GRUPO 3. MADRID 2014

GRUPO 3. MADRID 2014.

Universidad Complutense de Madrid Facultad de Odontología

INVESTIGACIÓN+DE+LOS+FACTORES+ETIOLÓGICOS:+ESTUDIO+MICROBIOLÓGICO+DEL+BIOFILM+SUBGINGIVAL!

González!Rodríguez!S,!Gulín!Arias!EJ,!Mar8nez!Villa!S,!Sale:a!JM,!Sicilia!Blanco!P,!Pianeta!Alviz!RR.!

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Dr. David Herrera

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ÍNDICE!

1. INTRODUCCIÓN! $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$!3!!

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2. MATERIAL'Y!MÉTODO! $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$!!15!

• Pregunta)PICO)---------------------------------------------------------------------)15)

• Criterios)de)Inclusión) ------------------------------------------------------------15)

• Criterios)de)Exclusión)-----------------------------------------------------------))17)

• Estrategia)de)búsqueda) ---------------------------------------------------17)

• Tabla)resultados) ------------------------------------------------------------)20)

3. RESULTADOS! $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$25!

• Selección) de) la) estrategia) de) toma) de) muestras) para) analizar) la) flora)

subgingival) --------------------------------------------------------------------))25)

• Selección) de) las) técnicas) para) evaluar) las) variables) microbiológicas) en)

periodoncia) ---------------------------------------------------------------------)27)

• Selección) de) las) variables) adecuadas) para) evaluar) la) microflora)

subgingival) --------------------------------------------------------------------))28)

4. DISCUSIÓN!$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$33!

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5. CONCLUSIÓN! $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$36!

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6 . BIBLIOGRAFÍA! $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$37

[INVESTIGACIÓN!DE!LOS!FACTORES!ETIOLÓGICOS:!ESTUDIO!MICROBIOLÓGICO!DEL!BIOFILM!SUBGINGIVAL]!

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3!

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1.! INTRODUCCIÓN!

Las) enfermedades) periodontales) son) infecciones) multifactoriales) provocadas)

por)un)complejo)de)especies)bacterianas)que)interactúan)con)los)tejidos)y) las)células)

del) anfitrión) causando) la) liberación)de)un)amplio) surtido)de) citocinas,)quimiocinas) y)

mediadores) inflamatorios;) la) acción) de) algunos) de) estos) elementos) conduce) a) la)

destrucción) de) las) estructuras) periodontales:) tejidos) de) soporte) dentario,) hueso)

alveolar)y)ligamento)periodontal.1)

Sin) embargo,) la) mera) presencia) de) potenciales) periodontopatógenos) en) el)

surco)gingival)no)es)suficiente,)per)se,)para)causar)inflamación)periodontal.)Lo)esencial)

para) que) se) produzca) una) respuesta) efectiva) de) destrucción) de) los) tejidos) es) el)

aumento)de)sus)proporciones)relativas,)de)forma)que)haya)una)masa)crítica)presente)

en) la) boca.) Sin) duda,) incluso) en) estado) de) salud,) hay) microorganismos)

periodontopatógenos)presentes)en)el)surco)gingival,)aunque)en)escaso)número,)como)

miembros)de)la)flora)normal)residente.))

Como)la)mayoría)de)las)enfermedades)periodontales)son)infecciones)mixtas,)se)

efectúan) pruebas) microbiológicas) para) una) batería) de) posibles) patógenos.) Se) han)

desarrollado) pruebas) microbiológicas) para) identificar) microorganismos)

periodontopatógenos) seleccionados) en) el) surco) o) bolsa) gingival.) Estas) pruebas) dan)

información) que) puede) guiar) al) clínico) en) la) determinación) de) si) es) necesario) un)

agente) antimicrobiano,) y) cuál) debe) ser) éste,) para) obtener) un) mayor) beneficio)

[INVESTIGACIÓN!DE!LOS!FACTORES!ETIOLÓGICOS:!ESTUDIO!MICROBIOLÓGICO!DEL!BIOFILM!SUBGINGIVAL])

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4!

terapéutico)para)el)paciente,)entre)otras)utilidades.2)

Sin) embargo,) se) ha) proporcionado) ) muy) poca) información) exacta) sobre) la)

forma) ) de) maduración) ) en) el) tiempo) de) la) placa) subgingival) y) de) la) ) secuencia) de)

eventos)que)se)produce)en)el)desarrollo)de)un)biofilm)de)estado)estacionario,)por) lo)

que) investigadores,) han) desarrollado) un) modelo) bacteriano) capaz) de) reproducir) el)

comportamiento)bacteriano)in)vitro)para)el)estudio)de)su)comportamiento.3)

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MÉTODOS'MICROBIOLÓGICOS$DE $MUESTREO: !

La) información) proporcionada) por) el) análisis) microbiológico) de) la) placa)

recogida) en) sitios) con) enfermedad) periodontal) depende) mucho) de) la) técnica) de)

muestreo.)La)placa)subgingival)puede)recogerse)según)dos)métodos)principales)para)su)

análisis) siguiente:) recogida)mediante) curetas) o) adsorción) con) puntas) de) papel) para)

endodoncia.) Ambos) requieren) una) eliminación) anterior) cuidadosa) de) la) placa)

supragingival) en) el) sitio) de) muestreo,) para) no) contaminar) o) diluir) la) muestra)

subgingival.)

LABORATORIO!PARA!SU!ANÁLISIS.!

La) información) procedente) de) las)muestras) obtenidas)mediante) cureta) suele)

diferir) de) la) obtenida) de) las)muestras) en) puntas) de) papel,) porque) la) cureta) recoge)

placa)de)toda)la)bolsa,)mientras)que)la)placa)adsorbida)en)las)puntas)de)papel)procede)

principalmente) de) las) capas) más) externas) del) biofilm,) que) pueden) contener) más)

microflora) patógena.) Por) lo) tanto,) las) muestras) de) las) puntas) de) papel) contienen)

mayores) proporciones) de) patógenos) potenciales) que) las) muestras) obtenidas) con)


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5!

cureta.)Además,)dependiendo)de) la)anatomía)de) la)bolsa)periodontal,) algunas) zonas)

pueden) albergar) un) mayor) número) de) patógenos,) pero) pueden) no) ser) fácilmente)

accesibles) al) muestreo.) Por) ejemplo,) las) puntas) de) papel) son)menos) eficaces) en) la)

recolección) de) placa) en) la) parte) apical) de) la) bolsa) que) en) zonas) cercanas) al) borde)

gingival.5)Como)las)bacterias)en)los)biofilms)subgingivales)no)se)distribuyen)de)forma)

homogénea)en)el) interior)de) la)bolsa,) las)muestras) tomadas)con)puntas)de)papel)no)

representan)de) forma)precisa) la) flora)de) la)base)de) las)bolsas)donde) la) enfermedad)

está)progresando.)

También) es) importante) tener) presente) que) cada) bolsa) tiene) un) perfil)

microbiológico)en)cierta)manera)único)y,)por)lo)tanto,)la)muestra)de)placa)de)un)sitio)

enfermo)puede)no)ser)representativa)de)la)flora)de)todos)los)dientes,)ni)siquiera)de)la)

de) otros) sitios) enfermos.) Esto) es) especialmente) cierto) para) microorganismos) cuya)

detección) es) infrecuente,) como) Aggregatibacter) actinomycetemcomitans,) cuya)

presencia) puede)no) ser) detectada) en) individuos)positivos,) incluso)después)de)haber)

tomado)muestras)de)numerosos)sitios)enfermos.)

En) general,) cuanto) más) sitios) se) muestrean,) más) representativo) del) perfil)

microbiológico)oral)del)paciente)será)el)análisis.)No)obstante,)esto)no)suele)ser)factible)

económicamente)y)a)menudo)los)resultados)se)obtienen)sólo)de)un)número)limitado)

de)sitios)que)no)han)respondido)al)tratamiento.)La)toma)de)muestras)duplicadas)puede)

ayudar)a)reducir)el)número)de)falsos)positivos)en)un)sitio)determinado.)

Las)técnicas)más)recientes)de)identificación)microbiológica,)como)los)métodos)

de)detección)de)la)reacción)en)cadena)de)la)polimerasa)basados)en)ARNr)16S,)parecen)

haber) solucionado) estas) limitaciones,) ya) que) tienen) poca) o) ninguna) reactividad)


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6!

cruzada,)y)son)capaces)de)detectar)un)amplio)abanico)de)tipos)de)clones)Aparte)de)la)

precisión)de)los)resultados,)cada)técnica)de)identificación)tiene)su)propia)sensibilidad)

(umbral)de)detección),)y)puede)resultar)afectada)por)los)métodos)de)transporte)y)de)

manipulación,)así)como)por)los)procedimientos)del)laboratorio.)En)un)estudio)reciente,)

dos) muestras) de) placa) tomadas) simultáneamente) y) procesadas) en) el) mismo)

laboratorio) por) los) mismos) métodos) dieron) resultados) distintos) con) respecto) a) las)

especies) bacterianas) identificadas) y) a) la) sensibilidad) a) los) antibióticos) (Otro) tema)

importante) que) puede) tener) impacto) en) el) análisis) microbiológico) es) la) amplia)

variación)en)diversidad)genética)y)clonal)entre)microorganismos)individuales.)

