

ölçülmüş ve deneyin başlangıcında ve sonrasında pH’nin yaklaşık 7 olduğu tespit

edilmiştir. Numunelerdeki BH miktarı, HPLC analizi yapılarak ölçülmüştür (196).

Görünür geçirgenlik katsayıları (Papp, cm/s) Eşitlik 3.7 kullanılarak

hesaplanmıştır.

𝑃𝑎𝑝𝑝 =𝑑𝑡

𝑑𝑐 𝑋 1/𝐴𝐶0 (3.7)

dt/dc ilaç geçirgenlik oranı (μg/s), A, nanolif yapıda insertin (hücre tek

tabakalı) yüzey alanı (cm2), C0, alıcı taraftaki ilacın başlangıç konsantrasyonudur

(μg/mL).

Şekil 3.10. Ex vivo geçiş çalışmaları için difüzyon odası sisteminin şematik

görünümü (197).

76

Şekil 3.11. Ex vivo kornea çalışma düzeneğinin fotoğrafı.

3.2.8. In Vivo Çalışmalar

In vivo çalışmalar kapsamında formülasyonların, keratite karşı antibakteriyel

etkinliği ve oküler güvenilirliği değerlendirilmiştir. Çalışmalar, derecelendirme

(skorlama) testi ile gerçekleştirilmiştir (32). In vivo oküler çalışmalar 2-3,5 kg ağırlık

aralığında erkek veya dişi, albino, Yeni Zelanda tavşanlarında yürütülmüştür.

Deneyler, Hacettepe Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezinde uzman göz hekimi

gözetiminde etik kurul protokoluna uygun olarak yürütülmüştür (Onay Hacettepe

Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu’ndan alınmıştır (No: 2018/69 -08)).

Çalışma boyunca tüm hayvanlar ışık kontrollü odalarda ve normal diyetle beslenmiş

olup, göz hareketlerinde herhangi kısıtlanma uygulanmamıştır.

Bakteriyal Keratit Oluşturulması

Tavşanlarda bakteriyal keratit oluşturmak için P.aeuroginosa (ATCC 27853)

standart kökeni, Mueller Hinton Agar besiyerinde hazırlanmıştır. Bu amaçla taze

kültürden serum fizyolojik yardımı ile bakteri süspansiyonları hazırlanmış ve

77

süspansiyonlarının bulanıklığı Biosan McFarland Dansitometre cihazında 0,5

McFarland olacak şekilde ayarlanmıştır. Hazırlanan süspansiyon seyreltilerek birimi

105 CFU olarak ayarlanmıştır. Tavşanlarda bakteriyel keratit oluşturabilmek için

anestezi işlemi uygulanmıştır. Bu amaçla, ilk olarak genel anesteziyi sağlamak için

göz kasları içine ksilazin HCl (3,5 mg/kg) ve ketamin HCl (35 mg/kg) uygulanmış,

lokal anesteziyi oluşturabilmek için de göz içine proparakain HCl (0,5% w/v Alcaine®)

damlatılmıştır. Sonrasında, hazırlanmış olan 105 CFU süspansiyonu 30-numaralı

insülin enjektörü ile tavşanların gözünün stroma tabakasına enjekte edilmiştir (Şekil

3.13). 24 saat sonra tavşanlarda bakteriyel keratit oluşup oluşmadığı uzman göz hekimi

tarafından yapılan muayene ile belirlenmiştir (198).

Şekil 3.12. Bakteri süspansiyonu enjeksiyonu a) öncesi b) sonrası tavşan gözünün

fotoğrafı.

a b

78

Tedavi İşlemi

Antibakteriyal etkinlik tayini için, her bir tavşan grubunun hastalık geliştirilen

sağ gözüne nanolif yapıda insert formülasyonları 7 günlük süre için bir kere olmak

üzere uygulanmıştır. Ticari formülasyon (Besivance ®) ve serum fizyolojik ise 7 gün

boyunca günde 3 defa 1 damla (1 damla = 50 µL) olacak şekilde uygulanmıştır. Ayrıca

gün aşırı olarak uzman göz hekimi tarafından skorlanarak tedaviye yanıtlar

değerlendirilmiştir. Her bir grup için 3 tavşan (n=6 göz) kullanılmıştır. İlaç içeren

insert gruplarında etken madde miktarı 36 µg±3,6µg BH/insert’dir. Deneyde

kullanılan gruplar aşağıdaki gibidir:

Grup 1: Formülasyon C (TSA kaplı BH içeren %13 PKL/PEG

(260mg:130 mg) nanolif yapıda insert))

Grup 2:Formülasyon D (BH:HP-β-Cyc inklüzyon kompleksi içeren %13

PKL/PEG (260mg:130 mg) nanolif yapıda insert))

Grup 3: Formülasyon C’ (İlaç içermeyen)

Grup 4: Formülasyon D’ (İlaç içermeyen)

Grup 5: Besivance® % 0.6 süspansiyon (300 µg BH /1 damla (50 µL)

Grup 6: Serum fizyolojik

Tedavinin Değerlendirilmesi

Tavşan gözlerine bakteri uygulamasından 16 saat sonra, tavşan gözleri uzman

göz hekimi tarafından ‘slit lamb’ mikroskobu yardımı ile incelenmiş ve oküler

patolojileri daha önce belirlenmiş skorlama sistemi kullanılarak derecelendirilmiştir.

Bunu takiben hastalığın geliştiği tespit edilen tavşanlara gerekli tedavi uygulamalar

yapılmıştır. Yedi gün boyunca gün aşırı olacak şekilde tavşanlar uzman göz hekimi

tarafından mikroskop yardımı ile muayene edilmiştir (199). Bu muayenede yedi

parametreye bağlı olarak enfeksiyon 0 (yok) ila 4 (şiddetli) ölçeğinde puanlama

yapılmıştır (200).

79

Tablo 3.5. Tedavi değerlendirme tablosu (200).

Skor 0 1 2 3 4

Konjonktival Enjeksiyon Sıfır Eser

miktarda

Hafif Orta Ciddi

Kemozis Sıfır Eser

miktarda

Hafif Orta Ciddi

Fibrin Sıfır Eser

miktarda

Hafif Orta Ciddi

İritis Sıfır Eser

miktarda

Hafif Orta Ciddi

Korneal sızma %0 %1-25 %26-50 %50-75 %76-100

Korneal ödem %0 %1-25 %26-50 %50-75 %76-100

Hipopiyon %0 %1-25 %26-50 %50-75 %76-100

3.2.9. Histolojik Çalışmalar

Histolojik değerlendirme için, kornealar gözden ayrılmış ve hemen %10

formol içeren bir tüp içine yerleştirilmiştir. Daha sonra örnekler, etiketli kaplara

konulmuş, artan konsantrasyonda alkol içeren çözeltilerde kurutulmuş ve son olarak

ksilen ile muamele edilmiştir. Bu işlemi takiben, her kornea ikiye bölünmüş ve

parafine gömülmüştür. Parafin içine gömülmüş kornealar daha sonra 5 mikrometre

kalınlığında kesitlere ayrılmıştır. Daha sonra bu kesitler hematoksilin ve eozin (H&E)

ile boyanmış ve ışık mikroskobu (Leica DMR, Leica Microsystems GmbH) ile

gözlenmiştir. Görüntüler 4x, 10x ve 40x büyütme ile elde edilmiştir (201) (LAS Sürüm

4.2.0, Leica Microsystems GmbH,).

3.2.10. İstatistiksel Analizler

Hücre kültürü, ex vivo kornea geçiş ve in vivo deneylerin istatistiksel analizleri

Graphpad Prism programı kullanılarak, tek yönlü varyans analizini (ANOVA)

takiben, Tukey testi yöntemi ile değerlendirilmiştir. Anlamlı farklılık seviyesi %95

olarak alınmıştır (P < 0.05).

80

4. BULGULAR

4.1. Besifloksasin HCl’nin Fizikokimyasal Özelliklerinin İncelenmesi

4.1.1. Besifloksasin HCl’nin Erime Derecesi Tayini

Bölüm 3.2.1’de belirtilen koşullarda gerçekleştirilen analiz sonucunda BH’nin

erimeye başladığı sıcaklığın 290 °C olduğu, erimenin tam olarak bittiği sıcaklığın ise

298 °C olduğu görülmüştür. Elde edilen bu sonucun, literatürde BH için bildirilen

erime derecesi değeriyle (210 °C’nin üzerinde) uyum içinde olduğu tespit edilmiştir

(49).

4.1.2. Besifloksasin HCl’nin DSC Analizi

Bölüm 3.2.1’de belirtilen koşullarda gerçekleştirilen analize ilişkin DSC

bulguları Şekil 4.1’de verilmiştir. BH’nin, 321,5 °C’de ekzoterm bir pike sahip olduğu

görülmektedir. Bu verinin literatürde yer alan bir araştırma sonucuyla uyum içinde

olduğu görülmektedir (49).

Şekil 4.1. BH’nin DSC analizi sonucu.

81

4.1.3. Besifloksasin HCl’nin FTIR Analizi

Bölüm 3.2.1’de belirtilen şartlarda yapılan analize ilişkin FTIR spektrumu

bulguları Şekil 4.2’de verilmiştir. BH’nin 3056 cm-1’de primer amin gerilim bandı,

2864 cm-1’de aril gerilim bandı, 1726 cm-1’de keton gerilim bandı ve 1610 cm-1’de

karboksil gerilim bandına sahip olduğu görülmektedir. Elde edilen bu verilerin,

literatürde BH için mevcut olan FTIR spektrum bulgularına benzer olduğu tespit

edilmiştir(49, 202).

82

Şekil 4.2. BH’ye ilişkin FTIR spektrumu.

Dalg

a B

oyu

(cm

-1)

3056

2864

1726

1610

% Transmittans

83

4.1.4. Besifloksasin HCl’nin UV Analizi

Bölüm 3.2.1’de belirtilen koşullarda gerçekleştirilen UV analizi sonucuna

ilişkin bulgular Şekil 4.3‘te verilmiştir. BH’nin distile su içinde 10-6 M (10 µg/mL)

konsantrasyonda, maksimum absorbans gösterdiği dalga boyunun (λ maks) 289 nm

(spektrumda gösterilen 3 numaralı pik) olduğu görülmektedir. Elde edilen bu sonucun

literatürde BH için mevcut olan maksimum absorbansın gözlendiği dalga boyuna

uygun olduğu tespit edilmiştir (49).

Şekil 4.3. BH’nin distile su içinde (10 µg/mL) Ultraviyole (UV) spektrumu (3

numaralı pik).

4.1.5. Besifloksasin HCl’nin HPLC ile Miktar Tayini

Bölüm 3.2.1’de belirtilen koşullarda gerçekleştirilmiş olan HPLC tayinine

ilişkin kromatogram Şekil 4.4’te verilmiştir. BH’nin alıkonma zamanının 5,5 dakika

olduğu görülmektedir. Elde edilen bu sonucun literatürde BH için mevcut olan

alıkonma zamanına uygun olduğu tespit edilmiştir (165).

Dalga Boyu (nm)

Ab

sorb

an

s

84

Şekil 4.4. BH’nin distile su içinde (20 µg/mL) elde edilen HPLC kromatogramı.

Analitik Yöntem Validasyonu

Doğrusallık

Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı üzere, etken madde konsantrasyonlarına karşı elde

edilen pik alanlarının (AUC) ortalama (X̄) ve standart sapma (SS) değerleri Tablo

4.1’de verilmiştir. Ayrıca, elde edilen kalibrasyon doğrusu grafiği, hesaplanan doğru

denklemi ve determinasyon katsayısı (R2) Şekil 4.5’te verilmiştir. Determinasyon

katsayısının 0,9999 olarak hesaplanması ve 1’e yakın olması denklemin doğrusallığını,

deneysel verilerin güvenilirliğinin yüksek olduğunu göstermektedir.

Eğri

alt

ınd

a k

ala

n a

lan

Zaman (dakika)

85

Şekil 4.5. BH’nin doğrusallık çalışmasından elde edilen kalibrasyon doğrusu grafiği

(n=6).

Tablo 4.1. BH’nin HPLC yöntemine ilişkin doğrusallık çalışmasından elde edilen

bulgular (n= 6 ).

Konsantrasyon (μg/mL)

X̄ pik alanı

SS (±)

20 1799,82 1,95

15 1361,36 1,20

10 909,75 5,97

5 458,35 2,51

2,5 241,87 1,30

1 109,76 4,57

0,75 88,80 0,54

0,6 56,71 0,47

Doğruluk

Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı gibi yapılan çalışmada elde edilen % geri kazanım

ve SS değerleri Tablo 4.2’de verilmiştir. Her konsantrasyon için ortalama yüzde geri

kazanım değeri hesaplanmıştır ve sonuçların sırasıyla % 108,97, % 99,21 ve % 99,96

olduğu tespit edilmiştir. Doğruluk için kabul edilebilir % geri kazanım aralığı %80-

%120 olarak belirlenmiştir.

y = 89,395x + 15,39

R² = 0,9999

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 5 10 15 20 25

AU

C (

Pik

Ala

nı)

Konsantrasyon (µg/ml)

86

Tablo 4.2. BH’nin HPLC yöntemine ilişkin doğruluk çalışmasından elde edilen

bulgular (n=6).

Konsantrasyon (μg/mL) X̄ (%) geri kazanım X̄ pik alanı SS (±)

0,75 108,97 88,45 0,53

5 99,21 458,87 0,94

15 99,96 1355,89 3,01

Kesinlik

Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı şekilde elde edilen ‘Tekrarlanabilirlik

(Repeatability)’ bulguları Tablo 4.3’te, ‘Tekrar elde edilebilirlik (Reproducibility)’

bulguları ise Tablo 4.4’te verilmiştir. Pik alanlarına karşılık gelen konsantrasyonlar

için VK değerleri hesaplanmıştır. VK’nın % 2’den küçük olması yöntemin

tekrarlanabilirliğini ve tekrar elde edilebilirliğini göstermektedir (184).

Tablo 4.3. BH’nin HPLC yöntemine ilişkin doğrusallık çalışmasından elde edilen gün

içi kesinlik bulguları (n=6).

Konsantrasyon (μg/mL) X̄ konsantrasyon (μg/mL) SS (±) % VK

0,75 0,78 0,01 1,04

5 4,95 0,01 0,19

15 14,98 0,04 0,28

Tablo 4.4. BH’nin HPLC yöntemine ilişkin doğrusallık çalışmasından elde edilen

günler arası kesinlik bulguları (n=6).

Konsantrasyon (μg/mL) X̄ konsantrasyon (μg/mL) SS (±) % VK

0,75 0,80 0,02 2,03

5 4,898 0,06 1,32

15 14,97 0,12 0,85

Özgüllük

Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı şekilde yapılan özgüllük çalışmasına göre,

formülasyonlarda kullanılan yardımcı maddelerin HPLC analizlerinde, BH’nin pik

alıkonma zamanında girişim yapmadığı belirlenmiştir.

87

Duyarlılık

BH’nin HPLC ile miktar tayininde kullanılan yöntemin duyarlılığı Bölüm

3.2.1’de belirtildiği şekilde tespit edilmiş olup miktar tayini sınırı (LOQ) 0.1 µg/mL

ve saptama sınırı (LOD) 0.04 µg/mL olarak belirlenmiştir.

Stabilite

Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı gibi hazırlanan BH’nin stabilite bulguları Tablo

4.5’te verilmiştir. % geri kazanım değeri % 97,43-109,1 arasında bulunarak BH’nin in

vitro salım çalışmaları sırasında dayanıklı kalacağı gösterilmiştir.

Tablo 4.5. BH’nin deney süresince stabilitesine ilişkin bulgular (n=6).

Konsantrasyon

(μg/mL)

Zaman

(Saat)

Pik alanı X̄ pik alanı SS (±) (%) geri

kazanım

0,75 0 88,64 109,1

24 87,54 87,19 1,60 107,61

48 86,07 105,41

5 0 459,66 99,39

24 453,19 453,92 4,79 97,94

48 450,92 97,43

15 0 1354,68 99,87

24 1345,14 1366,46 6,19 99,16

48 1338,56 98,67

4.2. Besifloksasin HCl Yüklü Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının

Optimizasyon Çalışmaları

Bölüm 3.2.2’de belirtildiği şekilde, BH yüklü PKL/PEG nanolif yapıda insert

formülasyonlarının optimizasyon çalışmaları kapsamında %10 veya % 13 oranında

toplam polimer ve polimer miktarının % 2.5’i oranında (a/a) BH içeren

formülasyonlarda PKL/PEG karışım oranının belirlenmesi için çalışmalar yapılmıştır.

Bu çalışmalarda en yüksek ilaç enkapsülasyon etkinliğine sahip ve istenen salım

profilini sağlayan karışım oranı tespit edilmiştir. Optimizasyon çalışmalarında in vitro

salım deneylerine ilişkin bulgular Şekil 4.6 ve Şekil 4.7’de, enkapsülasyon etkinliği

bulguları Tablo 4.6’da sunulmuştur.

88

Şekil 4.6. PKL/PEG içeren nanolif yapıda insertlerin optimizasyon çalışmalarında in

vitro salım bulguları (n= 6) (Tüm salım profili:168 saat).

Şekil 4.7. PKL/PEG içeren nanolif yapıda insertlerin optimizasyon çalışmalarında in

vitro salım bulguları (n=6) (168 saatlik salımın ilk 24 saatinin detaylı

gösterimi).

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200

%K

üm

üla

tif

Sa

lım

Zaman (Saat)

% 13 PKL/PEG (2:1) nanolif insert

% 13 PKL/PEG (1,75:1,25) nanolif

insert

% 13 PKL/PEG (1:1) nanolif insert

% 13 PKL/PEG (1:2) nanolif insert

% 10PKL/PEG (2:1) nanolif insert

%10 PKL/PEG (1,75:1,25) nanolif

insert

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30

%K

üm

üla

tif

Salı

m

Zaman (Saat)

% 13 PKL/PEG (2:1) nanolif insert

% 13 PKL/PEG (1,75:1,25) nanolif

insert

% 13 PKL/PEG (1:1) nanolif insert

% 13 PKL/PEG (1:2) nanolif insert

% 10 PKL/PEG (2:1) nanolif insert

% 10 PKL/PEG (1,75:1,25) nanolif

insert

89

Tablo 4.6. PKL/PEG içeren nanolif yapıda insertlerin optimizasyon çalışmalarında

enkapsülasyon etkinliği bulguları (n=3 ).

PKL/PEG toplam

konsantrasyonu (a/h)

PKL/PEG oranı

(a/a)

Enkapsülasyon

etkinliği (%)

SS (±)

10% 2:1 93,2 1,65

10% 1,75:1,25 92,6 1,45

13% 1:1 95,4 2,23

13% 1:2 95,9 1,94

13% 2:1 96,2 1,98

13% 1,75:1,25 95,3 2,02

Optimizasyon için yapılan in vitro salım deneylerinde salım profillerinin ilk 24

saatlik bölümünde %13 (a/h) toplam polimer içeren formülasyonlardan PKL:PEG 2:1

(a/a) olan formülasyonun %70’lik bir patlama salımı (“burst effect”) gösterdiği tespit

edilmiştir. Hazırlanmış olan diğer nanolif yapıda insert formülasyonlarının ise %75’in

üzerinde bir patlama salımı gösterdiği görülmüştür. Buna ilaveten, formülasyonların

enkapsülasyon etkinlikleri incelendiğinde, nanolif yapıda insert formülasyonlarının

hepsinin etken maddeyi %90’ın üstünde enkapsüle ettiği görülmüştür.

Bu nedenle %96,2 değeri ile en yüksek enkapsülasyon etkinliğine ve uygun

ilaç salım profiline sahip, %13 (a/h) konsantrasyonda toplam polimer içeren,

PKL:PEG oranı 2:1 (a/a) oranında olan formülasyon, tezin ilerleyen aşamalarında

etkinliği araştırılacak temel formülasyon (kaplanmamış) olarak belirlenmiştir.

4.3. Sodyum Aljinat (SA) / Tiyollenmiş Sodyum Aljinat (TSA) Kaplı

Polikaprolakton / Polietilen Glikol Nanolif Yapıda İnsertlerin

Hazırlanmasının Optimizasyonuna İlişkin Bulgular

Yapılan değerlendirmeler sonucunda Bölüm 4.2’de sunulduğu üzere %13 (a/h)

polimer içeren, PKL-PEG oranı 2:1 (a/a) olan ve % 2.5 (a/a) oranında BH içeren

formülasyon, en yüksek ilaç yükleme kapasitesi ve uygun bulunan in vitro salım

özellikleri nedeniyle optimum formülasyon olarak belirlenmiştir. Bu formülasyonun

SA veya TSA ile kaplanması için, % 2 oranında polimer içeren çözeltiler

kullanılmıştır. TSA ile kaplama işleminden önce Bölüm 3.2.3’te belirtildiği üzere TSA

sentezi yapılmıştır.

90

4.3.1. Tiyollenmiş Sodyum Aljinat’ın Sentez Sonrası FTIR Spektrumu

Analizi

Bölüm 3.2.3’te belirtilen şartlarda yapılan sentez ve FTIR analizi sonucu elde

edilen TSA ve sentezde kullanılan L-Sistein ve SA’ya ilişkin FTIR spektrumu

bulguları Şekil 4.8’de verilmiştir. Şekil 4.10’da TSA’ya ilişkin belirgin amid I ve amid

III gerilim bağları, 1639 cm−1 ve 1458 cm−1’de görülmektedir. Bu durum, TSA

sentezinin başarıyla gerçekleştirildiğini göstermekte olup elde edilen spektrum

literatür ile uyumludur (188).

91

Dalg

a B

oyu

(cm

-1)

% Transmittans A

)

92

Dalg

a B

oy

u (

cm-1

)

% Transmitans B

)

93

Şekil 4.8. FT-IR spektrumu analizi sonuçları A) L-sistein B) SA C) TSA.

Dalg

a B

oy

u (

cm-1

)

% Transmitans C

)

94

4.3.2. İnsertlerin Kaplama İşleminin X-Işını Fotoelektron Spektroskopisi

(XPS) ile Kontrolü

Bölüm 3.2.3’te belirtilen koşullarda nanoliflere uygulanan SA veya TSA

kaplamanın kontrolü amacıyla yüzey özellikleri XPS ile değerlendirilmiştir. Analiz

sonucu elde edilen grafikler Şekil 4.9’da verilmiştir. XPS sonuçları incelendiğinde SA

ve TSA ile kaplama yapılan Formülasyon C ve Formülasyon D’nin yüzeyinde kaplama

amacıyla kullanılan polimerlerdeki fonksiyonel grupların varlığı tespit edilmiştir

(ayrıntılı bilgi tartışma bölümünde verilmiştir).

95

Şekil 4.9. XPS analizi sonuçları.

A) Karbon 1s bağlanma enerjisi B) Oksijen 1s bağlanma enerjisi C) Sistein grubu 1s bağlanma enerjisi

(Formülasyon A: kaplı olmayan PKL/PEG insert; Formülasyon B: SA kaplı PKL/PEG insert;

Formülasyon C: TSA kaplı PKL/PEG insert; Formülasyon D: BH-Cyc kompleksi içeren PKL/PEG

insert).

96

4.4. Siklodekstrin: Besifloksasin HCl İnklüzyon Kompleksi İçeren

Polikaprolakton / Polietilen Glikol Nanoliflerinin Hazırlanmasında

Faz Çözünürlük Çalışması Bulguları

Bölüm 3.2.3’te belirtilen şartlarda, komplekleri oluşturmak üzere farklı

konsantrasyonlarda ve tipte Cyc türevleri kullanıldığında (β-Cyc veya HP-β-Cyc)

BH’nin çözünürlüğünde meydana gelen değişim incelenmiştir. Şekil 4.10 ve 4.11’te

iki farklı Cyc türevi ile çalışma sonucunda elde edilen faz çözünürlük diyagramları

gösterilmektedir. HP-β-Cyc’e ilişkin faz çözünürlük diyagramları AL tipinde iken β-

Cyc’e ilişkin faz çözünürlük diyagramının ise AN tipi olduğu tespit edilmiştir.

Şekil 4.10. BH:β-Cyc kompleksinin su içindeki faz çözünürlük diyagramı (n=3,

X̄±SS).

y = 0,4074x + 8,3517

R² = 0,8941

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

BH

Kon

san

trasy

on

u (

mM

)

β-Cyc Konsantrasyonu (mM)

97

Şekil 4.11. BH:HP-β-Cyc kompleksinin distile su içindeki faz çözünürlük diyagramı

(n=3, X̄±SS).

