Contenido

Generalidades 7-2Procedimientos 7-3 A. Recolección y transporte de las muestras 7-3 B. Preparación del medio de cultivo PDA 7-5 C. Aislamientos de R. solani 7-6 1. En el medio de cultivo PDA 7-6 2. Aislamiento monomicelial 7-9 D. Incremento del inóculo 7-10 1. Suelo + papa 7-10 2. Suelo + harina de frijol 7-12 E. Inoculación de plantas en el invernadero 7-14 1. Con inóculo incrementado a partir de suelo + papa 7-14 2. Con inóculo incrementado a partir de suelo + harina de frijol 7-15 F. Conservación de R. solani para almacenamiento 7-16 1. Conservación en papel filtro a –20 °C 7-16 2. Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a –20 °C 7-19 G. Prueba de almacenamiento 7-21 H. Recuperación del hongo almacenado 7-22 1. Conservado en papel filtro a –20 °C 7-22 2. Conservado a –20 °C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa 7-23

Rhizoctonia solani

Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia

Guía Práctica 7

Guillermo Castellanos, Experto en Investigación–2Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación

Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto

Fitopatología de Frijol

Manejo del hongo en el laboratorio

Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol

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Generalidades

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La pudrición radical causada por Rhizoctonia solani Kuhn es una de las pudriciones radicales más comunes del frijol. La enfermedad, como indica su nombre, ataca principalmente las raíces del frijol y se desarrolla cuando la temperatura del ambiente va de moderada a baja y la humedad del suelo de moderada a alta. Se ha reportado que la temperatura ideal para el desarrollo de la enfermedad es de 18 °C.

Los síntomas, conocidos como chancros, son lesiones cóncavas de color pardo rojizo que aparecen en el tallo (Foto 1) y en la raíz principal. El patógeno puede causar, finalmente, el ‘volcamiento’ de la planta (Foto 2), una manifestación del síndrome conocido como ‘damping off’. Las plantas susceptibles sufren graves daños en las 2 primeras semanas después de la siembra. Los suelos muy húmedos favorecen el desarrollo del hongo.

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Procedimientos

A. Recolección y transporte de las muestras

El hongo Rhizoctonia solani se aísla del tejido vegetal enfermo que presente síntomas típicos de la enfermedad. Con la ayuda de una espátula o paleta delgada se extrae del suelo la raíz, tan completa como sea posible, de una planta afectada por el patógeno. El suelo adherido a la raíz se lava con agua y la planta se coloca sobre una toalla de papel hasta que la raíz esté seca.

Materiales

– Toallas de papel – Bolsas de papel – Rótulos para identificar el material

• Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol infectado (de raíces o de tallos) que se colecta se envuelve en una toalla de papel que sirve, además, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares como servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en último caso, papel periódico.

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• Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algún papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plásticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulación de humedad en su interior; esta humedad favorece el crecimiento de microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán el aislamiento del patógeno que se hace a partir del tejido de frijol.

• Rótulos para marcar las muestras. Es muy importante identificar claramente la muestra con la siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol, tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma la muestra (localidad, provincia, departamento, país), fecha de recolección de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en cada muestra.

Recomendaciones

– Indicar en el rótulo si la recolección se hizo en el campo de un agricultor o en una estación experimental.

– Cuando no haya suficientes rótulos para todas las muestras, marcar las bolsas con un código y registrar la información completa en una libreta de campo.

– No recolectar material vegetal húmedo; si está en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas de papel al aire libre para que termine de secarse.

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Pasos del proceso

• Paso 1Tomar muestras de una raíz que presente los síntomas de la enfermedad.

• Paso 2Envolver cada muestra en una toalla de papel, colocarla en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el rótulo que corresponda.

• Paso 3Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento del hongo patógeno. Nunca envíe las muestras dentro de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio.

B. Preparación del medio de cultivo PDA

Las siglas PDA corresponden a los componentes del medio: papa, dextrosa y agar. Este medio se usa para aislar el patógeno.