¿ES!NECESARIA!LA!MICROBIOLOGÍA!CLÍNICA!EN!PERIODONCIA?:!

El)análisis)microbiológico)no)es)necesario)para)diagnosticar) la)mera)existencia)

de)gingivitis)o)periodontitis.)No)se)necesitan)análisis)microbiológicos)para)confirmar)lo)

que) una) sonda) dental) puede) revelar) con) facilidad.) El) conocimiento) microbiológico)

puede)ser)útil,)sin)embargo,)en)el)contexto)de)la)terapia)periodontal.4)

IDEALMENTE,!UN!TEST!MICROBIOLÓGICO!DEBERÍA!SERVIR!PARA!:!

• Determinar) el) agente) causal.) Las) periodontitis) son) infecciones) mixtas.) La)

selección) del) tratamiento) y) pronóstico) puede) variar) según) los) patógenos)

presentes.) Por) tanto,) en) la) fase) diagnóstica,) los) patógenos) específicos) deben)

ser)determinados.)

• Determinar)las)localizaciones)de)destrucción)tisular)activa.)Si)somos)capaces)de)

detectarlas) podremos) instaurar) el) tratamiento) adecuado) y) en) el) momento)

idóneo.)


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7!

• Planificar)el) tratamiento)para) los)pacientes)no-tratados.)El)diseño)del)plan)de)

tratamiento)irá)encaminado)a)la)eliminación)de)los)patógenos)periodontales.)

• Corregir)el) tratamiento)de)pacientes) refractarios)y) recidivantes.)Los)pacientes)

que) no) responden) al) tratamiento,) pueden) ser) pacientes) a) los) que) no) se) ha)

instaurado)el)tratamiento)correcto.)

• Controlar) los) efectos) del) tratamiento.) Conocer) si) se) ha) conseguido) la)

eliminación)de)los)patógenos)periodontales.)

• Decidir)los)intervalos)de)las)visitas)de)mantenimiento.)Se)puede)determinar,)en)

cada)momento,) los)niveles) residuales)o)de) carga)de)patógenos)periodontales)

para)decidir)el)intervalo)de)mantenimiento.)Hay)muy)poca)evidencia)que)apoye)

este)uso)de)los)test)microbiológicos,)sin)embargo,)puede)ser)razonable)pensar)

que) con)ciertos)niveles)de)patógenos)periodontales) sea)necesario) realizar) los)

mantenimientos)más)frecuentemente.)

)

USO!PARA!UN!GRUPO!DE!PACIENTES!DETERMINADO!

Otra) indicación) de) los) test) microbiológicos) es) el) examen) de) grupos) de)

población.)Se)han)descrito)tres)usos)importantes:)

• Estudios) epidemiológicos) sobre) prevalencia) de) patógenos) en) varias)

poblaciones.)Pueden)existir)patógenos)diferentes)en)poblaciones)distintas.)

• Estudios)longitudinales)para)valorar)la)importancia)de)las)bacterias)en)el)inicio)y)

progresión)de)las)periodontitis.)

• Identificar)individuos)de)riesgo,)que)pueden)padecer)periodontitis)o)tener)una)

forma)recurrente.5)


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8!

TIPOS!DE!TESTS!MICROBIOLÓGICOS:!!

Diferentes)tipos)de)test)microbiológicos)han)sido)utilizados)en)la)detección)de)

periodontopatógenos)putativos)en)muestras)subgingivales))in)vivo)y)como)método)de)

establecimiento) de) un) modelo) in) vitro) que) logre) reproducir) el) comportamiento)

bacteriano)complejo)en)la)cavidad)oral:6)

Cultivo(Bacteriano:(

Históricamente,) los) métodos) de) cultivo) han) sido) ampliamente) utilizados) en)

estudios) dirigidos) a) caracterizar) la) composición) de) la) microflora) subgingival) y) sigue)

siendo)considerado)el)método)de)referencia)(Gold)Estándar))para)la)determinación)de)

la)utilidad)de)un)nuevo)método)diagnóstico)microbianos)en)periodoncia.7)

La) principal) ventaja) de) este) método) es) la) posibilidad) de) obtener) conteos)

relativos)y)absolutos)de)la)especies)cultivadas.)

Los)métodos)de)cultivo)sólo)pueden)crecer)viables)bacterias),)por) lo)tanto),)el)

muestreo)y)la)estricta)condiciones)de)transporte)son)esenciales)5Sólo)alrededor)de)la)

mitad)de) las)bacterias)orales)se)pueden)cultivar)en)el) laboratorio)utilizando)métodos)

de)cultivo.8)

El) cultivo) tiene) una) ventaja) particular) sobre) todos) los) demás) métodos) de)

identificación)microbiológica:)permite)evaluar)la)sensibilidad)a)los)antibióticos)2)

El) inconveniente) más) importante) es) que) el) cultivo) requiere) de) laboratorio)

específicos,) equipo)y)personal) con)experiencia,) además)de) ser) relativamente) lento)y)

caro.7)


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9!

Métodos(basados(en(el(diagnóstico(inmunológico(

Los) ensayos) inmunológicos) utilizan) anticuerpos) que) reconocen) antígenos)

bacterianos) específicos,) y) la) identificación) de) estas) reacciones) antígeno-anticuerpo)

específicos) permite) la) detección)de)microorganismos)diana.) Esta) reacción)puede) ser)

visualizada) usando) una) variedad) de) técnicas) y) reacciones,) incluyendo) ensayos) de)

microscopía) ) de) inmunofluorescencia) directa) (DFA)) y) indirecta) (IFA),) citometría) de)

flujo,) prueba) de) inmunoensayo) ligado) a) enzimas) (ELISA),) aglutinación) de) látex) y)

membranas)de)inmunoensayo.5)En)conjunto,)estos)métodos)presentan)varias)ventajas)

importantes:)tienen)umbrales)de)detección)bastante)bajos,)su)coste)es)relativamente)

moderado,) son) rápidos) y,) de) alguna) manera,) son) cuantitativos) Sin) embargo,) no)

permiten)evaluar)la)sensibilidad)a)los)antibióticos)de)la)flora.2(

Análisis(Enzimáticos(

Se)ha)desarrollado)un)análisis)enzimático)que)detecta)las)bacterias)que)poseen)

enzimas) similares) a) la) tripsina,) como) T.) forsythensis,) Treponema) dentícola) y) P.)

gingivalis.)Cuando)una)muestra)de)placa)conteniendo)cualquier)combinación)de)estas)

tres) bacterias) se) pone) en) una) tira) de) papel) impregnada) con) el) sustrato) incoloro) N)

benzoil-DL-arginina-2-naftilamida) (BANA),) la) descomposición) del) sustrato) de) BANA)

produce)un)color)negro)azulado)cuya)intensidad)es)proporcional)a)la)cantidad)total)de)

los) tres) organismos.) Esta) prueba,) que) puede) realizarse) en) la) consulta,) no) distingue)

entre) las) proporciones) relativas) de) las) tres) bacterias,) ni) identifica) otros)

microorganismos)orales,)pero)los)estudios)sobre)la)prueba)del)BANA)han)demostrado)

que) se) relaciona) bien) con) la) profundidad) de) sondaje) en) sitios) con) enfermedad)

periodontal.2,5))Sin)embargo,)su)utilidad)como)método)diagnóstico)es)incierta,)debido)a)


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10!

su)escasa)fiabilidad)para)predecir)la)progresión)clínica)de)la)enfermedad).)Puede)tener)

más) valor) cuando) se) utiliza) en) combinación) con) otras) pruebas) microbiológicas)

realizables)en)la)consulta,)como)la)microscopía.)

Métodos(de(Biología(Molecular(

Sondas'de'ácido'nucleico'

Las) sondas) de) ácido) nucleico) consisten) en) secuencias) de) ácido) nucleico)

marcadas) con) un) indicador) colorimétrico) radiactivo) o) enzimático) que) se) une) a)

secuencias)complementarias)de)ácidos)nucleico)del)microorganismo)correspondiente.)

Las) secuencias) de) la) sonda) pueden) ser) del) genoma) completo,) secuencias) de) ácidos)

nucleicos) clonadas) al) azar) u) oligonucleótidos) sintéticos) (conocidos) también) como)

sondas) de)ARNr) 16S).)De) las) tres,) las) sondas) de)oligonucleótidos) son) las) que) tienen)

mayor) especificidad) y) menor) reactividad) cruzada) porque) están) dirigidas) a) genes)

específicos)de)una)especie)bacteriana.)