Artan Cyc konsantrasyonuna bağlı olarak BH’nin çözünürlüğünde meydana

gelen değişimler Tablo 4.7 ve Tablo 4.8’de gösterilmektedir. Tablo 4.7’de yer alan

sonuçlar incelendiğinde, HP-β-Cyc’nin konsantrasyonundaki artışın BH’nin

çözünürlüğünü artırdığı görülmektedir. Tablo 4.8’deki veriler incelendiğinde ise artan

β-Cyc konsantrasyonuna bağlı olarak BH’nin çözünürlüğünde belirli bir değere kadar

artış olduğu, sonrasında ise artan β-Cyc konsantrasyonuna rağmen azalma olduğu

tespit edilmiştir. 1:1 kompleks tipi faz çözünürlük eğrisinin eğiminden yararlanılarak

elde edilen kompleks stabilite sabiti (K1:1) değerleri kompleks etkinliği (KE) değeri ve

optimal BH:Cyc değeri (OBH) hesaplanarak Tablo 4.7 ve 4.8’de sunulmuştur.

y = 0,5911x + 9,5327

R² = 0,9309

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

BH

Ko

nsa

ntr

asy

on

u (

mM

)

HP-β-Cyc Konsantrasyonu (mM)

98

Tablo 4.7. Artan HP- β –Cyc konsantrasyonuna bağlı olarak elde edilen BH

çözünürlük değerleri (n=3).

Siklodekstrin

tipi

Siklodekstrin

konsantrasyonu

(mM)

BH çözünürlüğü

(μg/mL)

SS (±)

HP-β-Cyc 0 78,57 53,03

HP-β-Cyc 20 1032,72 93,03

HP-β-Cyc 40 1858,89 179,09

HP-β-Cyc 60 1953,56 129,09

HP-β-Cyc 80 2319,31 112,28

HP-β-Cyc 100 2848,58 151,2

K1:1=8503 M-1 OBH=1:1,69

KE=1,44

K1:1: kompleks stabilite sabiti, KE: kompleks etkinliği, OBH: optimal BH:Cyc değeri

Tablo 4.8. Artan β-Cyc konsantrasyonuna bağlı olarak elde edilen BH çözünürlük

değerleri (n=3).

Siklodekstrin

tipi

Siklodekstrin

konsantrasyonu

(mM)

BH çözünürlüğü

(μg/mL)±SS,

SS (±)

β-Cyc 0 78,57 53,03

β-Cyc 20 817,57 97,57

β-Cyc 40 1346,83 107,9

β-Cyc 60 1394,17 122,12

β-Cyc 80 1910,53 155,78

β-Cyc 100 1867,50 124,27

K1:1=4045 M-1 OBH=1:2,47

KE=0,68

K1:1: kompleks stabilite sabiti, KE: kompleks etkinliği, OBH: optimal BH:Cyc değeri

İki farklı Cyc türevi ile hazırlanan inklüzyon kompleksinin kompleks stabilite

sabitleri incelendiğinde elde edilen değerlerin, Cyc:ilaç inklüzyon kompleksinin

stabilitesi için gerekli olan 100-10000 M-1 aralığında olduğu tespit edilmiştir. Fakat

HP-β-Cyc’nin stabilite sabitinin β-Cyc’nin stabilite sabitinin iki katı olduğu

99

görülmektedir. Bu durum HP- β-Cyc’nin etken madde ile oluşturacağı inklüzyon

kompleksinin β-Cyc’ye oranla iki katı güçlü olduğunu göstermektedir.

4.4.1. İnklüzyon Kompleksi Üzerinde Yapılan Fizikokimyasal

İncelemeler

Yapılan faz çözünürlük çalışmalarının sonucu incelendiğinde, artan β-Cyc

konsantrasyonuna bağlı olarak BH’nin çözünürlüğünde belirli bir değere kadar artış

olduğu, sonrasında ise artan β-Cyc konsantrasyonuna rağmen azalma olduğu tespit

edilmiştir. Bu nedenle BH:Cyc kullanılacak formülasyonlarda HP-β-Cyc

kullanılmasına karar verilmiştir.

İnklüzyon Komplekslerinin FTIR Spektrumları

BH:HP-β-Cyc kompleksinin oluşumunun doğrulanması amacıyla Bölüm

3.2.3’te belirtilen koşullarda hazırlanan, BH:HP-β-Cyc fiziksel karışımı ve inklüzyon

komplekslerinin FTIR spektrumları, FTIR 420 Spec. cihazında 4000-400 cm-1 dalga

boyları arasında çekilmiştir. FTIR analizinde kompleksteki BH’nin karakteristik

piklerinde değişiklik olup olmadığı incelenmiştir. Bu karakteristik pikler;

2500-3300 cm-1 CO-OH bağlarına ilişkin gerilme titreşimleri

1900-1650 cm-1 C=O keton bağlarına ilişkin gerilme titreşimleri

1675-1500 cm-1 C=C aromatik veya alifatik bağlarına ilişkin gerilme

titreşimleri

3050-3500 cm-1 N-H bağlarına ilişkin gerilme titreşimleri

Saf BH, HP-β-Cyc ve BH’nin fiziksel karışımı ve HP-β-Cyc:BH inklüzyon

kompleksine ilişkin FTIR spektrumları Şekil 4.12’de verilmiştir. Şekil 4.12’de

gösterildiği gibi, hem fiziksel karışımda hem de inklüzyon kompleksinde BH’nin

karakteristik piklerinin kaybolduğu, dolayısıyla inklüzyon kompleksinin başarı ile

oluşturulduğu gösterilmiştir.

100

A

28

64

Da

lga

Bo

yu

(cm

-1)

% Transmitans

3056

17

26

16

10

A)

101

B

Dalg

a B

oy

u (

cm-1

)

% Transmitans

B)

102

Şekil 4.12. FTIR spektrum sonuçları

A)BH, B) BH: HP-β-Cyc inklüzyon kompleksi, C) BH ve HP-β-Cyc fiziksel

karışımı.

C

Dalg

a B

oyu

(cm

-1)

% Transmitans

C)

103

İnklüzyon Komplekslerinin DSC Termogramları

BH:HP-β-Cyc kompleksinin oluşumunun araştırılması amacıyla Bölüm

3.2.3’te belirtilen koşullarda hazırlanan saf BH, BH:HP-β-Cyc fiziksel karışımı ve

inklüzyon komplekslerinin DSC analizleri gerçekleştirilmiş ve sonuçlar Şekil 4.13’te

verilmiştir. Literatürde, BH’nin DSC termogramında, 321,5 °C’de ekzotermik bir pik

bulunduğu bildirilmektedir (36). Çalışmamızda elde edilen DSC analizi sonuçları

incelendiğinde, BH’nin literatürde belirtilen erime piki ile uyumlu olduğu

görülmüştür. Hem fiziksel karışımda hem de oluşturulan inklüzyon komplekslerinde

bu erime piki görülmediği için inklüzyon kompleksinin oluşturulduğu tespit edilmiştir.

Şekil 4.13. DSC analizi sonuçları.

4.5. Optimize Edilmiş Nanolif İnsert Formülasyonlarının Belirlenmesi

Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonrası belirlenen nanolif yapıda insert

formülasyonları ve kodları Tablo 4.9’da sunulmuştur. % 13 polimer ve polimer

konsantrasyonun % 2,5’i kadar etken madde içeren temel formülasyon (kaplanmamış),

%13 polimer ve polimer konsantrasyonun % 2,5’i kadar etken madde içeren SA ve

TSA kaplı formülasyonlar ve % 13 polimer ve Cyc:ilaç inklüzyon kompleksini içeren

104

formülasyon olmak üzere 4 adet formülasyon karakterizasyon çalışmaları, ex vivo

biyoadezyon ve ex vivo kornea geçiş çalışmalarında kullanılmak üzere hazırlanmıştır.

Tablo 4.9. Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonrası belirlenen nanolif yapıda

insert formülasyonları ve kodları.

Formülasyon

kodu

PKL/PEG

konsantrasyonu

(%)

SA

kaplama

(%2)

TSA

kaplama

(%2)

BH

miktarı

(%a/a)

BH: HP-

β-Cyc

kompleksi

Formülasyon A 13 - - 2,5 -

Formülasyon A’ 13 - - 0 -

Formülasyon B 13 + - 2,5 -

Formülasyon B’ 13 + - 0 -

Formülasyon C 13 - + 2,5 -

Formülasyon C’ 13 - + 0 -

Formülasyon D 13 - - 2,5 +

Formülasyon D’ 13 - - 0 +

4.6. Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının Karakterizasyon

Çalışmaları

4.6.1. Morfolojik İnceleme Bulguları

Bölüm 3.2.4’te belirtilen koşullarda nanolif yapıda insertlerin yüzey

morfolojilerinin SEM ile görüntülenmesi ve nanolif çap dağılımlarını gösteren

histogram grafikleri Şekil 4.14 - Şekil 4.18 arasında, ortalama nanolif çapları Tablo

4.10’da verilmiştir.

105

Şekil 4.14. A’ formülasyonunun SEM görüntüleri

(A) 5000x, B) 10000x büyütme ve nanolif çap dağılımını gösteren histogram

(C) grafiği (n=100).

0

5

10

15

20

25

30

200 300 400 500 600 700 800

Sık

lık

Nanolif Çapı (nm)

C)

A B A) B)

106

Şekil 4.15. A formülasyonunun SEM görüntüleri

(A) 5000x, B) 10000x büyütme venanolif çap dağılımını gösteren histogram

(C) grafiği (n=100).

0

5

10

15

20

25

30

35

200 300 400 500 600 700 800

Sık

lık

Nanolif Çapı (nm)

C)

A B

A) B)

107

Şekil 4.16. B formülasyonunun SEM görüntüleri

(A) 5000x, B) 10000x büyütme ve nanolif çap dağılımını gösteren histogram

(C) grafiği (n=100).

0

5

10

15

20

25

30

200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Sık

lık

Nanolif Çapı (nm)

C)

B A A) B)

108

Şekil 4.17. C formülasyonunun SEM görüntüleri

(A) 5000x, B) 10000x büyütme ve nanolif çap dağılımını gösteren histogram

(C) grafiği (n=100).

0

5

10

15

20

25

30

35

200 300 400 500 600 700 800

Sık

lık

Nanolif Çapı (nm)

900

C)

A B A) B)

109

Şekil 4.18. D formülasyonunun SEM görüntüleri

(A) 5000x, B) 10000x büyütme ve nanolif çap dağılımını gösteren histogram

(C) grafiği (n=100).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

200 300 400 500 600 700 800

Sık

lık

Nanolif Çapı (nm)

C)

A B A) B)

110

Tablo 4.10. Optimizasyon ve geliştirme çalışmaları sonrası belirlenen nanolif yapıda

insert formülasyonlarının ortalama lif çapları (n=100, X̄±SS).

Nanolif formülasyon

kodu

X̄ lif çapı (nm) SS (±)

Formülasyon A’ 498,3 123,14

Formülasyon A 521 140,07

Formülasyon B 643,54 154,46

Formülasyon C 709,46 132,22

Formülasyon D 572,4 138,65

Formülasyonların nanolif çapları incelendiği zaman SA ve TSA

kaplanmasından dolayı Formülasyon B ve Formülasyon C’nin nanolif çaplarının diğer

formülasyonlara oranla arttığı tespit edilmiştir.

4.6.2. Çap-Kalınlık Bulguları

Bölüm 3.2.4’te belirtilen koşullarda insertlerin çap-kalınlık ölçümleri

yapılmıştır. Çalışmaya ilişkin bulgular, Tablo 4.11’de, insertlerin fotoğrafları ise Şekil

4.19’da verilmiştir.

Tablo 4.11. Nanolif yapıda insertlerin çap-kalınlık çalışmasına ilişkin bulgular (n=3,

X̄±SS).

Formülasyon

kodu

X̄ İnsert çapı

(mm)

SS (±) X̄ İnsert kalınlığı

(mm)

SS (±)

Formülasyon

A

6,7 0,012 0,6 0,004

Formülasyon

B

6,7 0,004 0,8 0,008

Formülasyon

C

6,2 0,008 0,83 0,0004

Formülasyon

D

6,6 0,004 0,66 0,004

111

Şekil 4.19. Nanolif yapıda insertlerin fotoğrafı

a) Formülasyon A, b) Formülasyon B, c)Formülasyon C, d) Formülasyon D.

Çap-Kalınlık çalışmaları sonuçları incelendiğinde, ölçümler sonucu elde edilen

standart sapmaların düşük olması nanolif yapıda insertlerin kesme işleminin uygun bir

şekilde yapıldığını göstermektedir.

4.6.3. Ağırlık Tayini Bulguları

Bölüm 3.2.4’te belirtilen koşullarda insertlerin ağırlık ölçümleri yapılmıştır.

Çalışmaya ilişkin bulgular Tablo 4.12’de verilmiştir.

Tablo 4.12. Nanolif yapıda insertlerin ağırlık çalışmasına ilişkin bulgular (n=3,

X̄±SS).

Formülasyon kodu X̄ Ağırlık (mg) SS (±)

Formülasyon A 1.27 0,28

Formülasyon B 1,54 0,14

Formülasyon C 1,58 0,37

Formülasyon D 1,39 0,15

Ağırlık çalışmaları sonuçları incelendiğinde formülasyona katılan madde

miktarında artış ile beraber nanolif yapıda insertlerin ağırlığının arttığı tespit

edilmiştir.

112

4.6.4. Şişme Testine İlişkin Bulgular

Bölüm 3.2.4’te belirtilen koşullarda çalışma yapılmış ve ilgili sonuçlar Şekil

4.20, Şekil 4.21’de verilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde, SA ve TSA ile kaplanmış olan

Formülasyon B ve C’nin diğer formülasyonlara kıyasla daha yüksek bir şişme yüzdesi

gösterdiği belirlenmiştir.

Şekil 4.20. Formülasyonların şişme yüzdesi bulguları (%) (n=3, X̄±SS).

a) Formülasyon A (kaplanmamış), b) Formülasyon B (SAkaplı), c) Formülasyon C

(TSA kaplı), d) Formülasyon D (ilaç:siklodekstrin kompleksi içeren).

0

20

40

60

80

100

0 100 200

%Ş

işm

e

Zaman (Saat)

0

20

40

60

80

100

0 100 200

%Ş

işm

e

Zaman (Saat)

0

20

40

60

80

100

0 100 200

%Ş

işm

e

Zaman (Saat)

c)

0

20

40

60

80

100

0 100 200

%Ş

işm

e

Zaman (Saat)

a) b)

d)

113

Şekil 4.21. Nanolif yapıda insertlerin şişme yüzdesi bulguları (%) (n=3, X̄±SS).

4.6.5. In vitro Degradasyon Testi Bulguları

Bölüm 3.2.4 ’te belirtilen koşullarda yapılan çalışmanın bulguları Şekil 4.22,

Şekil 4.23’de verilmiştir. 7.gün sonunda bütün formülasyonların pH değerinin 7’nin

üstünde olduğu belirlenmiştir. Bu durum, hazırlanan formülasyonların göz pH’sı ile

uyumlu olduğunu göstermektedir (82).

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

% Ş

işm

e

Zaman ( Saat)

Formülasyon A

Formülasyon B

Formülasyon C

Formülasyon D

114

Şekil 4.22. Formülasyonların in vitro degradasyon çalışmasına ilişkin pH bulguları

(n=3, X̄±SS ). (a) Formülasyon A (kaplanmamış), b) Formülasyon B

(SA kaplı), c) Formülasyon C (TSA kaplı), d) Formülasyon D

( ilaç:siklodekstrin kompleksi içeren).

7,1

7,15

7,2

7,25

7,3

7,35

7,4

7,45

0 100 200

pH

Zaman (Saat)

a)

7,1

7,15

7,2

7,25

7,3

7,35

7,4

7,45

0 100 200

pH

Zaman (Saat)

b)

7,1

7,15

7,2

7,25

7,3

7,35

7,4

7,45

0 100 200

pH

Zaman (Saat)

c)

7,1

7,15

7,2

7,25

7,3

7,35

7,4

7,45

0 100 200

pH

Zaman (Saat)

d)

115

Şekil 4.23. Nanolif yapıda insertlerin in vitro degradasyon çalışmasına ilişkin

bulgular (n=3 X̄±SS).

4.6.6. Enkapsülasyon Etkinliği Bulguları

Bölüm 3.2.4’te belirtilen koşullarda yapılan çalışmanın bulguları Tablo

4.13’de verilmiştir. Formülasyonların hepsinin enkapsülasyon etkinliği %90’nın

üzerinde bulunmuştur. İlaç içeren insert gruplarında etken madde miktarı 36 µg±3,6µg

BH/insert olarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçların literatür ile uyumlu olduğu

görülmüştür (203).

Tablo 4.13. Nanolif yapıda insertlerin enkapsülasyon etkinliği bulguları (n=3, X̄±SS).

Formülasyon kodu X̄ Enkapsülasyon etkinliği (%) SS (±)

Formülasyon A 96,2 1,98

Formülasyon B 93,4 2,09

Formülasyon C 94,3 1,13

Formülasyon D 98,1 1,32

7,1

7,15

7,2

7,25

7,3

7,35

7,4

7,45

0 50 100 150 200

pH

Zaman (Saat)

Formülasyon A

Formülasyon B

Formülasyon C

Formülasyon D

116

4.6.7. In Vitro Salım Çalışmasına İlişkin Bulgular

Bölüm 3.2.4’te koşullarda gerçekleştirilen in vitro BH salım çalışmasından

elde edilen % kümülatif ilaç salım bulguları Tablo 4.14 - Tablo 4.17 arasında, salım

profilleri Şekil 4.24, Şekil 4.25’de ve f1/f2 farklılık/benzerlik faktörü sonuçları Tablo

4.28’de verilmiştir. In vitro salım sonuçları incelendiğinde Formülasyon A, B, C’nin

7 gün süre ile salım yaptığı, Formülasyon D’de ise 3. günün sonunda salımın

sonlandığı görülmüştür. Genel olarak ilk 24 saatte tüm formülasyonların yüklenen

ilacın %70-75 arasında saldığı bulunmuştur. Bu durum, PKL/PEG kullanılan

formülasyonlarda görülen salım profilleriyle uyumlu bulunmuştur (88). f1/f2

farklılık/benzerlik sonuçları incelendiğinde, f1 değerlerinin 15’in üzerinde f2

değerlerinin ise 50’nin altında olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçlar formülasyonların

salım profillerinin benzer olmadığını hazırlamada kullanılan farklı formülasyon

parametrelerinin salım profillerinde değişikliğe neden olduğunu göstermiştir.

Tablo 4.14. Formülasyon A’dan in vitro salınan kümülatif BH miktarı (%) (n=6).

Zaman (saat) %Kümülatif salım SS (±)

1 35,29 9,2

3 48,51 8,3

5 56,48 6,4

8 63,17 5,8

24 69,31 2,3

48 45,35 6

72 81,31 5,5

96 87,15 5,2

120 92,65 4,8

144 96,69 4,3

168 99,79 5

117

Tablo 4.15. Formülasyon B’den in vitro salınan kümülatif BH miktarı (%) (n=6).

Zaman (saat) %Kümülatif salım SS (±)

1 22,98 8,2

3 36,12 7,6

5 47,06 5,4

8 56,69 5,2

24 65,9 2,6

48 74,45 5,3

72 81,69 4,2

96 88,11 4,9

120 93,45 4,7

144 97,7 4,6

168 99,55 4,9

Tablo 4.16. Formülasyon C’den in vitro salınan kümülatif BH miktarı (%) (n=6).

Zaman (saat) %Kümülatif salım SS (±)

1 19,37 10,24

3 34,16 9,45

5 44,37 9,42

8 54,98 8,97

24 64,66 3,09

48 73,45 7,41

72 81,08 7,36

96 86,83 5,47

120 92,44 5,47

144 96,72 6,49

168 99,93 7,45

Tablo 4.17. Formülasyon D’den in vitro salınan kümülatif BH miktarı (%) (n=6).

Zaman (saat) %Kümülatif salım SS (±)

1 39,02 11,48

3 64,87 9,86

5 76,57 9,45

8 83,35 10,89

24 89,64 2,47

48 95,19 6,87

72 99,16 7,52

118

Şekil 4.24. Formülasyonların in vitro salım profilleri (n= 6, X̄±SS).

(a) Formülasyon A (kaplanmamış), b) Formülasyon B (SA kaplı), c) Formülasyon C

(TSA kaplı), d) Formülasyon D (ilaç:siklodekstrin kompleksi içeren).

0

20

40

60

80

100

0 100 200

%K

üm

üla

tif

Sa

lım

Zaman (Saat)

0

20

40

60

80

100

0 100 200

%K

üm

üla

tif

Sa

lım

Zaman (Saat)

b)

0

20

40

60

80

100

0 100 200

%K

üm

üla

tif

Salı

m

Zaman (Saat)

c)

0

20

40

60

80

100

0 100 200

%K

üm

üla

tif

Salı

m

Zaman (Saat)

d)

a)

119

Şekil 4.25. Formülasyon A,B,C, D’nin in vitro salım profilleri (n= 6, X̄±SS).

Tablo 4.18. Nanolif yapıda insertler için f1/f2 benzerlik değeri sonuçları (n=6).

Formülasyon

A

Formülasyon

B

Formülasyon

C

Formülasyon

D

Formülasyon A - 15,77/38,5 15,84/38,1 19,14/43,12

Formülasyon B 15,77/38,5 - 17,05/47,09 18,51/37,86

Formülasyon C 15,84/38,1 17,05/47,09 - 34,34/28,33

Formülasyon D 19,14/43,12 18,51/37,86 34,34/28,33 -

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

%K

üm

üla

tif

Sa

lım

Zaman ( Saat)

Formülasyon A

Formülasyon C

Formülasyon B

Formülasyon D

120

4.6.8. Ex vivo Biyoadezyon Çalışmasına İlişkin Bulgular

Bölüm 3.2.4’te belirtilen koşullarda çalışma gerçekleştirilmiştir. Nanolif

yapıda insertlerden elde edilen biyoadezyon bulguları Şekil 4.26’da verilmiştir.

Formülasyon B ve C’nin yüzeylerindeki SA ve TSA kaplamaların insertlerin

biyoadezif özelliklerini artırdığını göstermiştir.

A B C D

0 .0 0

0 .0 5

0 .1 0

0 .1 5

Min

imu

m B

að

lan

ma

Gü

cü

(N

ew

to

n)

A

B

C

D

Şekil 4.26. Nanolif yapıda insertlere ilişkin biyoadezyon sonuçları

(A: kaplanmamış, B: SA kaplı, C: TSA kaplı, D: ilaç: siklodekstrin kompleksi içeren

formülasyon) (n= 3, X̄ ± SS).

4.6.9. Mikrobiyolojik Çalışma Bulguları

Besifloksasin HCl’nin Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MİK)

Bulguları

Bölüm 3.2.5’te belirtilen koşullarda nanolif yapıda insert formülasyonları için

MİK analizi yapılmıştır. Mikroplakalara yapılan ekim sonucunda üreme görülmeyen

en düşük konsantrasyon belirlenmiştir. Elde edilen bulgular Tablo 4.19’da

gösterilmiştir. Nanolif yapıda insertlerden 168. saate kadar alınan tüm örneklerde elde

Min

imu

m B

ağla

nm

a

Gü

cü (

New

ton

)

121

edilen ilaç konsantrasyonlarının (8,88 μg /mL-0,39 μg /mL arasında) MİK değerinin

(0,031μg/mL) üzerinde olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.27).

Tablo 4.19. BH’nin MİK tayini bulguları.

S. aureus

(μg/mL)

E. coli

(μg/mL)

P. aeruginosa

(μg/mL)

ATCC 29213 ATCC 25922 ATCC 27853

Besifloksasin HCl 0,004 0,016 0,031

Kontrol

(Piperasilin/Tazobaktam)

0,5 0,5 0,5

Şekil 4.27. Nanolif yapıda insert formülasyonlarının salım örneklerinden elde edilen

MİK analizi sonuçları (n= 6, X̄±SS).

Geliştirilen Formülasyonların In Vitro Antibakteriyel Etkinlik Tayini

Antibakteriyel etkinlik tayini için, Bölüm 3.2.5’te belirtilen koşullarda

deneyler gerçekleştirilmiştir. Nanolif yapıda insertlerin ölçülen zon inhibisyon çapları

(mm) Tablo 4.20’de verilmiştir. Şekil 4.28’de BH içeren nanolif yapıda insertlerin ve

piyasa preparatının zon inhibisyon çapı ölçüm fotoğrafları gösterilmiştir. Zon

inhibisyon çaplarına ilişkin sonuçlar incelendiğinde tüm formülasyonların zon

çaplarının piyasa preparatı Besivance®’ın (31 mm) değerine yakın olduğu (26-27 mm

arasında ) tespit edilmiştir.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 50 100 150 200

Bes

iflo

ksa

sin

HC

l

Kon

san

trasy

on

u (

µg)

Zaman (Saat)

Formülasyon A

Formülasyon B

Formülasyon C

Formülasyon D

P. Aeuroginosa için

MİK Değeri

122

Tablo 4.20. Nanolif yapıda insertlerin P.aeuroginosa’ya karşı zon inhibisyon çapı

sonuçları (n= 3, X̄±SS).

Formülasyon P.aeuroginosa

(ATCC 27853) (mm) SS(±)

Formülasyon A 26,5 2,42

Formülasyon B 26 2,33

Formülasyon C 27 1,96

Formülasyon D 27 2,11

Besivance ® 31 3,34

Şekil 4.28. Nanolif yapıda insertlerin ve Besivance®’ın P.aeuroginosa’ ya karşı zon

inhibisyon çapları ölçümünün fotoğrafları.