Materiales

– PDA deshidratado 39 g/litro – Agua destilada 1 litro – Frascos erlenmeyer de 1000 ml 2

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Preparación

– Se pesan los ingredientes (Foto 3), se colocan en un recipiente grande, que puede ser un vaso de precipitado, y se les agrega el agua; esta solución se envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada uno).

– Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA se esterilizan en el autoclave. Esta máquina, con una presión de 20 libras y una temperatura de 121 °C, realiza el proceso total de esterilización en 40 minutos.

– El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda manipularse (Foto 4) y se vierte luego en cajas petri, a razón de 25 ml por caja (Foto 5).

C. Aislamientos de R. solani

1. En el medio de cultivo PDA

El protocolo de aislamiento de R. solani es sencillo, ya que 2 días después de hacer la ‘siembra’ de la muestra del patógeno en el medio de cultivo PDA, se observa un crecimiento rápido del hongo; después de varios días, el aislamiento adquiere un color café que cubre totalmente el medio de cultivo en la caja petri.

Materiales

– Cámara de flujo laminar – Tijeras – Cajas petri de 100 y 60 mm – Agua destilada estéril

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– Hipoclorito de sodio al 2% – Toallas de papel – Mechero – Marcador – Incubadora – Pinzas – Medio PDA – Muestra (tejido con síntomas)

Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cámara de flujo laminar; además, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas (BPM).

Pasos del proceso

• Paso 1Cortar varios trozos del tejido infectado de la muestra utilizando una tijera estéril (Foto 6).

• Paso 2Desinfectar los trozos de muestra en una caja petri de 60 mm que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2.5%, durante 3 minutos (Foto 7).

• Paso 3Lavar tres veces con agua destilada estéril los trozos desinfectados.

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• Paso 4Colocar los trozos lavados sobre toallas de papel estériles durante 10 minutos para que se sequen (Foto 8).

• Paso 5Cuando las muestras estén secas, tomar los pedazos de tejido con una pinza estéril y ‘sembrarlos’ en una caja petri que contenga el medio de cultivo PDA; colocar tres pedazos por caja. Repetir el procedimiento para todas las muestras (Foto 9). Incubar las cajas a 24 °C durante 10 días, tiempo en que el hongo producirá micelio y esclerocios. Estos últimos se observan como puntos de color café (Foto 10). Diez días más tarde, el aislamiento estará listo y podrá purificarse mediante un aislamiento monomicelial.

Nota: El cultivo del hongo es blanquecino en sus primeras etapas de crecimiento.

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2. Aislamiento monomicelial

El objetivo de este procedimiento es obtener una cepa del hongo genéticamente pura. Si el hongo se aísla de un tejido vegetal que presenta síntomas, éstos pueden ser producidos por varias cepas de un mismo hongo. Por eso es necesario purificar el hongo obtenido en el primer paso del aislamiento. Si el hongo no produce esporas en el medio de cultivo, se utilizan puntas de hifas. El procedimiento comprende los pasos siguientes:

• Paso 1Tomar un cuadrado de aproximadamente 0.5 cm (de lado) del medio de cultivo PDA donde se observe que el hongo crece (ver C., 1. En el medio…, Paso 5). Transferir el cuadrado al centro de una caja petri que tenga medio de cultivo PDA fresco. Incubar a 24 °C durante 24 horas.

• Paso 2Observar al día siguiente, bajo el estereoscopio y en la cámara de flujo laminar, el micelio del hongo en crecimiento, y enfocar los bordes de la colonia para identificar las puntas de las hifas en crecimiento.

• Paso 3Con un alfiler flameado, cortar un pedacito de agar que contenga la punta de una sola hifa, ejecutando las siguientes operaciones:

– Tener la precaución de no tocar otras hifas alrededor de la que se está aislando.

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– Transferir el pedacito de agar con la hifa a una nueva caja petri que contenga medio de cultivo PDA fresco; colocar solo una hifa en cada caja.

– Incubar esa caja con la punta de hifa a 24 °C durante 10 días. Pasado este tiempo de incubación se obtendrá un cultivo similar al del Paso 5, excepto que es genéticamente puro. A partir de aquí se harán los incrementos del hongo con el fin de producir inóculo suficiente para las pruebas que se harán en el invernadero o en el campo.