Los) sondas) del) genoma) completo) y) las) sondas) de) secuencias) de) ácidos)

nucleicos)clonados)al)azar)pueden)contener)secuencias)comunes)a)múltiples)especies.)

Las)sondas)de)ácido)nucleico)utilizadas)para)el)análisis)microbiológico)de)la)placa)han)

confirmado) tener) mayor) sensibilidad) que) los) métodos) de) cultivo.) ) Además,) la)

viabilidad)de)los)microorganismos)no)es)un)requerimiento)en)el)análisis)con)sondas)de)

ácido)nucleico,)lo)cual)puede)ser)una)ventaja)cuando)el)análisis)de)las)muestras)se)ha)

de) posponer) debido) a) un) tiempo) de) transporte) prolongado) entre) la) clínica) y) el)

laboratorio.2)

El) uso) de) métodos) moleculares) para) la) caracterización) del) microbioma)


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11!

periodontal,)ha)ampliado)considerablemente) la)gama)de)especies)bacterianas)que)se)

sabe)que)colonizan)este)hábitat.)8)

Hibridación' ADN' en' “tablero' de' ajedrez”' ' o' en' ' “damero”(Checkerboard'DNA?DNA'

hybridization'technology):'

Se) ha) desarrollado) esta) técnica) para) la) detección) de) hasta) 40) especies)

bacterianas,)las)más)comúnmente)encontradas)en)la)cavidad)oral.)Se)utiliza)una)sonda)

completa)de)ADN)genómico)marcada)con)digoxigenina.)La)unión)de)ambos)ADN,)el)de)

la) muestral) y) la) sonda,) se) detecta) mediante) anticuerpos) antidigoxigenina) y) se)

cuantifica)por)métodos)de)quimioluminiscencia,)dando) las)muestras) la) apariencia)de)

un) tablero) de) ajedrez.) Se) consigue) un) límite) de) detección) de) 104) células) de) cada)

especie,)pero)puede)ajustarse)para)detectar)103)células.))

Entre)sus)ventajas)está)la)posibilidad)de)realizar)el)procesamiento)rápido)de)un)

gran)número)de)muestras)analizando)40)especies)bacterianas)en)un)solo)paso,)no)son)

necesarias) bacterias) viables) y) es,) particularmente) aplicable) para) estudios)

epidemiológicos.)Pero)entre)sus)desventajas)cabe)destacar)la)sofisticación)y)coste)del)

laboratorio)para)llevarlo)a)cabo,)ya)que)es)necesario)un)equipo)altamente)específico),)y)

el)hecho)de)ser)semicuantitativo.)5,7,)9)

Análisis(de(reacción(en(cadena(de(la(polimerasa((>(PCR((Kary(Mullis):(

La) reacción) en) cadena) de) la) polimerasa) (PCR)) es) una) técnica) de) biología)

molecular) para) la) replicación) de) alto) rendimiento) del) ADN.) Permite) sintetizar) un)

amplio)número)de)copias)a)partir)de)muestras)mínimas)de)ADN,)en)teoría)incluso)tan)

pequeñas)como)una)única)bacteria,)para)facilitar)análisis)posteriores.)Una)modificación)


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12!

de) la) tecnología) original) de) la) PCR,) la) PCR) «en) tiempo) real»,) permite) no) sólo) la)

detección)de)microorganismos)específicos)en)la)placa,)sino)también)su)cuantificación.))

Los)análisis)de)la)PCR,)cuando)se)usan)en)combinación)con)sondas)de)ARNr)16S)

sintéticas) que) son) altamente) específicas) para) especies) individuales,) permiten) la)

detección) de) virtualmente) cualquier)microorganismo) en) una)muestra) de) placa.) Esta)

técnica)es,)por)lo)tanto,)la)más)sensible)de)todas)las)expuestas.))

Sin)embargo,)no)se)sabe)si)es)necesario)detectar) los)microorganismos)que)se)

encuentran)en) la)placa)en)cantidades)mínimas,) los)cuales)pueden)contribuir,)o)no,)al)

mecanismo)patológico)de)la)enfermedad)periodontal.2,)4)

Además,)una)desventaja)principal)de)la)PCR)en)tiempo)real,))era)que)se)detecta)

ADN) de) células) bacterianas) vivas) y) muertas,) debido) a) la) relativamente) larga)

persistencia)de)ADN)después)de) la)muerte)celular,)por) lo)tanto),)basado)en)el)ADN)y)

diagnósticos,)se)pueden)sobrestimar)el)número)de)células)vivas.)Para)solucionar)esto)

se) ha) hecho) un) estudio) utilizando) PMA) (propidium)monaczide),) como)marcador) de)

células) muertas,) lo) que) facilitará) de) aquí) en) adelante) la) cuantificación) de) solo) las)

células)vivas.10-11)

Otra)posible)alternativa)en)este)fallo)de)la)sobre)estimación)de))células)vivas)y)

muertas)es)el)método)de)bioluminiscencia)trifosfato)de)adenosina)(ATP)),)que)ha)sido)

utilizado)como)un)ensayo)cuantitativo)para)evaluar)las)bacterias)viables)en)diferentes)

muestras)biológicas,)así)como)en)la)placa)dental.)Este)método)se)basa)en)la)actividad)

de) los)nucleótidos)de)ATP) como)un)elemento) clave)en)el) intercambio)de)energía)de)

todos)los)sistemas)biológicos.12)


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13!

En) conjunto,) cada) técnica) de) análisis) microbiológico) proporciona) alguna)

información) útil) con) respecto) a) la) presencia) de) algunos) patógenos) periodontales)

potenciales) y,) posiblemente,) a) sus) cantidades) relativas.) Aunque) se) centren) en) las)

bacterias) orales)más) comúnmente) asociadas) a) la) periodontitis,) algunos) laboratorios)

dan)también)información)sobre)niveles)de)Cándida)y)microorganismos)entéricos)en)la)

placa.)Como)ninguna)técnica)por)sí)sola)proporciona,)a)partir)de)una)muestra)de)placa,)

la) información)necesaria)para)que)el)clínico)pueda)tomar)decisiones)terapéuticas)con)

respecto)a) la)necesidad)de) tratamiento)antibiótico) complementario,) la)utilización)de)

una) combinación) de) varias) pruebas)microbiológicas) puede) dar) los) datos)más) útiles.)

Hay)que)reconocer)que)los)resultados)obtenidos)del)análisis)de)placa)no)proporcionan)

información)sobre)el) riesgo)de)progresión)de) la)enfermedad,)y) las)decisiones)clínicas)

nunca)deben)hacerse) sin) tener) en) cuenta) los) datos) clínicos.)Además,) la) información)

recogida,)al)estar) limitada)a)un)número)relativamente)pequeño)de)patógenos,)puede)

no)ser)capaz)de)identificar)al)patógeno)principal)en)un)paciente)en)particular.2)

En)la)actualidad,)la)mayoría)de)los)investigadores)utilizan)algún)forma)de)la)PCR)

y/o) metodología) de) ) sonda) de) ADN.) Estos) ofrecer) una) mayor) especificidad) y)

sensibilidad,) no) son) afectado) por) las) condiciones) de) transporte) y) ) no) requieren)

condiciones)anaerobias)para)ser)mantenidos)durante)el)muestreo)y)el)transporte.)

La) masa) bacteriana) total) puede) estimarse) utilizando) ) cebadores) universales)

para) la) región)16S)ARN)del)genoma.)Por) lo) tanto,) la)presencia)y) la)proporción)de)un)

bacteriana)diana)pueden)ser)estimados).)La)principal)desventaja)de)estos)métodos)de)

base) molecular) es) el) gasto) que) supone.) Varias) reacciones) de) PCR) pueden) ser)

requeridos)bajo)diferentes)condiciones)si)varias)especies)están)siendo)estudiadas.)


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14!

La)hibridación)ADN-)ADN)en)damero)o)tablero)de)ajedrez),por)su)costo)no)debe)usarse)

para)una)sola)muestra)de)placa)subgingival.9)

)

)


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15!

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2.! MATERIAL(Y(MÉTODO!

PREGUNTA !P ICO: !

En)primer) lugar)procedimos)al) planteamiento)de) la)pregunta)PICO:)¿Cuales(

de( los( métodos( para( la( toma( y( procesamiento( (variables( para( determinar( la(

microflora( subgingival)( de( muestras( microbiológicas( están( siendo( utilizadas( en( la(

actualidad(en(pacientes(con(periodontitis(agresiva(o(periodontitis(crónica(no(tratada?((

P! Pacientes)con)periodontitis)agresiva)o)periodontitis)crónica)no)tratada.)

I! Diagnóstico) de) enfermedad) periodontal) a) través) de) diferentes) procedimientos) para)toma)de)muestra)microbiológica.)

C! Diagnóstico)de)enfermedad)periodontal)a)través)de)cultivos.)

O!1. Selección)de)la)estrategia)de)toma)de)muestras)para)analizar)la)flora)subgingival.)2. Selección)de)la)técnica)para)evaluar)las)variables)microbiológicas)en)periodoncia.)3. Selección)de)las)variables)adecuadas)para)evaluar)la)microflora)subgingival.)