4.6.10. Hücre Kültürü Çalışmaları Bulguları

Bölüm 3.2.6’da belirtilen koşullarda deneyler gerçekleştirilmiştir. Nanolif

yapıda insertlerle yapılan MTT analizinin sonuçları Şekil 4.29 - Şekil 4.32 arasında

verilmiştir. MTT analizi sonuçlarına göre 24, 48 ve 72. saatlerde tüm formülasyonların

sırasıyla en az % 80, %78 ve % 75 hücre canlılığı değerine sahip olduğu tespit edilmiş

ve 24, 48 ve 72. saat canlılık değerleri arasında anlamlı bir fark tespit edilememiştir

(p> 0,05).

123

Şekil 4.29. Nanolif yapıda insertlerin % hücre canlılığı sonuçları (24. saat) (n= 3,

X̄±SS).

Şekil 4.30. Nanolif yapıda insertlerin % hücre canlılığı sonuçları (48. saat) (n=3,

X̄±SS).

76

78

80

82

84

86

88

A A' B B' C C' D D'

%H

ücr

e C

an

lılı

ğı

İnsert Formülasyonları

1.Gün

72

74

76

78

80

82

84

86

A A' B B' C C' D D'

%H

ücr

e C

an

lılı

ğı

İnsert Formülasyonları

2. Gün

124

Şekil 4.31. Nanolif yapıda insertlerin % hücre canlılığı sonuçları (72.saat)

(n= 3, X̄±SS).

Şekil 4.32. Nanolif yapıda insertlerin 24, 48 ve 72. saatlerde % hücre canlılığı

sonuçları (n= 3, X̄±SS).

70

72

74

76

78

80

82

84

A A' B B' C C' D D'

%H

ücr

e C

an

lılı

ğı

İnsert Formülasyonları

3. Gün

68

70

72

74

76

78

80

82

84

86

88

90

A A' B B' C C' D D'

%H

ücr

e C

an

lılı

ğı

İnsert Formülasyonları

3.gün

1.gün

2.gün

125

4.7. Ex vivo Kornea Geçiş Çalışmaları Bulguları

Bölüm 3.2.7’de belirtilen koşullarda deneyler gerçekleştirilmiştir. Nanolif

yapıda insertlerin, ilaç çözeltisinin ve piyasa preparatının ex vivo olarak korneadan

geçiş çalışmalarının sonuçları Şekil 4.33’te verilmiştir. Ex vivo kornea geçiş çalışması

sonuçları incelendiğinde, en fazla geçişin çözelti formunda olmasından dolayı ilaç

çözeltisinde olduğu, ikinci sırada ise süspansiyon formunda olmasından dolayı piyasa

preparatında olduğu tespit edilmiştir. Nanolif yapıda insert formülasyonlarının ise katı

formda olmalarından dolayı ilaç çözeltisi ve piyasa preparatına oranla daha az kornea

geçişi sağlamıştır. Ancak insert şeklindeki formülasyonlar gözde daha uzun süre

kaldıkları için tedavi açısından herzaman üstünlük göstermektedir.

Şekil 4.33. Ex vivo kornea geçiş çalışması bulguları

(A: kaplanmamış, B: SA kaplı, C: TSA kaplı, D: ilaç: siklodekstrin kompleksi içeren,

formülasyon) (n=3, X̄±SS).

Görünür geçirgenlik katsayıları (Papp, cm / s) hesaplanmış ve sonuçlar Tablo

4.21'de verilmiştir.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 100 200 300 400

%K

üm

üla

tif

Korn

ea G

eçiş

i

Zaman (Dakika)

Formülasyon A

Formülasyon B

Formülasyon C

Formülasyon D

Besivance ®

İlaç Çözeltisi

126

Tablo 4.21. Ex vivo geçiş çalışmalarında hesaplanan görünür geçirgenlik katsayıları

(Papp, cm / s) (n= 3, X̄±SS ).

Formülasyonlar X̄ Papp (cm/s) Kornea

geçişi

SS (±)

Formülasyon A 4,08 E-06 2,03 E-08

Formülasyon B 4,43 E-06 6,14 E-08

Formülasyon C 4,27 E-06 5,47 E-08

Formülasyon D 5,66 E-06 4,05 E-08

Besivance® 7 E-06 1,87 E-08

İlaç Çözeltisi 1,98 E-05 3,54 E-08

Papp bulgularının % kümülatif kornea geçişi sonuçları ile uyumlu olduğu

görülmektedir. Geliştirilen formülasyonlar arasında Formülasyon D’nin (ilaç:

siklodekstrin içeren) görünür geçirgenlik katsayısı açısından en uygun olduğu

bulunmuştur.

4.8. In vivo Çalışmalara İlişkin Bulgular

4.8.1. Bakteriyal Keratit Oluşturulması Bulguları

Bölüm 3.2.8’de belirtilen koşullarda deneyler gerçekleştirilmiştir. Korneaya

yapılan uygulama sonucunda oluşan keratitli tavşan gözüne bir örnek Şekil 4.34’te

verilmiştir. Keratit oluşturma ve tedavi uygulanması uzman göz hekimi gözetiminde

yapılmış, tavşan gözlerinin derecelendirme (skorlama) işlemleri de hekim tarafından

gerçekleştirilmiştir.

127

Şekil 4.34. Bakteriyel keratit gelişmiş tavşan gözünün örnek fotoğrafı.

4.8.2. Bakteriyal Keratit Tedavisi Değerlendirilmesi Bulguları

Bölüm 3.2.8’de belirtilen koşullarda tavşanlara, Formülasyon C, D, C’, D’

Besivance® ve serum fizyolojik uygulanmıştır. Şekil 4.35’te tavşanların uygulamadan

önce ve 7. gündeki (tedavi sonunda) gözlerine ilişkin fotoğraf örnekleri verilmiştir.

Fotoğraf örneklerinden görüldüğü üzere Besivance®, Formülasyon D ve Formülasyon

C’nin 7. günün sonunda tavşan gözlerinde iyileşme gösterdiği, kontrol grubunda ise

hastalığın şiddetinin arttığı tespit edilmiştir.

Şekil 4.35. 1. ve 7. gün sonunda tavşan gözlerine ilişkin fotoğraf örnekleri.

128

4.8.3. Tedavinin Değerlendirilmesi Bulguları

Bölüm 3.2.8’de belirtilen koşullarda değerlendirme işlemi yapılmıştır. Şekil

4.36’da derecelendirme (skorlama) testine ilişkin sonuçlar (yedi farklı parametreye

göre değerlendirilmiş) verilmiştir. Formülasyon C ve D’nin, piyasa preparatına

(Besivance® ) benzer skorlama gösterdiği belirlenmiştir.

G ü n 1 G ü n 2 G ü n 3 G ü n 7

0

1 0

2 0

3 0

4 0

Z am an

Kli

nik

Sk

or

B e s iv a n c e ®

F o r m ü la s y o n C

F o r m ü la s y o n D

F o r m ü la s y o n C '

F o r m ü la s y o n D '

K o n tr o l

Şekil 4.36. Enfeksiyon sonrası 1, 3, 5 ve 7. günlerde tavşan gözlerinin klinik

derecelendirme sonuçları (n= 3, X̄±SS).

4.9. Histoloji Çalışmaları

Bölüm 3.2.9’da belirtilen koşullarda histoloji çalışmaları yapılmıştır. Histoloji

çalışmaları sonucu elde edilen bulgular Şekil 4.37’de verilmiştir. Histoloji çalışmaları

sonuçları incelendiğinde Formülasyon C, Formülasyon D ve ticari preparatın

uygulandığı tavşan kornealarının, epitel dokusunun, Bowman membranın sağlam

olduğu ve herhangi bir skuamöz keratinize yapının bulunmadığı görülmektedir.

129

Şekil 4.37. Tavşan kornea kesitlerinin ışık mikroskobu fotoğraf örnekleri

(C ve D formülasyonları ilaç içeren nanolif yapıda insertlerdir, C’ ve D'

formülasyonları ise ilaç içermeyen boş nanolif yapıda insertlerdir.)

200 µm

200 µm

200 µm

200 µm

200 µm

200 µm

130

5. TARTIŞMA

Göz dokularına ilaç taşınması gözdeki anatomik ve fizyolojik engeller

nedeniyle zordur. Bu engeller, birden fazla uygulama yolu kullanılsa bile (örneğin

topikal, sistemik ve enjeksiyon) ilacın göze girişini maalesef olumsuz yönde

etkilemektedir (204).

Gözün ön segment hastalıklarının (yüzeyel hastalıklar; bakteriyel keratit,

glokom, kuru göz hastalığı, alerjik konjonktivit, ön segment üveit, katarakt vb)

tedavisinde, sistemik yoldan ilaç uygulanması, gözde yer alan kan-aköz bariyeri ve

kan-retina bariyeri gibi engeller nedeniyle bu bölgede istenen düzeyde ilaç düzeyine

ulaşılmasını önlemektedir (26). Bu sorunun üstesinden gelmek için uygulanan yüksek

sistemik ilaç dozları hastalarda yan etkilere neden olmaktadır. Enjeksiyon ile ilaç

uygulanması girişimsel bir yöntem olduğu için özel durumlar dışında tercih

edilmemektedir. Bu nedenle, gözün ön segment hastalıklarının tedavisinde en çok

tercih edilen uygulama yolu topikal yoldan ilaç uygulanmasıdır (205).

Topikal yol ile gözün ön segmentine ilaç uygulanmasında piyasadaki oftalmik

ürünlerin % 90’nını konvansiyonel ilaç şekilleri oluşturmaktadır. Bu ilaç şekillerinin

% 62.4’ünü çözeltiler, % 8.7’sini süspansiyonlar ve % 17.4’ ünü merhemler meydana

getirmektedir (206). Ancak gözün savunma mekanizmalarına (göz yaşarması,

nazolakrimal drenaj, enzimatik aktivite) bağlı olarak ilaçların göz yüzeyinde oldukça

az bir süre kalması ve kornea epitelinden geçişin zor olması nedeniyle topikal ilaç

uygulamalarında da düşük oküler biyoyararlanım (<% 5) gözlenmektedir. Gözyaşının

toplam hacmi yaklaşık 7-9 µL’dir ve sağlıklı gözdeki gözyaşı devir hızı 0.5-2.2

µL/dakikadır. Topikal uygulama sırasında uygulanan formülasyonların bir damlası

yaklaşık 35-56 µL 'dir ve uygulanan dozun büyük bir kısmı göz dışına veya

nazolakrimal kanaldan sistemik dolaşıma akmaktadır. Buna ek olarak konjonktival

kan dolaşımı topikal ilaç absorpsiyonunu olumsuz etkiler. Sonuç olarak, sıralanan

bütün bu engeller topikal uygulama sonrasında % 95 ilaç kaybına yol açmaktadır

(207).

Topikal yoldan konvansiyonel oftalmik preparatların uygulanması sonucu

ortaya çıkan düşük oküler biyoyararlanımın üstesinden gelmek için araştırmacıların

geliştirdiği stratejiler: i) ilacın korneada kalma süresinin artırılması: viskozite

artırıcılar, mukoadesif veya jelleşen maddelerin kullanılması, ii) ilacın korneal

131

geçirgenliğinin artırılması: penterasyon artırıcılar veya ön ilaçların kullanılması,

olarak sıralanabilir (208).

Oftalmik insertler boyutları ve şekilleri açısından özellikle göze uygulanmak

üzere tasarlanmış ince, tek veya çok tabakalı olabilen steril katı veya yarı katı ilaç

şekilleridir (28). İnsertlerin üstünlükleri: i) içerdikleri etken maddenin gözde temas

süresini uzatarak oküler biyoyararlanımı artırmaları, ii) sürekli ilaç salımı sağlayarak

preparatın etkinliğini artırmaları, iii) bölgesel ilaç uygulaması sonucu sistemik yan

etkileri azaltmaları, iv) düşük uygulama sıklığı nedeniyle hasta uyuncunu artırmaları,

v) katı yapıları nedeniyle içerdikleri ilacın kararlı yapısını korumasında etkili olmaları,

olarak sıralanabilir (71).

Bakteriyel keratit, farklı bakterilerden kaynaklanabilen akut bir kornea

enfeksiyonudur. Hastalık etkeninin hızlı bir şekilde ortadan kaldırılmaması; ciddi

oküler morbiditeye, korneal yaralanmaya ve görme kaybına neden olabilir. Bakteriyel

keratitin ciddi olgularının tedavisinde antibiyotik içeren klasik göz damlalarının

genellikle her gün ve çok sık tekrarlanan dozlarda uygulanması gerekmektedir. Bu

durum, yan etkilere, hasta uyuncunun azalması sonucu, tedavinin tam olarak

sağlanamamasına ve zamanla bakterilerin kullanılan antibiyotiklere karşı direnç

geliştirmesine neden olmaktadır. Oftalmoloji alanında uzman hekimler ile yapılan

görüşmelerde ve literatür taramalarında antibiyotik içeren, sıklıkla uygulama

gerektirmeyecek, lokal ve istenen miktarda ve uzun süreli ilaç salımı sağlayacak,

biyogeçimli/ biyoparçalanır özelliği nedeniyle uzaklaştırılması için cerrahi bir işleme

gerek duymaksızın uygulanabilecek, gelişmiş ilaç taşıyıcı sistemlere ihtiyaç

duyulduğu tespit edilmiştir (209, 210). Bu doktora tez çalışmasının çıkış noktasını bu

talepler ve değerlendirmeler oluşturmuştur.

Tez çalışmasında sadece oftalmik uygulamalar için geliştirilmiş son jenerasyon

florokinolon grubu özel bir antibiyotik olan besifloksasin HCl (BH) oftalmoloji

klinisyenleri ile birlikte seçilerek keratit tedavisine yönelik geliştirilecek

formülasyonlar için potent etken madde olarak belirlenmiştir. Besifloksasin’in

süspansiyon şeklindeki klasik göz damlası ruhsatlı ürünü ilaç piyasasında

bulunmaktadır (211). Tez çalışmasında yukarıda belirtilen talebin karşılanmasında

hassas stabiliteye sahip olan bir antibiyotiği (besifloksasin) bu özelliğini koruyarak

taşıyacak, sık uygulama gerektirmeyerek hasta uyuncunu artıracak, hazırlanması kolay

132

ve düşük maliyetli olan ve endüstriyel üretime kolayca taşınabilecek ilaç şekli olarak

“insert” seçilmesinin rasyonel olduğu düşünülmüştür. Bakteriyel keratitin tedavisinin

başarıya ulaşması için, etki bölgesinde başlangıçta yüksek antibiyotik

konsantrasyonunu takiben uzun süreli ve sabit konsantrasyonda bir antibiyotik

varlığının gerekli olduğu bildirilmiştir (212, 213). Bu nedenle insert

formülasyonlarının geliştirilmesinde polimer matriks olarak Amerikan İlaç ve Gıda

Kurumu (FDA) onaylı, biyolojik olarak parçalanabilen ve uzun süreli ilaç salımı

sağlayan poli(kaprolakton) (PKL) belirlenmiştir. Uzun süreli ilaç salımının yanında;

i)başlangıçta hızlı ve yüksek konsantrasyonda antibiyotik salımını sağlamak amacıyla

matrikse hidrofilik yapı kazandırmak, ii) gözde batma hissini en aza indirmek için

pürüzsüz bir yüzey elde etmek, üzere poli(etilen glikol) (PEG)’in PKL ile birlikte

kullanılmasına karar verilmiştir. Buna ilaveten yine yukarıda belirtildiği üzere topikal

ilaç uygulamasında oküler biyoyararlanımı artırmak için geliştirilen bazı formülasyon

yaklaşımları da tez çalışmasında kullanılmıştır. Bu amaçla, geliştirilen insertlerin

mukoadezif polimerlerle kaplanması veya oküler penetrasyon artırıcı maddelerden

olan siklodekstrinlerin BH ile kompleksleştirilerek insert hazırlanması gibi

yaklaşımlar değerlendirilmiştir.

İnsert yapısının oluşturulmasında yüksek temas alanı, yüzey işlevlerinde

esneklik, gözenekli yapı ve iyi mekanik dayanıklılık sağlaması nedeniyle nanolifler

kullanılmıştır. Nanolif yapıda insert formülasyonlarının hazırlanması için son yıllarda

düşük maliyet ve endüstriye kolayca adapte edilebilmesi nedeniyle tercih edilen bir

yöntem olan (214, 215) elektro-eğirme yöntemi belirlenmiştir.

Bu bilgiler ışığında, doktora tezi çalışmamız kapsamında, bakteriyel keratit

tedavisine yönelik olarak, BH etken maddesinin fizikokimyasal özelliklerinin

belirlenmesi çalışmaları, daha sonra elektro-eğirme ile hazırlanmış nanolif yapıda

insertlerin optimizasyonu ve in vitro, ex vivo ve de in vivo olarak değerlendirilmesi

gerçekleştirilmiştir.

5.1. Besifloksasin HCl’nin Fizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi

BH’nin distile su içerisindeki UV spektrumları Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı

şekilde incelenmiş ve λmaks değeri 289 nm olarak bulunmuştur (Şekil 4.3). Elde edilen

133

λmaks değerleri literatürde bildirilen dalga boyu olan 289 nm ile uyumlu bulunmuştur

(216).

BH’nin elde edilen FTIR spektrum bulguları incelendiğinde, 3056 cm-1’de

primer amin gerilim bandı, 2864 cm-1’de aril gerilim bandı, 1726 cm-1’de keton gerilim

bandı ve 1610 cm-1’de karboksil gerilim bandı bulunduğu görülmüştür (Şekil 4.2).

Belirlenen bu absorpsiyon bantlarının literatürde bildirilen absorpsiyon bantları ile

uyumlu olduğu tespit edilmiştir (49, 202).

BH’nin DSC analiz bulguları incelenmiş (Şekil 4.1) ve 321,5 °C’de ekzotermik

bir pike sahip olduğu gözlenmiştir. Elde edilen termogramın literatürde BH için verilen

termogramla uyum gösterdiği tespit edilmiştir (49).

5.2. Besifloksasin HCl’nin Miktar Tayini

BH’nin miktar tayini için literatürde, kütle spektroskopisi (217) , biyolojik

tayin (218), mikrobiyolojik (219) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)

(165, 220) yöntemleri bulunmaktadır. Tez kapsamındaki in vitro çalışmalar için, bu

yöntemler içinde düşük miktarlardaki BH’yi yüksek hassasiyet ve doğruluk ile en

hassas ve özgül bir şekilde saptayan yöntem olması nedeni ile HPLC yönteminin

kullanılmasına karar verilmiştir.

BH’nin miktar tayini Bölüm 3.2.1’de belirtilen şekilde 297 nm dalga boyunda,

6 farklı konsantrasyonla valide edilen HPLC yöntemi ile gerçekleştirilmiştir (165). Tez

kapsamında yapılacak analizlere uygun olması için geniş bir konsantrasyon aralığı (0,6

– 200 μg/mL) seçilerek çalışılmıştır. Çalışılan bu konsantrasyonlarda yapılan

hesaplamalar sonucunda analitik yöntem validasyon parametrelerinden biri olan

doğrusallık için R2 değeri 0,9999 olarak bulunmuştur. R2 değeri 1’e ne kadar yakın

olursa yöntemin güvenilirliği o kadar artmaktadır (166). Yapılan özgüllük çalışması

ile formülasyon içinde kullanılan diğer maddelerin BH’nin miktar tayini üzerinde

herhangi bir etkilerinin olmadığı tespit edilmiştir. Yöntem validasyonu kapsamında;

kesinlik (tekrarlanabilirlik ve tekrar elde edilebilirlik), doğruluk, saptama sınırı (LOD)

ve miktar tayini sınırı (LOQ) incelenmiştir. Saptama sınırı ve tayin edilebilirlik sınırı

sırasıyla 0,04 μg/mL ve 0,1 μg/mL olarak hesaplanmıştır. Elde edilen bu değerler

çalışma boyunca tayin edilecek BH miktarının oldukça altında olduğu için belirlenen

yöntemin çalışma için uygun olduğuna karar verilmiştir. Ayrıca, tekrar edilebilirlik,

134

tekrar elde edilebilirlik ve günler arası farklılık ile analiz süresince etken maddeye

ilişkin stabilite değerleri saptanmıştır. İlgili kılavuza ( ICH Topic Q 2 (R1) Validation

of Analytical Procedures: Text and Methodology) (221) göre, analitik yönteme ilişkin

validasyon parametrelerinin belirlenen varyasyon katsayılarının (VK) %2’nin altında

olması beklenmektedir. VK’nın %2’nin altında olması, yöntemin istatistiksel

yayılımının düşük olduğunu, tekrarlanabilirlik ve tekrar elde edilebilirlik değerlerinin

kabul edilebilir ölçüde fark gösterdiğini belirtmektedir (166). Analitik yöntem

validasyonunda elde edilen değerlere ilişkin varyasyon katsayıları (VK<%2) miktar

tayini yönteminin hassas ve tekrarlanabilir olduğu kanıtlamıştır.

5.3. Besifloksasin HCl Yüklü Poli(Kaprolakton)/Poli(Etilen Glikol)

Nanolif Yapıda İnsertlerin Optimizasyonu

Tez çalışmalarında, nanoliflerin hazırlanmasında literatürde yaygın olarak yer

alan elektro-eğirme yöntemi kullanılmıştır (128, 130, 214). Literatürde çeşitli

antibakteriyel (tetrasiklin siprofloksasin, levofloksasin ve moksifloksasin) maddelerin

elektro-eğirme yöntemi ile nanoliflere yüklendiği tespit edilmiştir (222-224). Örneğin,

Kenawy ve ark. (225) yapmış oldukları çalışmada tetrasiklini, Poli(Laktik-ko-glikolik

asit) (PLGA), Polietilen vinil asetat (PEVA) veya bu iki polimerin karışımına

yüklemişler ve yapılan salım çalışmalarında her bir polimerin veya polimer

karışımının farklı salım karakteri sergilediğini bildirmişlerdir. Repanas ve ark. (149)

dipiridamol (DPA) yüklü farklı oranlarda PKL-PEG polimeri içeren nanolifler

üretmişler ve in vitro salım çalışmaları sonunda formülasyonlarda artan PEG oranının

ilaç salımını hızlandırdığını tespit etmiştir. Bu tez kapsamında da insert

formülasyonlarının geliştirilmesinde polimer olarak FDA onaylı, biyolojik olarak

parçalanabilen ve uzun süreli ilaç salımı sağlayan poli(kaprolakton) (PKL)

belirlenmiştir. Bakteriyel keratitte uygulanacak antibiyotik tedavisinde başlangıçta

yüksek ilaç konsantrasyonu için hızlı bir salım profili daha sonra uzun süreli

antibiyotik varlığının sağlanması gerekli olduğu için (74, 226, 227) ayrıca,

formülasyonun hem gözde batma hissi oluşturmaması (pürüzsüzlük) hem de salım

hızının ayarlanması amacıyla PKL matrikse PEG’in de dahil edilmesine karar

verilmiştir.

135

Nanoliflerin hazırlanmasının optimizasyonu kapsamında %8, 10 veya 13 (a/h)

konsantrasyon aralığında üç farklı PKL çözeltisi ve farklı elektro-eğirme parametreleri

(uygulanan gerilim, enjektör ucu-plaka arası mesafe, polimer çözeltisi akış hızı)

kullanılmıştır. Bu parametrelerde polimer çözeltisi akış hızı 0,01 veya 0,05 mL/dk,

uygulanan gerilim 10 veya15 kV aralığında ve şırınga ucu ile alüminyum plaka

arasındaki mesafe 10 veya 20 cm arasında değiştirilmiştir (Tablo 3.2). Elektro-eğirme

yöntemi ile lif üretimi yapıldıktan sonra ışık mikroskobu ile yapılan kontrollerde %8

(a/h) konsantrasyonda hazırlanan PKL çözeltisi ile konsantrasyonun yetersiz olması

nedeniyle istenen şekilde nanolif oluşmadığı, buna karşın, %10 ve %13 (a/h)

konsantrasyonlardaki PKL çözeltilerinde oluşan liflerlerin beklenen şekilde olduğu

tespit edilmiştir. Elde edilen bu sonuçlar, litratürde polimer konsantrasyonunun nanolif

oluşumu üzerinde etkisi olduğunu gösteren çalışmalar tarafından desteklenmektedir

(112, 126, 130, 228). Bu çalışmalarda (112, 126, 130), elektro-eğirme işleminde

kullanılan polimerin konsantrasyonu azaldıkça uygulanan gerilime bağlı olarak

elektro-eğirme yerine elektro-sprey işleminin meydana geldiği ve bu durumun lif

oluşumunu engellediği, belirli bir düzeye kadar polimer konsantrasyonunun artırılması

gerektiği bildirilmiştir.

Optimizasyon çalışmalarında, %10 ve %13 (a/h) konsantrasyonlarda PKL

kullanılarak optimum nanoliflerin elde edilebildiği gözlemlenmiş, elektro-eğirme

koşulları ise 15 kV gerilim, 0,05 mL/dk polimer çözeltisi akış hızı ve 20 cm enjektör

ucu-plaka arası mesafe olarak belirlenerek çalışma boyunca bu koşullar sabit

tutulmuştur.