D. Incremento del inóculo

El incremento de Rhizoctonia para realizar inoculaciones en invernadero puede hacerse de dos formas: una es con mezcla de suelo + papa, y la otra es suelo + harina de frijol.

1. Suelo + papa

Materiales

– Suelo estéril – Arena – Papa (200 g) – Frasco erlenmeyer de 1000 ml – Aislamiento monomicelial de R. solani

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Pasos del proceso

• Paso 1Mezclar en una bandeja cuatro partes de suelo por una de arena.

• Paso 2Picar la papa en pequeños trozos (Foto 11) y combinarla con la mezcla del paso anterior en la siguiente relación: 100 g de papa picada x 1600 g de mezcla de suelo-arena (Foto 12).

• Paso 3Introducir esta nueva mezcla en el frasco erlenmeyer de 1000 ml hasta completar 400 ml (Foto 13). Esterilizar dos veces la mezcla en un autoclave (ver B. Preparación del...).

• Paso 4Tomar una caja petri donde el hongo R. solani haya sido incrementado como cultivo monomicelial (Paso 5 anterior) y extraer, con un sacabocado de 1 cm de diámetro, 10 discos del medio en que esté el hongo incrementado. Todo el procedimiento debe hacerse bajo condiciones asépticas de laboratorio.

• Paso 5

Agregar 10 discos del paso anterior (medio de cultivo con hongo) al frasco erlenmeyer del Paso 3 (Foto 14). Agitar manualmente hasta que los discos se distribuyan por toda la mezcla de suelo y papa picada. Foto 14

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Foto 14

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Foto 15

• Paso 6Incubar el frasco erlenmeyer del paso anterior a 24 °C durante 12 días. Pasado este tiempo, el hongo habrá colonizado la mezcla de suelo y papa, y el inóculo estará listo para los ensayos que se harán en el invernadero.

2. Suelo + harina de frijol

Materiales

– Suelo estéril 1 kg – Harina de frijol 10 g – Agua destilada 50 ml – Aislamiento monomicelial de R. solani 2 cajas – Sacabocado de 1 cm de diámetro – Papel aluminio – Papel kraft

Pasos del proceso

• Paso 1En un recipiente que pueda ser autoclavado depositar 1 kg de suelo y adicionarle 10 g de frijol (Foto 15), homogenizar la mezcla y distribuirla de tal manera que la profundidad no sea superior a 3 cm.

Foto 15

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Foto 16

• Paso 2Adicionar a esta mezcla 50 ml de agua destilada para darle cierta humedad al suelo.

• Paso 3Cubrir el recipiente con papel aluminio y encima con papel kraft, y llevar al autoclave (Fotos 16 y 17).

• Paso 4Una vez retirado el suelo del autoclave dejarlo enfriar, destapar el recipiente y colocar los 25 discos de 1 cm de diámetro del aislamiento monomicelial (Foto 18) por kilogramo de suelo a incrementar (Foto 19).

• Paso 5Tapar nuevamente con el mismo papel con que fue llevado al autoclave y dejarlo a temperatura ambiente (22 °C) durante 15 días, tiempo en el cual los discos habrán producido micelio y colonizado el suelo (Foto 20).

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Foto 18

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Foto 20

Foto 16 Foto 17Foto 17Foto 17

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Foto 21

E. Inoculación de plantas en el invernadero

1. Con inóculo incrementado a partir de suelo + papa

Pasos del proceso

• Paso 1Agregar el inóculo producido en el incremento suelo + papa, en una relación de 2%, al suelo que será utilizado para la inoculación (Fotos 21 y 22).

• Paso 2Colocar el suelo y el inóculo en una bolsa plástica para mezclarlos, y agitar la bolsa varias veces para que la mezcla de ambos sea lo más homogénea posible (Foto 23).

• Paso 3Llenar una bandeja (o unos potes) con suelo normal y abrir en él surcos para siembra. Colocar luego en los surcos las semillas de los genotipos de frijol que se inocularán (Foto 24) y cubrirlas con 100 g de la mezcla de suelo más inóculo obtenida en el Paso 2 (Foto 25). Regar luego la bandeja con agua corriente.