)!CR ITER IOS !DE ! INCLUS IÓN: !

(Tipos(de(estudio:(

! Estudios) transversales) o) de) prevalencia) de) la) enfermedad) periodontal)

agresiva)y)crónica.)(

Característica(de(los(pacientes:(

! Pacientes)con)periodontitis)crónica)o)periodontitis)agresiva,)en)función)de)los)

criterios) establecidos) por) la) clasificación) de) las) enfermedades) periodontales)


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16!

propuesta) por) Armitage) en) 1999.) También,) fueron) incluidos) estudios) que)

consideraban) enfermedad) periodontal) descrita) de) las) siguientes) formas:)

periodontitis) relacionada) con)embarazo,) alcoholismo,) tabaquismo,) con) factores) de)

riesgos)periodontales,)etc.))

Tipo(de(intervención:(

Toma)de)muestras)microbiológicas) subgingivales) y)posterior)procesamiento)

mediante) los) diferentes) test) microbiológicos) (cultivo) bacteriano,) métodos)

inmunológicos,)métodos)enzimáticos,)métodos)de)biología)molecular).)

Variables(clínicas:(

1. Profundidad)de)sondaje.)

2. Nivel)de)inserción)clínica.)

3. Presencia/Ausencia)de)placa)

bacteriana.)

4. Sangramiento)al)Sondaje)

(BOP).)

5. Índice)gingival.)

6. Recesión)gingival.)

7. Morbilidad)dentaria.)

Variables(respuesta(en(microbiología:(

) Se) tienen) en) cuenta) como) variables) respuestas) microbiológicas) en)

periodoncia:)

1. Selección) de) la) estrategia) de) toma) de) muestras) para) analizar) la) flora)

subgingival.)

2. Selección) de) la) técnica) para) evaluar) las) variables) microbiológicas) en)

periodoncia.)

3. Selección)de)las)variables)adecuadas)para)evaluar)la)microflora)subgingival.)


!

!

17!

Variables(respuesta(en(microbiología:(

Se)tienen)en)cuenta)como)variables)respuestas)microbiológicas)en)periodoncia:)

4. Selección) de) la) estrategia) de) toma) de) muestras) para) analizar) la) flora)

subgingival.)

5. Selección) de) la) técnica) para) evaluar) las) variables) microbiológicas) en)

periodoncia.)

6. Selección)de)las)variables)adecuadas)para)evaluar)la)microflora)subgingival.)

!

CRITERIOS (DE (EXCLUSIÓN: !Estudios) longitudinales,) estudios) con) pacientes) bajo) tratamiento) periodontal,)

estudios)que)no)determinaban)la)técnica)de)procesamiento)a)utilizar)para)la)toma)de)

muestra,) estudios) in( vitro,) estudios) en) modelos) experimentales) animales,) estudios)

previos)al)año)2009.)

)

ESTRATÉGIA )DE )BÚSQUEDA: !Se) realizó) una) búsqueda) electrónica) utilizando) la) base) de) datos)

MEDLINE/PUBMED)y)BUCEA;)de) igual)manera,)se)realizó)una)búsqueda)manual)en) la)

hemeroteca) de) la) biblioteca) de) la) Facultad) de) Odontología) de) la) Universidad)

Complutense) de) Madrid.) Nos) limitamos) al) idioma) ingles) y) español.) Tres) revisores)

independientemente) realizaron) la) búsqueda) (electrónica/manual)) utilizando) los)

mismos)criterios)de)búsqueda)y)selección)de)artículos.)Las)discrepancias)que)surgieron)

durante)el)proceso)de)investigación)fueron)solventadas)mediante)el)diálogo.)


!

!

18!

La) selección) de) artículos) se) obtuvo) luego) de) realizar) la) siguiente) búsqueda)

electrónica:)

1. Periodontal(disease(diagnosis.((1859(artículos)(

2. Periodontal(microbiological(diagnosis.((622(artículos)(

3. Subgingival(microbiota(in(periodontitis.((607(artículos)(

4. Checkerboard(DNARDNA(hybridization(and(periodontitis.((650(artículos)(

)

La)búsqueda)manual)de)artículos)se)realizó)en)las)siguientes)revistas:)Journal)of)

Clinical) Periodontology,) Journal) of) Periodontal) Research,) Journal) of) Periodontology,)

desde)el)año)2009)hasta)la)actualidad.)No)se)encontró)ningún)artículo)adicional.)

Las)principales)causas)por)las)cuales)se)descartaron)los)artículos)fueron:)

1. Ausencia)de)abstract.)

2. Artículos)de)revisión,)resumen)o)consensus/workshop.)

3. Diseño)longitudinal.)

Búsqueda)eletrónica)

Arkculos)encontrados)(ktulo)y)resumen):)

3738)

Arkculos)descartados:)3678)

Arkculos)completos:)63)

Arkculos)incluidos:)19)

Número)final)de)arkculos)incluidos:)19)

Búsqueda)Manual)

Arkculos)encontrados:)0)


!

!

19!

4. Variables) que) no) fueran) útiles) o) válidas) (clínicas/) respuesta)

microbiológica).)

5. Estudios)en) los)que)hayan)realizado)tratamiento)periodontal)antes)de) la)

toma)de)muestra.)

6. Muestra)inadecuada)de)pacientes.)(menos)de)20)pacientes).)

7. Estudios)anteriores)al)año)2009.)

8. Estudios)que)no)proporcionen)datos)de) las) variables)principales)de)esta)

revisión.))

[INVESTIGACIÓN,DE,LOS,FACTORES,ETIOLÓGICOS:,ESTUDIO,MICROBIOLÓGICO,DEL,BIOFILM,SUBGINGIVAL]!

!

! 20!

AUTOR/AÑO, N,CARACTERÍSTICAS,

CLÍNICAS/,ESPECIALES,

VARIABLES,CLÍNICAS,

VARIABLES,RESPUESTA,EN,MICROBILOGÍA,

TEST,MICROBIOLÓGICO, TOMA,DE,MUESTRA, PROCESAMIENTO, EVALUACIÓN,DE,LA,MICRO,FLORA,

Telles,RP,2009,13,

40! PC!(20)!PS!(20)!

Examen!periodontal!completo!

CBIB!y!ELISA!

La!superficie!mesio!bucal!de!cada!diente!(menos!terceros!

molares)!Chapple!et!al.!Puntas!de!papel!

Eppendorf!con!150!ul!de!buffer!elution!(PBST).!

Se!obtuvo!muestras!estadísticamente!significativas!(P!<0.0001)!correlaciones!

positivas!entre!CBIB!y!datos!de!ELISA!para!los!tres!biomarcadores.!Los!sujetos!con!periodontitis!tenido!niveles!medios!

estadísticamente!significativamente!mayores!de!ILL1b!y!L8!en!comparación!con!los!sujetos!

sanos!

Haffajeea,A,2009,14,

50!P!(25)!PS!(25)!


PCR!Hibridación!ADNLADN!en!damero!

Se!tomaron!6!sitios!y!se!eligen!dos!de!cada!muestra.!(dos!<4,!

dos!=4,!dos!>6)!Puntas!de!papel!para!PCR!y!curetas!Gracey!estériles!para!damero!en!sitios!sanos!y!

enfermos.!!Puntas!de!papel!en!tubos!con!

200ml!de!Chelex!al!5%.!

Eppendorf!con!150!ul!de!buffer!!Tris!EDTA!

El!rango!más!alto!de!correlación!fue!de!0.58,!0.49!y!0.46!fueron!vistos!por!Treponema!dentícola,!Fusobacterium!nucleatum!y!Eubacterium!nodatum,!respectivamente!(po0.0001).!Ambas!pruebas!podrían!

distinguir!muestras!de!sujetos!sanos!y!la!periodontitis.!

Shaddox,LM,,,2009,15,

51!

Niños!PAL!(31),!11!

hermanos!sanos!y!9!niños!sanos!no!relacionados!

PD,!BoP,!CAL,!posición!margen!

gingival,!Rx!periapicales!y!aletas!de!

mordida!para!confirmar!dx!de!

PAL!

Ampliacion!de!los!genes!del!Rna!16!S!mediante!PCR!

En!los!enfermos!1!sitio!enfermo!(primer!M!o!I)!con!PPD≥5!y!BOP!positivo!1!sitio!

sano!(primer!M!o!!I!no!afectados)!con!PPD≤3!!BOP!negativo.!En!los!!sanos!1!sitio!

(1!M!o!I)!Punta!de!papel!esteril!

La!muestras!se!almacenaron!a!L70º!hasta!

el!procesado!

Dos!especies!de!A.a.!Fueron!detectadas!con!mayor!frecuencia!en!sitios!enfermos!en!

individuos!con!PAL.AA_ot531_AA84(OR=8,33)!

AAot531_P02(OR=5,82,!)!