PKL ve PEG karışım nanoliflerinin optimizasyonu için yapılan çalışmalarda,

%10 (a/h) toplam polimer içeren çözeltilerde kullanılan PKL:PEG oranları elde edilen

ön deneme sonuçlarına göre 2:1, 1,75:1,25 (a/a), %13 (a/h) toplam polimer içeren

çözeltilerde 2:1, 1,75:1,25, 1:1, 1:2 olarak belirlenmiştir (Tablo 3.3). Elektro-eğirme

ile lif üretimi yapıldıktan sonra ışık mikroskobu ile yapılan kontrollerde hazırlanmış

olan 6 farklı polimer çözeltisinde üretilen nanoliflerin istenilen şekilde olduğu tespit

edilmiştir. Elde edilen bu sonuçların, literatürde (168) PKL/PEG nanolif

hazırlanmasında belirlenen polimer oranları ile örtüştüğü tespit edilmiştir.

Tez çalışmasında karakterizasyon ve in vivo çalışmalarda kullanılacak temel

formülasyonun (kaplanmamış) belirlenmesi amacıyla başarılı lif oluşumu gözlenmiş

136

BH yüklü insert formülasyonlarının ilaç yükleme ve in vitro salım özellikleri

değerlendirilmiş ve sonuçlar Şekil 4.6, Şekil 4.7 ve Tablo 4.8’de gösterilmiştir.

Optimizasyon için gerçekleştirilen in vitro salım bulguları değerlendirildiğinde, salım

profillerinin ilk 24 saatlik bölümünde %13 (a/h) toplam polimer içeren

formülasyonlardan PKL:PEG 2:1 oranda (a/a) olan formülasyonun %70’lik bir

patlama salımı (“burst effect”) gösterdiği tespit edilmiştir. Hazırlanmış olan diğer

nanolif yapıda insert formülasyonlarının ise %75’in üzerinde bir patlama salımı

gösterdiği görülmüştür. Yüksek oranda PEG içeren formülasyonlarda (PKL/PEG

1:1,1:2) ise PEG’in yüksek çözünürlüğünden dolayı 24 saatlik sürenin sonunda ilaç

salımının tamamının gerçekleştiği belirlenmiştir. Bulgularımız ile benzer şekilde

literatürde formülasyonlarda PEG oranı artıkça, artan suda çözünme ile birlikte

patlama etkisinin arttığı bildirilmiştir (42, 229). Ayrıca, literatürde bakteriyel keratit

tedavisi için hazırlanan nanopartikül ve mikroemülsiyon şeklindeki

formülasyonlardan 7 günlük bir in vitro salımın yeterli olduğu bildirilmiştir (213, 230).

Formülasyonların enkapsülasyon etkinlikleri incelendiğinde ise nanolif yapıda insert

formülasyonlarının tümünün etken maddeyi %90’ın üstünde enkapsüle edebildiği

görülmüştür.

Yukarıda belirtilen bulgular göz önünde bulundurularak %96,2 değeri ile en

yüksek enkapsülasyon etkinliğine ve uygun ilaç salım profiline sahip, %13 (a/h)

polimer içeren PKL:PEG oranı 2:1 (a/a) olan formülasyon tezin ilerleyen

aşamalarında değerlendirilecek ve özellikleri çeşitlendirilecek (kaplama vb) temel

formülasyon (kaplanmamış) olarak belirlenmiştir.

5.4. Besifloksasin HCl Yüklü Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif

Yapıda İnsertlerin Hazırlanması ve Geliştirilmesi

Yapılan değerlendirmeler sonucunda yukarıda belirtildiği ve Bölüm 4.2’de

sunulduğu üzere %13 (a/h) polimer içeren, PKL-PEG oranı 2:1 (a/a) olan ve % 2.5

(a/a) konsantrasyonda BH içeren formülasyon, en yüksek enkapsülasyon etkinliği ve

uygun in vitro salım özellikleri nedeniyle optimum formülasyon olarak belirlenmiştir.

Buna ilaveten Şekil 3.4’te görüldüğü üzere bu temel (kaplanmamış) formülasyondan

yola çıkarak in vitro karakterizasyon, ex vivo ve in vivo değerlendirmelerde

137

kullanılmak üzere farklı özelliklere sahip formülasyonların geliştirilmesine ve

hazırlanmasına karar verilmiştir.

5.4.1. Sodyum Aljinat (SA) /Tiyollenmiş Sodyum Aljinat (TSA) Kaplı

Polikaprolakton/ Polietilen Glikol Nanolif Yapıda İnsertlerin

Hazırlanması

Topikal yoldan uygulanan konvansiyonel oftalmik preparatlarla ortaya çıkan

düşük oküler biyoyararlanımın (< %5) artırılması için literatürde yer alan

yaklaşımlardan birisi, ilacın korneada kalma süresinin viskozite artırıcılar,

mukoadesif veya jelleşen formülasyon maddelerinin kullanılması ile artırılmasıdır

(231). Bu nedenle tez çalışmasında optimizasyon çalışmaları sonucunda belirlenen

temel formülasyonun (kaplanmamış) mukoadezif polimerler olan (SA, TSA) ile

kaplanmasına karar verilmiştir.

SA, çeşitli oral ve topikal farmasötik formülasyonlarda kullanılan polisakkarit

türevi bir polimerdir. Farmasötik formülasyonlarda geniş kullanımının nedenlerinden

birisi, mukoadezif özelliğinin yüksek olmasıdır. SA mukoadezif özelliğini mukoza ile

oluşturduğu hidrojen bağları veya Van der Waals kuvvetleri ile sağlamaktadır (94,

232). Literatürde mukoadezyonu artırma yaklaşımlarından birisinin polimerlerin

tiyollenmesi olduğu bildirilmiştir (233).Tiyollenmiş polimerlerin tiyol gruplarının,

sistein bakımından zengin olan mukus glikoproteinleri ile kovalent bağ oluşturduğu

için çok yüksek mukoadezif özellik gösterdiği, güçlü kovalent bağlar sayesinde

dokulardan geçirgenliği de artırdığı bildirilmiştir (152). Bu nedenle çalışmamızda

SA’dan tiyolleme işlemi ile TSA sentezlenmesine karar verilmiştir. Tiyolleme işlemi

Bernkop Schnürch ve ark. (177) tarafından geliştirilen yöntemle yapılmıştır. İşlem

sonunda elde edilen ürünün TSA olduğunun doğrulanması amacı ile FTIR analizi

yapılmıştır. Elde edilen FTIR spektrumu literatürde (176) TSA için verilen spektrum

ile karşılaştırıldığında TSA sentezinin başarılı bir şekilde gerçekleştirildiği

belirlenmiştir.

Nanolif yapıda insertlerin XPS analizi bulguları Şekil 4.9’da verilmiştir. XPS

analizi ile PKL/PEG, SA, TSA ve HP-β-CYC içindeki ana elementlerin kimyasal bağ

tipindeki varyasyonları tespit edilmiştir. C 1s XPS spektrumları incelendiğinde elde

edilen 282, 283, 284 ve 286 eV piklerinin bağlayıcı enerji zirveleri, C – C, C – O ve C

138

= O ile ilişkilendirilmektedir. PKL-PEG polimelerinin sahip olduğu C-O bağlanması,

286 eV'de pik vermiştir. Spektrumda var olan 283.8 eV piki, hidrokarbon zincirindeki

lineer C-C bağlanması göstermektedir. Literatürde (234), lineer karbonların bağlayıcı

enerjilerinin diğer karbon bağlarından daha yüksek olduğu görülmektedir.

Formülasyon B’nin SA kaplama işlemi sırasında π – π etkileşimi nedeniyle diğer

örneklerden daha güçlü C – C pikine sahip olduğu görülmektedir. Formülasyon C’de

gerçekleştirilen TSA kaplamanın pikin 279-290 eV aralığında olmasına neden olduğu

tespit edilmiştir. Bu durumun farklı karbon bağlarından kaynaklanan sinyallerin

çakışmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)

karbodiimid hidroklorür (EDAC) tarafından aktif bir karboksil grubu ile aljinat ve

çapraz bağlı sisteinin birincil amin gruplarına aktive olan 1-etil-3-(3-

dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDAC) tarafından yeni bir yapı

oluşturulmuştur. Bu bağlanma 284 eV'de karbon-1 spektrumunda gözlenmiştir. O

1s’leri incelendiğinde, sırasıyla C = O, O-C = O ve C-O gruplarına atfedilen 530 ve

531’deki iki ana tepe noktasının var olduğu tespit edilmiştir. Aljinat-sistein kompleksi,

S ve -SH kimyasal durumun varlığını ortaya çıkarmıştır: ilki 165 eV’de (S elemanı)

bir sinyal verirken ikincisi ise 171 eV’de (-SH grupları) bir sinyal vermektedir. İki

zirvenin yoğunluğu arasındaki oran artışının varlığı, daha yüksek bağlayıcı enerji

türlerinin düşük bağlayıcı enerji türlerinin üzerinde lokalize olduğunu göstermektedir.

Sonuç olarak, SA ve TSA kaplama yapılan Formülasyon B ve C’nin yüzeylerinde

kaplama amacıyla kullanılan polimerlerin sahip olduğu fonksiyonel grupların varlığı

tespit edilmiştir, kaplama işleminin gerçekleştiği belirlenmiştir.

5.4.2. Besifloksasin HCl:Hidroksipropil-β-Siklodekstrin İnklüzyon

Kompleksi İçeren Polikaprolakton/Polietilen Glikol Nanolif

Yapıda İnsertlerin Hazırlanması

BH:Cyc inklüzyon komplekslerinin hazırlanması amacıyla ilk olarak faz-

çözünürlük çalışması yapılmıştır. BH’nin farklı konsantrasyonlardaki HP-β-Cyc veya

β-Cyc ile inklüzyon kompleksi oluşturması sonucu olarak çözünürlüğündeki

değişimler incelenmiştir. Elde edilen veriler Tablo 4.7 ve Tablo 4.8’de ve bu verilere

bağlı olarak oluşturulmuş faz çözünürlük diyagramları Şekil 4.10 ve 4.11’de

verilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde, BH’nin kompleks oluşumu sonucu

139

çözünürlüğünün HP-β-Cyc ile 36 kat, β-Cyc ile 24 kat arttığı görülmüştür. HP-β-Cyc,

β-Cyc’nin bir türevidir ve suda çözünürlüğü β-Cyc’e göre daha yüksektir (50,51). BH’

nin çözünürlüğünün HP-β-Cyc kompleksi oluşumu ile daha çok artış göstermesinin

bu nedenle olduğu düşünülmektedir.

Faz çözünürlük diyagramlarının doğrusal kısımları kullanılarak 1:1 kompleks

stabilite sabiti K1:1, BH:HP-β-Cyc ve BH:β-Cyc kompleksleri için hesaplanmıştır.

BH:HP-β-Cyc için K1:1: 8503 M-1, BH:β-Cyc için K1:1: 4045 M-1 olarak bulunmuştur.

Literatürde kompleks stabilite sabitinin ilaç:Cyc komplesksleri için 100-10.000 M-1

arasında olması gerektiği bildirilmiştir (179, 181, 235). Her iki Cyc türevi için de

bulunan değerlerin bu aralıkta olmasına rağmen kompleks stabilite sabitinin BH:HP-

β-Cyc kompleksinde daha yüksek olduğu görülmektedir. Bu sabitin daha yüksek

olması ilaç ile Cyc molekülü arasında etkileşimin arttığını ve daha dayanıklı

komplekslerin oluştuğunu göstermektedir (236). Ayrıca literatürde kompleks

etkinliğinin artması ile oküler geçirgenliğin artacağı, bununla beraber terapötik

etkinlikte artış olabileceği bildirilmiştir (237). Bu nedenle formülasyon çalışmalarına

BH:HP-β-Cyc inklüzyon kompleksi ile devam edilmesine karar verilmiştir. Kompleks

oluşturma yöntemi olarak literatürde sıklıkla kullanılan (234, 238, 239) birlikte

dondurarak kurutma (colyophilisation) yöntemi kullanılmıştır.

BH:HP-β-Cyc inklüzyon kompleksinin oluşumunu göstermek amacıyla FTIR

ve DSC analizi yapılmıştır. FTIR analizinde BH- HP-β-Cyc fiziksel karışımı ve

BH:HP-β-Cyc inklüzyon kompleksi kullanılmıştır. BH:HP-β-Cyc inklüzyon

kompleksi ve fiziksel karışımlarının FTIR spektrumları BH ile karşılaştırmalı olarak

Şekil 4.12’de verilmiştir. BH’nin FTIR spektrumunda mevcut olan 2500-3300 cm-1

CO-OH bağlarına ait gerilme titreşimleri, 1900-1650 cm-1 C=O keton bağlarına ait

gerilme titreşimleri, 1675-1500 cm-1 C=C aromatik veya alifatik bağlarına ait gerilme

titreşimleri, 3050-3500 cm-1 N-H bağlarına ait gerilme titreşimlerinin

siklodekstrinlerle oluşturulan fiziksel karışımlarda şiddetlerinin azaldığı, birlikte

dondurarak kurutma yöntemi ile elde edilen komplekslerde ise neredeyse tamamen

kayboldukları belirlenmiştir. Bunun nedeni, BH’nin Cyc’lerle inklüzyon kompleksi

oluşturmasıyla ortamdaki serbest BH miktarının büyük oranda azalmasıdır (239). C=O

piklerindeki azalmanın bir diğer nedeni olarak BH’nin Cyc’ler ile etkileşmesi ve buna

bağlı olarak H bağı oluşumu gösterilebilir. Yapılan bir çalışmada, karbonil gruplarının

140

(C=O) hidrojen bağı oluşumuna bağlı olarak siklodekstrin yapısında bulunan hidroksil

gruplarından etkilendiği gösterilmiştir (240). BH’nin FTIR spektrumu ve BH:Cyc

komplekslerinin FTIR spektrumları incelendiğinde 3050 - 3500 cm-1’de BH’nin NH2

yapısından dolayı N-H gerilme titreşimleri olduğu görülmektedir. Cyc’lerle kompleks

oluşturduğunda ise, Cyc’lerin aynı bölgede görülen O-H titreşimlerinin altında kaldığı

ya da Cyc’lerle NH2 yapısının olduğu kısımdan kompleks oluşturduğu için BH:Cyc

komplekslerine ilişkin FTIR spektrumlarında N-H titreşimleri kaybolduğu tespit

edilmiştir.

BH, BH:HP-β-Cyc inklüzyon kompleksi ve BH - HP-β-Cyc fiziksel karışımına

ilişkin DSC termogramları karşılaştırmalı olarak Şekil 4.13’de verilmiştir. BH’nin

321,5 °C ekzotermik bir pike sahip olduğu görülmektedir. İlaç molekülleri Cyc

kavitesi içerisine hapsedildiğinde, erime veya kaynama noktalarına ilişkin piklerindeki

kaybolma veya azalma, muhtemel bir ilaç:Cyc kompleks oluşumunun bir göstergesi

olarak kabul edilmektedir (241, 242). BH:HP-β-Cyc’nin hem birlikte dondurarak

kurutma yöntemi ile hazırlanan kompleksine hem de fiziksel karışımına ilişkin DSC

termogramları incelendiğinde BH’ye ilişkin pikin kaybolduğu görülmektedir. Bu

sonuçlara göre, ilaç:Cyc arasında bir etkileşme olduğu ve inklüzyon komplekslerinin

oluşumu gerçekleştiği tespit edilmiştir (243).

Yapılan FTIR ve DSC analizleri, birlikte dondurarak kurutma yönteminin

inklüzyon kompleksi oluşturmada etkili bir yöntem olduğunu göstermiştir. Benzer

şekilde Li ve ark. (244) yapmış oldukları çalışmada, HP-β-Cyc ile kurkumin

komplekslerini birlikte dondurarak kurutma yöntemiyle hazırlamış ve FTIR ve DSC

analizleri ile elde edilen komplekslerin başarılı bir şekilde oluştuğunu bildirmiştir.

5.5. Nanolif Yapıda İnsert Formülasyonlarının Karakterizasyon

Çalışmaları

5.5.1. Yüzey Morfolojisi

Nanolif yapıda insert formülasyonlarının yüzey morfolojileri ve ortalama

nanolif çapları Alan Taramalı SEM ile değerlendirilmiştir. (Şekil 4.14 - Şekil 4.18 ve

Tablo 4.10). Etken madde içermeyen temel formülasyonun (kaplanmamış) ortalama

lif çapı 498,3±123,14 nm iken, BH içeren Formülasyon A, B, C ve D’nin ortalama lif

çapları sırasıyla 521±140,07 nm, 643,54±154,46 nm, 709,46±132,22 nm, ve

141

572,4±138,65 nm olarak saptanmıştır. Formülasyonların SEM fotoğrafları incelendiği

zaman herhangi bir ilaç topaklanması veya boncuk oluşumu gözlemlenmemiş,

homojen düzgün lifler tespit edilmiştir. Bu durum formülasyonda bulunan bütün

maddelerin homojen şekilde karıştığını oluşan lif yapısının kararlı ve tekrarlanabilir

olduğunu göstermektedir. Bütün formülasyonlarda, silindirik yapıda nanoboyutta

pürüzsüz yüzeyli yoğun ağlar gözlenmiştir Buna ilaveten nanoliflere etken maddenin

yüklenmesi ile ortalama lif çapı ve çap dağılımında bir artış olduğu gözlemlenmiştir.

Bu durum, polimer çözeltisine eklenen etken maddenin çözeltinin viskozitesini

artırması ile açıklanabilir. Elektro-eğirme sırasında etken madde içeren polimer

çözeltilerinin daha yoğun kıvamda olduğu görsel olarak tespit edilmiştir (245). Benzer

şekilde, Gençtürk ve ark.’ın (246) yaptığı bir çalışmada poliüretan ve hidroksipropil

selüloz karışımı nanolif formülasyonlarına Alzheimer tedavisinde kullanılan bir ilaç

olan donepezil HCl yüklendikten sonra nanoliflerin ortalama çap ve çap

dağılımlarında artış olduğu bulunmuştur. Akduman ve ark.’ın (247) yaptığı bir

çalışmada ise termoplastik poliüretan nanoliflerine naproksen yüklenmesiyle

nanoliflerin ortalama çap ve çap dağılımlarında artış olduğu tespit edilmiştir. Buna

ilaveten, elektro-eğirme yönteminde kullanılan çözücülerin uçuculuğunun da

nanoliflerin çapını ve morfolojisini etkileyen faktörlerden biri olduğu bildirilmiştir

(118, 248).

Etken madde içeren formülasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında,

Formülasyon A’nın en küçük ortalama lif çapına sahip olduğu tespit edilmiştir.

Formülasyon A’daki BH’nin yerine BH:HP-β-Cyc’nin kullanılması ile elde edilen

Formülasyon D’nin ortalama lif çapı Formülasyon A’dan daha büyüktür (p < 0,05).

Literatürde BH gibi hidrofobik ilaçların hidrofobik polimer çözeltisine eklenmesi

çözeltinin yüzey gerilimini düşürdüğü için elektro-eğirme sırasında bükülme

kararsızlığını artırdığı buna bağlı olarak da lif çapını azalttığı bildirilmiştir (249).

Çalışmamızda siklodekstrin kompleksine göre daha hidrofobik olan BH içeren

Formülasyon A’nın lif çapının daha küçük olması polimer çözeltisinin yüzey

gerilimini düşürmüş olması ile açıklanabilir. Benzer şekilde, Zeng ve ark. (250)

yapmış oldukları çalışmada, lipofilik bir ilacın (rifampisin) hidrofobik yapıya sahip bir

PLA gibi bir polimer ile karıştırılarak nanolif hazırlandığında lif çapının azaldığını

tespit etmiştir. Formülasyon B ve C’nin ortalama nanolif çapları Formülasyon A ve

142

D’den daha büyük olarak saptanmıştır (p < 0,05). Literatürde kaplama işleminin

nanofiber çapını artırdığı bildirilmiştir (143). Bu nedenle Formülasyon B ve C’nin

hazırlanması sırasında uygulanan kaplama işleminin sonucu olarak nanolif çapının

arttığı düşünülmektedir. Zhenyu ve ark. (251) yapmış oldukları çalışmada

hidroksiapatit nanopartikülü yüklü selüloz asetat nanolif formülasyonlarını üretmiş ve

daldırma yöntemini kullanarak nanolifleri kitosan ile kaplamıştır. Araştırmacılar,

kaplama ile beraber lif çapının arttığını bildirmiştir.

5.5.2.Çap-Kalınlık ve Ağırlık Çalışmaları

Çap-kalınlık çalışmasına ilişkin bulgular Tablo 4.11’de verilmiştir. Sonuçlar

incelendiğinde, nanolif yapıda insertlerin kalınlığının 0,6-0,83 mm arasında değiştiği

görülmektedir. Kalınlık, insertin göze uygulanabilirliği bakımında önemlidir (74).

İnsertlerin ağırlık tespiti bulgularından (Tablo 4.12) da görüleceği gibi formülasyonun

kaplanması (SA, TSA) nedeniyle ağırlıklarının ve kalınlıklarının da arttığı

görülmüştür (p<0,05). Yapılan bir çalışmada (252) üretilen insert formülasyonun

içerisine farklı oranlarda bileşen ilave edilmiş ve bileşen miktarındaki artışla beraber

insert kalınlıklarının değiştiği görülmüştür.

Piyasada kullanılan oküler insertleri incelediğimizde, insertlerin ilk

örneklerinden biri olan Ocusert®’in kalınlığının 0,3 mm olduğu ve yine piyasada

bulunan Lacrisert®’in kalınlığının 1,27 mm olduğu görülmüştür (253). Geliştirdiğimiz

nanolif yapıda insertler kalınlık bakımından bu örneklerle uyumludur.

Çalışmamızda nanolif yapıda insert hazırlamak amacıyle nanolifler delgeç

yardımı ile dairesel şekilde (3.5 mm2) kesilmiştir (Şekil 4.19). İnsanlarda alt göz

kapağının hacmi 50 µL, üst göz kapağının, kapak merkezinde dikine ölçüldüğü zaman

yaklaşık 10-12 mm yükseklikte, alt göz kapağının ise en geniş olduğu yerde 4 mm

olduğu bilinmektedir (254). Bu sebeple, delgeçler yardımı ile kesilip elde edilen

insertler gözün alt kapağına uygulanılabilecek çapta olmalıdır. Ocusert’in boyutu

5,5x13 mm, Lacrisert’in boyutları ise 1,27 mm çapında ve 3,5 mm uzunluğundadır.

Sonuçlar incelendiğinde hazırlanan nanolif yapıda insertlerin boyut (yarıçapı 2,5 mm)

bakımından bu örneklerle uyumlu olduğu görülmektedir (253).

İnsertlerin ağırlık ve hacim bakımından homojen olması, içerdikleri etken

madde ve polimerlerin homojen dağılması bakımından çok önemlidir. Hazırlanan

143

insertlerin ağırlıkları 1,58-1,27 mg arasında değişmektedir (Tablo 4.12). Tablodan da

görüleceği üzere her bir formülasyon için 3 örneğin arka arkaya tartılması ve

ortalamasının alınması ile elde edilen değerlerin standart sapmaları oldukça düşüktür.

Bu durum formülasyonların homojen yapıda olduğunu ve kesme işleminin

tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir.

5.5.3. Şişme Testi Çalışmaları

Nanolif yapıda insert formülasyonlarının şişme testi sonucunda ede edilen

bulgular Şekil 4.20,4.21’de verilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde, kaplı olmayan ve

yapısında en az oranda hidrofilik madde içeren Formülasyon A’nın şişme yüzdesinin

en düşük olduğu görülmektedir. Formülasyon D ise ilaç:Cyc inklüzyon kompleksi

içerdiğinden formülasyon içerisinde bulunan hidrofilik madde miktarı artmış

durumdadır, bu nedenle Formülasyon A’ya oranla daha yüksek şişme gösterdiği tespit

edilmiştir. Literatürde, formülasyon içerisinde bulunan hidrofilik polimer miktarının

artmasıyla birlikte polimer zincirlerine girebilen daha yüksek su miktarına bağlı olarak

şişme kapasitesinin arttığı bildirilmiştir (255). Grimaudo ve ark. (256) yapmış

oldukları çalışmada, siklosporin yüklü hyalüronik asit-HP-βCyc insertleri üretmiştir.

Yapılan şişme testinde HP-β-Cyc miktarı artıkça şişme yüzdesinin ve hızının arttığı

görülmüştür.

Formülasyon B ve C’nin ise diğer iki formülasyona oranla daha kısa sürede

şişmeye başladığı ve daha yüksek şişme yüzdesine sahip olduğu görülmektedir

(p<0,05). SA ve TSA’nın suda çözünürlükleri yüksek olduğu için bu iki polimer ile

kaplı olan formülasyonlarda 3. saatten itibaren yüksek oranda şişme başlamış ve 24.

saatin sonunda yüzeyde bulunan SA ve TSA’nın etkisinin azalması ile beraber şişme

yüzdesinin düştüğü görülmüştür.