Foto 22

Foto 25

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Foto 23

Foto 21 Foto 22

Foto 23

Foto 24

Foto 25

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Foto 26

• Paso 4Evaluar los genotipos sembrados a los 14 días después de la inoculación, según la escala estándar del CIAT, cuyas categorías van del 1 al 9 y se distribuyen así: de 1 a 3: planta resistente de 4 a 6: planta de reacción intermedia de 7 a 9: planta susceptible

Evaluar, adicionalmente, la incidencia de la enfermedad en cada genotipo. Para hacerlo, observar la relación proporcional de las plantas afectadas (cualquier grado de severidad) respecto al total de semillas sembradas. Asegurarse de que no entren en esa relación las semillas que no germinaron por causas diferentes al patógeno inoculado.

2. Con inóculo incrementado a partir de suelo + harina de frijol

Pasos del proceso

• Paso 1Agregar el inóculo producido en el incremento suelo + harina de frijol, en una relación de 2%, al suelo que será utilizado para la inoculación. Si se prepara el inóculo en 1 kg de suelo + harina de frijol, mezclar éste con 50 kg de suelo a utilizar en la siembra (Foto 26).

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Foto 27

• Paso 2Utilizar la mezcladora (Foto 27) cuando los volúmenes a mezclar sean grandes.

• Paso 3Llenar potes de 2 kg de la mezcla anterior y realizar la siembra (Foto 28). La mezcla de 1 kg de suelo + harina con inóculo alcanza para 25 potes de 2 kg.

• Paso 4Evaluar los genotipos sembrados a los 14 días después de la inoculación (Foto 29), empleando la escala estándar del CIAT (ver E., 1. Con inóculo..., Paso 4).

F. Conservación de R. solani para almacenamiento

Pasos del proceso

Para almacenar el hongo R. solani se emplean dos métodos: la conservación en papel filtro y la conservación en suspensión de sucrosa y peptona.

1. Conservación en papel filtro a –20 oC

Este método permite conservar microorganismos durante períodos largos de tiempo.

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Materiales

– Papel filtro estéril, cortado en trozos pequeños (≈ 50) de 1 cm2

– Pinzas – Cajas petri estériles – Agua destilada estéril – Pipeta – Sobres de papel mantequilla

Pasos del proceso

• Paso 1Cortar cuadritos (60-80) de papel filtro de 1 cm2, colocarlos dentro de una caja petri o de un contenedor cerrado y esterilizarlos en autoclave.

• Paso 2

Colocar 10 cuadritos de papel filtro esterilizado sobre el medio de cultivo PDA en cada caja petri.

• Paso 3Preparar una suspensión de micelio de un aislamiento del hongo, de la siguiente manera:

– Agregar agua destilada estéril a la caja petri que contiene el hongo incrementado sobre el medio de cultivo PDA.

– Raspar luego la superficie de ese aislamiento con la punta de la pipeta para formar una suspensión.

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Tomar un poco de esa suspensión con la pipeta y colocar una gota en cada cuadrito de papel filtro esterilizado (en las cajas petri del Paso 2).

• Paso 4Incubar las cajas a 24 °C durante 12 días.

• Paso 5Pasados los 12 días de incubación, retirar los cuadritos de papel filtro del medio de cultivo junto con el hongo que creció en ellos, usando una pinza estéril; cumpliendo con todas las condiciones de asepsia, depositarlos en una caja petri estéril vacía. Colocarlos invertidos (la cara en que está el hongo hacia abajo) para que no se enrollen al secarse. Secar los cuadritos de papel filtro durante 7 días a 24 °C.

• Paso 6Pasar los cuadritos secos (con una pinza estéril) a bolsitas de papel mantequilla estéril, las cuales se introducen, a su vez, en otra bolsa más grande del mismo material. Colocar en las bolsitas toda la información referente al hongo, como la fecha de almacenamiento, el nombre de la cepa, etc. El hongo R. solani se debe almacenar a –20 °C.