Casarin,RCV,,2010,16! 68! PA!(40)!

PC!(28)!


PCR!en!tiempo!real!y!ELISA!

Biofilm:1!sitio!con!PPD≥5!y!un!sitio!con!PPD≥7!seleccionados!

al!azar.!!Punta!de!papel!esteril!(35)!por!

30!segundos.!!Fluido!crevicular:!mismos!sitios!Tira!de!papel!por!30!segundos!

Biofilm:!La!muestra!se!trasportaron!en!un!tubo!estéril!conteniente!300!ml!de!fluido!de!trasporto!

Fluido!crevicular:!un!tubo!esteril!con!400!ml!of!!

Phosphate!buffered!saline!

Los!pacientes!afectados!por!periodontitis!agresiva!tiene!cantidades!mas!elevadas!de!

A.a.y!P.g.!El!nivel!de!Igg!contra!esos!patógenos!en!el!fluido!crevicular!era!inferior!

en!esos!pacientes.!Ademas!tenían!una!cantidad!inferior!de!ILL10.!

[INVESTIGACIÓN,DE,LOS,FACTORES,ETIOLÓGICOS:,ESTUDIO,MICROBIOLÓGICO,DEL,BIOFILM,SUBGINGIVAL],

,

! 21!

Cosgarea,R,,2010,17,

69! PA!PC!

PPD,!CALLV,!en!6!sitios!por!diente.!BOP.!GBI!y!registro!de!placa!en!4!sitios!por!diente!

Sonda!RNA,!PCR!en!tiempo!real!

4!bolsas!más!profundas.!Fondo!bolsa!seleccionada!por!10s!Dos!puntas!de!papeles!

estériles!

las!muestras!fueron!puestas!en!dos!

trasportadores!separados:!un!trasportador!por!el!test!sonda!Rna!y!otro!por!la!PCR!en!tiempo!real!

Para!todos!los!patógeno!periodontales!!el!recuento!medio!detectado!con!sonda!RNA!era!menor!con!el!detectado!por!PCR!,!P.g.,!T.f.,!T.d.!Fueron!encontrados!en!la!mayoria!de!los!pacientes!con!ambos!test.!Con!sonda!RNA!A.a.!Fue!detectado!con!mas!frecuencia!(24,6%)!respecto!a!PCR!(18,8%).!Solo!el!

10.1%!de!los!pacientes!resultaron!positivos!por!A.a!en!los!dos!test.!

Shchipkova,AY,

2010,18,30!

Fumadores!(15)!No!fumadores!(15)!PCS/PCM!(CAL!≥6!mm!y!PPD≥5!en!30%!o!mas!de!los!

sitios)!

PPD,!CAL!en!6!sitios!por!

diente.!BOP!y!índice!de!placa!con!un!índice!dicotómico!


4!sitios!proximales!no!adyacentes!con!CAL!≥6!mm!y!

PPD≥5!15!puntas!de!papel!estériles!en!

la!bolsa!por!10!segundos!

Las!muestras!se!pusieron!en!tubos!para!

microcentrifuga!y!!congelados!hasta!el!siguiente!análisis!

el!valor!medio!de!especies!en!individuos!fumadores!era!37±10.5,!mientras!en!los!no!fumadores!era!36.8±9.1!especies(p=0,67).!No!había!diferencia!en!el!número!de!todavía!no!

cultivados!filotipos!(38.8%!y!44.5%!respectivamente!p=0.09)!

Faveri,M,2010,19, 120!

PAL!(15)!PAG!(25)!PC!(30)!PS!(50)!


Técnica!de!hibridación!ADNLADN!en!damero!

9!sitios!interproximales!no!contiguos!(PAL,!PAG,!PC)!(3!bolsas!por!cada!grupo)!y!por!

cada!grupo!3!muestras!(</=3mm,!4L6,!7)!

Curetas!Gracey!individuales!

tubos!de!polipropileno!

Algunas!especies!de!red!complejas!de!color!naranja!fueron!los!más!numerosos!y!

frecuentes!microorganismos!patógenos!periodontales!en!PAL.!Las!proporciones!de!Actinobacillus!Aggregatibacter!fueron!elevados!en!las!bolsas!poco!profundas!e!

intermedios!de!los!sujetos!PAL!en!comparación!con!aquellos!con!GAP!o!PC,!

pero!no!en!los!sitios!profundos.!Esta!especie!también!mostró!una!correlación!negativa!con!la!edad!y!con!las!proporciones!de!los!

patógenos!complejos!rojos.!Las!especies!de!Actinomyces!compatible!huéspedLse!

redujeron!en!PAL.!

Urbán,E,2010,20, 36! Embarazadas!

Examen!periodontal!completo,!

morbilidad!de!los!dientes!

Cultivo!!PCR!!

Hibridacion!

Los!4!sitios!más!enfermo!(dientes!de!Ramford)!≥4mm!!4!puntas!estériles!de!papel!que!se!colocaron!en!el!surco!

por!5!segundos.!!Dos!puntas!para!cultivo!

Medio!porta!gérmenes!multitransporte!las!otras!

dos!de!PCR!en!un!Eppendorf!estéril.!

Pg!:!similar!resultado!en!ambos!tipos!de!test.!Tf:!más!detectada!en!PCR.!Pi!y!Aa:!fue!concordante!en!ambos!métodos.!

Microorganismos!putativos!:!mejor!en!cultivo.!Espiroquetas:!no!visibles!en!ninguno!

de!los!dos.!


!

! 22!

da,Silva,Furtado,Amaral,C,2011,21,

98!AlcohólicosNo!alcohólicos!



Se!obtuvieron!dos!muestras!de!los!sitios!con!PPD!<4!mm,!y!2!muestras!de!los!sitios!con!PPD!!4mmC.Curetas!Gracey!estériles!

individuales!

slot!blot!

La!prevalencia!de!especies!bacterianas!no!fue!significativamente!diferente!entre!los!

grupos.!Sin!embargo,!los!alcohólicos!mostraron!significativamente!recuentos!

medios!más!altos!de!Actinomycetemcomitans,!Fusobacterium!nucleatum!Aggregactibacter!nucleatum!y!

Porphyromonas!gingivalis!(p<0,001).!Por!otra!parte,!los!alcohólicos!obtuvieron!niveles!significativamente!más!altos!de!sputigena!Capnocytophaga,!Fusobacterium!nucleatum!vincentii,!F.!nuc.!nucleatum,!morbillorum!Gemella,!Neisseria!mucosa,!P.!gingivalis,!Streptococcus!gordonii,!y!Tannerella!

forsythia!en!sitios!con!PD!<4!mm!o!!4!mm!en!comparación!con!los!no!alcohólicos!(p!</=!0.001).!De!igual!manera,!los!sacos!poco!profundos!de!alcohólicos!presentaron!

niveles!significativamente!más!altos!de!F.!nuc.!vincentii,!F.!nucleatum!nuc,!P.!gingivalis!y!T.!forsythia!que!los!sitios!con!EP!>!4!mm!de!

los!no!alcohólicos!(p</=0.001).!

Santa,Cruz,I,2012,22,

170! Embarazadas!Examen!

periodontal!completo!

Cultivo!

4!sitios!(con!surco!e!inflamación!más!profunda).!Se!insertaron!dos!puntas!consecutivos!de!papel!y!se!mantuvieron!en!el!lugar!durante!10!segundos.!

RTF!

Ciento!setenta!mujeres!fueron!incluidos!en!el!estudio!(116!sanas!y!54!con!periodontitis).!La!incidencia!de!parto!prematuro!(PTB)!y!de!bajo!peso!al!nacer!(BPN)!fue!de!2.94%!y!

3.53%,!respectivamente.!El!estado!periodontal!no!mostró!ninguna!asociación!con!resultados!adversos!del!embarazo.!La!

presencia!de!Eikenella!corrodens!se!relacionó!significativamente!con!PTB!(p!=!0,022)!y!la!presencia!Capnocytophaga!spp.!estaba!relacionado!con!bajo!peso!al!nacer!(p!

=!0,008).!Los!análisis!multivariados!mostraron!una!asociación!significativa!entre!

el!PTB!y!el!peso!del!recién!nacido!y!el!recuento!de!E.!corrodens.!La!salud!materna!y!los!recuentos!de!E.!corrodens!se!asociaron!significativamente!con!PTB!o!bajo!peso!al!

nacer.!


,

! 23!

Heller,D,,,2012,23,

260! PAG!Examen!

periodontal!completo!


7!sitios:!3!!PPD≤3!y!4!PPD≥4!!Cureta!de!Grecey!esteril!

Eppendorf!con!150!ul!de!TE!buffer!