5.5.4. In vitro Degradasyon Çalışmaları

Oküler formülasyonların pH değerinin, uygulama bölgesinde herhangi bir

iritasyona yol açmaması ve göz kırpma mekanizması ile salınan gözyaşı ile ilacın

uzaklaşmaması (257, 258) için gözün pH değeri ile aynı veya yakın olması istenir

(259). Ancak, etken maddenin stabilitesinin korunması amacıyla farklı pH değerine

sahip formülasyonlar geliştirilebilmektedir. Literatürde göze uygulanabilecek

144

formülasyonların kabul edilebilir pH aralığının pH 4-8 arasında olduğu bildirilmiştir

(65).

İnsert hazırlanmasında kullanılan biyoparçalanır polimerlerin uygulanma

bölgesinde zamanla parçalanması ile oluşan pH değeri de gözün tolere edebileceği pH

aralığında olmalıdır. Bu nedenle, literatürde oküler insertlerde in vitro degradasyon

çalışmaları yapılmaktadır (260, 261). Bunun için çalışmamızda hazırlanan nanolif

yapıda insertler 37 °C, pH 7,4 PBS ortamı içinde inkübe edilerek belirli zaman

aralıklarında ortamın pH değerleri ölçülmüş ve sonuçlar Şekil 4.22, Şekil 4.23’de

verilmiştir. Sonuçlardan görüleceği üzere hazırlanan hiçbir formülasyonda 7. günün

sonunda pH değeri 7’nin altına düşmemiştir (p>0,05). Bu durum formülasyonların

oküler olarak uygulanmaya uygun olduğunu göstermektedir (186). Benzer şekilde,

Yavuz ve ark. (173) yapmış oldukları çalışmada, siklosporin yüklü PCL-PLGA nanolif

yapıda oküler implantlar hazırlamış ve yaptıkları in vitro degradasyon çalışmasının 30.

gününde pH değerinin 7’nin üzerinde olduğunu tespit ederek formülasyonların oküler

uygulama için uygun olduğunu bildirmişlerdir.

5.5.5. Enkapsülasyon Etkinliği

Literatürde, elektro-eğirme yöntemi ile hazırlanan nanolif yapılarında yüksek

oranda ilaç hapsinin, dolayısıyla yüksek enkapsülasyon etkinliği değerlerinin elde

edildiği bildirilmiştir (262). Bunun nedeni olarak homojen lif yapılarının elde

edilebilmesi için ilaç polimer karışımının uzun süre karıştırılması ve sonuç ürünün

yüzey genişliğinin fazla olması gösterilmiştir (262, 263).

Geliştirilen nanolif yapıda insertlerin enkapsülasyon etkinliğine ilişkin

sonuçlar Tablo 4.13’te verilmiştir. Tablodan da görüleceği üzere Formülasyon A, B,

C ve D için enkapsülasyon etkinliği değerleri sırasıyla 96,2±1,98; 93,4±2,09;

94,3±1,13 ve 98,1±1,32 olarak bulunmuştur ve literatür ile uyumludur (203). Nour ve

ark. (264) yapmış oldukları çalışmada, elektro-eğirme yöntemiyle tetrasiklin yüklü

PKL ve PEVA (Polietilen vinil asetat) ilaç taşıyıcı matriksler geliştirmiştir.

Geliştirdikleri matrikslerin enkapsülasyon etkinliklerini incelediklerinde, bütün

formülasyonların %90’ın üzerinde enkapsülasyon etkinliğine sahip olduğunu, bununla

beraber PKL matriksin PEVA matrikse oranla daha yüksek ilaç hapsi sağladığını tespit

etmişlerdir. Ravikumar ve ark. (168) yapmış oldukları çalışmada, elektro-eğirme

145

yöntemiyle kurkumin yüklü PKL-PEG transdermal yamalar geliştirmiştir. Üretim

sonunda enkapsülasyon etkinliğinin %95 olduğu saptanmıştır.

Formülasyonlar kendi aralarında karşılaştırıldığında, Formülasyon D’nin

enkapsülasyon etkinliğinin en yüksek olduğu tespit edilmiştir (p < 0,05). Bu durum

Formülasyon D’deki ilacın Cyc ile inklüzyon kompleksi olması nedeniyle

çözünürlüğünün artmış olması ile açıklanabilir. Literatürde hidrofobik ilaçların Cyc

ile inklüzyon kompleksi oluşturularak formülasyona ilave edilmesi ile serbest ilaca

göre enkapsülasyon etkinliğinin arttığı bildirilmiştir (265, 266). Aksungur ve ark.

(267) yapmış oldukları çalışmada, siklosporini tek başına kullanarak veya HP-β-Cyc

ile kompleks oluşturmak suretiyle oküler nanapartikül formülasyonları üretmiş ve HP-

β-Cyc:ilaç kompleksinde ilaç yükleme oranının daha yüksek olduğunu tespit etmiştir.

5.5.6. In Vitro Salım Çalışmaları

Nanoliflerden in vitro ilaç salımını etkileyen faktörler genel olarak şu şekilde

sıralanabilir: i) düzenli lif dizilimi gösteren nanolifler, düzensiz lif dizilimi olanlara

göre daha hızlı ilaç salımı yapabilir, ii) ortalama lif çapı daha düşük olan nanolifler

daha yüksek olanlara oranla daha hızlı ilaç salımı gösterir, iii) nanolif yapısını

oluşturan kristal yapıdaki polimerler amorf yapıdaki polimerlere göre daha yavaş ilaç

salımı sağlar, iv) nanolif yapısının gözenekliliğinin yüksek olması hızlı ilaç salımına

neden olur (268, 269). Nanoliflerden ilaç salımı yüzeyde biriken ilacın desorpsiyonu,

içerdeki ilacın gözeneklerden difüzyonu yolu ile ve/veya matriksin parçalanması ile

gerçekleşebilir. Salım sürecinde gözeneklilik, morfoloji ve nanoliflerin geometrisinin

etkili olduğu bildirilmiştir (270).

İlacın çözünürlüğü, fiziksel özellikleri ve ilaç polimer etkileşiminin de nanolif

formülasyonlarında in vitro salım özellikleri üzerinde etkili olduğu bildirilmiştir (271,

272). Literatürde BH’nin suda çözünürlüğünün pH’ye bağlı olarak değiştiği ve asidik

pH’lerde 10 mg/mL’ye kadar çıktığı bildirilmiştir. pH 6 - 9 aralığında ise

çözünürlüğünün 0,08 mg/mL olduğu görülmektedir (49). Çalışmamızda faz-

çözünürlük deneyleri kapsamında, BH’nin suda çözünürlüğünün 0,078 mg/mL olduğu

tespit edilmiş olup literatür ile uyumludur (49). Buna ilave olarak insertlerde bulunan

etken madde miktarları hesaplanmış ve 1.5 mL PBS pH 7.4 içinde ortamda sink (ilaç

şeklinin çözünme ortamında etken maddenin doymuş çözeltisini hazırlamak için

146

gerekli olan çözünme ortamı miktarının üç katı oranında çözücü bulunması) koşulların

sağlandığı tespit edilmiştir (273)

Nanolif formülasyonlardan 168 saat (7 gün) süreyle salınan % kümülatif BH

değerleri Tablo 4.14 - Tablo 4.17 arasında, in vitro salım profilleri de Şekil 4.24, Şekil

4.25’de verilmiştir. İlk 24 saat içinde kümülatif salınan BH yüzdeleri Formülasyon A,

B, C ve D için sırasıyla %69,3; %75,9; %74,6 ve %89,6 olarak bulunmuştur. Bu

sürenin sonunda, Formülasyon A, B ve C sabit hızda salıma devam ederek salımı 7

günde tamamlarken, Formülasyon D’ de 3. gün sonunda salım tamamlanmıştır. Salım

profilleri incelendiğinde bütün formülasyonlar için ilk 24 saatlik periyotta patlama

salımı (burst effect)’ ndan söz etmek mümkündür. Bu durumun nanoliflerin sahip

olduğu geniş yüzey alanı ve kullanılan polimer karışımından kaynaklandığı

düşünülmektedir (108). Literatürde yapılan çalışmalar incelendiğinde benzer

sonuçların elde edildiği görülmüştür. Örneğin, Yavuz ve ark. (173) hazırlamış

oldukları siklosporin yüklü nanopartikülleri, farklı oranlarda PLGA-PKL içeren

polimer matrikste dağıtarak hem eritme yöntemi hem de elektro-eğirme yöntemi ile

oküler implant hazırlamıştır. Çalışmada eritme yöntemi ile hazırlanan

formülasyonlardan 2 ay süre ile elektro-eğirme yöntemiyle hazırlanan implantlardan 1

ay süre ile ilaç salımı gerçekleştiği ve patlama etkisinin ilk 2 gün boyunca gözlendiği

bildirilmiştir. Karataş ve ark. (274) yapmış oldukları bir çalışmada ofloksasin yüklü

PKL: Poli (butilen süksinat) (PBS) nanolif formülasyonları üretmiştir. Araştırmacılar,

hazırlanan nanolif formülasyonlarının başlangıçta patlama etkisi gösterdiğini sonra

sabit bir oranda ilaç salımına devam ederek salımı tamamladığını belirtmiştir. Siafaka

ve ark. (275) varikonazol:β-Cyc kompleksleri içeren PKL nanoliflerini elektro-eğirme

yöntemiyle hazırlamış ve in vitro salım çalışmalarında %80’in üzerinde patlama

salımı meydana geldiğini bildirmiştir.

Formülasyon A, B ve C’den BH salımı 7 gün süre ile devam ederken bu

sürenin Formülasyon D için 3 gün olduğu tespit edilmiştir. Bu durumun Formülasyon

D’de etken maddenin BH:HP-β-Cyc kompleksi şeklinde olması nedeniyle BH’nin

artmış çözünürlüğünden kaynaklandığı düşünülmektedir. Benzer şekilde, Akduman

ve ark. (247) naproksen sodyum(NAP), HP- β-Cyc:NAP ve β-Cyc:NAP inklüzyon

kompleksi yüklü poliüretan nanolif formülasyonu hazırlamış ve in vitro salım

çalışmasında sadece NAP içeren nanoliflerin 120 saat süre ile salım yaparken β-

147

Cyc:NAP ve HP- β-Cyc:NAP içeren nanoliflerin sırasıyla 36 saat ve 5 saatte salımı

tamamladıklarını ve bu sonucun NAP’ın artmış çözünürlüğü nedeniyle meydana

gelmiş olabileceğini bildirilmiştir. Aytaç ve ark. (276) sulfisoksazol: HP- β-Cyc ve

sulfisoksazol yüklü hidroksipropil selüloz nanolifler hazırlamıştır. Çalışmada

geliştirilen bütün formülasyonlarda 12 saat bitmeden salımın tamamlandığı, inklüzyon

kompleksi içeren formülasyonlarda ise salımın çok daha hızlı olduğu tespit edilmiştir.

Nanolif insertlerin salım profillerini karşılaştırmak için fark faktörleri (f1) ve

benzerlik faktörleri (f2) hesaplanmış ve formülasyonların salım profillerinin

istatistiksel olarak benzer olmadığı görülmüştür (p < 0,05) (0 ile 15 arasındaki f1, 50

ile 100 arasındaki f2 değerleri, iki salım profilinin benzer olduğunu göstermektedir

(17). Sonuç olarak, temel formülasyonun (kaplanmamış), SA veya TSA ile kaplanması

veya temel formülasyonda BH yerine BH:HP-β-Cyc kompleksinin kullanılması gibi

formülasyon geliştirme yaklaşımlarının in vitro salım profillerinde farklılık yarattığı

tespit edilmiştir.

5.5.7. Ex vivo Biyoadezyon Çalışmaları

Ex vivo biyoadezyon çalışmaları, kornea ile geliştirilen insert formülasyonları

arasındaki bağlanma (=biyoadezyon) gücünün belirlenmesi için gerçekleştirilmiştir.

Ex vivo biyoadezyon çalışmaları sonuçları Şekil 4.26’da verilmiştir. Elde edilen

sonuçlar incelendiğinde, formülasyonların korneaya biyoadezyon gücü (Newton) için

sıralamanın Formülasyon C > B> D > A şeklinde olduğu ve farkın istatistiki olarak

anlamlı olduğu tespit edilmiştir (p <0,05).

Mukoadezif polimerle kaplı Formülasyon B ve C kendi aralarında

karşılaştırıldığında, tiyollenmiş bir mukoadezif polimer olan TSA ile kaplanan

Formülasyon C’nin korneaya bağlanma gücünün, diğer bir mukoadezif polimer olan

SA ile kaplanmış Formülasyon B’den daha yüksek olduğu tespit edilmiştir (p < 0,05).

Bu durum tiyol gruplarının daha yüksek mukoadezif güce sahip olması ile açıklanabilir

(152). Kornea yüzeyindeki mukusun temel bileşeni olan müsinin yapısında bulunan

yüksek miktardaki sistein, TSA’nın yapısında bulunan –SH ile disülfür köprüleri

oluştururken, SA mukus tabaka ile sadece iyonik etkileşimler ve hidrojen bağları

yoluyla kovalent olmayan bağlar oluşturabilmektedir. (277). Çalışmamızda elde

ettiğimiz sonuçlar ile paralel olarak, Aher ve ark. (188) SA veya TSA polimeri

148

kullanarak gatifloksasin yüklü oküler insert formülasyonları hazırlamış ve TSA ile

hazırlanan insertlerin bağlanma (biyoadezif ) kuvvetinin SA ile hazırlananların iki katı

olduğunu tespit etmiştir. Pawar ve ark. (185) yapmış oldukları çalışmada,

moksifloksasin yüklü insertleri Eudragit ile kaplamış ve mukoadezyon testinde kaplı

olan insertlerin kaplı olmayan insertlere oranla daha yüksek mukoadezif güce sahip

olduğunu tespit etmiştir.

5.6. Hücre Kültürü Çalışmaları

Oküler yüzeyde bozulma ile karakterize olan klinik olgularda antibiyotiklerin

uygulanmasından kaynaklanabilecek bir toksisite tedaviyi uygulayan hekimler için en

büyük kaygı nedenidir (278). Bakteriyel keratit gibi kornea bütünlüğünü bozabilecek

hastalıkların tedavisinde uygulanan antibiyotikler gibi geliştirilen formülasyonların da

sitotoksik olmaması gerekmektedir. Bu amaçla, çalışmamızda seçilen etken madde ve

formülasyonların olası sitotoksisitesini belirlemek amacı ile MTT sitotoksisite analizi

yapılmıştır.

Sitotoksisite deneyleri Yöntem 3.2.6’ da anlatıldığı şekilde Amerikan

Farmakopesi 42’ de “<1031> The Biocompability of Materials Used in Drug

Containers, Medical Devices and Implants” başlığı altında belirtilen koşullarda

gerçekleştirilmiştir (192). Bunun için katı formlar olan insertler hücre kültür ortamı ile

7 gün inkübe edilerek ekstraktlar hazırlanmış ve elde edilen bu ekstraktların

sitotoksisitesi değerlendirilmiştir. BH içeren ve içermeyen nanolif yapıda insertlerin

24, 48 ve 72. saatlerdeki % hücre canlılığı Şekil 4.29-4.32 arasında verilmiştir.

Şekillerden de görüleceği üzere, MTT analizi sonuçlarına göre 24, 48 ve 72. saatlerde

tüm formülasyonların sırasıyla en az % 80, %78 ve % 75 hücre canlılığı değerine sahip

olduğu tespit edilmiş ve 24, 48 ve 72. saat canlılık değerleri arasında anlamlı bir fark

tespit edilememiştir (p> 0,05).

MTT testinde 24. saat bulguları kendi arasında değerlendirildiğinde, BH içeren

ve içermeyen bütün formülasyonların %80 üzerinde hücre canlılığı gösterdiği tespit

edilmiştir. BH içeren formülasyonların içermeyenlere oranla hafif bir sitoksisite

gösterdiği yani % hücre canlılığı değerlerinde az miktarda bir düşme olduğu tespit

edilmiştir ancak bu fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p>0,05). Etken

madde içermeyen formülasyonlar arasında Formülasyon B’nin %81 hücre canlılığı ile

149

(diğer formülasyonlarda % hücre canlılığı daha yüksektir) en yüksek sitotoksisite

riskine sahip formülasyon olduğu görülmüştür. Buna karşın, etken madde içeren

formülasyonlar içinde inklüzyon kompleksi bulunan Formülasyon D’nin en az

sitotoksisite gösterdiği tespit edilmiştir, ancak gruplar arasındaki fark istatistiksel

olarak anlamlı değildir (p>0,05).

MTT testinde 48. saatteki bulgular incelendiğinde bütün formülasyonların %78

üzerinde canlılık gösterdiği görülmüştür. Etken madde içermeyen Formülasyon B’,

%78,5 ile en az hücre canlılığı gösteren formülasyondur. Etken madde içeren

formülasyonlar içerisinde ise Formülasyon D, %82,4 ile en yüksek hücre canlılığı

göstermektedir. BH içeren formülasyonlar, içermeyenlere oranla hafif bir sitotoksisite

riski göstermektedir. Ancak gruplar arasındaki fark istatistiki olarak anlamlı

bulunmamıştır (p>0,05). 48. saat bulgularına benzer şekilde, 72. saat bulguları

incelendiğinde bütün formülasyonların %75 üzerinde canlılık gösterdiği görülmüştür.

Formülasyon B’ %75,7 değeri ile etken madde içermeyen gruplarda en az hücre

canlılığı gösteren formülasyondur. Etken madde içeren formülasyonlar içerisinde ise

Formülasyon D %80,7 hücre canlılığı ile en yüksek değere sahiptir. BH içeren

formülasyonları içermeyenlere oranla hafif bir sitotoksisite riski göstermektedir.

Ancak gruplar arasındaki fark istatistiki olarak anlamlı değildir (p>0,05).

Etken madde içeren ve içermeyen nanolif yapıda insert formülasyonları kendi

arasında değerlendirildiğinde, hücre canlılığında anlamlı bir farklılığın olmadığı

görülmektedir. Bu durum, nanolif yapıda insertlerin içerdiği etken maddenin

bakteriyel olarak etkin fakat göz hücreleri üzerinde sitotoksik bir etki oluşturmayacak

bir dozda olduğunu göstermektedir. Zgadzaja ve ark. (193) hazırlamış oldukları

siprofiloksasin çözeltisinin V 79 hücre hattı üzerindeki etkilerini incelemiş ve artan

siprofloksasin konsantrasyonu ile beraber hücre canlılığının azaldığını tespit

etmişlerdir. Ayaki ve ark. (279) yapmış oldukları çalışmada farklı florokinolon grubu

antibiyotiklerin korneal hücre hattı üzerindeki etkilerini incelemiş ve hücre canlılığının

antibiyotiğin dozuna bağlı olarak azaldığını gözlemlemişlerdir. Silva ve ark. (194)

yapmış oldukları çalışmada hazırlamış oldukları seftazidim yüklü oküler jel

formülasyonunun ARPE-19 üzerinde sitotoksik bir etki oluşturmadığını tespit etmiştir.

MTT testinde etken madde içermeyen nanolif yapıda insert formülasyonlarının

da yüksek hücre canlılığı göstermesi tez kapsamında hazırlanan taşıyıcı sistemin

150

ARPE-19 hücre hattında sitotoksik etkiye sahip olmadığını göstermiştir. Benzer

şekilde Da Silva ve ark. (280) yapmış oldukları çalışmada elektro-eğirme yöntemi ile

PKL nanolifler hazırlamış ve etken madde içermeyen taşıyıcının ARPE-19 hücre hattı

ve Müller glial hücre (MIO-M1 hücreleri) hattı üzerinde sitotoksik etkiye sahip

olmadığını bildirmişlerdir.

5.7. Mikrobiyolojik Çalışmalar

Mikrobiyolojik çalışmalarda, öncelikle, deneye alınan tüm formülasyonların

hazırlanması sonrasında sterilizasyonları UV lamba ile gerçekleştirilmiş ve sterilite

kontrolü yapılarak tüm formülasyonların sterilitesi doğrulanmıştır.

MİK, bir antibiyotiğin herhangi bir mikroorganizma üzerinde etkin olduğu en

düşük konsantrasyondur. MİK analizi antibiyotiğin etkinliği bakımında önemli bir

kriterdir (184). Literatürde daha önce yapılan bir çalışmada (281) BH’nin

P.aeuroginosa’nın 0464 suşuna karşı MİK değerinin 0,06 µg/mL, 0462 suşuna karşı

ise 1 µg/mL olduğu bildirilmiştir. Tez çalışmamız kapsamında yapılan deneylerde

BH’nin MIK değeri P.aeuroginosa’nın ATCC 27853 suşuna karşı 0,031 µg/mL, S.

Aureus’un ATCC 29213 suşuna karşı 0,004 µg/mL olarak bulunmuştur.

Disk difüzyon testi, etken maddelerin in vitro olarak bakterilere karşı

etkinliğinin belirlenmesi ve formülasyonlar arasında karşılaştırma yapılabilmesi

bakımından önemli bir testtir (184). Bu amaçla, BH içeren bütün formülasyonlar ve

piyasa preparatı (Besivance®), P.aeuroginosa’nın bulunduğu petri kaplarına

uygulanmıştır. Uygulamanın üzerinden 24 saat geçtikten sonra bakterilerin petri

kaplarında oluşturdukları zon çapları ölçülmüştür. Bu çalışmada, gram-negatif bir

bakteri olan P.aeuroginosa’nın seçilme sebebi özellikle son zamanlarda kontakt lens

kullanımı ile birlikte P.aeuroginosa kaynaklı keratit vakalarında ciddi anlamda artış

olması ve bu bakteri kaynaklı keratitin tedavisinde kullanılabilecek ilaçların kısıtlı

olmasıdır (282). Disk difüzyon testi sonuçları Tablo 4.20 ve Şekil 4.28’de

gösterilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde piyasa preparatı, Formülasyon A, B, C ve D

için zon çapları sırasıyla 31, 26.5, 26.5, 27 ve 27 mm olarak ölçülmüştür ve gruplar

arasında istatistiki olarak fark olmadığı bulunmuştur (p>0,05). Bu durum geliştirilen

formülasyonların piyasa preparatı kadar etkin olduğunu göstermektedir. Benzer

151

şekilde, Handoko ve ark. (283) 5 mg siprofloksasin emdirilmiş diskleri P.aeuroginosa

petri kaplarına uyguladıklarında 32 mm çapında bir alanı inhibe ettiğini tespit etmiştir.

5.8. Ex Vivo Kornea Geçiş Çalışmaları

Ex vivo kornea geçiş çalışması, nanolif yapıda insert formülasyonları, piyasa

preparatı (Besivance®) ve BH çözeltisi için tavşan korneası kullanılarak

gerçekleştirilmiştir. Çalışmalarda kulanılacak kornea taze olarak tavşan gözlerinden

izole edilmiş ve literatürde mevcut bilgi doğrultusunda (284) doku yapısını

koruyabildiği 6 saatlik süre içinde analiz tamamlanmıştır.

Ex vivo çalışmalara ilişkin sonuçlar Şekil 4.33 ve Tablo 4.21’de verilmiştir.

Sonuçlar incelendiğinde, ilaç çözeltisinin kornea dokusundan en yüksek geçiş

değerine sahip olduğu tespit edilmiştir (p<0,05). Süspansiyon formunda olan piyasa

preparatının ise uygulanan süre içinde en çok geçiş sağlayan ikinci formülasyon

olduğu görülmektedir. İnsert formülasyonlarından salınan BH’nin ise kornea

dokusundan daha az oranda geçtiği görülmektedir. Bu durum, çözeltide BH’nin

çözünmüş formda olması, süspansiyon formunda da çözünmek için bir miktar zamana

ihtiyaç duyulması ile açıklanabilir. Çözelti ve süspansiyonda çözünmüş veya

çözünmeye hazır halde bulunan BH, 6 saatlik deney süresi içerisinde kornea

dokusundan hızlıca penetre olabilmekte, buna ilaveten aynı sürede formülasyonlardan

etken maddenin salınması insertin katı bir ilaç şekli olması nedeniyle bir miktar zaman

almaktadır. Bu nedenle, insertlerden salınan BH’nın korneadan geçiş miktarı daha

düşük tespit edilmiştir ve bu sonuçlar literatür ile uyumlu bulunmuştur. Khalil ve ark

(285) yaptıkları çalışmada azitromisin içeren nanopartikül yüklü polivinilpirolidon

nanolifler üretmiştir. Yapılan ex vivo kornea geçiş çalışmasında, çözelti şeklindeki

piyasa preparatından ilaç geçiş miktarının nanoliflere göre daha yüksek olduğu

bildirilmiştir.