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2. Conservación como suspensión ensolución de peptona-sucrosa, en papelfiltro a –20 oC

La conservación de un patógeno suspendido en solución de peptona-sucrosa que se deposita luego en papel filtro, es uno de los métodos más efectivos para almacenarlo.

Materiales

– Peptona al 10% – Sucrosa al 20% – Cajas petri con el hongo de 10 días de crecimiento – Espátula y papel filtro cortado en cuadros de

0.5 cm2

– Cajas petri vacías

Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa

Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml de agua destilada. Se prepara de igual modo una solución de sucrosa al 20%, disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de agua destilada. Las dos soluciones, que se preparan por separado, se llevan al autoclave. Una vez esterilizadas, se mezclan partes iguales de cada una en un recipiente estéril para hacer una solución homogénea de peptona-sucrosa.

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Pasos del proceso

• Paso 1Tomar una caja petri que contenga el hongo purificado e incrementado (ver C., 2. Aislamiento monomicelial) y agregar 2 ml de la solución de peptona-sucrosa (Foto 30).

• Paso 2Raspar con una espátula estéril la caja petri (Foto 31) para desprender el micelio o los esclerocios del hongo (o ambas estructuras). Dejar la suspensión en la misma caja petri.

• Paso 3 Tomar los cuadritos de papel filtro estériles con una pinza (ver F., 1. Conservación en…), colocarlos en la suspensión del hongo y asegurarse de que queden bien impregnados (Fotos 32).

• Paso 4

Retirar los cuadritos de papel filtro de la caja petri y colocarlos en una caja petri estéril con papel filtro en el fondo para que se sequen durante 7 días a 24 °C (Foto 33).

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• Paso 5Transcurrido ese tiempo, guardar los cuadritos en sobres estériles de papel mantequilla (Foto 34) para almacenarlos a –20 °C. Colocar luego en ellos la información referente al hongo, o sea, la fecha de almacenamiento, el nombre de la cepa, etc. (Foto 35).

G. Prueba de almacenamiento

Esta prueba es la forma clara, práctica y confiable de garantizar que el hongo secado por 7 días está libre de contaminantes y que puede ser almacenado.

Pasos del proceso

• Paso 1Tomar uno de los cuadritos de papel filtro que había sido impregnado con la suspensión de R. solani y que fue secado por 7 días a 24 °C (ver Paso 4 anterior).

• Paso 2Sembrar el cuadrito en un nuevo medio de cultivo PDA. Después de 5 días, el patógeno almacenado debe haber crecido en este medio de cultivo.

Foto 34

Foto 35

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• Paso 3Observar el crecimiento del hongo en el estereoscopio. Si presenta agentes contaminantes, como otros hongos o bacterias, tanto la muestra observada como los demás cuadritos de papel filtro deberán desecharse, y se repetirá entonces el proceso de conservación.

H. Recuperación del hongo almacenado

1. Conservado en papel filtro a –20 oC

Pasos del proceso

• Paso 1Trasladar, con una pinza estéril, uno de los cuadritos de papel filtro que portan el hongo —que habían sido almacenados en bolsitas (ver F., 1. Conservación en…, Paso 6)— a una caja petri (Foto 36) que contenga el medio de cultivo PDA. Incubar a 24 ºC.

• Paso 2Pasados 3 días después de la incubación, el hongo reiniciará su crecimiento y a los 8 días estará listo para ser incrementado.

Foto 36

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2. Conservado a –20 oC en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa

Pasos del proceso

• Paso 1Sacar de los sobres de papel mantequilla 1 o 2 cuadraditos de papel filtro que llevan el hongo y que fueron almacenados a –20 °C (ver F., 2. Conservación como…, Paso 5) y sembrarlos en una caja petri que contenga el medio de cultivo PDA (Foto 37). Repetir la misma operación con los diferentes aislamientos.

• Paso 2Incubar las cajas a 24 °C durante 12 días. Después de 3 o 4 días se observará que una colonia del hongo cubre el medio en la caja. Después de 12 días, el hongo estará listo para nuevos ensayos o pruebas.

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