A.geren.,!A.!Israeli.,E.nodatum,!P.acnes,!se!detectaron!en!recuentos!mayores!en!PAgG,!mientras!C.!Ochracea,!F.!Periodonticum,S.!Aureus,!V.!Parvula!eran!mas!predominantes!

en!periodontitis!crónica!(p<0,001).!E.!Nodatum(nivel!medio≥4x105)!aumentaron!significativamente!la!probabilidad!que!los!pacientes!padecen!PAGg!(OR=2.44(0.96L6.20)!mientras!P.g.!(OR=0,34(0.11L0,93)!y!T.d.(OR=0,35(0.11L0.93)!eran!asociados!con!

periodontitis!crónica.!

Field,CA,,2012,24,

48!

Diabetes!Mellitus!tipo!2!(24)!

P!(9)/NP!(15)!PS:!P!(12)/NP!(12)!


PCR!en!tiempo!real!

3!sitios!PPd≤3!por!pacientes!sin!enf.!Periodontal;!3!sitios!

PPd≤3!y!3!sitios!PPD≥5!pacientes!con!enf!periodontal.!3!puntas!de!papeles!paralelas!por!cada!sitio!estériles!(60)!por!

10s!

tubos!para!microcentrifuga!

Utilizando!PCR!en!tiempo!real!P.g.,!eran!significativamente!mas!elevados!en!bolsas!periodontales!profundas,!sin!diferencias!

entre!sujetos!diabéticos!y!no!diabéticos.!A.a.!fue!detectado!en!todos!los!grupos!en!bajas!

cantidades!y!el!recuento!no!era!significativamente!diferente!entre!ambos!grupos!(p<0,05).!F.n.!era!abundante!en!

ambos!grupos!sin!diferencia!estadísticamente!significativa!entre!ambos!grupos.!P.g.!fue!detectado!en!elevadas!cantidades!en!sujetos!con!enfermedad!periodontal.!Correlación!positiva!entre!

profundidad!de!bolsa!y!recuento!de!las!tres!especie!bacteriana!(p<0,05)!

Khocht,A,2012,25,

193!

Síndrome!de!Down!(44)!

Retraso!Mental!(83)!

PS!(66)!Periodontitis!



3!sitios!interproximales!con!bolsas!mayores!a!5!mm.!!Cureta!Gracey!estéril!

Eppendorf!con!450ul!de!buffer!Tris!y!EDTA.!

Congelados!a!70!grados!

Se!encontró!un!número!similar!de!bacterias!en!pacientes!con!síndrome!de!Down!y!

pacientes!son!retraso!mental,!a!excepción!de!una!mayor!proporción!de!noxia!

Selenomonas,!Propionibacterium!acnes,!Streptococcus!gordonii!,!Streptococcus!mitis!y!Streptococcus!oralis,!Treponema!socransky!que!fue!mayor!en!pacientes!con!síndrome!de!

Down.!


!

! 24!

Zhou,M,,2013,26, 31!

Diabetes!Mellitus!tipo!2:!P/NP!!PS:!P/NP!


Pirosecuenciación!de!ADNr!(16S!

rDNA)!

4!sitios!mas!enfermos!en!los!molares!!

Curetas!Gracey!estériles!

Tubo!con!200!ul!PBS!y!congelado!a!70!grados!

En!los!sujetos!con!diagnóstico!de!salud!periodontal!,!las!abundancias!de!los!tres!géneros!(Prevotella,!Pseudomonas,!y!Tannerella)!fueron!significativamente!

diferentes!entre!los!pacientes!diabéticos!y!sus!contrapartes!no!diabéticas!.!En!sujetos!portadores!de!periodontitis,!las!cantidadess!

de!Actinobacteria,!Proteobacteria!!y!Bacteriodetes!Actinomyces!y!

Aggregatibacters!también!fueron!significativamente!diferentes!entre!los!

diabéticos!y!no!diabéticos!

Haririan,H,2013,27, 76! PC/PAG!

PPD,!CAL,!BOP!en!6!sitios!por!diente.!Rx!intraoral!y!

ortopantomografia!para!

determinar!la!perdida!ósea!y!convalidar!el!diagnostico!de!periodontitis!


Muestras!de!saliva:!solución!para!estimular!la!secreción!salival!por!2!min;!la!toma!se!efectuó!en!posición!sentada.!Muestra!placa!subgingival:!se!seleccionan!los!4!sitios!con!

mayor!PPD!de!cada!cuadrante.!Punta!de!papel!esteril!15s!

Muestras!Microbiana!se!pusieron!en!un!tubo!esteril!

y!congeladas!a!L40ºm.!Muestras!salivares!se!trasfirieron!en!tubos!

conteniente!una!solución!de!azida!de!sodio!y!

centrifugadas!3200rpm,!4º!

Se!detectó!una!correlación!positiva!significativa!entre!la!saliva!y!muestras!de!placa!subgingival!en!pacientes!con!ambos!tipos!de!periodontitis.!No!hubo!diferencias!significativas!en!las!bacterias!en!la!saliva!y!

muestras!de!placa!subgingival!entre!periodontitis!agresiva!y!crónicas.!

Bertoldi,C,2013,28, 25!

PCS/PCM!(25)!mínimo!1!defecto!intraóseo!próximo!a!un!sitio!sano!

PPD≤3!


n/r!

Después!de!la!elevación!de!un!colgajo!lingual!y!uno!bucal!a!espesor!parcial,!se!procedió!a!

recolectar!el!tejido!interproximal!relacionado!a!la!bolsa!y!el!tejido!interproximal!en!los!sitios!con!PPD!normal.!

Las!muestras!fueron!inmediatamente!congelados!a!80!Cº!

15!proteínas!se!expresaban!en!manera!diferentes!entre!tejidos!sanos!y!enfermos.!Annexina!A2,!actina!citoplasmática!1,!

anidrasa!carbónica!!1y!2!Ig!C!re!

Rams,TE,2013,29, 564!

Periodontitis!Severa!

n/r, Cultivo!

Se!obtuvieron!de!3!a!5!muestras!de!los!sitios!con!BOP!

con!profundidad!!6.!Puntas!de!Papel!

vial!de!vidrio!VMGA!

Blood!Agar!

52,1%!!de!los!sujetos!del!estudio!demostró!que!las!bacterias!subgingivales!analizadas!producen!bLlactamasa,!con!Prevotella!intermedia/!nigrescens,!Fusobacterium!

nucleatum!y!otras!especies!de!Prevotella!que!!identificados!con!mayor!frecuencia!como!bLlactamasa!que!producen!los!organismos.!De!las!especies!bacterianas!de!prueba!de!bL

lactamasas!98,9%!fueron!sensibles!in!vitro!al!metronidazol!en!4!lg/!ml.!

PC:!Periodontitis!crónica!.!PS:!Pacientes!sanos!PAL:!Periodontitis!agresiva!localizada.!PAG:!Periodontitis!agresiva!generalizada!PCS:!periodontitis!crónica!severa.!PCM:!periodontitis!crónica!moderada!H:!Hombre.!M:!Mujer.!P:!periodontitis.!n/r:!no!responde.!CBIB:!Immunoblotting!!


!

!25!

,

3., RESULTADOS,

SELECCIÓN( DE ( LA ( ESTRATEGIA & DE & TOMA& DE& MUESTRAS&

PARA$ANALIZAR$LA $FLORA#SUBGINGIVAL ,

TÉCNICA'DE'TOMA'DE'MUESTRA''

Cuatro' de' los' 16' artículos'

revisados,'utilizaron'como'método'

de' toma' de' muestras' solo' la'

cureta' esteril' Gracey,' un' estudio'

utilizo' curetas' y' punta' de' papel;'

otro' de' ellos' no' refirió' la' técnica'

con' que' se' tomo' la' muestra,' sin'

embargo' describe' que' para' la' recolección' muestral' subgingival' utilizó' una' técnica'

quirúrgica.'Por'otro'lado,'los'diez'estudios'restantes'indicaron'la'utilización'de'puntas'

endodónticas'de'papel'estériles'para'la'recolección'muestral.'

MUESTRAS'ÚNICAS'O'MÚLTIPLES'

En' cuanto' a' los' sitios' de' recolección,' un'

solo'estudio'utilizó'muestras'únicas'considerando'

solamente'una'bolsa'periodontal' como'nicho'de'

0! 2! 4! 6! 8! 10! 12!

Cureta'Gracey'

Cureta'Gracey'+'puntas'de'papel'

Puntas'endodónScas'de'papel'esteril'

n/r'

Cureta!Gracey!

Cureta!Gracey!+!puntas!de!papel!

Puntas!endodónticas!de!papel!esteril!

n/r!

n=16! 4! 1! 10! 1!

Técnica,toma,de,muestra,

0!2!4!6!8!10!12!14!16!

Únicas' MúlSples'

n=16!


!

!26!

recolección.'Quince'estudios'analizados'recopilaron'muestras'múltiples.!'

MUESTRAS!AISLADAS!O!AGRUPADAS!!

'

Encontramos'cinco'estudios' tomaron'muestras'agrupadas'que'variaban'entre'

2,'3,'4'puntas'de'papel'estériles.'Por'otra'parte,'en'el'caso'de' las'muestras'de'papel'

aisladas'se'encontraron'once'artículos'que'utilizaron'esa'técnica.'