Ex vivo permeasyon çalışmalarında nanolif yapıda insert formülasyonlarından

salınan BH’nın korneadan geçtiği gösterilmiştir. Formülasyonlar, kendi aralarında

değerlendirildiğinde, Formülasyon D’nin en yüksek etken madde geçişini sağladığı

görülmektedir (p < 0,05). Diğer formülasyonlar Formülasyon D’den daha düşük

olmakla birlikte birbirine benzer miktarda ex vivo ilaç geçisi sağlamıştır. Bu durum,

Formülasyon D’nin içerisinde ilaç:Cyc inklüzyon kompleksine bağlı olarak artan BH

152

çözünürlüğü dolayısıyla artan salım hızı ve Cyc’nin penetrasyon artırıcı özelliği ile

açıklanabilir (157). Benzer şekilde Shelley ve ark. (286) yapmış oldukları çalışmada

Cyc:Nepafenak kompleksi içeren in situ jel formülasyonları geliştirmiş ve Nepafenak

içeren piyasa preparatını karşılaştırmıştır. Araştırmacılar, hazırlamış oldukları

ilaç:Cyc kompleksi içeren jelin 5 kat daha fazla kornea geçişi sağladığını tespit

etmiştir.

5.9. In Vivo Çalışmalar

In vivo çalışmalara, in vitro karakterizasyon, hücre kültürü, antimikrobiyal

aktivite ve ex vivo ilaç geçiş çalışmalarında en uygun sonuçları veren Formülasyon C

ve Formülasyon D dahil edilmiştir. In vivo çalışmalar kapsamında hazırlanan

formülasyonların antibakteriyel etkinliğini tespit etmek amacıyla öncelikle tavşan

kornealarında bakteriyel keratit oluşturulmuştur. Bunun için tavşan gözünün stroma

tabakasına 10-5 CFU bakteri süspansiyonu, 30 numaralı enjektör ucu ile uygulanmıştır.

Uzman göz hekimi tarafından 24 saat sonra yapılan incelemede korneada keratit

bulgularına rastlanmış ve aynı zamanda bütün tavşanlar için ilk gün derecelendirmesi

(skorlama) yapılmıştır (Şekil 4.36). Skorlama sonrası hemen tedaviye başlanmıştır:

piyasa preparatı (Besivance®) ve kontrol olarak Serum fizyolojik günde 3 kere olmak

üzere 7 gün süre ile uygulanmış, nanolif yapıda insert formülasyonları ise 7 gün içinde

sadece 1 kez uygulanmıştır. Daha sonra, 1, 3, 5 ve 7. günlerde uzman göz hekimi

tarafından muayeneler yapılmış ve keratitle ilişkili 7 parametre üzerinden 0-4 arası

derecelendirme yapılmıştır. Hastalık şiddeti arttıkça skorlama değeri yükselirken,

şiddet azaldıkça derecelendirme değerinde düşüş görülmüştür.

Sonuçlar incelendiğinde (Şekil 4.36) bütün grupların mikroorganizama

enjeksiyonunu takiben ilk 24 saatte (tedaviden önce) toplam klinik skorunun ortalama

13,5 civarı olduğu görülmektedir. Formülasyon C değerlendirildiğinde, 72 saat

sonunda gözde akıntının olmadığı, kornea ödeminin azaldığı fakat kemozisin aynı

seviyede kaldığı görülmüştür. 120. saatin sonunda ise Formülasyon C uygulananlarda

konjonktival kemozisin ve kornea opaklığının tamamen kaybolduğu görülmüştür.

Formülasyon C grubunda bulunan tavşanların, bütün muayene zamanlarında,

tedavinin başarısına bağlı olarak, etken madde içermeyen (Formülasyon C’) ve tedavi

edilmemiş (PBS uygulanan) grubun klinik puanlarından anlamlı olarak düşük olduğu

153

görülmüştür (p <0,05). Formülasyon D’nin klinik sonuçları incelendiğinde, tedaviyi

takiben 24 saatte diğer gruplara kıyasla daha düşük klinik skorlar gözlenmiştir. Bu

durum, Formülasyon D’nin 24 saatlik in vitro salım profili sırasında görülen ani salım

etkisi ve siklodektrinin penetrasyon artırıcı etkisi ile açıklanabilir (287). Yapılan son

muayenede, Formülasyon D uygulaması sonrasında kornea ödemi ve konjonktival

kemozisin tamamen kaybolduğu gözlenmiştir. Formülasyon D grubunda bulunan

tavşanların, bütün muayene zamanlarında, tedavinin başarısına bağlı olarak, etken

madde içermeyen (Formülasyon D’) ve tedavi edilmemiş grubun (PBS uygulanan)

klinik puanlarından anlamlı olarak düşük olduğu görülmüştür (p <0,05). Besivance®’

ın etkinliği incelendiğinde, 72 saat sonra kornea ödeminin azaldığı ve kemozisin aynı

seviyede olduğu, gözdeki akıntının ise tamamen sonlandığı gözlenmiştir. 120. saat

sonunda ise korneal ödemin ve kemozisin artık gözlenmediği tespit edilmiştir.

Besivance® grubunda bulunan tavşanların, tüm muayene zamanlarında etken madde

içermeyen (Formülasyon C’ ve D’) ve tedavi edilmemiş grubun klinik skorlarından

anlamlı olarak düşük olduğu görülmüştür (p <0,05).

Formülasyon C, D ve Besivance®’dan elde edilen klinik skorlar

karşılaştırıldığında, Formülasyon C ve D’nin Besivance®’a yakın etkinlik gösterdiği

ve tüm muayene noktaları skorlarında istatistiksel anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir

(p > 0,05). Bununla beraber, Besivance® günde 3 kez uygulanırken, nanolif yapıda

insert formülasyonları ise tedavi süresince sadece bir kez uygulanmıştır. Benzer

şekilde Franca ve ark. (288) glokom tedavisi için dorzolamidin sürekli salımını

sağlayan kitosan/hidroksietil selüloz insertleri geliştirmiş ve ticari ilacın (çözelti) in

vivo etkinliğini araştırmıştır. Araştırmacılar, geliştirilen insertlerin 14 günlük tedavi

süresi boyunca bir kez uygulanmasına rağmen günlük olarak uygulanan ticari preparat

ile aynı derecede etkinlik gösterdiğini bildirmiştir.

5.10. Histoloji Çalışmaları

Histoloji çalışmaları sonucu elde edilen bulgular Şekil 4.37’de verilmiştir.

Histolojik olarak, Formülasyon C, Formülasyon D ve ticari preparatta korneaların,

hücre katmanlarında epitel dokunun Bowman membranın ve epitel dokunun sağlam

olduğu ve herhangi bir skuamöz keratinize yapının olmadığı tespit edilmiştir. Ayrıca,

histolojik bulgular piyasa preparatı veya geliştirilen formülasyonların uygulandığı

154

korneaların normal kalınlıkta ve düzenli epitel ve endotel içererek bütünlüğünü

koruduğunu ve inflamatuvar hücrelerin gözlenmediği bir stroma yapısının

bulunduğunu göstermiştir.

155

6. SONUÇ

Tezimize ilişkin deneysel çalışmalardan elde edilen bulgular kısaca

özetlenecek olursa:

Bu tez çalışmasında, bakteriyel keratitin topikal olarak etkin tedavisi için,

uzun süre besifloksasin HCl (BH) salımı sağlayacak, farklı yüzey

özelliklerine sahip nanolif yapıda insert formülasyonları geliştirilmesi

gerçekleştirilmiştir.

BH içeren nanolif yapıda insert formülasyonları, Poli(Kaprolakton)

(PKL)/Poli(Etilen Glikol)(PEG) polimerleri (2:1) ile elektro-eğirme

yöntemi kullanılarak başarılı bir şekilde hazırlanmıştır.

Hazırlanan formülasyonlara SA veya TSA ile kaplama yapılarak

mukoadezif özelliklerinin iyileştirilmesi veya BH yerine BH:HP-β-Cyc

inklüzyon kompleksi kullanılarak ilacın penetrasyonunun artırılması gibi

formülasyon yaklaşımları uygulanarak BH’nın oküler biyoyararlanımını

artırmak üzere formülasyon stratejileri geliştirilmiştir.

Formülasyonlara uygulanan kaplama işleminin veya BH:HP-β-Cyc’nin

formülasyonlara dahil edilmesinin, formülasyonların bazı in vitro

karakteristikleri üzerinde (nanolif çapı, şişme özellikleri, in vitro ilaç

salımı, ex vivo biyoadezyon) olumlu etki gösterdiği tespit edilmiştir.

Hazırlanan nanolif yapıda insert formülasyonlarındaki lif yapısının

homojen ve nano boyutta olduğu tespit edilmiştir. İn vitro salım

çalışmalarında BH:HP-β-Cyc içeren formülasyonlar dışındaki

formülasyonlarla, 7 günlük bir antibiyotik salımı elde edilmiştir. Tüm

formülasyonlardan elde edilen her bir salım örneğine mikrobiyolojik

analiz uygulandığında, salım örneklerindeki BH miktarının her bir zaman

noktası için MIK değerinin üzerinde olduğu (mikroorganizma üzerinde

etkili) belirlenmiştir.

156

Kornea dokusu kullanılarak yapılan ex-vivo biyoadezyon çalışmalarında,

formülasyonların SA veya TSA ile kaplanmasının formülasyonun

biyoadezyon gücünü artırdığı belirlenmiştir.

Hücre kültürü çalışmalarında tüm formülasyonların 24, 48 ve 72. saat

sonunda ARPE-19 insan retina pigment epitel hücreleri üzerinde %75’ in

üstünde hücre canlılığı sağladığı, sitotoksik olmadığı gösterilmiştir.

Ex-vivo kornea geçiş çalışmalarında nanolif yapıda insert

formülasyonlarından salınan BH’nin korneadan geçtiği, siklodekstrinlerin

çözünürlük ve penetrasyon artırıcı özelliği nedeniyle BH:HP-β-Cyc içeren

formülasyonlarda geçişin daha yüksek oranda olduğu tespit edilmiştir.

In vivo çalışmalar için seçilen (Formülasyon C, D) formülasyonların, ilaç

çözeltisinin ve piyasa preparatının (Besivance®) antibakteriyel etkinliğini

tespit etmek amacıyla Yeni Zelanda tipi albino tavşan kornelarında

bakteriyel keratit modeli başarıyla oluşturulmuştur.

In vivo çalışmalarda tedavi öncesi ve sonrası Formülasyon C, D ve

Besivance®’dan elde edilen klinik skorlar karşılaştırıldığında,

Formülasyon C ve D’nin Besivance®’a yakın etkinlik gösterdiği ve tüm

muayene noktaları skorlarında bu gruplar arasında istatistiksel olarak

anlamlı bir farklılık görülmemiştir.

In vivo çalışmalarda, tez kapsamında geliştirilen, sadece bir defa

uygulanan insert formülasyonlarının, süspansiyon formunda olması

nedeniyle 7 gün boyunca günde 3 kez kullanılan piyasa preparatı

Besivance®’a benzer etkinlik gösterdiği tespit edilmiştir.

Bu çalışmanın bir TÜBİTAK projesi ve doktora tezi olması nedeniyle

belirlenen süre içinde planlanan çalışmaların tamamlanması ve

sonlandırılması gerekmiştir. Daha ileri çalışmalar düşünülecek olursa in

vivo oküler ilaç dağılım çalışmalarının gerçekleştirilmesi uygun olacaktır.

157

7. KAYNAKLAR

1. Forrester JV DA, McMenamin PG, Roberts F, Pearlman E. The eye: basic

sciences in practice: Elsevier Health Sciences; . The eye: basic sciences in

practice. Elsevier Health Sciences. 2015.

2. Beuerman RW, Pedroza L. Ultrastructure of the human cornea. Microsc Res

Tech. 1996;33(4):320-35.

3. Sahoo SK, Dilnawaz, F., & Krishnakumar, S. Nanotechnology in ocular drug

delivery. Drug discovery today. 2008;13(3-4):144-51.

4. Bíró T, & Aigner, Z. Current approaches to use cyclodextrins and mucoadhesive

polymers in ocular drug delivery—A mini-review. Scientia Pharmaceutica.

2019;87(3)

5. Baloglu E, Karavana SY, Senyigit ZA, Hilmioglu-Polat S, Metin DY, Zekioglu

O, et al. In-situ gel formulations of econazole nitrate: preparation and in-vitro

and in-vivo evaluation. J Pharm Pharmacol. 2011;63(10):1274-82.

6. Basaran E, Demirel M, Sirmagul B, Yazan Y. Cyclosporine-A incorporated

cationic solid lipid nanoparticles for ocular delivery. J Microencapsul.

2010;27(1):37-47.

7. Kayıran S, Bozdağ Pehlivan, S, Çelebier, M, Ünlü, N. Determination of

Naproxen Sodium from poly(lactıde-co-glycolıde) Corneal Scaffolds. Turk J

Pharm Sci, . 2010;7(1):57-68.

8. Jawahar N, Eagappanath, T, Nagasamy, V, Jubie, S, Samanta, M.K. Preparation

and Characterisation of PLGA-Nanoparticles Containing an Anti-hypertensive

Agent. Int J PharmTech Research. (2009); 1(2): :390-3.

9. Rowsey TG, Karamichos D. The role of lipids in corneal diseases and

dystrophies: a systematic review. Clin Transl Med. 2017;6(1):30.

10. Ross MH PW. Histology a Text and Atlas. With Correlated Cell and Molecular

Biology. & LW, Wilkins., editors. Philadelphia, (2006). 417-844. p.

11. Dhanapal R, Ratna, J.V. Ocular Drug Delivery System – A Revıew. Int J Innov

Drug Dis. (2012);2(1): 4-15.

12. Wheater PR BH, Daniels VG. . Functional Histology: A Text and Colour Atlas.

Second Edn. Churcill Livingstone Medical Division of Longman Group Ltd.

Hong Kong; 1987.

13. Yasukawa T, Ogura Y, Tabata Y, Kimura H, Wiedemann P, Honda Y. Drug

delivery systems for vitreoretinal diseases. Prog Retin Eye Res. 2004;23(3):253-

81.

14. Campbell M, Nguyen AT, Kiang AS, Tam L, Kenna PF, Dhubhghaill SN, et al.

Reversible and size-selective opening of the inner Blood-Retina barrier: a novel

therapeutic strategy. Adv Exp Med Biol. 2010;664:301-8.

158

15. Pahuja P, Arora S, Pawar P. Ocular drug delivery system: a reference to natural

polymers. Expert Opin Drug Deliv. 2012;9(7):837-61.

16. Janagam DR, Wu L, Lowe TL. Nanoparticles for drug delivery to the anterior

segment of the eye. Adv Drug Deliv Rev. 2017;122:31-64.

17. Hamidi M, Azadi A, Rafiei P. Hydrogel nanoparticles in drug delivery. Adv

Drug Deliv Rev. 2008;60(15):1638-49.

18. Jiang J, Moore JS, Edelhauser HF, Prausnitz MR. Intrascleral drug delivery to

the eye using hollow microneedles. Pharm Res. 2009;26(2):395-403.

19. Wadhwa S, Paliwal R, Paliwal SR, Vyas SP. Nanocarriers in ocular drug

delivery: an update review. Curr Pharm Des. 2009;15(23):2724-50.

20. Patel P, Shastri, D., Shelat, P., & Shukla, A. Ophthalmic drug delivery system:

challenges and approaches. Systematic Reviews in Pharmacy. 2010;1(2).

21. Raghava S HM, Kompella UB. Periocular routes for retinal drug delivery. Expert

Opin Drug Deliv. 2004(1):99-114.

22. Mitra AK. Role of transporters in ocular drug delivery system. Pharm Res.

2009;26(5):1192-6.

23. Schoenwald RD. Pharmacokinetics in ocular drug delivery. (Ed.). EE, editor.

Boca Raton: CRS Press(1993). p. 159-189.

24. Lang JC. Ocular Drug-Delivery Conventional Ocular Formulations. Advanced

Drug Delivery Reviews, . (1995);16 (1), :39-43.

25. Venkata Ratnam G, Madhavi, S.,Rajesh, P. Ocular Drug Delıvery: An Update

Revıew. IJPBS. (2011) ;1 (4), (437-446.).

26. Bourlais CL, Acar, L., Zia, H., Pierre, A., Sado, T.N.,Leverge, R. Ophtalmic

Drug Delivery Systems - Recent Advances. Progress in Retinal and Eye

Research,. 1998;17 (1), :33-58.

27. Das S, Suresh, P.K. Nanosuspension: A New Vehicle For the Improvement of

the Delivery of Drugs to the Ocular Surface Application to Amphotericin B.

Nanomed –Nanotechnol, 2011;7(2) 242-7.

28. Polat HK, Pehlivan, SB., & Çalış, S. Bakteriyel Keratit Tedavisinde Yeni İlaç

Taşıyıcı Sistemlerin Uygulanması. Türkiye Klinikleri Oftalmoloji Dergisi,

(2018) ;27(4): 289-301.

29. Kanski JJ, Bowling, B. Klinik Oftalmoloji Sistemik Yaklaşım. Editör: Nischal

K, Pearson, A. Güneş Tıp Kitabevi, Ankara: 7. Baskı, ; (2011). 167-238. p.

30. Erie JC NM, Hodge DO, Ballard DJ. Incidence of ulcerative keratitis in a defined

population from 1950 through 1988. Arch Ophthalmol 1993;111(12):1665-71.

31. Sensoy D, Cevher E, Sarici A, Yilmaz M, Ozdamar A, Bergisadi N. Bioadhesive

sulfacetamide sodium microspheres: evaluation of their effectiveness in the

treatment of bacterial keratitis caused by Staphylococcus aureus and

159

Pseudomonas aeruginosa in a rabbit model. Eur J Pharm Biopharm.

2009;72(3):487-95.

32. Manav G, Akarçay, K. Göz İnfeksiyonlarına Neden Olan Mikroorganizmalar,.

Ankem Dergisi. 1991;5 (4) 396-400.

33. Mc NN, Van R, Tuchin OS, Fleiszig SM. Ocular surface epithelia express

mRNA for human beta defensin-2. Exp Eye Res. 1999;69(5):483-90.

34. Baba K, Tanaka Y, Kubota A, Kasai H, Yokokura S, Nakanishi H, et al. A

method for enhancing the ocular penetration of eye drops using nanoparticles of

hydrolyzable dye. J Control Release. 2011;153(3):278-87.

35. Onlen Y, Tamer C, Oksuz H, Duran N, Altug ME, Yakan S. Comparative trial

of different anti-bacterial combinations with propolis and ciprofloxacin on

Pseudomonas keratitis in rabbits. Microbiol Res. 2007;162(1):62-8.

36. Hornof M, Toropainen E, Urtti A. Cell culture models of the ocular barriers. Eur

J Pharm Biopharm. 2005;60(2):207-25.

37. Özsoy Y. Göz, Kulak ve Buruna Uygulanan Dojaz Şekilleri, Temel Konular ve

Dozaj Şekilleri, Gürsoy AZ, editor. İstanbul,: Kontrollü Salım Sistemleri

Derneği Yayını; 2004. p.233-44.

38. Dutta D, Cole N, Willcox M. Factors influencing bacterial adhesion to contact

lenses. Mol Vis. 2012;18:14-21.

39. Musa F, Tailor, R., Gao, A., Hutley, E., Rauz, S., & Scott, R. A. H. Contact lens-

related microbial keratitis in deployed British military personnel. British journal

of ophthalmology. 2010;94(8) 988-93.

40. Tuft SJ, Matheson M. In vitro antibiotic resistance in bacterial keratitis in

London. Br J Ophthalmol. 2000;84(7):687-91.

41. Chalita MR, Hofling-Lima AL, Paranhos A, Jr., Schor P, Belfort R, Jr. Shifting

trends in in vitro antibiotic susceptibilities for common ocular isolates during a

period of 15 years. Am J Ophthalmol. 2004;137(1):43-51.

42. Sharma A, & Taniguchi, J. Emerging strategies for antimicrobial drug delivery

to the ocular surface: Implications for infectious keratitis. The ocular surface, .

2017;15(4), :670-9.

43. Okur NÜ. Antibiyotik İçeren Çeşitli Oküler Nano-Taşıyıcı Sistemlerin İn Vitro

– İn Vivo Değerlendirilmesi Üzerine Çalışmalar [Doktora Tezi]. İzmir2012.

44. Lihara H, Suzuki T, Kawamura Y, Ohkusu K, Inoue Y, Zhang W, et al.

Emerging multiple mutations and high-level fluoroquinolone resistance in

methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from ocular infections.

Diagn Microbiol Infect Dis. 2006;56(3):297-303.

45. Oküler Enfeksiyon Hastalıkları BK, Türk Oftalmoloji Derneği Eğitim Yayınları

No:8: 181-200.

160

46. Stroman DW, Dajcs JJ, Cupp GA, Schlech BA. In vitro and in vivo potency of

moxifloxacin and moxifloxacin ophthalmic solution 0.5%, a new topical

fluoroquinolone. Surv Ophthalmol. 2005;50 Suppl 1:S16-31.

47. Xie S, Zhu L, Dong Z, Wang Y, Wang X, Zhou W. Preparation and evaluation

of ofloxacin-loaded palmitic acid solid lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine.

2011;6:547-55.

48. Mah FS, & Sanfilippo, C. M. (2016). Besifloxacin: efficacy and safety in

treatment and prevention of ocular bacterial infections. Ophthalmology and

therapy,. 2016; 5(1):1-20.

49. Harry M. King J, Webster, NY (US) inventor; Bausch & Lomb Incorporated,

Rochester, NY (US) assignee. Fluoroquınolone Carboxylıc Acıd Molecular

Crystals. USA patent US 8.481526 B2 2013 Jul. 9, 2013

50. Totoli EG, Salgado HRN. Besifloxacin: A Critical Review of Its Characteristics,

Properties, and Analytical Methods. Crit Rev Anal Chem. 2018;48(2):132-42.

51. Blondeau JM. Fluoroquinolones: mechanism of action, classification, and

development of resistance. Surv Ophthalmol. 2004;49 Suppl 2:S73-8.

52. Levine C HH, Marians K. DNA gyrase and topoisomerase IV: biochemical

activities, physiological roles during chromosome replication, and drug

sensitivities. Biochim Biophys Acta. 1998:1400:29–43.

53. Lal SCA, S. Sokindra, K. Majumdar, D. K. Besifloxacin the Fourth Generation

Fluoroquinolone: A Review. J Drug Deliv Ther. 2014:39–44.

54. Khimdas SV, K. L. Hutnik, C. M. L. Ophthalmology and Eye Diseases

Besifloxacin Ophthalmic Suspension: Emerging Evidence of its Therapeutic

Value in Bacterial Conjunctivitis. Ophthalmol Eye Dis. 2011;3:7–12. .

55. Cambau E, Matrat S, Pan XS, Roth Dit Bettoni R, Corbel C, Aubry A, et al.

Target specificity of the new fluoroquinolone besifloxacin in Streptococcus

pneumoniae, Staphylococcus aureus and Escherichia coli. J Antimicrob

Chemother. 2009;63(3):443-50.

56. Sanfilippo CM, Hesje CK, Haas W, Morris TW. Topoisomerase mutations that

are associated with high-level resistance to earlier fluoroquinolones in

Staphylococcus aureus have less effect on the antibacterial activity of

besifloxacin. Chemotherapy. 2011;57(5):363-71.

57. Karpecki P, Depaolis M, Hunter JA, White EM, Rigel L, Brunner LS, et al.

Besifloxacin ophthalmic suspension 0.6% in patients with bacterial

conjunctivitis: A multicenter, prospective, randomized, double-masked, vehicle-

controlled, 5-day efficacy and safety study. Clin Ther. 2009;31(3):514-26.

58. Karpecki P, Paterno MR, Comstock TL. Limitations of current antibiotics for

the treatment of bacterial conjunctivitis. Optom Vis Sci. 2010;87(11):908-19.

59. Proksch JW GC, Siou-Mermet R, Comstock TL, Paterno MR, Ward KW. Ocular

pharmacokinetics of besifloxacin following topical administration to rabbits,

monkeys, and humans. J Ocul Pharmacol Ther. 2009;25(4):335–44.

161

60. Haas W SC, Hesje CK, Morris TW. Contribution of the R8 substituent to the in

vitro antibacterial potency of besifloxacin and comparator ophthalmic

fluoroquinolones. Clin Ophthalmol. 2013;7: 821–30.

61. Haas W PC, Zurenko GE, Lee JC, Brunner LS, Morris TW. Besifloxacin, a novel

fluoroquinolone, has broad-spectrum in vitro activity against aerobic and

anaerobic bacteria. Antimicrob Agents Chemother. 2009;53(8):3552–60.

62. Patel A, Cholkar, K., Agrahari, V., & Mitra, A. K. Ocular drug delivery systems:

an overview. World journal of pharmacology. 2013;2(2), .

63. Kang-Mieler JJ, Dosmar E, Liu W, Mieler WF. Extended ocular drug delivery

systems for the anterior and posterior segments: biomaterial options and

applications. Expert Opin Drug Deliv. 2017;14(5):611-20.

64. Lakhani P, Patil, A., & Majumdar, S. Recent advances in topical nano drug-

delivery systems for the anterior ocular segment. Therapeutic delivery. 2018;

9(2), :137-53.

65. Patel A, Cholkar, K., Agrahari, V., & Mitra, A. K. Ocular drug delivery systems:

an overview. World journal of pharmacology. 2013;2(2):47.

66. Dillen K, Bozdağ, S., Vandervoort, J., Ludwing, A. Evaluation of the

Physicochemical Charateristics and Activity of Various Kinds of Ciprofloxacin

HCL-loaded Cationic Nanoparticles,. J Drug Del Sci Tech. 2007;17(19) 49-56.

67. Patel HA, Patel, J.K., Patel, K.N., Patel, R.R. Ophthalmic Drug Delivery system

–A Review, Der Pharm Let. 2010;2(4) 100-15.

68. Grass GM CJ, Makoid MC. Ocular delivery of pilocarpine from erodible

matrices. J Pharm Sci 1984;73(5) 618-21.

69. Bozdağ S, Weyenberg, W., Ludwig, A. Rheological Evaluation of Dispersions,

Prepared with Different Non- and Gamma-irradiated Bioadhesive Cospray

Dried Powder Mixtures. Pharmazie. 2005;60:593-7.

70. Thakur R SG. Promising Implication of Ocuserts in Ocular Disease. Journal of

Drug Delivery and Therapeutics. 2012; 2(2):18-25.

71. Bozdag S, Weyenberg W, Adriaens E, Dhondt MM, Vergote V, Vervaet C, et

al. In vitro evaluation of gentamicin- and vancomycin-containing minitablets as

a replacement for fortified eye drops. Drug Dev Ind Pharm. 2010;36(11):1259-

70.

72. Imperiale JC, Acosta GB, Sosnik A. Polymer-based carriers for ophthalmic drug

delivery. J Control Release. 2018;285:106-41.

73. Gürsoy AZ. Oküler Sistemler, Kontrolü Salım Sistemleri. Gürsoy AZ, editor.

İstanbul2002. p.197 215.

74. Ustundag-Okur N, Gokce EH, Bozbiyik DI, Egrilmez S, Ertan G, Ozer O. Novel

nanostructured lipid carrier-based inserts for controlled ocular drug delivery:

evaluation of corneal bioavailability and treatment efficacy in bacterial keratitis.

Expert Opin Drug Deliv. 2015;12(11):1791-807.

162

75. Gürsoy AZ, Ed.Kontrollü Salım Sistemleri, Temel Konular ve Dozaj Şekilleri.

Gürsoy AZ, editor. İstanbul,2004. p 409-22.

76. JC. R. Ocular anatomy and physiology relevant to ocular drug delivery. AK m,

editor. New york1993.

77. Gurtler F, and Robert Gurny. "Patent literature review of ophthalmic inserts."

Drug development and industrial pharmacy. 1995; 21.1: 1-18.

78. Musgrave CSA, Fang F. Contact Lens Materials: A Materials Science

Perspective. Materials (Basel). 2019;12(2).

79. Singh K, Nair, A. B., Kumar, A., & Kumria, R. Novel approaches in formulation

and drug delivery using contact lenses. Journal of basic and clinical pharmacy,

2011; 2(2).

80. Le Bourlais C, Acar, L., Zia, H., Sado, P. A., Needham, T., & Leverge, R.

Ophthalmic drug delivery systems—recent advances. Progress in retinal and eye

research,. 1998;17(1) 33-58.

81. Kumar BP, G. Harish, and Debjit Bhowmik. Ocular inserts: A novel controlled

drug delivery system. The Pharma Innovation 2013;1:1-12.

82. Zaffaroni A. MaaTF, inventor Osmotic Releasing Device Having a Plurality of

Release Rate Patterns 1977.

83. Pal Kaur I, & Kanwar, M. Ocular preparations: the formulation approach. Drug

development and industrial pharmacy, 2002; 28(5) 473-93.

84. Devhadrao N.V SM. Revıew On Ocular Insert Drug Delıvery System. Journal

of Drug Delivery & Therapeutics. 2018;8(5-s) 115-21.

85. Bengani LC, Hsu, K.H., Gause, S., Chauhan, A. Contact lenses as a platform for

ocular drug delivery. Expet Opin Drug Deliv. 2013;10: 1483–96.

86. Prakash M, Dhesingh, R.S. Nanoparticle modified drug loaded biodegradable

polymeric contact lenses for sustainable ocular drug delivery. Curr Drug Deliv

2017;14;555–565

87. Richdale K, Lam, D.Y., Wagner, H., Zimmerman, A.B., Kinoshita, B.T.,

Chalmers, R., Sorbara, L., Szczotka-Flynn, L., Govindarajulu, U., Mitchell, G.L.

Case-control pilot study of soft contact lens wearers with corneal infiltrative

events and healthy controls. Invest Ophthalmol Vis Sci 2016;57:47–55.

88. Saettone MF, and Lotta Salminen. Ocular inserts for topical delivery. Advanced

drug delivery reviews 1995;16.1:95-106.

89. Gote V, Sikder, S., Sicotte, J., & Pal, D. Ocular drug delivery: present

innovations and future challenges. Journal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics. 2019;370(3): 602-24.

90. Harwood R.J. Inventor Stabilized hydroxypropyl cellulose ophtalmic inserts and

process to sterilize the same1983.

163

91. Jimenez J, Sakthivel, M., Nischal, K. K., & Fedorchak, M. V. Drug delivery

systems and novel formulations to improve treatment of rare corneal disease.

Drug discovery today. 2019;24(8):1564–74.

92. Taylor SR, Isa, H., Joshi, L., & Lightman, S. New developments in

corticosteroid therapy for uveitis.Ophthalmologica. 2010; 224(Suppl. 1):46-53.

93. Varun R, Senthil, V., Lavanya, K., Ritu, H. A Brief Review on Oral Film

Technology,. Int J Res Ayur & Pharm. (2011).2(4);1138-47.

94. Arthanari S, Mani G, Jang JH, Choi JO, Cho YH, Lee JH, et al. Preparation and

characterization of gatifloxacin-loaded alginate/poly (vinyl alcohol) electrospun

nanofibers. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2016;44(3):847-52.

95. Calamak S, Shahbazi, R., Eroglu, I., Gultekinoglu, M., & Ulubayram, K. An

overview of nanofiber-based antibacterial drug design. Expert opinion on drug

discovery. 2017;12(4):391–406.

96. Goyal R, Macri, L. K., Kaplan, H. M., & Kohn, J. Nanoparticles and nanofibers

for topical drug delivery. Journal of controlled release: official journal of the

Controlled Release Society. 2016; 240;77–92.

97. Groeber F HM, Hampel M, Hinderer S, Schenke-Layland K. Skin tissue

engineering-in vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 2011; 63(4-

5):352-66.

98. Sill TJ, Von Recum HA. Electrospinning: applications in drug delivery and

tissue engineering. Biomaterials. 2008;29(13):1989-2006.

99. Wang Y ZM, Lu H, Feng S, Ji G, Cao J. Template synthesis of carbon nanofibers

containing linear mesocage arrays. . Nanoscale Res Lett. 2010;5(6) 913-6.

100. Ellison CJ PA, Giles DW, Macosko CW, Bates FS. Melt blown nanofibers: Fiber

diameter distributions and onset of fiber breakup. Polymer. 2007;48(11) 3306-

16. .

101. Nayak R PR, Kyratzis IL, Truong YB, Arnold L. Recent advances in nanofibre

fabrication techniques. Text Res J. 2012; 82(2) 129-47.

102. Esentürk İ. Elektroeğirme Yöntemi ile Hazırlanan Nanoliflerin Deriye

Uygulanan İlaç Taşıyıcı Sistemler Olarak Değerlendirilmeler’ [doktora tezi].

İstanbul Üniversitesi, 2018.

103. Mei L, Wang, Y., Tong, A., & Guo, G. Facile electrospinning of an efficient

drug delivery system. Expert Opinion on Drug Delivery, 2016;13(5) 741-53.

104. Rim NG SC, Shin H. Current approaches to electrospun nanofibers for tissue

engineering. Biomed Mater 2013;8(1): 014102.

105. Abrigo M, McArthur SL, Kingshott P. Electrospun nanofibers as dressings for

chronic wound care: advances, challenges, and future prospects. Macromol

Biosci. 2014;14(6):772-92.

164

106. Wang C, Wang, J., Zeng, L., Qiao, Z., Liu, X., Liu, H., ... & Ding, J. Fabrication

of electrospun polymer nanofibers with diverse morphologies. Molecules. 2019;

24(5).

107. Singh A, Rath, G., Singh, R., & Goyal, A. K. Nanofibers: An effective tool for

controlled and sustained drug delivery. Current drug delivery. 2018; 15(2) ;155-

66.

108. Thakkar S, & Misra, M. Electrospun polymeric nanofibers: New horizons in

drug delivery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2017;107 148-67.

109. Chen Z, Chen Z, Zhang A, Hu J, Wang X, Yang Z. Electrospun nanofibers for

cancer diagnosis and therapy. Biomater Sci. 2016;4(6):922-32.

110. Haider A, Haider, S., Kang, I. K. A comprehensive review summarizing the

effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in

biomedical and biotechnology. Arabian J Chem. 2015.

111. Khalf A, Madihally SV. Recent advances in multiaxial electrospinning for drug

delivery. Eur J Pharm Biopharm. 2017;112:1-17.

112. Bhattarai RS, Bachu, R. D., Boddu, S. H., & Bhaduri, S. Biomedical applications

of electrospun nanofibers: Drug and nanoparticle delivery. Pharmaceutics.

2019;11(1).

113. Li ZW, C. Effects of working parameters on electrospinning. Berlin, Germany,

2013. p. 15–28

114. Deitzel JK, J.; Harris, D.; Tan, N.B. The effect of processing variables on the

morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer 2001.42, :261–72.

115. Ramakrishna S, Fujihara K., Teo W.E., Lim T.C., Ma Z. Introduction to

Electrospinning and Nanofibers, World Scientific. Publishing Co, Singapore.

2005:p.381.

116. Megelski SS, J.S.; Chase, D.B.; Rabolt, J.F. Micro-and nanostructured surface

morphology on electrospun polymer fibers. Macromolecules. 2002;35: 8456–66.

117. Andrady A. L. Science and Technology of Polymer Nanofibers. S Willey Pres,

New Jersey. 2008:p.403.

118. Bhardwaj N, Kundu SC. Electrospinning: a fascinating fiber fabrication

technique. Biotechnol Adv. 2010;28(3):325-47.

119. Şirin Ş, Çetiner, S., Saraç, A. S. Elektro çekim yoluyla polimer nanolifler:

nanolif kalitesini etkileyen faktörler. KSU Mühendislik Bilimleri Dergisi.

2013;16(2) 1-12.

120. Baumgarten PK. Electrostatic spinning of acrylic microfibers. J Colloid Interface

Sci 1971;36, :71–9.

121. Mihindukulasuriya SDFPT. Investigations of heat seal parameters and oxygen

detection in flexible packages. University of Guelph, Canada 2012.

165

122. Sukigara SG, M, Ayutsede, J. Micklus, M. Ko, F. Regeneration of Bombyx mori

silk by electrospinning—Part 1: Processing parameters and geometric

properties. . Polymer. 2003;44, :5721–7.

123. Üstündağ GC. Elektrospinning Yöntemi ile Biyomedikal Kullanıma Yönelik

Nanolif Yüzey Üretimi ve Uygulması 2009.

124. Larrondo LSJM, R. Electrostatic fiber spinning from polymer melts. I.

Experimental observationson fiber formation and properties. J Polym Sci Polym

Phys. 1981;19, :909–20.

125. Yang QL, Z. Hong, Y. Zhao, Y. Qiu, S. Wang, C. Wei, Y. Influence of solvents

on the formation of ultrathin uniform poly(vinyl pyrrolidone) nanofibers with

electrospinning. J Polym Sci Part B Polym Phys. 2004;42, :3721–6.

126. Pillay VD, C. Choonara, Y.E. Tyagi, C. Tomar, L. Kumar, P. du Toit, L.C.

Ndesendo, V.M. A review of the effect of processing variables on the fabrication

of electrospun nanofibers for drug delivery applications. J Nanomater 2013.

127. Hayati IB, A. Tadros, T.F. Investigations into the mechanisms of

electrohydrodynamic spraying of liquids: I. Effect of electric field and the

environment on pendant drops and factors affecting the formation of stable jets

and atomization. J Colloid Interface Sci. 1987;117, :205–21.

128. Shahriar SM, Mondal, J. Hasan, M. N., Revuri, V., Lee, D. Y., & Lee, Y. K.

Electrospinning nanofibers for therapeutics delivery. Nanomaterials. 2019;9(4),

.

129. Zamani M, Molamma P. Prabhakaran, and Seeram Ramakrishna. Advances in

drug delivery via electrospun and electrosprayed nanomaterials. International

journal of nanomedicine 2013;8.

130. Hu X, Liu S, Zhou G, Huang Y, Xie Z, Jing X. Electrospinning of polymeric

nanofibers for drug delivery applications. J Control Release. 2014;185:12-21.

131. Mohammadian F, Eatemadi A. Drug loading and delivery using nanofibers

scaffolds. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2017;45(5):881-8.

132. Zeng J, Yang L, Liang Q, Zhang X, Guan H, Xu X, et al. Influence of the drug

compatibility with polymer solution on the release kinetics of electrospun fiber

formulation. J Control Release. 2005;105(1-2):43-51.

133. Meng ZX, Xu XX, Zheng W, Zhou HM, Li L, Zheng YF, et al. Preparation and

characterization of electrospun PLGA/gelatin nanofibers as a potential drug

delivery system. Colloids Surf B Biointerfaces. 2011;84(1):97-102.

134. Jannesari M VJ, Morshed M, Zamani M. Composite poly(vinyl

alcohol)/poly(vinyl acetate) electrospun nanofibrous mats as a novel wound

dressing matrix for controlled release of drugs. Int J Nanomedicine. 2011;6;993–

1003.

135. Volpato FZ AJ, Erickson K, Popat KC, Migliaresi C, Kipper MJ. Preservation

of FGF-2 bioactivity using heparin-based nanopar¬ticles, and their delivery from

electrospun chitosan fibers. Acta Biomater. 2012; 8(4):1551–9.

166

136. Kim HS, Yoo HS. MMPs-responsive release of DNA from electrospun

nanofibrous matrix for local gene therapy: in vitro and in vivo evaluation. J

Control Release. 2010;145(3):264-71.

137. Luu YK, Kim K, Hsiao BS, Chu B, Hadjiargyrou M. Development of a

nanostructured DNA delivery scaffold via electrospinning of PLGA and PLA-

PEG block copolymers. J Control Release. 2003;89(2):341-53.

138. Liao IC, Chen S, Liu JB, Leong KW. Sustained viral gene delivery through core-

shell fibers. J Control Release. 2009;139(1):48-55.

139. Saraf A, Baggett LS, Raphael RM, Kasper FK, Mikos AG. Regulated non-viral

gene delivery from coaxial electrospun fiber mesh scaffolds. J Control Release.

2010;143(1):95-103.

140. Yang Y LX, Qi M, Zhou S, Weng J. Release pattern and structural integrity of

lysozyme encapsulated in core-sheath structured poly(DL-lactide) ultrafine

fibers prepared by emulsion electrospinning. Eur J Pharm Biopharm 2008;69(1)

106–16. .

141. He S, Xia T, Wang H, Wei L, Luo X, Li X. Multiple release of polyplexes of

plasmids VEGF and bFGF from electrospun fibrous scaffolds towards

regeneration of mature blood vessels. Acta Biomater. 2012;8(7):2659-69.

142. Xu X, Yang L, Xu X, Wang X, Chen X, Liang Q, et al. Ultrafine medicated

fibers electrospun from W/O emulsions. J Control Release. 2005;108(1):33-42.

143. Woodruff MA, Hutmacher, D. W. The return of a forgotten polymer.

Polycaprolactone in the 21st century. Progress in Polymer Scinece. (2010).35,

:1217-56.

144. Chasin M, Langer, R. Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems.

Marcel Dekker, New York.1990.

145. Zhu X, Ni, S., Xia, T., Yao, Q., Li, H., Wang, B., ... & Su, W. Anti-neoplastic

cytotoxicity of SN-38-loaded PCL/Gelatin electrospun composite nanofiber

scaffolds against human glioblastoma cells in vitro. Journal of Pharmaceutical

Sciences.2015; 104(12):4345-54.

146. Gaucher G, Dufresne, M.H., Sant, V.P., Kang, N., Maysinger, D., Lrroux, J.C.

Block copolymer micelles preparation, characterization and application in drug

delivery. Journal of Controlled Release. 2005; 109, :169-88.

147. Leuner C, Dressman, J. Improving drug solubility for oral delivery using solid

dispersions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics.

2000;50, :47-60.

148. Radhakrishnan J KU, Sethuraman S, Hydrogel based injectable scaffolds for

cardiac tissue regeneration. Biotechnol Adv. 2014;32 449-61.

149. Repanas A WW, Gryshkov O, Müller M, Glasmacher B. Pcl/Peg Electrospun

Fibers as Drug Carriers for the Controlled Delivery of Dipyridamole. Journal of

In Silico & In Vitro Pharmacology. 2015;1:1-10.

167

150. Ertesvag H, Valla, S. “Biosynthesis and applications of alginates” Polymer

Degredation and Stability. 1998;59: :85-91.

151. Fragonas E, Valente, M., Pozzi-Mucelli, M., Toffanin, R., Rizzo, R., Silvestri,

F., Vitur, F. Articular cartilage repair in rappits by using suspension of allogenic

Chondrocytes İn Alginate. Biomaterials. 2000; 21: :795-801

152. Eşim Ö. Analjezik Etkili Mukoadeif Bir Formülasyonun Geliştirilmesi, Kontrol

Ve Analizleri [Yüksek lisans tezi]. Ankara 2011.

153. Nitalikar MM, Sakarkar, D.M.,Jain, P.V. The cyclodextrins: a review. Journal

of Current Pharmaceutical Research. 2012;10 (1):01-6.

154. Kurkov SV, Loftsson T. Cyclodextrins. Int J Pharm. 2013;453(1):167-80.

155. J Otero-Espinar F, Blanco-Mendez, J. Editorial (Thematic Issue: Natural &

Synthetically-Modified Cyclodextrins and Polymers in Drug Delivery Systems).

Current topics in medicinal chemistry, . 2014;14 (4), :463-4.

156. Jacob S, & Nair, A. B. Cyclodextrin complexes: Perspective from drug delivery

and formulation. Drug development research. 2018; 79(5):201–17.

157. Brewster ME, Loftsson T. Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers. Adv

Drug Deliv Rev. 2007;59(7):645-66.

158. Laza-Knoerr A, Gref, R.,Couvreur, P. Cyclodextrins for drug delivery. Journal

of Drug Targeting. 2010;18 (9), :645-56.

159. Zhang X, Zhang, C., Sun, G., Xu, X., Tan, Y., Wu, H. ve diğerleri. Cyclodextrins

and Their Derivatives in the Resolution of Chiral Natural Products: a Review.

Instrumentation Science & Technology. 2012; 40 (2-3), :194-215.

160. Loftsson T, Brewster, M.E. Cyclodextrins as functional excipients: methods to

enhance complexation efficiency. Journal of Pharmaceutical Sciences,.

2012;101 (9), :3019-32.

161. Jansook P, Ogawa, N., & Loftsson, T. Cyclodextrins: structure,

physicochemical properties and pharmaceutical applications. International

journal of pharmaceutics. 2018;535(1-2) 272-84.

162. Rouf MA, Vural, I., Bilensoy, E., Hincal, A.,Erol, D.D. Rapamycin-

cyclodextrin complexation: improved solubility and dissolution rate. Journal of

Inclusion Phenomena and Macrocyclic. Chemistry. 2011;70 (1-2):167-75.

163. Duchêne D, Cyclodextrins and their inclusion complexes. Cyclodextrins in

Pharmaceutics. Cosmetics, and Biomedicine: Current and Future Industrial

Applications. 2011:1-18.

164. Challa R, Ahuja, A., Ali, J.,Khar, R. Cyclodextrins in drug delivery: an updated

review. Aaps Pharmscitech. 2005; 6 (2), :E329-E57.

165. Sadhana R. Charu P. Prankruti C. Development and validation of rp- hplc

method for estimation of besifloxacin hydrochloride in bulk and its ophtalmic

168

formulation. İnternational Journal of Chemical and pharmaceutical analysis.

2016:2395-466.

166. Shabir GA. Step-by-step analytical methods validation and protocol in the

quality system compliance industry. Journal of validation technology.

2005;10:314-25.

167. Kai D, Liow, S. S., & Loh, X. J. Biodegradable polymers for electrospinning:

towards biomedical applications. Materials Science and Engineering.

2014;45:659-70.

168. Ravikumar R, Ganesh, M. Senthil, V. Ramesh, Y. V. Jakki, S. L. & Choi, E. Y.

Tetrahydro curcumin loaded PCL-PEG electrospun transdermal nanofiber patch:

Preparation, characterization, and in vitro diffusion evaluations. Journal of Drug

Delivery Science and Technology. 2018;44:342-8.

169. Pant B, Park, M. & Park, S. J. Drug delivery applications of core-sheath

nanofibers prepared by coaxial electrospinning: a review. Pharmaceutics.

2019;11(7).

170. Bui HT, Chung, O. H. Cruz, J. D. & Park, J. S. Fabrication and characterization

of electrospun curcumin-loaded polycaprolactone-polyethylene glycol

nanofibers for enhanced wound healing. Macromolecular Research. 2014;

22(12), :1288-96.

171. Yu H, Jia, Y. Yao, C. & Lu, Y. PCL/PEG core/sheath fibers with controlled drug

release rate fabricated on the basis of a novel combined technique. International

journal of pharmaceutics. 2014;469(1): 17–22.

172. Mohammadi Z SZM, Majdi H, et al. The effect of chrysin-curcumin-loaded

nanofibres on the wound-healing process in male rats. Artif Cells Nanomed

Biotechnol. 2019;47(1) 1642-52.

173. Polat, H. K., Bozdağ Pehlivan, S., Özkul, C., Çalamak, S., Öztürk, N., Aytekin,

E., Fırat, A., Ulubayram, K., Kocabeyoğlu, S., İrkeç, M., & Çalış, S. (2020).

Development of besifloxacin HCl loaded nanofibrous ocular inserts for the

treatment of bacterial keratitis: In vitro, ex vivo and in vivo

evaluation. International journal of pharmaceutics, 585, 119552.

https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.119552

174. Mehta P A-KA, Arshad MS, Chang MW, Alany RG, Ahmad Z. Development

and characterisation of electrospun timolol maleate-loaded polymeric contact

lens coatings containing various permeation enhancers. Int J Pharm. 2017;532(1)

408-20.

175. Shah VP, Tsong Y, Sathe P, Liu JP. In vitro dissolution profile comparison--

statistics and analysis of the similarity factor, f2. Pharm Res. 1998;15(6):889-

96.

176. Xiao J, Zhu, Y., Liu, Y., Zeng, Y., & Xu, F. A composite coating of calcium

alginate and gelatin particles on Ti6Al4V implant for the delivery of water

soluble drug. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied

Biomaterials: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese

169

Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials and the

Korean Society for Biomaterials. 2009;89(2), :543-50.

177. Bernkop-Schnurch A, Kast CE, Richter MF. Improvement in the mucoadhesive

properties of alginate by the covalent attachment of cysteine. J Control Release.

2001;71(3):277-85.

178. Wright ME PI, Yang M, Santerre JP. Electrospun polyurethane nanofiber

scaffolds with ciprofloxacin oligomer versus free ciprofloxacin: Effect on drug

release and cell attachment. J Control Release 2017;250:107-15.

179. Higuchi TKAC. A phase solubility technique. Adv Anal Chem Instrum.

1965;4:117-211.

180. Loftsson T, Brewster ME. Pharmaceutical applications of cyclodextrins: basic

science and product development. J Pharm Pharmacol. 2010;62(11):1607-21.

181. Williams HD, Trevaskis NL, Charman SA, Shanker RM, Charman WN, Pouton

CW, et al. Strategies to address low drug solubility in discovery and

development. Pharmacol Rev. 2013;65(1):315-499.

182. Ünal S, Yücel, Ç, Tort, S, Ç.tekelı̇, M, Aktaş, Y, Bı̇lensoy, E. Dosetakselin

Siklodekstrin Türevleri İle Farklı Yöntemlerle Kompleks Oluşturması Ve

Oluşan İnklüzyon Komplekslerinin Karakterizasyonu. Sağlık Bilimleri Dergisi.

2017; 26 (2)

183. Taneri F. Doktora Tezi. Bazı Antimikrobiyal Maddelerin Siklodekstrin

Komplekslerinin Hazırlanması ve Bunların Farmasötik Formülasyonlarda

Kullanımı. 2004.

184. Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by

a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 1966;45(4):493-6.

185. Pawar PK, Katara R, Majumdar DK. Design and evaluation of moxifloxacin

hydrochloride ocular inserts. Acta Pharm. 2012;62(1):93-104.

186. Yoon JJ, Park TG. Degradation behaviors of biodegradable macroporous

scaffolds prepared by gas foaming of effervescent salts. J Biomed Mater Res.

2001;55(3):401-8.

187. Moore TW SR, Habib Y. Dissolution calibrator tablets: A recommendation for

new calibrator tablets to replace bothcurrentUSPcalibratortablets.