SELECCIÓN!DE!LOCALIZACIONES!

En' cuanto' a' las' localizaciones,' obtuvimos' resultados' muy' variados.' Seis'

artículos' seleccionaron' los' 4' sitios' con' mayor' profundidad' de' sondaje' (PPD),' éstos'

variaban'entre'≥4'mm'y'≥6'mm.'Los'demás'artículos,'eligieron'localizaciones'diferentes'

entre' ellos' en'donde'destacan' el' estudio'de' Faveri' y' cols19'' en'donde' se' eligieron'3'

sitios' interproximales' en' cada' uno' de' los' grupos' muéstrales' seleccionados'

(periodontitis' agresiva' localizada' (PAL),' periodontitis' agresiva' generalizada' (PAG)' y'

periodontitis'crónica'(PC))'un'sitio'≤3'mm,'otro'entre'4'y'6'mm,'y'el'tercero'≥7'mm.'

Por'otra'parte,'Da'Silva'y'cols'21'eligieron'dos'sitios'≥'a'4'mm'y'dos'sitos'≤'4'mm.'Santa'

Cruz'y'cols'22'tomaron' las'muestras'de'siete'sitios'diferentes,'tres'≤3mm'y'cuatro'≥4'

11!

5!

0!2!4!6!8!10!12!

Aisladas! Agrupadas!

Muestras(Aisladas(o(Agrupadas(

n=16!


!

!

27!

mm.'En'2009,'Telles'y'cols'13'extrajeron'muestras'desde' la'superficie'mesio'bucal'de'

cada'diente'presente'en'boca'(excepto'terceros'molares).'En'ese'mismo'año,'Haffajeea'

y'cols' 14' 'se'seleccionan'seis'sitios,'dos'≤'4'mm,'dos'entre'4'y'6,'y'dos'≥6.' 'Khocht'y'

cols25'eligieron'tres'sitios'interproximales'≥'5'mm.'Tres'años'más'tarde,'Heller'y'cols23'

seleccionaron' tres' sitios' <' 3mm' y' tres' sitios' >5'mm.'De' igual'manera,' Field' y' cols24''

realizaron' un' estudio' tomando' las' muestras' de' 2' sitios' (≤' 3mm' y' sitio' ≥' 5' mm).'

Shaddox'y'cols15'un'sitio'>5mm''y'uno'>7mm.'En'el'estudio'de'Cosagarea'y'cols17'se'

realizó'un'acceso'quirúrgico,'eligiendo'un'sitio'interproximal'con'un'defecto'intraóseo'

en'que'era'indicado'para'realizar'un'tratamiento'regenerativo.'

'

SELECCIÓN( DE ( LAS ( TÉCNICAS & PARA& EVALUAR' LAS '

VARIABLES )MICROBIOLÓGICAS&EN&PERIODONCIA ,

USO!DE!UNA!TÉCNICA!

Se'describieron'diferentes'técnicas'utilizadas'en' los'estudios'revisados.'Encontramos'que'

solamente' 2' artículos' realizaron' cultivos,' mientras' que' en' otros' 4' se' realizó' la' técnica' de'

hibridación' ADNjADN' en' damero.' Por' otra' parte,' encontramos' la' técnica' de' PCR' y' su' distintas'

3!

5!

2!

1!

1!

2!

2!

PCR!tiempo!real!

Hibridación!ADN!ADN!damero!

Cultivo!

Pirosecuenciación!!

Imnuno!blot!

Ampliacion!de!los!genes!del!Rna!16!S!mediante!PCR!!

PCR!

Uso(de(Técnicas(n=16!


!

!28!

variantes'(en'tiempo'real,'amplificación'de'genes'del'RNA'16S);'de'igual'manera,'se'encontró'que'

muchas'de'estas'técnicas'fueron'comparadas'con'la'técnica'ELISA.'También'se'halló'una'técnica'de'

amplificación' de' ' genes' del' RNA' 16S' mediante' pirosecuenciación' como' en' otro' caso' que' el' se'

realizó'el'estudio'mediante'un'immunoblot'

!

SELECCIÓN( DE ( LAS ( VAR IABLES ' ADECUADAS' PARA" EVALUAR"

LA#MICROFLORA#SUBGINGIVAL ,

Las' variables' a' estudiar' encontradas' en' los' artículos' de' revisión' fueron' las'

siguientes'y'de'la'siguiente'forma:'

1. Shcipkova* y* cols18' se' compararon' sujetos' fumadores' y' no' fumadores'

afectados'por'periodontitis'y'las'variables'consideradas'fueron:''

• La'detección'de'frecuencia'de'patógenos''

• La'prevalencia'de'patógenos'seleccionados''

• La'proporción'de'esos'en'sujetos'fumadores'y'no'fumadores'

2. Heller* y* cols23' observaron' el' recuento' total' de' bacterias' anaerobios' ' y'

aerobios' en' pacientes' con' Periodontitis' crónica' y' Periodontitis' agresiva'

generalizada.' De' Igual' manera,' analizaron' el' recuento' de' patógenos'

seleccionados'por'pacientes.'

3. Shaddox*y*cols15'evaluaron'la'proporción'de'patógenos'según'paciente,'según'

paciente'positivo'y'localización,'localización'positiva,'en'sitios'enfermos'(I'o'M)'

y' sanos' (I' o'M)' en' pacientes' con' LAP,' sitios' sanos' (I' y' M)' en' hermanos' sin'

enfermedad' periodontal' y' sitios' sanos' (I' y' M)' en' controles' combinados' por'

edad'y'sexo.'


!

!29!

4. En' el' estudio' de' Field* y* cols24' La' prevalencia' de' patógenos' seleccionados'

(localización'positiva'en'cada'paciente)'en'pacientes'con'DM'tipo'2'y'pacientes'

no' diabéticos' afectos' por' ' periodontitis' crónica' severa' fueron' las' variables'

estudiadas.'

5. Cosgarea* y* cols17' observaron' la' prevalencia' de' patógenos' mediante' la'

comparación' del' resultados' de' PCR' real' time' y' sonda' RNA' en' detectar'

patógenos'periodontales'seleccionados'en'individuos'con'periodontitis'crónica'

severa'o'periodontitis'agresiva'.'

6. Haririan* y* cols27' analizaron' la' prevalencia' de' patógenos' seleccionados,'

mediante' la' presencia' de' 20' tipos' de' bacteria' en' sujetos' con' periodontitis'

crónica' y' periodontitis' agresiva' ' utilizando' muestras' salivares' y' de' placa'

subgingiva.'

7. Casarin* y* cols16'estudiaron'el'recuento'de'patógenos'seleccionados'de'A.a'y'

P.g'en'pacientes'con'periodontitis'agresiva'(paciente'positivo)'

8. Bertoldi* y* cols28'no'pudieron'evaluar'bacterias'periodontopatógenas,'por' lo'

tanto' evaluaron' el' perfil' proteómico' en' la' bolsas' interproximales' (presencia'

bacteriana'no'específica)'

9. Faveri* y* cols19' analizaron' las' siguientes' variables' en' pacientes' con'

periodontitis'agresiva'localizada':'

• Recuento'total'de'anaerobios'y'aerobios'

• Proporción'de'patógenos'según'paciente'positivo.'

10. Da* Silva* y* cols21' ' evaluaron' la' prevalencia' de' patógenos' seleccionados,' el'

recuento' de' patógenos' seleccionado' por' pacientes' (alcohólico' vs' noj

alcohólicos)'


!

!30!

11. Rams* y* cols29' estudiaron' la' frecuencia' de' detección' de' patógenos,' la'

proporción' de' patógenos' según' pacientes' positivos' a' la' B"lactamasa' en'

pacientes'con'periodontitis'crónica.''

12. En'2009,'Haffajee*y*cols14'analizaron:''

• Los' recuentos' totales' (anaerobios).' Se' estudiaron' las' bacterias'

anaerobias'totales'que'se'encontraban'en'los'dos'grupos'de'pacientes'

• Los' Recuentos' de' los' patógenos' seleccionados' por' paciente' ,' por'

paciente' positivo.' Se' estudiaron' los' patógenos' en' cada' grupo' ,' por'

paciente'y'por'paciente'positivo.'

• La'prevalencia'de'patógenos'seleccionados'por'localización'positiva'y'por'

localización' (' grupo' con' periodontitis' y' sin' periodontitis)' ,' teniendo' en'

cuenta' la'comparación'de'ambos'test' ('hibridación'en'damero'y'microj'

IDent)'

13. Khocht*A*y*cols25'estudiaron:'

• Las'proporciones'de'los'patógenos'por'paciente'y'por'paciente'positivo,'

tomando'en'cuenta'los'tres'grupos'estudiados,'pacietes'con'síndrome'de'

Down,'pacientes'con'y'sin'limitaciones'mentales.'