PharmacopeialForum. 1996;22(3):2423– 8.

188. Aher ND, Nair HA. Bilayered films based on novel polymer derivative for

improved ocular therapy of gatifloxacin. ScientificWorldJournal.

2014;2014:297603.

189. Aygül A. The importance of efflux systems in antibiotic resistance and efflux

pump inhibitors in the management of resistance. Mikrobiyoloji bulteni.

2015;49(2) 278-91.

170

190. Hansen MB, Nielsen, S.E.,Berg, K. Re-Examination and Further Development

of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill.

Journal of Immunological Methods. 1989; 119 (2): 203-10.

191. Riss TL, Moravec RA, Niles AL, Duellman S, Benink HA, Worzella TJ, et al.

Cell viability assays. Assay Guidance Manual [Internet]: Eli Lilly & Company

and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2016.

192. United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 42 NF 37).The

Biocompability of Materials Used in Drug Containers MDaIR, Md.United States

Pharmacopeial Convention, Inc. 2019.

193. Zgadzaj A, Kornacka J, Jastrzebska A, Parzonko A, Sommer S, Nalecz-Jawecki

G. Development of photoprotective, antiphototoxic, and antiphotogenotoxic

formulations of ocular drugs with fluoroquinolones. J Photochem Photobiol B.

2018;178:201-10.

194. Silva MM, Calado R, Marto J, Bettencourt A, Almeida AJ, Goncalves LMD.

Chitosan Nanoparticles as a Mucoadhesive Drug Delivery System for Ocular

Administration. Mar Drugs. 2017;15(12).

195. Yavuz B. In Vıtro/In Vıvo Evaluatıon Of Dendrımerıc Systems For Retınal Drug

Delıvery [Doktora tezi ] 2014

196. Yavuz B, Pehlivan SB, Vural I, Unlu N. In Vitro/In Vivo Evaluation of

Dexamethasone--PAMAM Dendrimer Complexes for Retinal Drug Delivery. J

Pharm Sci. 2015;104(11):3814-23.

197. Barton FB, Fong, D.S., Knatterud, G.L.,Grp, E.R. Classification of Farnsworth-

Munsell 100-hue test results in the early treatment diabetic retinopathy study.

American Journal of Ophthalmology. 2004;138 (1) 119-24.

198. Marquart ME. Animal models of bacterial keratitis. J Biomed Biotechnol.

2011;2011:680642.

199. Sanders ME, Moore QC, Norcross EW, Sanfilippo CM, Hesje CK, Shafiee A, et

al. Comparison of besifloxacin, gatifloxacin, and moxifloxacin against strains of

pseudomonas aeruginosa with different quinolone susceptibility patterns in a

rabbit model of keratitis. Cornea. 2011;30(1):83-90.

200. Johnson MK HJ, Hagenah M, et al. The role of pneumolysin in ocular infections

with Streptococcus pneumoniae. Curr Eye Res 1990;9:1107–14.

201. Tas T, Kucukbayrak, A. Hakyemez, I. N. Mengeloglu, F. Z. Simavli, H.

Ozyalvacli, G. & Erdurmus, M. Linezolid versus vancomycin for the treatment

of methicillin-resistant Staphylococcus aureus keratitis in rabbits. Cornea.

2013;32(7) 1052-7.

202. Erdal E, Aslan Altay, Y, Ugurlu, N. Preparation and Characterization of

Nanoparticular Systems For Topical Treatment of Ocular Infections. Hacettepe

Journal of Biology and Chemistry 2020;48 (1) , :49-58.

203. Wang B, Li, H. Yao, Q., Zhang, Y., Zhu, X., Xia, T., Wang, J., Li, G., Li, X., &

Ni, S. Local in vitro delivery of rapamycin from electrospun PEO/PDLLA

171

nanofibers for glioblastoma treatment. Biomedicine & pharmacotherapy=

Biomedecine & pharmacotherapie. 2016;83 1345–52.

204. Ribeiro AM, Figueiras, A. & Veiga, F. Improvements in Topical Ocular Drug

Delivery Systems: Hydrogels and Contact Lenses. Journal of pharmacy &

pharmaceutical sciences: a publication of the Canadian Society for

Pharmaceutical Sciences, Societe canadienne des sciences pharmaceutiques.

2015;18(5):683–95.

205. Bachu RD CP, Al-Saedi ZHF, Karla PK, Boddu SHS. Ocular Drug Delivery

Barriers-Role of Nanocarriers in the Treatment of Anterior Segment Ocular

Diseases. . Pharmaceutics 2018;10(1).

206. Baranowski P KB, Gajda M, Pluta J. Ophthalmic drug dosage forms:

characterisation and research methods. ScientificWorld Journal 861904

Published 2014. 2014.

207. Fangueiro JF VF, Silva AM, Souto EB. Ocular Drug Delivery - New Strategies

for Targeting Anterior and Posterior Segments of the Eye. Curr Pharm Des

2016;22(9): 1135-46.

208. Cholkar K PS, Vadlapudi AD, Mitra AK. Novel strategies for anterior segment

ocular drug delivery J Ocul Pharmacol Ther. 2013;29(2): 106-23.

209. Rachwalik D PU. Bacterial Keratitis. Klin Monbl Augenheilkd.

2015;232(6):738-44.

210. Sharma A, Taniguchi J. Review: Emerging strategies for antimicrobial drug

delivery to the ocular surface: Implications for infectious keratitis. Ocul Surf.

2017;15(4):670-9.

211. Khimdas S, Visscher, K. L., & Hutnik, C. M. Besifloxacin ophthalmic

suspension: emerging evidence of its therapeutic value in bacterial

conjunctivitis. Ophthalmology and eye diseases, (2011);3:7–12.

212. Ustündağ-Okur N, Gökçe, E. H., Bozbıyık, D. İ., Eğrilmez, S., Ozer, O., & Ertan,

G. Preparation and in vitro-in vivo evaluation of ofloxacin loaded ophthalmic

nano structured lipid carriers modified with chitosan oligosaccharide lactate for

the treatment of bacterial keratitis. . European journal of pharmaceutical

sciences:official journal of the European Federation for Pharmaceutical

Sciences, 2014; 63, :204–15.

213. Bharti SK, & Kesavan, K. Phase-transition W/O Microemulsions for Ocular

Delivery: Evaluation of Antibacterial Activity in the Treatment of Bacterial

Keratitis. Ocular immunology and inflammation. 2017;25(4):463–74.

214. Haidar MK, & Eroglu, H. Nanofibers: New Insights for Drug Delivery and

Tissue Engineering Current topics in medicinal chemistry,2017;17(13):1564–

79.

215. Contreras-Cáceres R, Cabeza, L., Perazzoli, G., Díaz, A., López-Romero, J. M.,

Melguizo, C., & Prados, J. Electrospun Nanofibers: Recent Applications in Drug

Delivery and Cancer Therapy. Nanomaterials (Basel, Switzerland). 2019;9(4).

172

216. Singh CL, Singh, A., Kumar, S., Kumar, M., Sharma, P. K., & Majumdar, D. K.

Development and validation of different ultraviolet-spectrophotometric methods

for the estimation of besifloxacin in different simulated body fluids. Indian

journal of pharmaceutical sciences. 2015;77(4).

217. Arnold DR, Granvil, C. P., Ward, K. W., & Proksch, J. W.Quantitative

determination of besifloxacin, a novel fluoroquinolone antimicrobial agent, in

human tears by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of

chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences.

2008;867(1):105–10.

218. Costa MC, Barden, A. T., Andrade, J. M., Oppe, T. P., & Schapoval, E. E.

Quantitative evaluation of besifloxacin ophthalmic suspension by HPLC,

application to bioassay method and cytotoxicity studies. Talanta. 2014;119:367–

74.

219. Alzli CL, Caballero, A. R., Tang, A., Weeks, A. C., & O'Callaghan, R. J.

Penetration and effectiveness of prophylactic fluoroquinolones in experimental

methicillin-sensitive or methicillin-resistant Staphylococcus aureus anterior

chamber infections. . Journal of cataract and refractive

surgery.2010;36(12):2160–7.

220. Wang Z, Wang, S., Zhu, F., Chen, Z., Yu, L., & Zeng, S. Determination of

enantiomeric impurity in besifloxacin hydrochloride by chiral high-performance

liquid chromatography with precolumn derivatization. Chirality.

2012;24(7):526–31.

221. ICH Topic Q 2 (R1) Validation of Analytical Procedures: Text and

Methodology. 1995

222. Karczewski A FS, Hamer EI, et al. Clindamycin-modified Triple Antibiotic

Nanofibers: A Stain-free Antimicrobial Intracanal Drug Delivery System. J

Endod 2018;44(1) 155-62.

223. Topuz F, & Uyar, T. Electrospinning of cyclodextrin functional nanofibers for

drug delivery applications. Pharmaceutics, 2019;11(1).

224. Gao J HG, Liu G, et al. A biodegradable antibiotic-eluting PLGA nanofiber-

loaded deproteinized bone for treatment of infected rabbit bone defects. J

Biomater Appl. 2016; 31(2) 241-9.

225. Kenawy ER, Bowlin, G. L., Mansfield, K., Layman, J., Simpson, D. G., Sanders,

E. H., & Wnek, G. E. Release of tetracycline hydrochloride from electrospun

poly (ethylene-co-vinylacetate), poly (lactic acid), and a blend. Journal of

controlled release. 2002;81(1-2) :p.57-64.

226. Dandagi PM, Belekar, A. M., Mastiholimath, V. S., Gadad, A. P., Sontake, V.

W., & Salian, P. S. An Improvement of the Efficacy of Moxifloxacin HCl for

the Treatment of Bacterial Keratitis by the Formulation of Ocular Mucoadhesive

Microspheres. Scientia pharmaceutica. 2013;81(1):259–80.

173

227. I. ND. Ophthalmic delivery of sparfloxacin from in situ gel formulation for

treatment of experimentally induced bacterial keratitis. Drug testing and

analysis. 2011;3(2) 106–15.

228. Haghi A AMA. Trends in electrospinning of natural nanofibers. Phys Status

Solidi. 2007;204(6): :1830-4.

229. Mealy JE, Fedorchak MV, Little SR. In vitro characterization of a controlled-

release ocular insert for delivery of brimonidine tartrate. Acta Biomater.

2014;10(1):87-93.

230. Long Y, Li, Z., Bi, Q., Deng, C., Chen, Z., Bhattachayya, S., & Li, C. Novel

polymeric nanoparticles targeting the lipopolysaccharides of Pseudomonas

aeruginosa. International journal of pharmaceutics. 2016;502(1-2):232–41.

231. Zhu X, Su, M., Tang, S., Wang, L., Liang, X., Meng, F., Hong, Y., & Xu, Z.

Synthesis of thiolated chitosan and preparation nanoparticles with sodium

alginate for ocular drug delivery.Molecular vision. 2012; 18:1973–82.

232. Bogun M, Krucinska I, Kommisarczyk A, Mikolajczyk T, Blazewicz M,

Stodolak-Zych E, et al. Fibrous polymeric composites based on alginate fibres

and fibres made of poly-epsilon-caprolactone and dibutyryl chitin for use in

regenerative medicine. Molecules. 2013;18(3):3118-36.

233. B. N. Singh and K. H. Kim. Drug delivery: oral route. In: Swarbrick J, editor.

Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. 3rd edition ed. Informa

Healthcare, New York, NY, USA,2007.

234. Herrmann S, Winter, G., Mohl, S., Siepmann, F., & Siepmann, J. Mechanisms

controlling protein release from lipidic implants: effects of PEG addition. .

Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society,.

2007;118(2):161–8.

235. Zheng Y, Haworth IS, Zuo Z, Chow MS, Chow AH. Physicochemical and

structural characterization of quercetin-beta-cyclodextrin complexes. J Pharm

Sci. 2005;94(5):1079-89.

236. Carrier RL, Miller LA, Ahmed I. The utility of cyclodextrins for enhancing oral

bioavailability. J Control Release. 2007;123(2):78-99.

237. Ochiai A, Ohkuma M, Danjo K. Investigation of surfactants suitable for

stabilizing of latanoprost. Int J Pharm. 2012;436(1-2):732-7.

238. Li Z, An L, Fu P, Gao C, Zhang Z. Highly efficient chromium(VI) adsorption

with nanofibrous filter paper prepared through electrospinning

chitosan/polymethylmethacrylate composite. Carbohydr Polym. 2016;137:119-

26.

239. Yavuz B, Bilensoy E, Vural I, Sumnu M. Alternative oral exemestane

formulation: improved dissolution and permeation. Int J Pharm. 2010;398(1-

2):137-45.

174

240. Otero-Espinar F, Anguiano-Igea, S., Garcia-Gonzalez, N., Vila-Jato, J.,Blanco-

Mendez, J. Interaction of naproxen with β-cyclodextrin in solution and in the

solid state. International journal of pharmaceutics. 1992; 79 (1):149-57.

241. Al-Marzouqi AH, Elwy HM, Shehadi I, Adem A. Physicochemical properties of

antifungal drug-cyclodextrin complexes prepared by supercritical carbon

dioxide and by conventional techniques. J Pharm Biomed Anal. 2009;49(2):227-

33.

242. Yap KL, Liu X, Thenmozhiyal JC, Ho PC. Characterization of the 13-cis-

retinoic acid/cyclodextrin inclusion complexes by phase solubility,

photostability, physicochemical and computational analysis. Eur J Pharm Sci.

2005;25(1):49-56.

243. Naidu NB, Chowdary KP, Murthy KV, Satyanarayana V, Hayman AR, Becket

G. Physicochemical characterization and dissolution properties of meloxicam-

cyclodextrin binary systems. J Pharm Biomed Anal. 2004;35(1):75-86.

244. Li N, Wang N, Wu T, Qiu C, Wang X, Jiang S, et al. Preparation of curcumin-

hydroxypropyl-beta-cyclodextrin inclusion complex by cosolvency-

lyophilization procedure to enhance oral bioavailability of the drug. Drug Dev

Ind Pharm. 2018;44(12):1966-74.

245. Nezarati RM, Eifert MB, Cosgriff-Hernandez E. Effects of humidity and

solution viscosity on electrospun fiber morphology. Tissue Eng Part C Methods.

2013;19(10):810-9.

246. Gencturk A, Kahraman E, Gungor S, Ozhan G, Ozsoy Y, Sarac AS.

Polyurethane/hydroxypropyl cellulose electrospun nanofiber mats as potential

transdermal drug delivery system: characterization studies and in vitro assays.

Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2017;45(3):655-64.

247. Akduman C, Ozguney I, Kumbasar EPA. Preparation and characterization of

naproxen-loaded electrospun thermoplastic polyurethane nanofibers as a drug

delivery system. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016;64:383-90.

248. Fong H RD. Elastomeric nanofibers of styrene–butadiene–styrene tri-block

copolymers. J Polym Sci B Polym Phys 1999;37:3488–93.

249. Bui HT, Chung, O. H., Cruz, J. D., & Park, J. S. Fabrication and characterization

of electrospun curcumin-loaded polycaprolactone-polyethylene glycol

nanofibers for enhanced wound healing. Macromolecular Research. 2014;22

(12):1288-96.

250. Zeng J, Xu X, Chen X, Liang Q, Bian X, Yang L, et al. Biodegradable

electrospun fibers for drug delivery. J Control Release. 2003;92(3):227-31.

251. Zhong Z, Qin J, Ma J. Cellulose acetate/hydroxyapatite/chitosan coatings for

improved corrosion resistance and bioactivity. Mater Sci Eng C Mater Biol

Appl. 2015;49:251-5.

252. Laokaunjit N, Noomhorm, A. . Effect of Plasticizers on Mechanical and Barrier

Properties of Rice Starch Film. Starch. 2004;56( 348 356).

175

253. Gürsoy AZ. Oküler Sistemler, Kontrollü Salım Sistemleri. A. Z. Gürsoy, editor.

İstanbul,2002. p.197-215.

254. Solmaz İ A. Levator Kas Fonksiyonu Zayıf Gözlerde Silikon Çubuklar ile

Frontale Askı Cerrahisi. Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Uzmanlık

Tezi, İstanbul 2009.

255. Stein S, Auel T, Kempin W, Bogdahn M, Weitschies W, Seidlitz A. Influence

of the test method on in vitro drug release from intravitreal model implants

containing dexamethasone or fluorescein sodium in poly (d,l-lactide-co-

glycolide) or polycaprolactone. Eur J Pharm Biopharm. 2018;127:270-8.

256. Grimaudo MA, Nicoli S, Santi P, Concheiro A, Alvarez-Lorenzo C.

Cyclosporine-loaded cross-linked inserts of sodium hyaluronan and

hydroxypropyl-beta-cyclodextrin for ocular administration. Carbohydr Polym.

2018;201:308-16.

257. Camey L, Hill, R. Human tear buffering capacity. Arch Ophthalmol. 1979; 97:

951-2.

258. Butty P. Determination in situ du pH et du pouvoir tampon de la surface

comtenne de la souris par epi-microscopic de fluorescence. These UniversitC de

Geneve. 1995:1-212.

259. ersani D, Mougin, J., Lopez, M., Degoutin, S., Tabary, N., Cazaux, F., Janus, L.,

Maton, M., Chai, F., Sobocinski, J., Blanchemain, N., & Martel, B. . Stent

coating by electrospinning with chitosan/poly-cyclodextrin based nanofibers

loaded with simvastatin for restenosis prevention. . European journal of

pharmaceutics and biopharmaceutics: official journal of Arbeitsgemeinschaft fur

Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 2020;150, :156–67.

260. Matter B GA, Bourne D, Wang Y, Choi S, Kompella UB. Dexamethasone

Degradation in Aqueous Medium and Implications for Correction of In Vitro

Release from Sustained Release Delivery Systems. AAPS PharmSciTech

2019;20(8) 320.

261. Solano A, de Fátima Pereira, A., de Faria, L., Fialho, S. L., de Oliveira Patricio,

P. S., da Silva-Cunha, A., Fulgêncio, G. O., da Silva, G. R., & Pianetti, G. A.

Etoposide-Loaded Poly(Lactic-co-Glycolic Acid) Intravitreal Implants: In Vitro

and In Vivo Evaluation. AAPS PharmSciTech. 2018;19(4):1652–61.

262. Wen P, Wen, Y., Zong, M. H., Linhardt, R. J., & Wu, H. Encapsulation of

Bioactive Compound in Electrospun Fibers and Its Potential Application.

Journal of agricultural and food chemistry. 2017;65(42):9161–79.

263. Ashammakhi N, Wimpenny, I., Nikkola, L., & Yang, Y. Electrospinning:

methods and development of biodegradable nanofibres for drug release. Journal

of biomedical nanotechnology, 2009;5(1):1–19.

264. Alhusein N, Blagbrough IS, De Bank PA. Electrospun matrices for localised

controlled drug delivery: release of tetracycline hydrochloride from layers of

polycaprolactone and poly(ethylene-co-vinyl acetate). Drug Deliv Transl Res.

2012;2(6):477-88.

176

265. Zhang L, Zhang, Q., Wang, X., Zhang, W., Lin, C., Chen, F., Yang, X., & Pan,

W. Drug-in-cyclodextrin-in-liposomes: A novel drug delivery system for

flurbiprofen. International journal of pharmaceutics. 2015; 492(1-2) 40–5.

266. Nittayacharn P, & Nasongkla, N. Development of self-forming doxorubicin-

loaded polymeric depots as an injectable drug delivery system for liver cancer

chemotherapy. Journal of materials science Materials in medicine. 2017;

28(7):101.

267. Aksungur P, Demirbilek M, Denkbas EB, Unlu N. Comparative evaluation of

cyclosporine A/HPbetaCD-incorporated PLGA nanoparticles for development

of effective ocular preparations. J Microencapsul. 2012;29(6):605-13.

268. Goonoo N, Bhaw-Luximon A, Jhurry D. Drug loading and release from

electrospun biodegradable nanofibers. J Biomed Nanotechnol. 2014;10(9):2173-

99.

269. Chou SF, Carson D, Woodrow KA. Current strategies for sustaining drug release

from electrospun nanofibers. J Control Release. 2015;220(Pt B):584-91.

270. Chou S-F, Woodrow, K.A. Relationships between mechanical properties and

drug release from electrospun fibers of PCL and PLGA blends. J Mech Behav

Biomed Mater 2017;65

271. Hrib J, Sirc J, Hobzova R, Hampejsova Z, Bosakova Z, Munzarova M, et al.

Nanofibers for drug delivery - incorporation and release of model molecules,

influence of molecular weight and polymer structure. Beilstein J Nanotechnol.

2015;6:1939-45.

272. Natu MV, de Sousa HC, Gil MH. Effects of drug solubility, state and loading on

controlled release in bicomponent electrospun fibers. Int J Pharm. 2010;397(1-

2):50-8.

273. lose D, Delplace, C., & Siepmann, J. Unintended potential impact of perfect sink

conditions on PLGA degradation in microparticles. . International journal of

pharmaceutics, . 2011;404(1-2): 75–82.

274. Karatas A, Algan AH, Pekel-Bayramgil N, Turhan F, Altanlar N. Ofloxacin

Loaded Electrospun Fibers for Ocular Drug Delivery: Effect of Formulation

Variables on Fiber Morphology and Drug Release. Curr Drug Deliv.

2016;13(3):433-43.

275. Siafaka PI, Ustundag Okur N, Mone M, Giannakopoulou S, Er S, Pavlidou E, et

al. Two Different Approaches for Oral Administration of Voriconazole Loaded

Formulations: Electrospun Fibers versus beta-Cyclodextrin Complexes. Int J

Mol Sci. 2016;17(3):282.

276. Aytac ZS, H.S. Durgun, E. Uyar, T. Sulfisoxazole/cyclodextrin inclusion

complex incorporated in electrospun hydroxypropyl cellulose nanofibers as drug

delivery system. Colloids Surf B Biointerfaces. 2015;128, :331–8.

177

277. R. Bansil and B. S. Turner. Mucin structure, aggregation, physiological

functions and biomedical applications. Current Opinionin Colloid and Interface

Science. 2006;11(2-3):164– 70.

278. Scuderi AC, Paladino GM, Marino C, Trombetta F. In vitro toxicity of netilmicin

and ofloxacin on corneal epithelial cells. Cornea. 2003;22(5):468-72.

279. Ayaki M, Iwasawa A, Soda M, Yaguchi S, Koide R. Cytotoxicity of five

fluoroquinolone and two nonsteroidal anti-inflammatory benzalkonium

chloride-free ophthalmic solutions in four corneoconjunctival cell lines. Clin

Ophthalmol. 2010;4:1019-24.

280. Da Silva GR, Lima, T. H., Oréfice, R. L., Fernandes-Cunha, G. M., Silva-Cunha,

A., Zhao, M., & Behar-Cohen, F. In vitro and in vivo ocular biocompatibility of

electrospun poly (ɛ-caprolactone) nanofibers. European Journal of

Pharmaceutical Sciences. 2015;73: 9-19.

281. Shinabarger DL, Zurenko GE, Hesje CK, Sanfilippo CM, Morris TW, Haas W.

Evaluation of the effect of bacterial efflux pumps on the antibacterial activity of

the novel fluoroquinolone besifloxacin. J Chemother. 2011;23(2):80-6.

282. Subedi D, Vijay AK, Willcox M. Overview of mechanisms of antibiotic

resistance in Pseudomonas aeruginosa: an ocular perspective. Clin Exp Optom.

2018;101(2):162-71.

283. Adi H, Young PM, Chan HK, Agus H, Traini D. Co-spray-dried mannitol-

ciprofloxacin dry powder inhaler formulation for cystic fibrosis and chronic

obstructive pulmonary disease. Eur J Pharm Sci. 2010;40(3):239-47.

284. Balzus B, Sahle FF, Honzke S, Gerecke C, Schumacher F, Hedtrich S, et al.

Formulation and ex vivo evaluation of polymeric nanoparticles for controlled

delivery of corticosteroids to the skin and the corneal epithelium. Eur J Pharm

Biopharm. 2017;115:122-30.

285. Khalil IA, Ali IH, El-Sherbiny IM. Noninvasive biodegradable nanoparticles-in-

nanofibers single-dose ocular insert: in vitro, ex vivo and in vivo evaluation.

Nanomedicine (Lond). 2019;14(1):33-55.

286. Shelley H, Rodriguez-Galarza RM, Duran SH, Abarca EM, Babu RJ. In Situ Gel

Formulation for Enhanced Ocular Delivery of Nepafenac. J Pharm Sci.

2018;107(12):3089-97.

287. Abdelkader H, Fathalla, Z., Moharram, H., Ali, T., & Pierscionek, B. .

Cyclodextrin Enhances Corneal Tolerability and Reduces Ocular Toxicity

Caused by Diclofenac. Oxidative medicine and cellular longevity. 2018; 2018,

5260976.

288. Franca JR, Foureaux G, Fuscaldi LL, Ribeiro TG, Castilho RO, Yoshida MI, et

al. Chitosan/hydroxyethyl cellulose inserts for sustained-release of dorzolamide

for glaucoma treatment: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm.

2019;570:118662.