• La' frecuencia' y' el' recuento' de' presencia' de' periodontopatógenos'

seleccionados,' en' pacientes' y' pacientes' positivos' ' para' Treponema'

Socranskii,' Streptococcus' constellatus,' S.' constellatus,' Fusobacterium'

nucleatum'ssp.'nucleatum,'S.'noxia'y'Prevotella'nigrescens,'Actinomyces'

naeslundii'II'y'Actinomyces'odontolyticus.'

14. En' el' estudio' de' Edit* Urbán* y* cols20' ' se' observó' la' prevalencia' de' los'

diferentes'periodontopatógenos'en' las'muestras'de'36'mujeres'embarazadas'


!

!31!

con'periodontitis'por'el'método'de'cultivo'se'realizó'en'base'a'el' 'método'de'

identificación' de' a' cuerdo' a' ' con' los' CFUs/' ml.' Por' otra' parte,' se' evaluó' la'

proporción' de' periodontopatógenos' “key”' y' otras' 6' bacterias' elegidas,' en' la'

muestra' de' mujeres' embarazadas,' con' microjIDent' y' cultivo' basado' en'

identificación'con'CFUs/ml.'

15. Zhou*y*cols26'analizaron'la'prevalencia'de'periodontopatógenos'en'pacientes'y'

pacientes'positivos,'con'diabetes'tipo2'y'periodontitis,'pacientes'con'diabetes'

tipo'2'y'sin'periodontitis'y'pacientes'sanos.'De'igual'manera,'las'proporciones'

bacterianas'en'los'grupos'de'pacientes'según'asociación'de'bacterias'por'OTUs'

(unidad'taxonómica'operativa)'

16. En'2009,'Telles*y*cols13''evaluaron'la'frecuencia'de'detección'de'MMPj8,'ILj8'y'

j1b''in'GCF'en'pacientes'sanos'y'pacientes'positivos'para'periodontitis.'

17. Finalmente,'Santa*cruz*y*cols22:'estudiaron:'

• El'recuento'total'de'bacterias''en'CFUs'

• La'proporción'por'pacientes''en'CFUs'

• La' frecuencia' de' aparición' de' diferentes' especies' bacterianas' en' 39'

pacientes'embarazadas''positivas'para'periodontitis''en'CFUs'

• Prevalencia'de'periodontopatógenos'

En' resumen,' las' variables' y' el' número'de' artículos'que' las' estudiaron' fueron' las'

siguientes:'

• Recuentos'totales'(anaerobios,'aerobios,'ambos:''(8'artículos)'

• Proporciones'de'los'patógenos'seleccionados:'(8'artículos)'

• Prevalencia'de'patógenos'seleccionados:'(9'artículos)'


!

!32!

• Frecuencia'de'detección'de'patógenos'seleccionados'en'una'población'

(pacientes'positivos):''(5'artículos)'

Recuentos'totales'26%'

Proporciones'de'los'patógenos'

seleccionados'27%'

Prevalencia'de'patógenos'

seleccionados'30%'

Frecuencia'de'detección'

17%'

Variables,Microbiológicas,


!

!33!

,

4., DISCUSIÓN,

Se' revisaron' 17' artículos' transversales' en' donde' se' evaluó' la' estrategia' de'

toma' de' muestras' para' analizar' la' flora' subgingival,' las' técnicas' para' evaluar' las'

variables' microbiológicas' en' periodoncia' y' las' variables' adecuadas' para' evaluar' la'

microflora'subgingival.'

En'cuanto'a'las'tomas'de'muestra,''un'estudio'en'el'cual'utilizaron'curetas'para'

la' toma' de' biofilm' subgingival,' aseguran' que' las' puntas' de' papel' como'método' de'

recolección'de'muestras'subgingivales,'se' limitan'generalmente'a' la'placa'bacteriana'

que'se'encuentra'en'el'líquido'crevicular'gingival'y'la'placa'adherida,'a'diferencia'de'la'

recolección'con'curetas,'que'además,' también'es'capaz'de'recolectar'muestras'en' la'

parte'donde'está'mas'unido'el''diente'al'epitelio.26'

A' pesar' de' esto,' hemos' observado' que' la' tendencia' de' los' estudios' es' la' de'

recoger'las'muestras'utilizando'puntas'de'papel,'y'pensamos'que'puede'ser'debido'a''

la'manipulación'y'comodidad'al'momento'de'la'toma'de'muestra'y'transporte.'

En' cuando' al' número' de'muestras' por' pacientes' y' número' de'muestras' por'

sitio,''los'autores'justifican'que'entre'más'tomas'por'sitio,'y'además'de'el'mismo'sitio'

podrían' garantizar' una' muestra' mucho' más' representativa,' que' evitaría' errores' al'

momento' de' la' evaluación,' en' el' caso' de' los' estudios' comparativos,' tener' sesgos' y'

diferencias'sin'justificación.17'


!

!34!

En'el'caso'de'los'test,'según'los'hallazgos'esperados'para'el'estudio,'los'autores'

utilizan'cultivo,'como'Gold'estándar'al'momento'de'comparar'técnicas'o'cómo'método'

único'de'análisis'en'bacterias'que'ha'sido'comprobado'que'son'cultivables.'20,'22'

Algunos'que'eligieron'los'métodos'de'amplificación'de'16S'rADN',hibridación'o'

PCR,' reportaron' que' no' eligieron' el' cultivo' como' método' de' medición' ,' debido' a'

utilizar'mucho' tiempo'y'necesitar'de'una' técnica'muy'elaborada,'a'demás'de'que' lo'

consideraron'menos'preciso.'14,'18'

Dentro'de'la'búsqueda'encontramos'un'artículo'que'describía'biomarcadores'y'

decidimos' incluirlo,' porque' queríamos' ' observar' cómo' el' ELISA,' podía' determinar'

resultados' satisfactorios.' Los' autores' incrementaron' el' éxito' en' los' resultados,'

aumentando'el'número'de'ejemplos'en'los'que'estudiar'los'biomarcadores.13''

Los'autores'que'según'su'estudio'buscaban'hallar'diferencias'entre'grupos'de'

pacientes,' en' los' que' hay' bacterias' específicas' incultivables' y' con'muestras' de' gran'

tamaño,' utilizaron' test' más' minuciosos,' como' el' caso' de' el' ADN' en' damero' ' e'

hibridación'de'ADN.'25'

Las'variables'respuesta'para''evaluar' la'microflora'subgingival,'variaron'en'los'

estudios' según' los' objetivos.' En' el' caso' de' los' estudios' que' buscaban' encontrar'

marcadores' específicos,' las' variables' a' estudiar' se' centraron' en' la' proporción' o'

prevalencia' de' periodontopatógenos.' Los' estudios' que' buscaban' saber' cuando' se'

presentaban' las'bacterias'en'determinados'tipos'de'pacientes,'se'centraron'más'que'

todo'en'la'frecuencia''y'prevalencia'de'los'periodontopatógenos.'13'j29'


!

!35!

Consideramos,' el' estudio' de' Santa' Cruz' y' cols22' como' el' más' conciso' y'

completo.' Debido' al' tipo' de' variables' que' evaluaron' la' microflora,' partiendo' de' la'

base,' que' la' influencia' del' número' y' tipo' de' bacteria,' sitio' y' paciente' positivo' o'

negativo' y' concentraciones' de' bacterias' según' CFUs,' pueden' producir' ' resultados''

mucho'mas'significativos.''

En' resumen,'nos'encontramos' con'que'el'uso'de' las' técnicas'microbiológicas''

en' la' actualidad' es' muy' común' sobre' todo' para' comprobar' técnicas' nuevas,' para'

confirmar' la' presencia' o' ausencia' de' periodontopatógenos' en' salud' y' enfermedad,'

para''estudiar''especies'bacterianas'que'hasta'hace'unos'años'era'imposible''pesquisar''

y' los' autores' echan'mano' de' diferentes'métodos' de' toma' de'muestra' y' según' sus'

objetivos,'analizan'o'no'determinado'tipo'de'variables'microbiológicas.'


!

!36!

,

5., CONCLUSIÓN,

Hemos'encontrado'que'los'métodos'de'estudios'microbiológicos'más'utilizados'

en' la' actualidad' son' la' hibridación' DNAjDNA,' sondas' de' a' ARNr' 16s,' PCR,' PCR' en'

tiempo' real,' la' hibridación' de' DNAjDNA' ' en' damero,' entre' otros.' No' obstante,' el'

cultivo' sigue' siendo' utilizado' para' la' comprobación' de' bacterias' potencialmente'

cultivables'al'igual'que'como'método'comparativo.'

Aunque' las' técnicas' microbiológicas' para' el' diagnóstico' periodontal' no' son'

indispensables,' resultan' un' gran' complemento' a' la' hora' de' brindar' un' tratamiento'

más'eficaz'y'específico'al'momento'de'tratar'la'enfermedad'periodontal.''

'

,


!

!37!

,

6., BIBLIOGRAFÍA,

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GRUPO 3. MADRID 2014

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